Souris

1 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de quarante minutes, une légère décharge électrique et une série de tests comportementaux (activité motrice, exploration, anxiété, attention, mémoire associative), avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur décrit des atteintes limitées, un stress lié à l'anesthésie et aux tests, mais ne précise pas les effets de la décharge électrique. Il affirme que ces explorations sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro et espère identifier des cibles thérapeutiques contre les troubles neuropsychiatriques.

Objectifs

Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d ́exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier d'une part chez des souris comment les neurones des régions cérébrales clés de la perception échangent des informations. D'autre part, nous allons nous demander quel est le rôle de ces régions spécifiques dans la cognition sensorielle. Dans les deux cas, nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de troubles neuropsychiatriques. Nous espérons que cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet permettront de disséquer de manière fonctionnelle l’implication du système thalamo-corticale dans la mémoire sensorielle chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles murins transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales fonctionnellement mises en jeu. Mieux comprendre le système thalamo-corticale sensorielle permettra d’appréhender les processus d'apprentissage, de mémorisation et de perception, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles elle est altérée. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.

Procédures

Biopsie de queue: 1 fois de moins d'une seconde. Injection sous-cutanée : 3 fois pour la chirurgie stéréotaxique, durée 5 secondes. Chirurgie pour injection stéréotaxique intracérébrale, 1 fois de 40 minutes. Légère décharge électrique, 1 fois de 1 seconde. Injection intra-péritonéale: 1 injection, durée 5 secondes. Etudes du comportement, 1 fois chacun: moteur (5 minutes), d’exploration (10 minutes), d’anxiété (10 minutes), d’attention (15 minutes) et de mémoire associatif (15 minutes/jour, 3 jours), répartis sur 4 à 7 jours.

Impact sur les animaux

L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée à la biopsie de queue et aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical. Le test de memoire peut entraîner de l'inconfort et du stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort: 1) pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales; 2) à la fin de la période de reproduction chez les souris utilisées pour les croisements.

Remplacement

Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.

Réduction

Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permettre de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de plusieurs animaux afin d'éviter tout stress produit par un isolement social, dans un environnement avec matériel pour faire un nid. L’état de sante des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroule dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une solution de serum physiologique. Des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués aux mains de l'expérimentateur afin de réduire leur stress par leur manipulation.

Choix des espèces

Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les experiences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 5 semaines et 6 mois car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées entre un et quatre mois après la greffe, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant jusqu'à 17 fois sous anesthésie. Rasées et greffées sous la peau du flanc de cellules de mélanome de souris, elles reçoivent sans anesthésie deux injections d'anticorps qui bloquent leurs lymphocytes T régulateurs, puis sont opérées au douzième jour pour retirer la greffe et la peau qui la recouvre, afin de déclencher une dépigmentation de type vitiligo. Le porteur additionne ces actes en "68 minutes" par souris. Il annonce aussi 640 souris numérotées par amputation de phalanges et génotypées, et écrit que le protocole s'appliquera à "un maximum de 640 souris", pour 400 déclarées.

Objectifs

Les cytokines sont des petites protéines ayant un rôle essentiel dans la régulation du système immunitaire, lors des infections ou lors de maladies auto-immunes. L'équipe est reconnue pour avoir étudié le rôle d'une cytokine produite par les cellules de l'épiderme dans différentes maladies inflammatoires de la peau. Le vitiligo est une maladie auto-immune, caractérisée par l’apparition de taches blanches sur la peau. La prévalence de cette maladie est estimée à 1 % de la population mondiale et il n'existe actuellement aucun traitement pour la guérir. En effet, le vitiligo est une maladie complexe faisant intervenir de nombreux facteurs combinés : prédisposition génétique, stress, frottements. Avec une diminution de cette cytokine dans la peau chez le patient humain, il nous parait important d’étudier la fonction des voies de signalisation de cette cytokine dans la pathogenèse du vitiligo. En utilisant des modèles, nous pourrons développer de nouvelles thérapies. Le projet utilisera les souris initialement développées dans notre laboratoire où sont inactivées les gènes de la cytokine et d’un acteur de sa voie de signalisation dans un modèle d’induction du vitiligo décrit récemment dans les publications. Ce modèle est médié par une réaction auto-immune qui induit une dépigmentation de la peau. On greffe sous la peau des cellules d'une lignée cellulaire de mélanocytes générée à partir d’un mélanome de souris, qui vont induire une réponse immune par la production de lymphocytes T tueurs. Ceux-ci étant réprimés par des lymphocytes T régulateurs (Treg) qui seront bloqués par deux injections d’anticorps neutralisants, ces cellules T tueuses pourront provoquer une réaction auto-immune dirigée contre les cellules de la peau pigmentaires entrainant la décoloration : le vitiligo. Au bout de 12 jours, on retire les cellules greffées et la peau au-dessus de cette greffe. Au bout de 1 mois, on arrive à voir les modifications des populations de lymphocytes T. Au bout de 2 mois, on peut voir la dépigmentation se mettre en place. Entre un mois et 4 mois, nous euthanasierons les souris et effectuerons les prélèvements pour analyser le développement de cette maladie et son impact sur le système immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes biologiques mis en place lors du développement du vitiligo, d’expliciter le rôle de la cytokine étudiée et de sa voie de signalisation et de proposer de nouvelles thérapies à cette maladie auto-immune très invalidante.

Procédures

640 souris seront numérotées par phalangesctomie et génotypées. 400 souris seront anesthésiées, puis rasées et injectées en sous-cutanée sur un des flancs, avec des cellules de mélanome (durée : 6min). Au jour 4 et 10 post-greffe, ces souris vont être pesées puis injectées sans anesthésie en intrapéritonéale par des anticorps neutralisants (durée : 1min). 3 fois par semaine (lundi, mercredi et vendredi), les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement de la greffe (durée 5x3min). Au jour 12, elles vont subir une opération sous anesthésie générale pour réséquer la greffe (durée = 15min). Puis, 2 fois par semaine, les souris vont être anesthésiées par voie gazeuse légère pour pouvoir les peser, mesurer et photographier le développement du vitiligo autour de la cicatrice et sur la queue (durée 6x 3min). Entre 1 et 4 mois, le suivi sera uniquement visuel, sans anesthésie. Après 3 mois, selon le développement des taches blanches, des photos seront prises sous anesthésie gazeuse (durée = 4x3min). La durée totale de la procédure par souris est de 68 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une masse cellulaire localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites, ni de gène dans les mouvements des animaux. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. La résection de la greffe se fera sous anesthésie générale profonde. Tous les animaux seront surveillés et traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour effectuer les prélèvements qui seront analysés.

Remplacement

Les cibles (cytokines, récepteurs et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. L'étude de la réponse immunitaires met en jeu plusieurs organes et réseaux complexes impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre le type d’interaction et les différentes voies de signalisation impliquées dans ces réponses immunitaires ainsi que le processus de pathogenèse du vitiligo.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 640 souris. Elles seront utilisées afin de caractériser le rôle de la cytokine étudiée ainsi que des acteurs de sa voie de signalisation dans la pathogenèse du vitiligo. Nous réaliserons une expérience pilote avec un nombre limité d’animaux sauvages pour mettre en place et valider le protocole expérimental publié récemment et déterminer le meilleur moment pour faire nos analyses. Les groupes comporteront 40 souris pour avoir un effectif minimal de 24 (60% à 80% des souris traitées développent un vitiligo d’après la publication) pour obtenir, au meilleur moment choisi lors de l’étude pilote, des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquences des Treg et des autres populations de lymphocytes T). Nous allons tout d'abord étudier 2 lignées de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite les lignées de souris dans laquelle les gènes étudiés sont absents dans un type cellulaire donné (les cellules dendritiques).

Raffinement

Les souris seront maintenues en groupe pour préserver les interactions sociales. La prise de photos et le suivi nécessitent une anesthésie gazeuse légère de courte durée. Les souris seront remises dans leur cage avec une courte exposition à la lampe chauffante. En plus de la surveillance journalière, le suivi de la croissance de la greffe (pesée, photos, mesure de la taille) sera réalisé 3 fois par semaine (lundi, mercredi, vendredi). La chirurgie se fera sous anesthésie totale et sous antalgique, par des personnes ayant suivies la formation correspondante. La chirurgie, les médicaments utilisés et leurs doses seront validés par notre vétérinaire. Les observations faites lors des suivis permettront de situer l'état des animaux dans l'arbre décisionnel et d'appliquer ces points limites. L’arbre décisionnel mis en place pour ce projet tient compte de l’apparence physique ("Grimace Scaling"), du comportement (observation de la continuité des activités comportementales normales des animaux), de l’absence de signes d’infection aux lieux de piqures ou de traitements, du développement de la greffe qui ne doivent pas être invalidantes pour nos animaux. Ces critères sont assortis de points limites ou points d’arrêt, définis pour éviter des douleurs entrainant un changement dans les comportements des animaux et des blessures qui impactent nos résultats : prostration, taille maximale de la greffe, signe d’infection au point d’injection, nécrose, saignement.

Choix des espèces

La réponse immunitaire dans le contexte du vitiligo met en jeu différents organes comme la peau, les ganglions lymphatiques, le thymus, rendant nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre cette réponse.

8 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent jusqu'à trois injections de virus ou de vésicules extracellulaires, la moitié une greffe de cellules tumorales, une partie des injections répétées d'immunothérapie sur trente et un jours, avec prélèvements de sang, pour caractériser la réponse immunitaire à ces candidats médicaments anticancéreux. Le porteur indique que les souris greffées peuvent voir leur état s'altérer (prostration, amaigrissement) et que les injections répétées sont source de stress. Il affirme qu'aucune alternative non animale n'existe pour étudier ces processus complexes, sans détailler de test comportemental au-delà du suivi clinique.

Objectifs

Le cancer est la deuxième cause de décès dans les pays développés après les maladies cardiovasculaires. Les traitements conventionnels de nombreux cancers tels que la radiothérapie, la chimiothérapie et la chirurgie ont démontré des limites d’efficacité nécessitant un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Les virus ou les vésicules extracellulaires (EV) libérées par des cellules infectées par un virus sont une nouvelle classe d’agent thérapeutique pouvant être une alternative au traitement des cancers. Les virus candidats vont servir de vecteurs pour permettre l’expression d’agents thérapeutiques et bioactifs au sein des tumeurs pour lesquelles il y a un fort besoin médical en clinique humaine. Sachant que le développement clinique de ces virus prévoit de les combiner avec de l’immunothérapie afin de potentialiser l’activité anti-tumorale, le projet se propose d’explorer dans les modèles murins les combinaisons de ces virus (ou EV) avec des traitements d’immunothérapie pour le traitement de cancers de différentes origines. Le but de ce projet sera d’évaluer l’effet sur le système immunitaire des virus candidats-médicaments en association ou non avec de l’immunothérapie. Ce projet vise à déterminer la production et l‘efficacité du médicament apporté par les vecteurs viraux et mettre en évidence la qualité de la réponse immunitaire suite à l’injection d’un virus ou EV en combinaison ou non avec un produit d’immunothérapie. Les données générées nous permettront d’améliorer notre compréhension des mécanismes d’action dans un organisme complexe et d’envisager le développement de ce candidat en déterminant sa chronologie d’action et son efficacité.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à caractériser la réponse immunitaire suite à l’injection de virus recombinants ou de vésicules extracellulaires de cellules infectées en combinaison ou non avec des produits d’immunothérapie. Il s’agit de mieux comprendre l’impact de l’injection de vecteurs viraux sur le type de cellules immunitaires recrutées dans l’organisme et le microenvironnement tumoral. Cette connaissance devrait nous permettre de mettre en place de nouvelles thérapies anti-cancéreuses chez l’Homme.

Procédures

Toutes les souris recevront au maximum 3 injections de virus. Chaque injection sera réalisée sur souris vigile mais geste rapide de l’ordre de la minute. Les injections seront séparées de 2 jours ou 8 jours maximum selon le virus ou EV candidat. La moitié des souris recevra une greffe de cellules qui sera effectuée sur souris vigile, durée environ 1 minute. 3840 souris recevront des injections de produits d’immunothérapie qui seront réalisées sur souris vigile, durée des injections environ 1 minute, maximum 3 injections par semaine durant 31 jours maximum. Sur toutes ces souris, lorsque cela sera nécessaire, il sera possible de prélever du sang. Trois prélèvements maximum sont envisagés à raison de 1 prélèvement maximum par semaine. Cette intervention sera de courte durée de l’ordre de la minute. Elle se fera sur souris anesthésiées ou vigiles.

Impact sur les animaux

Il n’est pas attendu d’observer de nuisances chez la souris naïve injectée avec des virus ou EV car ceux-ci n’ont pas donné de signes de toxicité dans les études antérieures. Les souris greffées avec des cellules tumorales en sous-cutanée pourront potentiellement voir leur état général s’altérer avec des signes cliniques d’affaiblissement (prostration, poils hirsutes, amaigrissement…) Les injections répétées chez la souris peuvent également être source de stress et d’angoisse mais tout est mis en œuvre pour limiter cette nuisance (gestes rapides inférieurs ou égaux à 1minute par du personnel formé, utilisation tunnel de change, …). Le prélèvement de sang peut générer un stress et de la douleur mais le geste sera de courte durée (environ 1 minute) et le stress que transitoire. Une anesthésie pourra être réalisée. On ne peut pas exclure un effet secondaire des produits d’immunothérapie seuls ou en combinaison avec nos virus ou EVs. Si c’est le cas on peut s’attendre à une perte de poids transitoire ou un effet sur le comportement mais les doses seront choisies en fonction des données pharmacologiques publiées ou obtenues antérieurement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes (organes lymphoides et tumeur s'il y a lieu).

Remplacement

L’étude de l’effet thérapeutique de candidats médicaments sur des processus complexes tels que l’oncologie et le système immunitaire ne peut se faire sans l’utilisation de modèles animaux. En effet, des mécanismes complexes sont mis en place dans la réponse immunitaire et la croissance tumorale. Aucune alternative non animale n’est encore connue à ce jour permettant le remplacement.

Réduction

Avant d’être testés chez l’animal, les virus-candidats médicaments auront été évalués in vitro sur des modèles cellulaires de tumeurs humaines et murines établies et caractérisées, ainsi que dans des cellules primaires (non tumorales) pour sélectionner les virus candidats médicaments ayant une activité antitumorale et ne présentant pas de cytotoxicité. Le nombre d’animaux nécessaire à la réalisation des expériences a été déterminé en se basant sur les résultats obtenus lors de nos expériences antérieures. Nous avons retenu et validé le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats fiables et robustes. Les virus (ou EV) qui ne devraient pas avoir une activité suffisante et concluante ne seront pas testés ultérieurement. Leur étude sera stoppée.

Raffinement

Tout au long de leur vie, une attention particulière est portée au bien-être des animaux en particulier par un enrichissement de leur milieu de vie (matériel de nidification : bâtonnet et carré de coton dans chaque cage) qui leur permet d’assouvir les comportements liés à leur espèce. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux pendant toute la durée des expérimentations, dans le but de préserver les interactions sociales entre congénères. A la réception des souris une phase d’acclimatation de 15 jours est prévue. Durant la première semaine les souris seront laissées dans leur nouvel environnement afin qu’elles se familiarisent avec celui-ci. Puis, au bout de 8 jours, l’expérimentateur habituera l’animal à la contention et aux gestes utilisés. L’utilisation d’un tunnel de change permettra également de réduire le stress et l’angoisse chez l’animal. La réalisation par des techniciens rompus à ses manipulations garantissent la bonne reproductibilité des expériences et un suivi optimal du bien-être des animaux. Les effets dus au traitement seront surveillés et des critères d’interruption de l’expérimentation en fonction de l’aspect clinique des animaux (volume tumoral, l’apparence de la tumeur, l’évolution pondérale, l’apparence physique générale, le comportement) sont mis en place afin de limiter le stress et la souffrance des animaux. Enfin, lorsqu’un prélèvement de sang sera envisagé, le recours à l’anesthésie pourra supprimer la douleur et l’angoisse sera réduite grâce à des gestes rapides et maitrisés.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence en oncologie. Il s’agit de mammifères au système immunitaire assez proche de l’homme pour pouvoir utiliser des données générées dans une approche translationnelle valide. Il existe de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires chez cette espèce. Animaux adultes de 4 à 5 semaines minimum (à la réception), soit 6 semaines minimum au début de l’étude (avec 2 semaines de stabulation). Six semaines est l’âge où le système immunitaire est considéré comme suffisamment mature pour la réalisation de l’étude

324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur humaine sous la peau, puis des injections intrapéritonéales deux fois par semaine pendant quatre semaines, pour évaluer l'activité antitumorale d'anticorps polyclonaux. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer une douleur si elle nécrose ou s'ulcère, et prévoit des points limites et une mise à mort en cas de signes cliniques. Il affirme que les études sur l'animal restent "indispensables" pour valider l'activité des traitements dans un environnement physiologique, malgré des tests in vitro disponibles.

Objectifs

L’immunothérapie antitumorale utilise les acteurs du système immunitaire pour s’attaquer aux cellules cancéreuses. L’objectif de ce projet est d’évaluer l'activité antitumorale d'anticorps polyclonaux dans des modèles murins de cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de confirmer l’activité antitumorale des anticorps polyclonaux et d’offrir une alternative thérapeutique aux patients dans des pathologies où le besoin médical est important.

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie. Le traitement sera effectué par injection en intrapéritonéal (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :moins de 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéal, la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Ils peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal. Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. L’état clinique et le poids des souris seront suivis 3 fois par semaine. Une contention légère sera faite sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne dureront que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères.

Devenir

Après chaque expérimentation, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Si des tests in vitro sont utilisés pour évaluer l'activité des nouvelles thérapies, les études chez l'animal restent indispensables pour valider leur activité dans un environnement physiologique. Ces études permettent aussi de repérer une éventuelle toxicité des traitements et éclairent sur les modes d'action engagés.

Réduction

Le choix de 12 animaux par groupe est le nombre nécessaire et suffisant pour nous permettre de faire des analyses statistiques robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon la règlementation en vigueur avec des enrichissements afin de réduire l’angoisse, éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Des signes cliniques et points limites ont été définis afin de monitorer objectivement la soufrance des animaux. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux ou par injection d’analgésique selon les signes cliniques observés. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des frisottis sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher.

Choix des espèces

Les modèles xénogreffes décrits dans ce projet ont été validés et caractérisés dans des publications. Les animaux utilisés sont des souris immunodéficientes. Ces souris sont très largement utilisées pour la mise en place des modèles xénogreffes. Nous travaillerons avec des souris femelles (le sexe des animaux n'a pas d'impact sur les résultats mais les souris femelles étant plus légères elles permettent d'utiliser moins d'anticorps) jeunes adultes (la prise tumorale est plus homogène dans cette tranche d’âge).

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer du sein triple négatif humain, puis une injection de nanoparticules dans la tumeur suivie de séances d'irradiation aux rayons X sous anesthésie, réparties entre deux établissements, pour tester l'efficacité de cette combinaison. Le porteur indique une gêne à la mobilité et une nécrose tumorale possibles, ainsi qu'un stress lié aux contentions répétées. Il affirme que "la règle de remplacement ne peut être appliquée" et que le développement doit "impérativement" se faire chez l'animal, une présélection in vitro étant toutefois prévue.

Objectifs

Le cancer du sein est le plus fréquent des cancers chez la femme et le cancer du sein triple négatif parmi les plus agressifs, avec souvent des échecs aux thérapeutiques classiques du cancer. Le pronostic de ce type de cancer est mauvais et la recherche continue activement pour trouver des nouvelles thérapeutiques. Chez ces patientes, il est important de disposer de médicaments améliorant la survie et leur qualité de vie. Une thérapeutique innovante d’irradiation sélective à basse dose grâce aux rayons X a vu le jour. Elle permet de déclencher un processus de mort cellulaire en cascade grâce à des nanoparticules. Les nanoparticules sont spécifiquement conçues pour agir à la fois comme produit de contraste et agent thérapeutique. Un modèle animal murin pour le cancer du sein triple négatif sera utilisé afin d’investiguer 2 nanoparticules innovantes, pour évaluer l'efficacité thérapeutique après irradiation. Le projet est mené entre 2 établissements utilisateurs .Une injection intra tumorale de la nanoparticule sera réalisée dans des conditions de concentration du produit et de dose d’irradiation restreints, suite de précédentes études. Le développement et l’optimisation doit impérativement se faire chez l’animal pour pouvoir assurer la translation des résultats à terme chez l’être humain. La règle de remplacement ne peut être appliquée.

Bénéfices attendus

Chez les patientes atteintes d’un cancer du sein triple négatif , plusieurs stratégies de traitement existent telles que la chirurgie, la chimiothérapie, la radiothérapie et l'immunothérapie, mais les résultats sont souvent insuffisants. Au stade localement avancé ou métastatique, le besoin médical, en première ligne (chez les patientes n’ayant pas précédemment reçu de chimiothérapie en situation métastatique), est actuellement mal couvert par les alternatives disponibles. De plus, même si dans certains cas la survie à cinq ans après traitement peut être encourageante, les conditions de vie des patientes se dégradent du fait des effets secondaires des thérapies. De nouveaux traitements spécifiques, moins toxiques, plus puissants et surtout des approches thérapeutiques combinatoires constituées de différentes modalités et donc complémentaires les unes des autres représentent une approche extrêmement prometteuse pour améliorer la survie et la qualité de vie des patients atteints de cancer. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité thérapeutique de cette nouvelle thérapie et de prouver que l'approche combinatoire offre un bénéfice maximal avec un profil de toxicité acceptable pour les animaux, ce qui justifierait les bases d'études cliniques chez l’homme. A court terme, une efficacité antitumorale démontrée au stade pré clinique dans cette méthode de traitement innovante, permettrait éventuellement d’envisager de futurs essais chez l’homme.

Procédures

EU 1 Anesthésie locale (1x, 30sec): identification des souris _Contention 3x/semaine 25sec- mesure de la taille/pied à coulisse EU 1 et 2 _ EU 2Injection intratumorale sous cutanée 1x 100µL 30sec_Procedure 1 : Injection intratumorale de nanoparticule (1injection, 30sec)_Irradiation : 1x/sem ou 4x/sem_ Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j._Procedure 2 : selon précédents résultats, choix schéma irradiation et nanoparticule (en 1x /sem ou en 4x/sem) en variant dose et concentration._Anesthésie générale selon schéma expérimental d'irradiation: soit 1 anesthesie/jour soit 4anesthesies/4j.

Impact sur les animaux

Dans de très rares cas, un phénomène de gêne à la mobilité peut être observé après injection des cellules cancéreuses. Dans de rares cas, une nécrose de la tumeur peut apparaitre . Douleur lors de l'injection intratumorale du traitement ( douleur inférieure à celle procurée par un traitement anesthésique + contention) . Les contentions multiples (lors des mesures au pied à coulisse, des anesthésies, des pesées) de l’animal peuvent générer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, car les tumeurs seront prélevées pour des analyses histologiques.

Remplacement

Une présélection des nanoparticules sera effectuée grâce à des expériences in vitro pour exclure les combinaisons de traitement inefficaces et éviter ainsi des expériences animales inutiles. Pour confirmer l'efficacité in vivo et assurer la possible translation chez l'humain à terme, le modèle murin est nécessaire car les expériences in vitro ne peuvent pas reproduire entièrement le l'environnement complexe de la tumeur

Réduction

La conception des expériences et les procédures par étapes conditionnelles permettent de réduire le nombre d'animaux calculés à l'aide d'un test statistique . De plus, nous testons uniquement 2 nanoparticules sur 4 intialement produites ; ce choix a été basé sur l’ensemble des résultats obtenus par nos précédentes expériences in vitro et celles de nos collaborateurs

Raffinement

Une anesthésie locale est prévue pour l’identification des souris. Une anesthésie générale est prévue lors des sessions d'irradiation avec l’imagerie. De la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. Les animaux seront hébergés par groupe de 5. Une période d’acclimatation d’une semaine sera respectée avant l’entrée des animaux en protocole . Surveillance des points limites, et des souffrances possibles, via une grille de scoring établie avec la SBEA. Mesures de raffinement prévues pour le transfert entre les EU ( 5 maximum par cage pour le transport, trajet court,alimentation, abreuvement, aération des cages)

Choix des espèces

Le modèlede cancer du sein triple négatif par greffe de lignées cellulaires humaines de sein immortalisées est un des modèle le plus utilisé pour les études visant à étudier l’efficacité des thérapeutiques anticancéreuses. Les souris immunodéprimées permettent de greffer des tumeurs humaines, ce qui permet de tester la réponse des tumeurs d'origine humaine. Les greffes de tumeurs humaines représentent des modèles cliniquement pertinents de cancer humain, qui simulent de nombreuses caractéristiques du cancer, notamment un microenvironnement tumoral distinct avec des structures vasculaires mal organisées et des régions de cellules hypoxiques, ce qui affecte négativement la sensibilité des cellules cancéreuses aux radiations. Greffe chez des athymic nude femelles à l’âge de 6-7 semaines, ce stade permet d’optimiser la prise de la greffe

120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, on leur pratique deux incisions dorsales pour insérer des membranes synthétiques sous la peau, seules ou avec des cellules, afin d'évaluer si ces implants favorisent la croissance de vaisseaux sanguins en vue d'une future greffe rétinienne. Le porteur indique des douleurs possibles après incision et un risque d'infection ou d'inflammation au site d'implantation. Il décrit des travaux préalables in vitro et affirme qu'aucun système ex vivo n'intègre les phénomènes de vascularisation d'un greffon, rendant les expériences in vivo "nécessaires".

Objectifs

La barrière hémato-rétinienne externe (BHRE) est la barrière la plus externe de l'oeil, protégeant ce dernier, notamment des infections. Dans de nombreuses pathologies de la rétine, comme la dégénérescence maculaire ou rétinopathie diabétique, la BHRE est endommagée conduisant à une perte irrémédiable des cellules la constituant, menant à terme à une perte de la vision. Plusieurs thérapies ont été envisagées, notamment une thérapie cellulaire visant à implanter de nouvelles cellules rétiniennes saines afin de reconstituer le tissu malade. Cependant, ces stratégies n'incluaient pas, au sein de l'implant, de pré-vascularisation. Cette dernière consiste en la formation in vitro de portions de vaisseaux sanguins, au sein d'un implant, qui peuvent ensuite être reliées par le corps humain pour former des vaisseaux fonctionnels. Des études ont récemment montré que la pré-vascularisation est nécessaire pour une bonne intégration et une bonne irrigation sanguine du greffon ainsi qu'à une survie optimale des cellules implantées. L'objectif global de notre projet est donc de proposer un nouveau greffon incluant à la fois les cellules rétiniennes et une pré-vascularisation. Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des membranes en polysaccharides qui sont des molécules naturelles organisées en de longues chaînes constituées à partir de différents types de sucres. L'objectif de cette étude in vivo est d'analyser si ces membranes sont propices à la croissance de vaisseaux sanguins dans le greffon pour garantir son irrigation et si la présence d'une pré-vascularisation des membranes grâce à l'ajout de cellules du système vasculaire permet une meilleure et plus rapide vascularisation de l'implant.

Bénéfices attendus

A travers ce projet, une nouvelle stratégie de thérapie cellulaire pourra être évaluée, en analysant le bénéfice de la pré-vascularisation de l'implant sur l'intégration du greffon chez l'hôte. Cette étude permettra d'évaluer la condition de pré-vascularisation optimale afin de conduire plus tard des implantations dans la rétine. A long terme, ce projet pourra permettre de proposer une nouvelle stratégie de thérapie cellulaire pour de nombreuses rétinopathies aujourd'hui sans traitement efficace.

Procédures

Les animaux seront soumis à une unique procédure menée sous anesthésie générale avec administration d'anti-douleur. Elle consiste à deux incisions cutanées au niveau dorsal, de chaque côté du dos, afin de créer deux poches sous-cutanées dans lesquelles seront placées les implants. Selon les conditions, les implants seront implantés seuls ou en présence de cellules. La procédure dure environ 10 minutes par animal (5-6 minutes pour l'épilation et 3-4 min pour l'implantation).

Impact sur les animaux

L'anésthésie réalisée pour les implantations sera faire par injection, pouvant induire un stress pour l'animal ainsi qu'une douleur au moment de la piqûre. Des douleurs peuvent être ressenties suite à l'incision et à l'implantation du greffon. De plus, même si les implants sont stérilisés puis conservés en milieu stérile et que les souris ont de bonnes capacités de cicatrisation de la peau, une infection pourrait être possible au niveau de l'incision. Enfin, une réaction inflammatoire est possible au niveau de l'incision au cours de la phase de cicatrisation, ainsi qu'au sein de l'implant, en réaction à l'implantation des cellules endothéliales et des péricytes.

Devenir

Pour les analyses prévues, nous avons donc besoin d'euthanasier les animaux à la fin de l'expérience. L'euthanasie sera effectué après anesthésie de l'animal. Le greffon sera alors explanté avec le tissu avoisinant (peau au-dessus et autour de l'implant).

Remplacement

Des études préliminaires in vitro ont été menées afin de montrer la possibilité de céllulariser les membranes. De plus, la cytotoxicité de la membrane a été évaluée in vitro et les résultats ont montré que les cellules ensemencées survivent durant plusieurs semaines sur les membranes. Afin d'évaluer la capacité de vascularisation de ces membranes, il n'existe cependant pas de système ex vivo permettant d'intégrer l'ensemble des phénomènes complexes à l'oeuvre dans les processus de vascularisation d'un greffon. Des expériences in vivo sont donc nécessaires.

Réduction

Des études in vitro ont permis d'optimiser la composition et la structure de la membrane ainsi que les protocoles utilisés afin d'ajouter les cellules dans la membrane afin de limiter le nombre de groupes à étudier chez l'animal, et donc de limiter le nombre d'animaux à utiliser. De plus, dans chaque animal, deux membranes seront implantées, de part et d'autre de la ligne médiane dorsale, afin de limiter le nombre d'animaux. En prenant en compte cet élément, le nombre minimum d’animaux à utiliser a été déterminé d’après le logiciel Invivostat: un nombre de 12 échantillons et donc de 6 animaux par groupe et par temps d'analyse est nécessaire pour assurer des résultats statistiquement pertinents.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d'un hébergement avec environnement enrichi et en groupe social, et seront surveillés quotidiennement par le personnel technique pour vérifier leur état de bien-être, avant et après la procédure. Pour réaliser la procédure, l'anesthésie se fera avec analgésie (buprénorphine) pour réduire la douleur durant la procédure et en post-opératoire. Après la procédure, les animaux seront surveillés tous les deux jours au cours des deux premières semaines par du personnel compétent grâce à une grille d'évaluation et la mise en place de points limites afin de surveiller la présence de potentiels effets secondaires potentiels de la procédure et de réduire les douleurs éventuelles.

Choix des espèces

Nous souhaitons conduire des implantations en sous-cutané chez la souris, modèle sélectionné grâce à l'importante vascularisation de la peau et aux bonnes capacités de re-cellularisation en sous-cutané, d'après des études reportées dans la littérature. De plus, nous souhaitons utiliser des souris immunodéficientes, c'est à dire qui possèdent un système immunitaire déficient, voire une absence de système immunitaire, afin de limiter la réaction inflammatoire après implantation. Nous utiliserons des souris adultes (environ 8 semaines) afin de maximiser les capacités de vascularisation.

410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies du crâne pour injection de virus et implantation d'électrodes, jusqu'à quatre heures, puis des enregistrements et tests comportementaux sur l'animal vigile, avec une restriction alimentaire maintenant la faim pendant dix à vingt jours et une perte de poids jusqu'à 15 %, pour étudier le rôle du cervelet dans l'autisme. Le porteur reconnaît que les chirurgies provoquent une douleur de 24 à 48 heures et que l'isolement postopératoire génère un stress, jugés "indispensables" pour cibler des sous-régions cérébrales. Il affirme que les études in vitro et sur invertébrés ne permettent pas d'étudier ces comportements complexes.

Objectifs

Le syndrome de Phelan McDermid (PMS), qui est dû à une mutation génétique du gène Shank3, provoque des déficits moteurs, des troubles du spectre autistiques (TSA) et des déficiences intellectuelles. Ce gène est fortement exprimé dans plusieurs régions du cerveau et chaque région touchée pourrait donc contribuer à un sous-ensemble des déficits exprimés par les patients. Notre projet a pour objectif de caractériser en détail la contribution spécifique du cervelet à ce trouble neuro-developpemental.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à comprendre l'implication du cervelet dans l'expression de certains troubles comportementaux associés au syndrome de Phelan Mc Dermid. Il contribuera ainsi non seulement à mieux cibler les causes des troubles neurodeveloppementaux associés à une dysfonction du cervelet mais apportera plus largement des pistes sur de nouveaux mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux troubles du spectre autistique.

Procédures

Un groupe de 6 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 20 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h), euthanasie par mode réglementaire. Un groupe de 288 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 20 j max) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 96 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 20 j max) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 24 animaux suivra l'étape suivante : test comportemental.

Impact sur les animaux

Les procédures de chirurgie (injection de virus et implantation d'éléctrodes) peuvent être à l'origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seule une chirurgie stéréotaxique permet de cibler spécifiquement des sous régions cérébrales (placement d’électrodes et injection locale de virus). L'isolement post-chrirugie (après la pose d'implant) ainsi que certaines tâches comportementales mesurant l'anxiété pourront entraîner une sensation de stress pour l'animal. Enfin certaines tâches comportementales reposent sur la motivation de l'animal à chercher des récompenses alimentaires et nécéssitent donc que les animaux ressentent de la faim. Une restriction aimentaire est donc maintenue pendant 10 à 20 jours maximum et la perte de poids est limitée à 15 pour cent du poids initial.

Devenir

Le prélèvement et l’analyse des cerveaux post-mortem sont indispensables à la validation des procédures d'injection virale et d'implantation d'électrodes. Cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par différentes méthodes réglementaires en fonction des analyses nécessaires.

Remplacement

La modélisation permet d’apporter des informations sur le fonctionnement et les opérations faites par le cerveau mais nécessite les données cellulaires et comportementales. La modélisation ne nous permet pas d’étudier le rôle précis de notre gène d'intérêt dans les différentes sous régions du cervelet impliquées dans la cognition et les troubles du spectre autisitque. Les etudes in vitro et les animaux invertebres ne permettent pas l'etude des comportements complexes ; la souris est donc l'espece la plus appropriee pour ce type d'etudes.

Réduction

En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux et des analyses statistiques similaires, nous estimons le nombre de souris par groupe à 12 souris pour les études comportementales et 5 souris pour les analyses moléculaires. La taille des effectifs nécessaires par groupe a également été confirmé par un calcul de puissance et des tests stattistiques seront réalisés afin d'avoir une interprétation stable des résultats. Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble du projet, 434 souris seront nécessaires.

Raffinement

Les souris provenant d'un fournisseur extérieur ont un temps d'adaptation à la pièce d'hébergement de 5-7 jours. Afin de réduire au maximum le stress, les animaux sont habitués à être manipulés 5min par jour par l’expérimentateur avant le début du protocole expérimental. Les animaux sont placés dans des cages en communauté de 2 à 5. Lorsque la procédure nécessite l’isolement des animaux, du nid végétal et un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. . Des points limites sont mis en place afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux. Ils seront suivis quotidiennement par les mêmes manipulateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être. Pendant les chirurgies, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques.

Choix des espèces

Le modèle murin est idéal pour répondre à notre question scientifique. En effet, il existe un grand nombre de lignées de souris transgéniques que nous pourrions utiliser dans le cadre de notre projet d’étude du rôle du cervelet dans les troubles du spectre autistique. L’utilisation de modèles murins transgénique permettra de déléter spécifiquement un gène d'intérét dans les cellules granulaire de tout le cervelet ou dans les cellules granulaires de lobules spécifiques du cervelet. De plus, la souris est un animal explorateur pour lequel de très nombreux tests de comportement ont été développés. le projet utilisera des souris adultes âgées de 2 à 6 mois nous permettant d’étudier le comportement et la physiologique sur un cerveau stable d'un point de vue développemental (2 mois). Nous arrêterons les tests avant l'effet du vieillissement cérébral (6 mois).

958 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le modèle reproduit une ataxie héréditaire, les souris atteintes développant atrophie musculaire, troubles de la coordination et perte de poids avant une mort prématurée, aucun animal n'étant conservé au-delà de vingt-huit semaines. Elles subissent un prélèvement de queue pour génotypage, une injection intraveineuse d'un vecteur de thérapie génique sous anesthésie, parfois un prélèvement de sang, et huit tests comportementaux étalés sur dix jours, pour évaluer une protéine mitochondriale censée protéger les neurones. Le porteur renvoie l'application clinique à d'éventuelles études futures et affirme que la preuve d'efficacité "ne peut être obtenue" que chez des animaux malades.

Objectifs

Malgré les progrès de la génétique durant les dernières décennies, les maladies neurologiques héréditaires sont le plus souvent incurables. Il a été démontré que la progression des symptômes chez les patients est fréquemment associée à un déficit de la production d’énergie cellulaire. Dans les cellules, les structures responsables de la production de cette énergie sont les mitochondries ; elles sont considérées comme des centrales énergétiques et elles régulent des processus essentiels à la vie cellulaire, spécialement pour les neurones. En conséquence, nous avons émis l’hypothèse que préserver la fonction des mitochondries dans le système nerveux central chez des patients souffrant de pathologies neurologiques héréditaires serait une piste thérapeutique prometteuse pour aider les cellules nerveuses débilitées par la maladie. Une thérapie génique conduisant à la production abondante d’une protéine mitochondriale qui possède des propriétés intéressantes pour le fonctionnement neuronal est en cours de développement. Pour y parvenir, un vecteur comportant le gène correspondant à la protéine « candidate » a été injecté par voie intraveineuse chez des souris souffrant d’une maladie mitochondriale qui entraîne des troubles de l'équilibre, la coordination et la mémoire spatiale. Il a été montré des effets bénéfiques et durables de cette intervention sur les atteintes motrices et cognitives de ces souris. Encouragés par ces données, une thérapie génique avec cette protéine « candidate » sera testée dans un autre modèle de pathologie neurologique qui est également associé à un déficit de la production d’énergie, mais dont la cause génétique initiale ne concerne pas des gènes mitochondriaux. L’objectif sera de démontrer qu’en augmentant la quantité de cette protéine dans le système nerveux central, l’état de santé général de ces animaux sera préservé grâce à la diminution de leurs troubles moteurs et cognitifs. Si nous observons des bénéfices liés à la forte concentration de la protéine mitochondriale étudiée dans les neurones du modèle expérimental examiné, nous pourrions élargir les effets thérapeutiques à d’autres pathologies neurologiques héréditaires. In fine, une étude clinique pourrait être développée pour améliorer les conditions de vie des patients souffrant d'un éventail de maladies neurologiques.

Bénéfices attendus

Notre objectif scientifique est de prouver l'intérêt d'une thérapie génique entrainant l’augmentation d’une protéine mitochondriale possédant des propriétés de protection des neurones dans le cadre des maladies neurologiques héréditaires dont les symptômes s'aggravent suite à un déficit mitochondrial mais dont la cause génétique est au-delà des gènes mitochondriaux. Actuellement, les thérapies conçues pour ces patients ciblent l'anomalie génétique et non pas le déficit de la production d’énergie cellulaire ; ce qui ne garantit pas avec certitude une amélioration clinique même partielle. Notre stratégie consistera à réaliser une thérapie génique (traitement par modification d’un gène), à large spectre, permettant l’augmentation pérenne de la concentration d’une protéine à propriétés neuroprotectrices dans le système nerveux central. Cette protéine a déjà montré une efficacité incontestable dans un modèle expérimental dont les souris miment une maladie mitochondriale et souffrent de troubles moteurs et de mémoire. L’abondance accrue de la protéine candidate a permis de préserver l’intégrité des mitochondries et d’améliorer les paramètres physiques et neurologiques de ces souris. Le projet actuel vise à confirmer ces résultats dans un second modèle animal d’une maladie neurodégénérative héréditaire dont la cause génétique n’est pas une mutation liée à la fonction mitochondriale. Ainsi, nous déterminerons si la thérapie génique protègerait effectivement les neurones et la fonction mitochondriale ce qui permettrait une diminution chez ces souris des troubles de la locomotion, de l’équilibre, de la coordination des mouvements et de la mémoire. À terme, les données qui seront récoltées à l’issue du projet, si elles confirmaient le bénéfice pour des souris souffrant des troubles moteurs et cognitifs mais dont la cause génétique ne concerne pas les gènes mitochondriaux encourageront le développement d’études cliniques chez l’Homme pour traiter un large spectre des maladies neurologiques incurables. Ces études viseront à améliorer les conditions de vie de patients pour lesquelles aucune thérapie n’a démontré son efficacité à ce jour.

Procédures

Le modèle expérimental qui sera étudié présente des signes cliniques dommageables de par son altération génétique et ce dès 20 semaines d’âge : diminution du poids corporel, dégénérescence musculaire, déficit de l’apprentissage spatial, insuffisance respiratoire et apparition d’une ataxie (locomotion réduite, démarche anormale et troubles de la coordination). Cette dernière est évidente chez toutes les souris possédant la modification génétique à l’âge de 6 mois. Un petit fragment de l’extrémité de la queue sera prélevé sur les animaux engagés dans le projet âgés entre 7 et 10 jours afin d’identifier le génotype qui permettra de les intégrer dans les différents groupes expérimentaux. Cet acte ne sera réalisé qu’une fois et durera moins de 2 minutes par animal. Le gène médicament que nous testerons sera administré une fois aux souris âgées de 26 ou 28 jours par voie intraveineuse. Cette injection se fera sous anesthésie générale et ne durera au maximum que 5 minutes. Chez certains animaux, un prélèvement de sang sera réalisé 10 semaines après le traitement pour vérifier l’absence du médicament dans le sang périphérique et permettre la sortie des souris traitées de la zone de confinement. Ce prélèvement se fera sous anesthésie gazeuse et durera maximum 5 minutes. Une évaluation des capacités motrices et cognitives sera effectuée chez les souris traitées et certaines souris non traitées à 1, 3 et 6 mois d’âge. Cette évaluation sera composée de huit tests comportementaux pour les souris âgées d’un et 6 mois ou de quatre tests comportementaux pour les souris âgées de 3 mois. La réalisation de huit tests sera étalée sur 10 jours à raison d’un ou deux tests maximum par jour et un repos d’une nuit ou au minimum de 3 heures entre chaque test. Ils seront programmés au mieux pour éviter la fatigue, l’inconfort et le stress chez les souris. L’ensemble des animaux âgés de 6 mois sera euthanasié à la fin des procédures par une méthode règlementaire.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris sur lequel nous travaillerons est un modèle expérimental qui reproduit une pathologie neurologique s’aggravant avec le vieillissement des souris. Les animaux présentent donc dès 8 semaines un retard de croissance qui entraine par la suite une diminution du poids moyen des animaux (20 pourcent de moins qu’une souris saine). À 30 semaines de vie, ces animaux souffriront d’une atrophie musculaire généralisée, d’une locomotion réduite, d’une démarche anormale, des tremblements, des troubles de la coordination et de l’équilibre ainsi que d’une insuffisance de la mémoire spatiale. Enfin, ils décèdent prématurément entre 35 et 45 semaines de vie ; de ce fait nous ne conserverons aucune souris en vie au-delà de l’âge de 28 semaines. Entre 7 et 10 jours de vie, tous les mâles et une partie des femelles se verra prélever un fragment de l’extrémité de leur queue pour déterminer leur génotype (sain ou malade). Une légère et brève douleur pourrait être ressentie par l’animal lors du prélèvement. Les animaux subiront une injection unique par voie intraveineuse et certains de ces animaux subiront aussi un prélèvement de sang. Ces deux gestes seront réalisés sous anesthésie gazeuse et ne dureront que 5 minutes et ils pourraient entrainer, au site d’injection ou de prélèvement, de la douleur, de l’inconfort et plus rarement, une inflammation ou un saignement. En outre, l’anesthésie gazeuse présente des risques associés (arrêt respiratoire, hypothermie). Une évaluation des capacités motrices et cognitives sera effectuée chez les souris traitées et certaines souris non traitées à 1, 3 et 6 mois d’âge. Cette évaluation sera composée de huit tests comportementaux pour les souris âgées d’un et 6 mois ou de quatre tests comportementaux pour les souris âgées de 3 mois. La réalisation de huit tests sera étalée sur 10 jours à raison d’un ou deux tests maximum par jour et un repos d’une nuit ou au minimum de 3 heures entre chaque test. Ils seront programmés au mieux pour éviter la fatigue, l’inconfort et le stress chez les souris. Malgré les précautions prises, la réalisation de ces tests pourrait diminuer le bien-être animal de par leur fréquente manipulation mais aussi de la fatigue générée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet ; ils seront alors âgés de 6 mois. La majorité d’entre eux permettront d’étudier les caractéristiques morphologiques et fonctionnelles des cervelets et des cerveaux grâce aux expériences d’histologie, biochimie et biologie moléculaire. L’autre partie correspond aux animaux reproducteurs qui seront euthanasiés à la fin de leur période d’accouplement (lorsqu’ils seront âgés de 6 mois). De plus, quelques animaux sains correspondent à un surplus de production nécessaire pour l’obtention du bon nombre des souris malades à traiter avec le vecteur médicament. Certains de ces souris pourraient remplacer des souris engagées dans la procédure 2 mais perdues précocement, ou pourraient être testées pour l’optimisation des techniques. Enfin, certaines de ces souris pourraient être cédées à la plateforme pour être utilisées par d’autres équipes ou pour des projets de formation.

Remplacement

La démonstration de l’efficacité biologique de la thérapie génique avec la protéine « médicament » ne peut être obtenue que par une étude exhaustive chez des animaux souffrant d’une pathologie similaire à celle de l’Homme. Cette étude devra combiner des évaluations morphologiques et fonctionnelles des structures cérébrales mais aussi l’évaluation des capacités motrices et cognitives pour déterminer l’efficacité de la thérapie chez les souris traitées qui indiquera que leur système nerveux central fonctionne mieux. Pour compléter les études morphologiques des cultures de neurones ou des tranches de cerveau ou de cervelet pourraient être effectuées. Cependant, les données qui seraient récoltées à partir de ce type d’expériences ex vivo resteront insuffisantes et ne permettront pas d’apporter une preuve de concept suffisamment robuste dans le cadre de cette étude préclinique. En effet, notre objectif final est qu’elle aboutisse au développement et à l’autorisation d’une étude clinique chez des patients atteints des maladies neurodégénératives car des thérapies conduisant à l’amélioration de leur qualité de vie sont très peu nombreuses.

Réduction

Pour ce projet nous allons utiliser au total 958 souris, nous avons réduit au strict minimum le nombre de reproducteurs qui permettront l’obtention du nombre d’animaux nécessaires pour la réalisation de l’étude. Ces nombres ont été rigoureusement définis en fonction de nos expériences précédentes sur un modèle murin de pathologie mitochondriale et grâce à un calcul de puissance du nombre des souris nécessaires. Ainsi, la taille de chaque groupe de souris incluses dans les procédures a été défini pour pouvoir récolter suffisamment de données expérimentales qu’une fois évaluées sur le plan statistique seront significatives et robustes.

Raffinement

Les souris seront hébergées entre 2 et 4 par cage sur des portoirs ventilés, nourries et abreuvées à volonté. Chaque cage comportera un environnement enrichi (maisonnette en plastique ou en cellulose, coton et bâtonnet de bois). Les pièces de l’animalerie sont maintenues à 20-22 degrés avec contrôle de la température et de l’hygrométrie, et un cycle jour-nuit progressif de 12 heures. Les injections intraveineuses de gène médicament seront réalisées sous anesthésie gazeuse. Si une détresse respiratoire est observée pendant celle-ci, la quantité d’anesthésiant sera diminuée pour permettre une meilleure oxygénation des souris. Afin de prévenir toute hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant à 37 degrés pendant la durée de l’intervention. Le site d'injection sera examiné pour s’assurer de l’absence d’un saignement ou un autre traumatisme. Chaque souris sera évaluée pendant les 2 jours qui suivent l’injection pour confirmer l’absence de blessure et d’inflammation ou un autre signe de souffrance dans l’œil injecté ; une grille de notation sera complétée pour chaque souris à la suite des observations. Une évaluation des capacités motrices et cognitives sera effectuée chez les souris traitées et certaines souris non traitées à 1, 3 et 6 mois d’âge. Cette évaluation sera composée de huit tests comportementaux pour les souris âgées d’un et 6 mois ou de quatre tests comportementaux pour les souris âgées de 3 mois. Ils seront programmés au mieux pour éviter la fatigue, l’inconfort et le stress chez les souris. Avant ces séances, les souris devront se familiariser à l’expérimentateur pendant une semaine. Le jour du test, les souris seront installées dans la pièce d’expérimentation 30 minutes avant celui-ci pour minimiser leur stress et assurer la fiabilité des données obtenues. Les huit tests comportementaux seront répartis sur 10 jours afin d’éviter l’anxiété, la fatigue ou le stress des animaux ; l’ordre de la réalisation de tests sera également choisi pour réduire au minimum les nuisances chez les souris testées. Par ailleurs, quotidiennement pendant ces séances et deux fois par semaine le reste du temps, les animaux seront observés et la grille de notation sera complétée de manière détaillée pour chaque souris ; des mesures adaptées seront prises si le bien-être des souris venait à être compromis.

Choix des espèces

Le modèle de souris sur lequel nous allons travailler est particulièrement adapté à notre projet de recherche puisqu’il reproduit fidèlement une maladie neurologique héréditaire chez l’Homme qui est associée au dysfonctionnement des structures cellulaires responsables de la production d’énergie, les mitochondries. Nous travaillerons uniquement sur les mâles car la mutation génétique responsable de la pathologie est moins stable chez les femelles. Toutes les souris engagées dans le projet proviendront de notre propre élevage. Les animaux impliqués dans le maintien de la lignée seront mis en accouplement à l’âge de 2 mois jusqu’à l’âge de 6 mois (début des symptômes chez les mâles reproducteurs). Entre 7 et 10 jours de vie, l’ensemble des animaux se verra prélevé un millimètre de l’extrémité de leur queue pour identifier leur génotype. Celui-ci nous permettra de sélectionner les femelles reproductrices (Wild-type), les mâles sains (Wild-type) et les mâles qui développeront la maladie à 6 mois d’âge. Une proportion de ces derniers servira à la reproduction et l’autre partie sera testée avec le gène médicament. Les souris mâles asymptomatiques et les mâles qui développeront la maladie à partir de 6 mois d’âge seront traitées à l’âge de 26 ou 28 jours afin d’optimiser le bénéfice potentiel de la thérapie génique qui permettrait, si efficace, une protection des neurones. En effet, la maladie débute à 8 semaines d’âge, donc nous interviendrons avec la thérapie génique précocement afin de prévenir la dégénérescence neuronale grâce à la protection de la fonction mitochondriale.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de cancer pulmonaire humain dans le flanc, avec suivi de la tumeur trois fois par semaine pendant quatre-vingt-dix jours, pour tester si un groupe de gènes ralentit la croissance tumorale. Le porteur indique que des métastases peuvent se former dans les poumons et entraîner amaigrissement et difficultés respiratoires, et que les tumeurs volumineuses peuvent gêner les déplacements. Il affirme qu'après des travaux sur cellules en culture il est "nécessaire" de passer à un modèle vivant représentatif de la pathologie humaine.

Objectifs

52 777 nouveaux cas de cancer du poumon ont été estimés en France en 2023, avec un taux de survie à 5 ans pour les personnes diagnostiquées entre 2010 et 2015 qui s’élève à 20 % (Institut National du Cancer). La compréhension de cette pathologie et le développement de nouvelles thérapies représentent ainsi un enjeu majeur de santé publique. Nous avons observé sur des modèles cellulaires dérivés de cancer pulmonaire qu’un groupe de gènes était capable d’induire la mort des cellules cancéreuses. Nous souhaitons donc maintenant implanter ces cellules dans des souris afin de déterminer si nous obtenons les mêmes effets dans un modèle vivant représentatif des différentes situations pathologiques rencontrées chez l’Homme. Nous nous intéresserons à la pousse tumorale de ces cellules avec ou sans induction du groupe de gènes de reprogrammation. Les caractéristiques cellulaires et moléculaires des tumeurs seront ensuite étudiées.

Bénéfices attendus

Confirmer dans un modèle vivant que le groupe de gènes de reprogrammation retarde le développement tumoral nous permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement du cancer.

Procédures

Des cellules tumorales seront greffées dans le flanc des animaux. Cette procédure n’est réalisée qu’une fois par animal et dure une quinzaine de secondes. Cette implantation va engendrer le développement d’une tumeur. Le diamètre de chaque tumeur sera mesuré 3 fois par semaine pendant une durée maximale de 90 jours ou jusqu’à un point limite. Pour permettre ces mesures, les animaux sont maintenus à la main pendant une quinzaine de seconde.

Impact sur les animaux

Les animaux vont recevoir une unique implantation sous-cutanée de cellules tumorales dans le flanc. Cette procédure, bien que très rapide, peut induire du stress à l’animal ainsi qu’une douleur légère. Puisqu’il est attendu que des tumeurs se développent, ces dernières pourraient gêner les animaux dans leurs déplacements. Aussi, si le volume tumoral est important, il est possible que les animaux se blessent, ce qui conduirait à une douleur modérée de l’animal. De plus, des métastases peuvent se former dans les poumons, dégradant ainsi l’état de santé des souris et pourrait engendrer amaigrissement, difficultés à respirer ou troubles moteurs. Enfin, les contentions multiples pour assurer le suivi du volume tumoral peuvent également induire un stress aux animaux.

Devenir

En fin de procédure les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs. Ces dernières seront analysées au laboratoire par diverses techniques histologiques et de biologie moléculaire.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la capacité à former des tumeurs et à étudier la prolifération et la mort cellulaire de lignées cancéreuses induites à reprogrammer. Ces travaux ayant déjà été menés sur des cellules en culture, il est maintenant nécessaire de travailler avec un modèle intégré représentatif du contexte pathologique observé chez l’Homme.

Réduction

i) Analyse de la pousse tumorale et caractérisation histologique des tumeurs Dans notre procédure, les tumeurs seront prélevées en début d’expérimentation dans 10 animaux afin d’effectuer des analyses histologiques. En parallèle, 10 animaux supplémentaires sont requis pour effectuer un suivi du volume des tumeurs. Des analyses statistiques ont montré qu’un effectif de 10 animaux est le nombre minimal requis pour générer des résultats significatifs. ii) Analyse moléculaire En parallèle, nous réaliserons une analyse moléculaire suivant 2 approches dont les données générées seront traitées par bio-informatique. Des analyses statistiques ont montré qu’un effectif de 5 animaux par approche (donc 2x5 =10) est le nombre minimal requis pour générer des résultats significatifs.

Raffinement

Les souris présentant un système immunitaire déficient, elles seront hébergées dans des portoirs ventilés qui les protège de toutes contaminations par l’environnement extérieur. Avant le début de l’expérimentation, les animaux sont laissés une semaine en acclimatation à leur nouvel environnement. Ensuite, une habituation à être manipulés sera effectuée pendant une semaine dans le but de réduire le stress des animaux lorsque l’expérimentateur devra les manipuler dans le cadre des suivis de pousse tumorale. Une fois les implantations réalisées, une surveillance quotidienne des animaux sera effectuée afin de repérer au plus tôt toute douleur ou souffrance éventuelle. L‘implantation des cellules de lignées cancéreuses impliquant le développement tumoral, un suivi de poids des souris ainsi que de volume des tumeurs sera réalisé trois fois par semaine. Des points limites qui auront pour effet l’arrêt de la procédure ont été déterminés. Pour faciliter et uniformiser le suivi des animaux, une grille de calcul des points limites sera utilisée.

Choix des espèces

Les animaux seront âgés de 8 semaines à leur arrivée à l’animalerie. La procédure débutera 2 semaines plus tard, ceux-ci seront donc âgés de 10 semaines, nous permettant de mener nos projets sur un stade jeune adulte. Le stade jeune adulte a l’intérêt de favoriser la pousse tumorale. Les animaux seront greffés avec des cellules cancéreuses d’origine humaine. Afin qu’il n’y ait pas rejet de la greffe, les souris auront un système immunitaire déficient.

2 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une inoculation de bactéries de peau humaine par voie sous-cutanée ou dans une plaie créée au poinçon de 4 mm, avec prélèvements de sang rétro-orbitaires, avant mise à mort par dislocation cervicale au cinquième jour d'infection. Le porteur indique que l'injection peut provoquer des abcès ou une infection systémique "possiblement douloureuses" et surveille la douleur au moyen d'une grille de score. Il affirme qu'un processus impliquant autant de types cellulaires est "impossible à reproduire in vitro" et que l'expérimentation animale est un "élément clé" du projet.

Objectifs

Il existe des maladies génétiques telles que les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton caractérisées par une fragilité de la peau (génodermatoses). Les patients atteints de génodermatoses présentent des plaies qui sont infectées par des bactéries du microbiote cutané s. Les patients atteints des formes les plus sévères d’epidermolyse bulleuse présentent de larges décollements cutanés et développent des plaies infectées chroniques qui peuvent entraîner des cicatrices et une fibrose. Il est probable que la multiplication des bactéries sur la plaie, appelée "colonisation critique" dans la pratique clinique, entrave la cicatrisation et favorise l’inflammation locale et générale. En outre, les infections cutanées répétées favorisent les carcinomes spinocellulaires agressifs sur les sites exposés à des blessures continues. Les protéines (cytokines, chemokines, facteurs de croissance) exprimées au niveau de la plaie par les différentes populations cellulaires de la peau (kératinocytes, fibroblastes, cellules immunitaires) sont essentielles au processus de guérison et sont susceptibles d'être influencées par la colonisation par les bactéries du microbiote cutané. L'impact des différents types de souches bactériennes adaptées à l'hôte sur les signaux pro-inflammatoires et profibrotiques dans le contexte des plaies est mal connu. Les Objectifs scientifiques sont (i) comprendre pourquoi et comment les souches bactériennes issues de la peau humaine parviennent à coloniser de façon chronique la peau des patients atteints de pathologies de la barrière cutanée (ii) identifier les liens entre l'infection cutanée et les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte. Les objectifs cliniques sont (i) tester l’impact de molécules anti-inflammatoires et antibactériennes sur la colonisation bactérienne des plaies et sur les réponses pro-inflammatoires et profibrotiques de l'hôte(ii) identifier les marqueurs de virulence bactérienne. AMENDEMENT : Les nouvelles souches de souris qui seront utilisées permettront de mieux déterminer les mécanismes pathologiques induits par des infections bactériennes.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à améliorer notre compréhension des infections chroniques de la peau chez les patients atteints d’altération de la barrière cutanée, comme les epidermolyses bulleuses ou le syndrome de Netherton, en exploitant des souches bactériennes issues de la peau humaines. Nous comparerons 2 modes d’infection pour évaluer l’impact local des souches (infection de plaies) et leur capacité à disséminer à partir d’un abcès (infection sous-cutanée). Ceci nous permettra de mieux comprendre le rôle des bactéries dans les lésions localisées et dans les lésions compliquées d’infection disséminée. Il est fondamental de comprendre l'impact des infections. Notre projet vise à identifier des marqueurs de sévérité des infections chroniques de la peau pour une meilleure anticipation et gestion des complications chez les patients. Notre projet prévoit aussi de tester des molécules visant à inhiber l'inflammation et la fibrose de la peau ce qui pourra contribuer à mieux traiter les patients. En outre, notre projet peut aider à fournir une compréhension physiopathologique plus large des mécanismes complexes qui sous-tendent les dermatites chroniques également associées à des infections cutanées, comme la dermatite atopique et les plaies chroniques non cicatrisantes des diabétiques.

Procédures

Au cours de l’ensemble des procédures, les interventions réalisées sur les animaux seront : (i) Procédure 1 : Inoculation bactérienne sous-cutanée (1minute par animal). (ii) Procédure 2 : Lésion artificielle et inoculation bactérienne (15minutes par animal). (iii) : Anesthésie (3 fois au cours de chaque procédure, 5minutes par animal). (iv) Prélèvement sanguin rétro-orbitaire (2 fois au cours de chaque procédure, volume de 30 à 60ul de sang, 3 minutes par animal). (v) mise à mort par dislocation cervicale (quelques secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances infligées chez la souris sont (i) inoculation par injection sous – cutané, réalisée sous anesthésie gazeuse peut provoquer une infection profonde pouvant provoquer des abcès ou une infection systémique possiblement douloureuses (ii) la réalisation d’une plaie artificielle de 4mm par punch biopsy sous anesthésie peut entrainer une douleur. (iii) les prélèvements de sang rétro-orbitaire, réalisé sous anesthésie, à J2 et J5 peuvent engendrer une douleur. Pour le respect du principe des 3R la durée et les doses des infections seront réalisées selon les protocoles préétablis pendant une période d’infection de 5 jours ou la perception du stimulus qui causent la douleur sera surveillée par les critères relatifs au bien-être animal, selon une grille de score.

Devenir

Tous mis à mort à J5 de l'infection pour analyse histologique de la peau et quantification du nombre de bactéries.

Remplacement

Des expériences in vitro seront réalisées lorsque cela est possible pour démontrer le rôle précis de certains types cellulaires (keratinocytes, neutrophiles). Toutefois, les modèles animaux sont utilisés ici dans le but d’obtenir des modèles d’infection impliquant de nombreux types cellulaires interagissant les uns avec les autres et impossible à reproduire in vitro. En effet, au cours de l’infection les interactions entre les cellules de la peau (keratinocytes et fibroblastes) et les cellules immunitaires (neutrophiles, cellules de Langerhans, lymphocytes..) ont un rôle fondamental dans la capacité de l’hôte à éradiquer les bactéries pathogènes. De plus, l’infection est caractérisée par des symptômes uniquement observables chez l’animal (abcès). Il est donc impossible de reproduire efficacement un processus biologique aussi complexe impliquant le système immunitaire uniquement par des études in vitro. L’expérimentation animale est donc un élément clé de ce projet.

Réduction

Pour ce projet, nous utiliserons des souris femelles adulte s. Le nombre de souris qui sera inclus dans chaque groupe sera le plus faible possible pour pouvoir assurer la reproductibilité des expériences et répondre aux questions scientifiques . Le nombre d'animaux sera de 12 souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs. L’application de tests statistiques efficaces sur le nombre des échantillons collectés réduira l’utilisation des animaux dans les différentes conditions expérimentales. Le nombre d'animaux a été détermié par une approche statistique.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation du décret n°2013-118 et adaptées. Nous veillerons à l’enrichissement de l’environnement des animaux par la mise à disposition de la nidification, de maisonnette et de bâtonnets en bois à ronger. Les animaux disposent de nourriture, d’eau et de litière. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux et de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance journalière et une durée limitée à 5 jours. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est sensibilisé à la détection des signes de souffrance des animaux et qualifié sur le plan réglementaire, technique en continu. Pendant la période de quarantaine les animaux seront familiarisés par la prise en main et la contention par l’expérimentateur. Pour limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie gazeuse. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le test des réflexes à la douleur (pincement du coussinet de la patte), les prélèvements sanguins rétro-orbitaire sont réalisés sur souris anesthésiées à l'isoflurane. La fréquence est de 2 prélèvements à J2 et J5 de l’infection en alternant les prélèvements des yeux. Afin de limiter la souffrance infligée lors des prélèvements sanguins, de l’ocry-gel sera appliqué en préventif sur l’œil prélevé, 5 min avant le prélèvement rétro-orbitaire. Des antalgiques sont prévus en pré-opératoire et en cas de souffrance en post -opératore si le score est égal à 2 (injection sous cutanée de 50ul de buprénophine à 0,05mg/kg). En cas d’atteinte de point limite égal à 3 , nous procèderons immédiatement à la mise à mort par une dislocation cervicale.

Choix des espèces

Au cours des quarante dernières années, la recherche sur les maladies infectieuses a fait de la souris un modèle de choix pour les maladies infectieuses humaines, permettant la mise au point de traitement efficaces et de réponses scientifiques. La pathologie de la peau développée suite à l’injection de bactérie chez la souris est très similaire à celle développée chez l’homme. Un autre facteur important la petite taille de l’animal, la courte gestation et la grande taille des portées rendent les souris facile à élever que tout autre mammifère actuellement utilisé pour la recherche sur les maladies infectieuses. Les souris adultes seront utilisées afin que le système immunitaire soit mature.