Souris

378 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales puis des injections intraveineuses ou intrapéritonéales répétées, jusqu'à seize sur soixante jours, avec prélèvements sanguins et imagerie sous anesthésie, pour évaluer une stratégie de ciblage des chimiothérapies vers la tumeur. Le porteur indique une nécrose tumorale possible et un stress lié aux manipulations, sans détailler de test comportemental. Il décrit des travaux préalables in vitro et sur organoïdes humains, tout en affirmant que le modèle animal reste un "prérequis obligatoire" avant tout essai clinique.

Objectifs

Le cancer colorectal, au niveau mondial, est le 3ème cancer le plus diagnostiqué après le cancer du poumon et du sein (plus de 1,8 million de nouveaux cas par an) et le 2ème cancer le plus mortel après le cancer du poumon (plus de 900 000 décès par an). Selon les estimations, ces chiffres devraient encore augmenter et atteindre plus de 2,2 millions de nouveaux cas et 1,1 million de décès par an d'ici 2030. Comme pour la plupart des cancers, l’une des limitations actuelles dans la prise en charge de ce cancer est la toxicité des traitements dont les effets délétères sur la qualité de vie du patient peuvent conduire jusqu’à imposer un arrêt de la thérapie. Afin de surmonter cette limitation nous avons développé une stratégie qui devrait permettre de cibler les chimiothérapies dans la tumeur sans affecter les tissus sains. L’objectif de cette étude est d’évaluer in vivo le potentiel thérapeutique de cette stratégie.

Bénéfices attendus

L’objectif est d’établir une preuve de concept à visée clinique (au-delà de la portée du présent projet). Les enjeux sont, in fine, de mettre à la disposition des cliniciens oncologues une stratégie de délivrance sécurisée de médicaments pour la prise en charge du cancer colorectal. Les bénéfices attendus sont d’améliorer l’efficacité des traitements, de diminuer leurs effets secondaires et d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les procédures impliquent au maximum une injection sous-cutanée (en début d’expérience) et soit des injections intraveineuses ou intrapéritonéales uniques avec prélèvement sanguin, soit des injections intraveineuses ou intrapéritonéales répétées tous les 4 jours (maximum 16 sur 60 jours). Lors des études de biodistribution, les animaux subiront également des prises de sang répétées sur 24h (maximum 3) ainsi que des analyses par imagerie (maximum 4) sous anesthésie gazeuse légère.

Impact sur les animaux

Nous n’avons pour l’instant aucune donnée expérimentale permettant de prédire quels seront les effets toxiques liés à l’injection des composés. En revanche, on peut s’attendre à un léger stress dû à la manipulation des animaux lors des injections, de la xénogreffe et/ou de la mesure de la taille des tumeurs pour le suivi de la croissance tumorale. Nous n'attendons pas d'autres nuisances ou effets indésirables sauf nécrose éventuelle de la tumeur chez les animaux xénogreffés : il n’est pas attendu qu’une tumeur située sur le flanc de l’animal, altère la locomotion ou soit à l’origine de contraintes mécaniques chez la souris. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale et ne devrait pas occasionner non plus de nuisance particulière chez l’animal.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés au terme de chaque procédure afin d’effectuer des prélèvements d’organes post-mortem.

Remplacement

La mise au point de la stratégie (efficacité et sélectivité de ciblage de la cellule tumorale) a été réalisée sur des modèles in vitro (cultures de cellules tumorales et non tumorales colique). Des tests ex-vivo (organoïdes générés à partir de résections chirurgicales humaines normales et tumorales) font également partie intégrante du projet. Cette stratégie de remplacement a permis d’optimiser et d’orienter le choix des composés à tester sur les modèles pré-cliniques in vivo tout en limitant considérablement le nombre d’animaux. Cependant, l’évaluation de l’efficacité thérapeutique de nouvelles stratégies de traitements dans des modèles animaux, murins notamment, est un prérequis obligatoire pour, in fine, justifier l’investigation clinique et la première administration chez l’homme. Ces expériences sont en effet difficilement modélisables dans d’autres systèmes et ont une valeur prédictive bien supérieure à celles réalisées in vitro ou ex-vivo. En particulier, il n’existe pas à l’heure actuelle, de systèmes alternatifs pour caractériser de façon fiable l'efficacité anti-tumorale et évaluer les effets secondaires (toxicité) de nouvelles stratégies de traitement.

Réduction

La stratégie de réduction est basée sur un mode d’incrémentation des procédures qui, étape par étape, permettra d’optimiser le protocole thérapeutique (posologie, système de ciblage, voie d’administration). La sélection progressive d’une voie d’administration, d’une stratégie de ciblage et d’une concentration de produit à administrer permettra en particulier de limiter le nombre de conditions expérimentales (et donc le nombre d’animaux) à tester au fil des procédures. D’après notre expérience, un nombre de 6 souris par groupe expérimental permet de garantir un nombre minimum de 4 animaux pour obtenir des résultats statistiquement valides, compte tenu de possibles aléas expérimentaux (prise de greffe défaillante, perte de poids trop importante voire décès).

Raffinement

Les procédures ont été optimisées au cours d’études précédentes dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et la surveillance de l’état clinique des animaux se fera au quotidien, y compris les week-ends et jours fériés. Une fiche de soins permettra également d’assurer la prise en charge et le suivi des animaux. Les observations et l’évolution de l’état général des animaux conditionneront les prises de décisions permettant d'assurer leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la mieux définie génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence (y compris les nôtres) dans le domaine de la cancérologie (modèles précliniques de tumeurs intestinales induites et tests de principes actifs) sont nombreuses, bien documentées et bien validées. Les souris seront âgées de 7 semaines en début d’expérimentation (souris adultes).

3 228 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer "un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à sept jours" et une perte de poids, des chirurgies stéréotaxiques et des tests cognitifs, pour étudier la neuro-inflammation dans la maladie d'Alzheimer. Les organes, dont le cerveau, sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme que les études in vitro "ne permettent pas" d'étudier le comportement et la cognition.

Objectifs

Une inflammation à bas bruit tout au long de la vie contribuerait aux mécanismes du vieillissement et même pourrait fortement peser dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer et des démences associées. Au niveau du cerveau, des médiateurs de l’inflammation, les cytokines, qui circulent en grande quantité dans le cerveau au cours des infections ou lors des maladies neurodégénératives pourraient perturber les mécanismes de réponses physiologiques du neurone. Il est donc important de mieux comprendre comment les processus de neuro-inflammation affectent le comportement et la cognition. Ici, il est proposé d'utiliser des modèles de souris dans lesquels il est possible d’induire la suppression de l’expression d’un récepteur à une cytokine à la fois, et cela seulement dans les neurones. Cela permettra d’étudier l’importance de cette cytokine dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans des processus pathologiques. Ces derniers sont la neuroinflammation chronique ou des infections du système nerveux central. L'étude utilisera un modèle transgénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, ou une infection par Toxoplasma ou l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation. Le recours à un modèle animal est donc irremplaçable pour cette étude, puisqu'elle vise à déterminer les effets de la suppression de la signalisation de cytokines sur la physiologie de neurones, le comportement et la cognition.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle des signaux pro-inflammatoires reçus par les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire et la neurodégénérescence, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur l'identification de nouvelles cibles, pour des stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer, pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (2904 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (2796 souris, une injection de quelques secondes); iii) deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, 432 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, 960 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), la force (une session de 5 minutes au total par animal, à raison deux 3 essais de 5 secondes chacun et 30 secondes au minimum entre chaque groupe de 3 essais) et les processus cognitifs ( toutes les souris (3228), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), labyrinthe de Barnes ( chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 3228 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent aucun symptômes apparents de maladie et n'ont donc pas de phénotype dommageable, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour ces lignées. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédant les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes; où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissement du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Les 3228 animaux seront en fin de procédure euthanasiés. L'euthanasie est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant la neurodégénérescence. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires (12 pour les groupes contrôles témoins). En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. L'utilisation d'implants sous-cutanés permettront de délivrer des molécules de manière chronique ce qui évitera de devoir recourir à des injections journalières répétées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). La maitrise des interventions qui pourraient s'avérer douloureuses sera effectuée par l'utilisation d'analgésiques en péri-opératoire. Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux .

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la signalisation de médiateurs de l'inflammation dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (modèles invalidés pour un gène contribuant à la maladie ou exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour la protéine étudiée n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

220 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont mises à jeun jusqu'à seize heures, soumises à un gavage oral d'un colorant puis isolées jusqu'à cinq heures, pour mesurer la motricité intestinale et l'effet du fer héminique apporté par la viande rouge. Divers organes sont prélevés après mise à mort. Le porteur indique réutiliser des souris "surnuméraires" issues de l'élevage et affirme que seule une "approche in vivo intégrée" permet de reproduire l'axe intestin-cerveau.

Objectifs

Le syndrome de l’intestin irritable est l’une des pathologies intestinales chroniques très répandue (10-15% de la population), altérant la qualité de vie des patients par l’inconfort digestif et les douleurs abdominales générées. C’est une cause majeure de consultations médicales dans le monde occidental. Son origine est multifactorielle, mais des facteurs nutritionnels contribuent fortement à l’aggravation des symptômes, notamment en raison des ballonnements causés. Bien que non établit encore chez l'Homme, un lien a été mis en évidence chez la souris entre la consommation de fer héminique, à savoir une source de fer principalement apportée par les produits carnés, et une augmentation de la sensibilité abdominale vis-à-vis d'une pression appliquée sur la paroi du côlon. Une étude est prochainement programmée pour répondre à la question de savoir si la consommation maternelle de fer héminique engendre également cette augmentation chez sa descendance. Pour ce type d’étude s’intéressant à la période périnatale, un calcul est réalisé pour ajuster au minimum le nombre de souris mises en reproduction, mais malgré tout, cette phase d’élevage, de par le caractère aléatoire de l’obtention d’une gestation et de taille des portées, génère des variabilités d’effectif et occasionne la survenue d’individus surnuméraires qui ne sont pas requis pour l’étude. N’ayant pas subi antérieurement de procédure dommageable, l’objectif est de les dédier à la mesure de la motricité intestinale (chez la souris adulte à partir des animaux reproducteurs et de sa descendance si l'effectif est conséquent) pour savoir si elle est altérée ou non par la consommation de fer héminique. Cette mesure de motricité est fréquemment décrite dans la littérature, elle comprend l’évaluation du temps de transit et la fréquence de défécation. Nous avons cependant peu de recul au laboratoire sur sa mise en œuvre chez la souris, particulièrement pour la mesure du temps de transit. Dans ce contexte, ce projet a pour objectif (i) d’ajuster les protocoles détaillés dans la littérature pour nous permettre ensuite (ii) de réaliser la mesure de la motricité intestinale chez la souris en fonction de son régime ou du régime maternel en période périnatale.

Bénéfices attendus

Ces études permettront d’améliorer notre connaissance des processus physiologiques associés à notre santé digestive. Plus spécifiquement, elle permettra de savoir si la sensibilité abdominale augmentée par la consommation de fer héminique est liée ou non à des troubles de la motricité intestinale. Sur le plan de la santé publique, cette étude contribue à mieux préciser (i) les bénéfices/risques associés à la surconsommation de ces produits carnés et (ii) les recommandations nutritionnelles en fer à préconiser aussi bien pour les patients atteints du syndrome de l’intestin irritable que pour la population générale.

Procédures

Les souris de cette étude, ayant reçu jusqu'alors uniquement un régime équilibré supplémenté en citrate de fer ou en fer héminique, subiront (i) une période mise à jeun comprise entre 0 et 16h selon les résultats de la première phase de mise au point du protocole définitif, (ii) un gavage oral par une solution semi-liquide contenant un colorant inerte non absorbable dont l'acte ne dépassera pas 10 secondes, (iii) suivi d’un hébergement en cage individuelle qui ne dépassera pas 5h avant un retour en hébergement conventionnel.

Impact sur les animaux

Pour chaque souris, les nuisances attendues sont une éventuelle baisse de la glycémie liée au jeune, associée à un stress transitoire engendré par (i) les 10 secondes de contention et d’inconfort lors de l’introduction de la sonde de gavage dans l’œsophage, suivi (ii) d'un isolement d'une durée maximale de 5 heures le temps d'attendre l'apparition de fèces contenant le colorant.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les souris seront mises à mort et divers prélèvements seront effectués post-mortem pour des analyses histologiques, biochimiques et moléculaires ultérieures.

Remplacement

De par la complexité des interactions de l’axe intestin-cerveau impliqué dans la motricité intestinale, aucun modèle cellulaire ou de substitution ne permet à l’heure actuelle de reproduire ce processus physiologique pour estimer un temps de transit ou une fréquence de défécation. Seule une approche in vivo intégrée est donc envisageable pour nous permettre de prendre également en compte les processus en amont liés à la digestion en fonction du régime alimentaire.

Réduction

Le nombre minimum requis de souris utilisées pour la reproduction afin d'étudier l’impact d’un régime maternel supplémenté en fer héminique ou en citrate de fer sur la santé digestive de la descendance est calculé au plus juste selon une convention établie dans le cadre des études développementales (concept de la DoHAD). Malgré tout, cette phase d’élevage occasionne des individus surnuméraires qui ne sont pas utilisés pour les procédures dédiées à l'étude principale (sensibilité abdominale). Nous prévoyons d’optimiser la présence de ces souris surnuméraires pour les dédier à l’évaluation de la motricité intestinale en fonction du régime déjà reçu, et ainsi éviter le recours à la réception de nouvelles souris. Pour la phase de mise au point de la méthode, aucune statistique n’est requise et nous prévoyons des très petits groupes de 2 à 3 souris. Pour appliquer le protocole finalisé au projet destiné à évaluer l’impact de la surconsommation de fer héminique (exposition chez l’adulte et en période périnatale), un nombre optimal de souris basé sur les données de la littérature (6 souris par groupe) a été retenu.

Raffinement

Pour assurer une fiabilité des résultats tout en limitant le nombre d’animaux utilisés, une attention particulière est accordée au bien-être de l’animal : un hébergement collectif maximisé, un environnement contrôlé, le respect du cycle jour nuit, des manipulations douces d’habituation lors des pesées hebdomadaires. Des buchettes en peuplier disposées sur la litière leur permettront de satisfaire le besoin de ronger. Un abri en aluminium leur permettra de s’y loger. Une observation des souris à l’occasion du nourrissage quotidien permettra de détecter toute anomalie éventuelle, et ainsi minimiser la durée de toute souffrance constatée par des soins appropriés. Plus spécifiquement au cours de la procédure, nous veillerons à minimiser le stress de l’isolement : des cages transparentes de petite taille seront alignées et laissées sans couvercle filtrant pour maximiser les échanges visuels, olfactifs et auditifs. Les buchettes de peuplier à ronger habituellement présentes, l’eau et le régime seront également remis à disposition sur la période d’isolement. Une personne expérimentée réalisera le gavage pour limiter la durée de l’inconfort lié au stress de contention et à l'introduction de la sonde de gavage dans l’œsophage, et prendra soin de surveiller continuellement le comportement de la souris durant les 5 heures suivantes (l’observation étant également requise pour détecter l'apparition de fèces colorés).

Choix des espèces

Les travaux antérieurs de l’équipe avec la lignée de souris choisie permettent d’avoir maintenant une bonne base de connaissance de sa barrière intestinale, son microbiote, son système immunitaire et de sa sensibilité abdominale. Ces souris se distinguent également par leur comportement maternel et le soin qu’elles apportent à leur portée. Pour l’analyse de la motricité intestinale, les animaux seront tous âgés de 9-10 semaines car il est indispensable d'avoir un tractus digestif à pleine maturité physiologique.

423 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur du côlon leur est induite par greffe sous-cutanée, puis traitée par ultrasons focalisés et injections répétées, la tumeur pouvant "gêner la locomotion et être douloureuse". Les tumeurs sont récupérées après mise à mort. Le porteur affirme que le micro-environnement tumoral est "impossible à reproduire in vitro" et ne présente l'application clinique qu'au conditionnel ("pourrait découler").

Objectifs

Les immunothérapies actuelles sont en plein essor dans le cadre du traitement contre le cancer. Cependant, malgré un effet démontré sur la régression tumorale et l’augmentation de la survie globale, ces thérapies ne sont effectives que chez 20 % à 40 % des patients. L’hypothèse est qu’il faut activer le système immunitaire. Il est proposé ici de l’activer avec les ultra-sons avec une application locale et ciblée. Les ultrasons thérapeutiques sont aujourd’hui utilisés en clinique pour de nombreuses applications. Selon la modalité du traitement, les ultrasons peuvent activer le système immunitaire. L’objectif de notre étude est donc de caractériser le potentiel des ultrasons en complément d’immunothérapie pour améliorer la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait découler sur l’utilisation d’ultrasons en clinique pour réduire les risques de récidive dans le traitement de cancer avec l’immunothérapie mais aussi combinés à d’autres types de traitement.

Procédures

Les animaux subiront une injection sous cutanée de cellules tumorales qui conduira au développement d’une tumeur. L’animal sera épilé (jusqu’à 3 fois ; 1 à 2 minutes de manipulation) et recevra un traitement par ultrasons (5min) par semaine (soit maximum 6) et des injections dans l’abdomen ou dans la tumeur de traitement (jusqu’à 12 maximum) à raison de 2 par semaine maximum.

Impact sur les animaux

Les animaux pourront ressentir du stress lors des contentions en amont des gestes techniques. Le traitement par ultrasons pourra générer en cas de problème de ciblage un échauffement de la peau (rare). Les injections génèreront de la douleur courte et la tumeur pourra gêner la locomotion et être douloureuse (rare).

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs et d’analyser les réponses immunitaires par cytométrie.

Remplacement

Nous avons en amont réalisé des études in vitro afin de s’assurer de la non toxicité de l’immunothérapie et son efficacité. Ceci étant, l’interaction entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales est un phénomène biologique complexe faisant intervenir différents types cellulaires particulièrement sensibles au micro-environnement de la tumeur qui est impossible à reproduire in vitro. De plus, des traitements destructifs et immunomodulateurs de la tumeur et de son environnement amènent à divers effets biologiques complexes et nombreux, également impossibles à reproduire in vitro.

Réduction

Les effectifs des groupes ont été déterminés grâce à des outils statistiques. Chaque procédure soulève une question à laquelle nous souhaiterions répondre, sans laquelle nous ne passerons pas à l’étape suivante. Ceci aura pour but d’obtenir les résultats attendus avant de passer à l’étape suivante, ce qui permet de ne pas gaspiller d’animaux lorsque les résultats observés ne sont pas ceux attendus.

Raffinement

Si nécessaire, de la crème cicatrisante sera appliquée sur la peau , là où les ultrasons seront passés. Les souris sont surveillées trois fois par semaine. Dès qu'un des points limites définis est atteint, pour réduire la douleur et l'angoisse, l'animal est mis à mort.

Choix des espèces

Les souris ont été choisies car elles contiennent le fond génétique d'où est issue la lignée cellulaire du modèle de cancer qui sera implanté. Des animaux de 5 à 7 semaines seront utilisés car l’âge de l’animal est une variable importante à contrôler pour caractériser la réponse immunitaire.

2 540 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses par voie sous-cutanée ou, sous anesthésie, directement dans le pancréas, puis jusqu'à 24 injections sur huit semaines, la tumeur pouvant induire "un dysfonctionnement léger de la fonction pancréatique". Même les animaux dont la tumeur ne s'est pas développée sont tués. Le porteur indique avoir déjà obtenu et breveté des résultats in vitro, tout en concluant qu'ils "ne permettent pas de récapituler la complexité d'un organisme vivant complet".

Objectifs

Nous avons identifié une stratégie médicamenteuse qui stimule l'activation de l'immunité, tout en diminuant les toxicités classiquement associées. Nous proposons de prouver la validité de cette stratégie thérapeutique en évaluant sa capacité à induire des réponses anti-cancéreuses et en mesurant les toxicités potentielles associées dans des modèles de cancers réfractaires à l'immunothérapie. Dans ce cadre, nous nous concentrerons sur le cancer du pancréas et le cancer de la peau menant à des métastases, cancers au pronostic sombre pour lequel l'immunothérapie représente un fort espoir thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce programme de recherche vise à approfondir la compréhension d’une stimulation de l'immunité innée au cours d’un traitement par immunothérapie. Nous déterminerons notre combinaison médicamenteuse présente un effet supérieur sur la réponse inflammatoire anti-tumorale en comparaison à l'utilisation des médicaments utilisés seuls. Les résultats de ce programme pourraient avoir un impact significatif sur le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les cancers réfractaires à l'immunothérapie et ouvrir la voie à des thérapies plus efficaces et mieux tolérées pour les patients.

Procédures

Gestes techniques de cette demande sont les suivants : - injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée (10 minutes) - chirurgie/injection de cellules cancéreuses en intra-pancréatique (30 minutes) sous anesthèsie - injection en intrapéritonéal sur animal vigile (20 secondes) = anticorps ou luciférine - injection en péritumoral sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes) = anti douleur, anticorps ou traitements pharmacologiques. Au maximum un animal recevra : soit (i) - 1x chirurgie/injection de cellules cancéreuses en intra-pancréatique (20 minutes) sous anesthèsie -2x injection en sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes) - 24x injection en intrapéritonéal sur animal vigile (20 secondes) sur une durée de 8 semaines soit (ii)- injection de cellules cancéreuses en sous-cutanée (10 minutes) - 24x injection en péritumoral sous-cutanée sur animal vigile (20 secondes)

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie (injections de cellules en intra-pancréatiques) les animaux pourraient ressentir de la douleur à la zone d'incision et d'injection et avoir un peu de difficulté à accéder à la nourriture. La présence d'une tumeur sur le flanc peut limiter les mouvements de la souris. La présence d'une tumeur en orthotopique (pancréas) peut induire un dysfonctionnement léger de la fonction pancréatique.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. Les animaux dont la tumeur ne s'est pas développée seront également euthanasiés, en effet ces animaux auront subi des changements dans leur immunité ne permettant pas leur réutilisation.

Remplacement

Dans le cadre du remplacement, visant à réduire l’utilisation de modèles animaux dans les procédures expérimentales, nous avons déjà réalisé des expériences in vitro permettant de mettre en évidence un l'effet synergique entre deux molècules. Ces résultats ont été brevetés par notre équipe. Ces résultats très encourageants obtenus en culture cellulaire ne permettent pas de récapituler la complexité d'un organisme vivant complet.

Réduction

Une étude statistique préalable et un nombre adapté de souris par groupe expérimental nous permettent de réduire le nombre d’animaux utilisé. Ainsi la taille des groupes a été déterminé via lun logiciel statistique et le nombre minimal d’animaux par groupe doit être de 8 à 10 animaux . De plus les études antérieures menées par le groupe, nous permettent également d’estimer d’une moyenne de 10 animaux par groupe expérimental est nécessaire et suffisant pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle ou expérimentale. Les prélèvements d’organes qui se feront après euthanasie des animaux.

Raffinement

Toutes les mesures susceptibles de prévenir tout effet impactant le bien être des individus seront mise en oeuvre durant la durée du projet. Les animaux seront sous surveillance quotidienne et pesés une fois par semaine. En préchirurgie les animaux recevront une dose d'antalgique et en post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posés à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement en post-chirurgie. Les animaux seront placés en cage de minimum 4 individus avec maisonnette plus du coton afin de combler les besoins physiologiques et comportementaux des animaux. Enfin des points limites ont été établis afin de pouvoir surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le présent projet.

Choix des espèces

La souris constitue un modèle expérimental de référence pour ce type d'expérience de greffes de cellules cancéreuses. Des souris de 7 à 12 semaines seront utilisées en début de manipulations expérimentales afin d’avoir des animaux adultes (d’âge mûr).

778 souris vont être utilisé·es, la plupart tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau et 90 réutilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une biopsie de la queue et la pose d'une bague auriculaire sous anesthésie, et 216 passent des tests de motricité et de sociabilité, pour étudier une mutation génétique liée à l'autisme. Les bénéfices annoncés, un diagnostic précoce et une meilleure prise en charge des patients, sont renvoyés au conditionnel et au long terme ("à terme", "pourrait"). Le porteur affirme que l'étude comportementale ne peut être reproduite en culture cellulaire ou en modèle informatique.

Objectifs

De nombreuses études génétiques montrent que la famille de gène à laquelle le gène d'intérêt de ce projet appartient, participe activement au développement embryonnaire ; ils sont pour la plupart impliqués dans des maladies génétiques rares affectant le neurodéveloppement. Au moins 3 d’entre eux sont responsables de troubles du spectre autistique qui souvent sont associés à des troubles moteurs. Le gène d’intérêt que l’on souhaite étudier dans ce projet est l’un des rares à ne pas avoir encore été formellement relié à une maladie génétique et reste à ce jour très peu étudié. Plusieurs études semblent toutefois montrer son implication dans des troubles moteurs et potentiellement dans l’autisme. Dans ce contexte, nous souhaitons caractériser le développement neuronal, le développement moteur et la sociabilité des souris génétiquement modifiées pour ce gène d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre à court terme d’infirmer ou de confirmer l’implication de ce gène dans les troubles du spectre autistique et de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans les troubles sociaux et moteurs engendrés par la mutation du gène d’intérêt. A terme, ce projet pourrait permettre de poser un diagnostic précoce ainsi qu’une meilleure prise en charge à plus long terme des patients.

Procédures

Toutes les souris (778) auront une biospie d’un petit bout de queue pour l'identification génétique des souris et la mise en place d’une bague auriculaire sous anesthésie au moment du sevrage. Sur les 778 souris du projet, 144 auront une prise de sang terminale sous anesthésie générale avec antalgiques (durée de 2 min). 216 souris seront pesées régulèrement (1 pesée par semaine, d’une durée de 10 secondes maximum par pesée, 30 fois maximum). Les 216 souris vigiles seront soumises à des tests de motricité et d'évaluation de leur sociabilité ; à l'âge de 28 jours dans la même journée, les souris auront 2 sessions d'une durée maximale de 30 secondes ; entre l'âge de 45 et de 50 jours puis entre 135 et 150 jours, les souris subiront 4 tests d'une durée maximale de 10 minutes pour les 3 premiers tests et de 35 minutes pour le quatrième test. Les tests seront réalisés sur 4 jours consécutifs avec 1 test par jour.

Impact sur les animaux

(1)Une légère altération de la motricité et la sociabilité ,(2) un stress léger et transitoire lié au réveil suite à l’anesthésie et une légère douleur transitoire suite à la biopsie tissulaire (sous anesthésie). (3) L'ensemble des tests de motricité et d'évaluation de la sociabilité évaluant le développement et la motricité générale pourront engendrer un stress léger et transitoire lié à la manipulation chez les souris.

Devenir

La plupart des animaux seront mis à mort notamment pour des prélèvements du cerveau. 90 seront maintenus en vie et réutilisés dans d'autres projets.

Remplacement

Le projet comporte une étude comportementale (sociale et motrice) qu’il est impossible de reproduire en culture cellulaire ou en modèle informatique dans l’état des connaissances actuelles. Il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico pour réaliser ce projet. Ces approches nécessitent la présence du réseau neuronal qui est uniquement accessible dans des modèles d’animaux intègres et donc vivants.

Réduction

Nous minimiserons le nombre d'animaux utilisés par des méthodes expérimentales validées et reproductibles, en ayant recours à des analyses statistiques pour l’interprétation des résultats obtenus. Le nombre d'animaux par lot a été calculé en tenant compte de la variabilité des résultats dans d'autres modèles animaux d'autisme et de troubles moteurs. De plus nous mettrons en place une stratégie d’accouplement restreinte au juste nécessaire en réalisant les accouplements par étapes successives jusqu’à obtention du nombre d’animaux nécessaires à nos études.

Raffinement

Toutes les phases du projet seront réalisées par des personnels expérimentés. Le bien-être des animaux est pris en compte à chaque étape par une surveillance régulière des animaux selon une grille de suivi de bien-être animal qui aide dans le suivi des points limites stricts et précis et des critères d’intervention et d’arrêt suffisamment précoces. Un animal atteignant un des points limites définis nécessitant une intervention est pris en charge sans délai. Après leur naissance, les animaux resteront avec leur mère jusqu’au sevrage (J21), hébergés en conditions normales (température et humidité contrôlées, cages ventilées) avec un enrichissement dans la cage fournie par l’animalerie (matériel de nidification et des tunnels pour leur permettre de se cacher) avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Les souris seront observées jusqu’au sevrage, puis seront hébergées par groupe de même sexe de 3 à 5 animaux issus de deux portées par cage. La mise en place de la boucle d'oreille pour identification et la biopsie tissulaire sera réalisé sous anesthésie gazeuse. La prise de sang sera réalisée sous anesthésie avec une couverture antalgique. Les animaux seront placés en habituation dans la pièce de comportement minimum 30 minutes avant le début des tests.

Choix des espèces

Les rongeurs ont un système nerveux moteur proche de l’Homme. Les troubles autistiques peuvent être reproduits chez la souris. Les souris seront incluses dans le projet dès leur naissance et utilisées entre l'âge de 28 jours (correspondant au sevrage) et 150 jours (âge adulte). Nous cherchons à montrer que le gène étudié est impliqué dans une maladie neurodéveloppementale, il est donc nécessaire de réaliser une étude longitudinale (des premières étapes du développement au stade adulte), afin d’objectiver le phénotype ataxique qui pourrait survenir dans un stade de la vie plus tardif. Une étude chez la souris âgée fera l’objet d’un autre projet qui sera entrepris en fonction des données préliminaires obtenues dans cette présente étude.