Souris

800 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent de multiples injections, jusqu'à douze prélèvements de sang à la queue et une perfusion intracardiaque décrite comme une "douleur modérée", certaines étant rendues diabétiques, pour étudier la communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux des îlots pancréatiques. Les organes sont prélevés après mise à mort. Le porteur indique que ce dialogue "n'a jamais été étudié" et affirme que les modèles animaux sont nécessaires pour analyser plusieurs organes à la fois.

Objectifs

Dans le pancreas, les ilots de Langherans sont centraux dans la régulation du glucose dans le sang. Ces micro-organes produisent les hormones permettant de réguler le taux de glucose. Des cellules immunitaires sont présentes dans les ilots et jouent une rôle important dans leur fonction. Comme tous les tissus, les ilots sont reliés au cerveau par le système nerveux périphériques. Cependant, la communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux n’a jamais été étudié et son rôle dans la fonction des ilots pancréatiques n’est pas bien connu. Dans ce projet nous proposons d’étudier les mécanismes de communication entre les cellules immunitaires et le réseau nerveux des ilots pancréatiques ainsi que le rôle de ces moyens de communications dans la fonction des ilots en condition normal et diabètique, une maladie caractérisée par une dérégulation du glucose dans le sang.

Bénéfices attendus

Il est aujourd'hui admis que les cellules immunitaires jouent un rôle primordial dans la régulation du taux de glucose sanguin par le gras et le foie. Les cellules immunitaires présentes dans les ilots pancréatiques n'ont elles été décrites que tardivement et les contraintes liées à leurs techniques d'analyse font qu'elles restent encore très peu connues. La communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux a été montrée comme primordiale dans la fonction de multiples organes. Cependant, de part la difficulté d'étudier les cellules immunitaires des ilots pancréatiques, ces moyens de communications n'ont pas encore été décrits dans les ilots. Ce projet permettra de mieux comprendre les moyens de communication entre cellules immunitaires et réseau nerveux dans la fonction ilots pancréatiques et leurs implication dans la régulation du taux de glucose sanguin.

Procédures

9 injection intra-péritonéale (20s), 1 injection sous-cutanée, 1 injection intra-veineuse, 12 prélèvement de sang à la queue (3s), 1 anesthésie gazeuse (10min), 1 perfusion intra-cardiaque.

Impact sur les animaux

-Injections intrapéritonéale (ip) : douleur légère due à la piqure. -Injection iv rétro-orbitale (iv) : gêne, douleur légère au point de prélèvement. Les animaux sont sous anesthésie gazeuse au moment du prélèvement. -Injection sous-cutanée (sc) : douleur légère due à la piqure. -Diabète : prise de poids progressive. Les souris peuvent devenir moins actives. Le souris urinent plus souvent. - Perfusion intra-cardiaque : Douleur modérée. Les souris recevront un analgésique opioïde 15min avant la procédure. - Micro-coupure à la queue : douleur modérée au moment de la réalisation de la coupure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes d'intérêts.

Remplacement

Cette étude a pour but d'étudier la communication entre les cellules immunitaires et le système nerveux des ilots pancréatiques en condition normale et de dérégulation du taux de glucose sanguin, tels que le diabète. Les ilots pancréatiques répondent à la prise de poids et au dialogue entre différents organes. Cela implique donc d’étudier différents paramètres dans différents organes. Ainsi les modèles animaux sont nécessaires pour mener à bien ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour permettre l’analyse des résultats selon des tests statistiques adaptés. Des tests in vitro ont été inclues pour mettre en place des protocole adaptés et réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Dans les cages les souris bénéficient de coton et de « maisons » afin d’augmenter la diversité de leurs activités et qu’elles puissent se construire un nid. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum). Lorsque nécessaire, la douleur et la gêne des souris sont réduites à un niveau modéré par l’administration d’anti-douleur et par l’anesthésie. Les souris sont surveillées régulièrement et lors des procédures, les paramètres de santé qui peuvent être affectés sont évalués et notés régulièrement. Les souris diabétiques urinant plus souvent, pour permettre une bonne hygiène des souris les cages seront changées deux fois par semaines.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal de référence dans l'étude de l'obésité. De nombreux outils sont disponibles chez la souris. Les souris sont utilisées entre l’âge de 10 jours et 22 semaines.

640 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée de cellules de mélanome, six injections d'immunothérapie et un prélèvement de sang par voie rétro-orbitaire, la tumeur pouvant "gêner le déplacement de l'animal". Les tumeurs sont récupérées après mise à mort. Les retombées annoncées pour les patients, améliorer la prise en charge du mélanome métastatique, restent renvoyées au conditionnel et au long terme, le porteur affirmant que seul un modèle in vivo permet d'étudier la résistance aux traitements et le système immunitaire.

Objectifs

Le mélanome est la forme la plus agressive des cancers de la peau. Malgré les progrès majeurs apportés par l'essor des immunothérapies, près d’un patient sur deux résiste encore aux traitements. Il demeure donc crucial de comprendre les mécanismes de résistance mis en place par les cellules cancéreuses et de proposer de nouvelles combinaisons thérapeutiques. L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une combinaison de traitement par immunothérapie sur 2 modèles murins de mélanome, et d’appréhender les mécanismes d’action de ces anticorps sur le système immunitaire et les cellules tumorales.

Bénéfices attendus

Le mélanome métastatique est le cancer de la peau le plus agressif. Malgré l’essor récent des immunothérapie dans le traitement du mélanome, des problèmes de résistance sont observés. Tester de nouvelles pistes de combinaisons thérapeutiques avec l’immunothérapie permettrait à terme d’améliorer la prise en charge des patients.

Procédures

Dans ce projet, les animaux seront soumis à 1 injection sous-cutané de cellules de mélanome, qui se fera à 2 manipulateurs et durera moins d'une minute. Ils subiront également 6 injections d’immunothérapie, réalisées en intra-péritonéal, à raison de 2 injections tous les 2 jours. L'injection durera environ une dizaine de seconde. Les animaux subiront aussi un prélèvement sanguin par voie rétro-orbitaire. Le prélèvement se fera sous anesthésie et durera moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Le traitement par immunothérapie, déjà utilisé dans des précédents protocoles pour d’autres types tumoraux, n'induit pas d'effet secondaire entrainant une dégradation de l'état général de l'animal. Les nuisances attendues sont l'apparition de tumeur localisée sur le flanc droit qui pourra possiblement gêner le déplacement de l'animal. Le prélèvement rétro-orbitaire pourra aussi provoquer une irritation de l'oeil.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses histologiques et moléculaires.

Remplacement

Seul un modèle in vivo chez l’animal peut permettre d’étudier la capacité tumorigénique et la résistance aux traitements dans une tumeur. En parallèle, des analyses complémentaires seront réalisées in vitro dans des lignées de mélanome, et sur des prélèvements tumoraux de patients, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Cependant, ces modèles ont des limites et ne permettent pas l'étude du système immunitaire. C’est pourquoi le recours aux animaux est nécessaire dans notre projet.

Réduction

Le nombre maximal de souris utilisées dans ce projet a été calculé au minimum pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et reproductibles. Notre projet sera réalisé dans un premier temps sur la moitié de l'effectif prévu, et si les résultats sont satisfaisants, nous poursuivrons sur le reste de l'effectif.

Raffinement

La bonne connaissance des modèles expérimentaux, le suivi adapté des points limites précoces et clairement définis, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes en expérimentation animale permettent de limiter au maximum toute douleur ou souffrance des souris. Nous évaluerons l'état de bien-être ou de souffrance des animaux au minimum 2x/semaine. Une anesthésie sera réalisée avant le prélèvement rétro-orbitaire afin de diminuer le stress généré, et des gouttes de Collyr seront appliquées afin de prévenir une irritation de l'oeil.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus pertinente pour l’étude du mélanome. Bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. Le modèle murin de mélanome que nous utilisons miment bien la pathologie chez l'homme. D'autre part, la richesse des réactifs disponibles (notamment immunothérapie) permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans notre projet. Des souris adultes de 6 semaines (âge standard pour ce genre d'étude) seront utilisées.

24 souris Hairless vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Trois formulations à principe actif leur sont appliquées quotidiennement sur le dos pendant 14 jours, ce qui "pourrait induire avec le temps le développement de rougeur (érythème) ou de gonflement (œdème)". La peau est prélevée après mise à mort pour évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution. Le porteur affirme que le remplacement "n'est pas envisageable", aucun modèle cellulaire ne reproduisant selon lui le microenvironnement cutané sur un temps prolongé.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer chez la souris la tolérance cutanée et la biodistribution dans la peau de 3 formulations différentes appliquées quotidiennement sur le dos des souris pendant 14 jours consécutifs. Chacune des 3 formulations à évaluer possédera un pricincipe actif différent mais avec les mêmes composants permettant une meilleure diffusion et distribution dans le tissu cutané. Pour effectuer l’évaluation de la tolérance de ces 3 formulations, en comparaison avec une formulation neutre dépourvue de principe actif, une observation quotidienne de la zone traitée sera effectuée avec un scorage de différents paramètres. Un suivi pondéral régulier des souris et une observation de leur comportement seront effectués au cours des 14 jours de traitement. A l’issue des 14 jours de traitement, un prélèvement cutané au niveau de la zone d’application des différentes formulations sera effectué afin de réaliser un ensemble d'analyses qui permettront de caractériser la tolérance, par le tissu cutané, des traitements effectués, et la biodistribution dans la peau des produits appliqués. Cette étude permettra ainsi de sélectionner la formulation ayant la meilleure tolérance cutanée et la meilleure biodistribution au niveau du tissu cutané pour la réalisation d’une étude d’efficacité sur un modèle de lésion précancéreuse de la peau (kératose actinique).

Bénéfices attendus

La kératose actinique est une lésion cutanée développée à partir de cellules constituant 90 % de la couche superficielle de la peau (épiderme), est dont les deux facteurs de risque principaux sont l’exposition solaire avec les rayonnements ultraviolets, ainsi qu’une peau sensible, personnes ayant une peau et des yeux clairs. En France, il s’agit d’une des premières causes de consultation chez le Dermatologue et son incidence double tous les 10 ans proportionnellement au vieillissement de la population. Une kératose actinique se traduit par un épaississement de la surface de la peau aux endroits du corps exposés au soleil pendant une période prolongée. Elle est considérée comme précancéreuse et peut évoluer de différentes manières : elle peut se résorber spontanément, persister ou augmenter de volume plus ou moins rapidement. Dans 16 à 20 % des cas, elle peut évoluer vers un cancer cutané. Différents traitements locaux sont possibles en fonction de la localisation, des caractéristiques du patient et de celles de la kératose actinique. Cependant les effets indésirables varient en fonction du type de kératose actinique et de la durée des traitements nécessaires. Il est donc important et nécessaire de développer de nouvelles thérapies permettant de traiter ces lésions précancéreuses avant qu’elles ne se transforment en lésions cancéreuses, avec la meilleure tolérance possible, par des approches simples et sur des modèles expérimentaux représentatifs de la pathologie humaine. Ces nouvelles thérapies pourront ainsi être évaluées par la suite chez l’Homme et elles permettront d’améliorer la prise en charge de personnes atteintes de kératose actinique.

Procédures

Les 24 souris nécessaires à la réalisation de ce projet seront soumises à une application cutanée quotidienne sur le dos pendant 14 jours d’une formulation neutre ou d’1 des 3 formulations contenant chacune un principe actif différent. Ces applications cutanées effectuées sur animal vigile seront effectuées en 1 minute environ chaque jour. Pour chaque souris, la zone d’application des formulations sera observée quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin de suivre la tolérance cutanée au cours du temps. Ces observations seront effectuées sur animal vigile, en 1 à 2 minutes environ chaque jour.

Impact sur les animaux

Les applications cutanées quotidiennes des formulations effectuées sur animaux vigiles pourront engendrer un léger stress mais qui devrait s’estomper progressivement au cours des 14 jours de traitement, celles-ci étant réalisées en moins d’une minute par du personnel expérimenté et en limitant le nombre de personnes manipulant les animaux et réalisant les traitements. Ces applications cutanées répétées des formulations à évaluer pourraient induire avec le temps le développement de rougeur sur la peau (érythème) ou de gonflement de la peau (œdème) mais avec une douleur induite très limitée du fait des propriétés anti-inflammatoires des principes actifs qui la composent. Les observations quotidiennes effectuées avant chaque traitement n’engendreront pas de douleur et seront réalisées en un temps très court (1 à 2 minutes environ). Un suivi quotidien du comportement des animaux et régulier de leur évolution pondérale sera effectué tout au long de l’étude mais aucune modification comportementale notoire et aucune perte de poids significative ne sont attendues.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 24 souris seront toutes euthanasiées après les 14 jours de traitement cutané. Un prélèvement de peau sera effectué au niveau de la zone traitée pour la réalisation d’analyses qui permettront de caractériser la tolérance cutanée et la biodistribution des 3 formulations évaluées.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles cellulaires permettant de caractériser sur un temps prolongé la tolérance cutanée et la biodistribution de formulations (influence du microenvironnement cutané et processus immunitaire), et ses effets éventuels sur le comportement. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. L’utilisation de souris mâles et femelles permettra d’obtenir suffisamment de données et d’échantillons pour la réalisation des analyses envisagées. S’agissant d’une étude observationnelle et le nombre d’animaux étant limité, aucune analyse statistique ne sera effectuée.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux suite à la réalisation des traitements quotidiens. Les animaux et la région d’application des formulations à évaluer seront observés chaque jour tout au long de l’expérimentation. Le poids sera relevé 3 fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 10% entre 2 pesées ou 20% par rapport au poids maximal atteint est observée, ou si des signes d’intolérance cutanée (érythème ou œdème important, ulcération de la peau) ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, prostration, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Les souris seront placées par 3 dans des cages de 18.9x29.6x12.8 cm dans une animalerie dédiée au souris immunocompétentes. Elles seront maintenues en cycle de lumière inversé pour observer leur comportement pendant leur phase active et ainsi respecter leur horloge biologique (chronobiologie), des morceaux de papier absorbants étant placés dans leur cage comme enrichissement pour assurer leur bien-être, remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris et plus particulièrement la souris Hairless, dépourvue de poils, est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet. Elle est très utilisée pour les études dans le domaine de la Dermatologie notamment pour les études de tolérance cutanée et d’efficacité sur différents modèles de pathologies dont la kératose actinique. C’est donc l’espèce animale la plus appropriée pour ce projet afin d’évaluer la tolérance cutanée et la biodistribution de nouvelles formulations. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris classiquement décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études de tolérance cutanée et de biodistribution (généralement 6 à 8 semaines).

48 souris vont être utilisé·es, gardées en vie et conservées comme reproductrices dans l'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une douzaine de semaines d'apprentissage par renforcement positif, elles passent des tests comportementaux décrits comme "potentiellement modérément anxiogènes" pour évaluer une méthode de capture moins stressante. Le porteur indique que les animaux sont placés dans des situations qu'ils "éviteraient probablement en conditions naturelles" et que leur "liberté comportementale est donc affectée". Il affirme que le projet reste utile "tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs" existent.

Objectifs

Dans un cadre expérimental, les souris sont généralement attrapées à la main par la queue ou en les incitant à entrer dans un tube de transport. Bien qu'il ait été démontré que ce dernier type de manipulation soit moins stressant, il impose l’ouverture de la cage par l’expérimentateur ce qui est susceptible d'induire un certain stress chez la souris capturée et chez celles qui partagent sa cage. En outre, les difficultés rencontrées pour attraper les souris dans des environnements d'hébergement enrichis et complexes, par la queue ou à l’aide d’un tube de transport, peuvent conduire à freiner l'adoption de ces nouveaux types d'hébergement, qui amélioreraient considérablement le bien-être de ces animaux. En entraînant les animaux à venir volontairement dans une boite de transport, en utilisant un apprentissage par renforcement positif, on réduirait l'anxiété due à l’ouverture de la cage et à la capture, et on autoriserait l'utilisation d'environnements plus complexes sans créer de contraintes supplémentaires pour les expérimentateurs. Le premier objectif de ce projet de recherche est de développer un protocole d’apprentissage basé sur le conditionnement opérant, de sorte que chacune des souris, vivant dans un petit groupe social, apprenne à répondre à un signal sonore, différent pour chacune, en venant dans une boite de transport connectée à leur cage d'origine. L'animal pouvant alors être transporté jusqu'au dispositif expérimental. Notre deuxième objectif est de déterminer si cette procédure permet de réduire l'anxiété des animaux comparativement à une manipulation classique dans un tube de transport.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention d’animaux moins stressés lors de la manipulation. Les manipulations des animaux sont nécessaires lorsque les animaux sont placés dans les dispositifs expérimentaux, ou changés de cage. Outre l’intérêt éthique d’éviter le stress, ce stress lié à la manipulation peut notamment affecter les mesures effectuées lors de divers tests comportementaux et affecter la qualité des expériences scientifiques utilisant des animaux de laboratoire. La capture d’animaux dans des environnement complexes (diverses parois, et enrichissements) peut s’avérer encore plus délicate et stressante. Cette procédure permettrait, une fois développée et automatisée, la capture plus aisée des animaux dans ces environnements complexes sans créer un stress supplémentaire ni compliquer le travail des expérimentateurs.

Procédures

Durant une première phase s'étalant sur une douzaine de semaine, les animaux connaitront un apprentissage où les animaux seront récompensés en effectuant certaines tâches. Les animaux seront ensuite soumis à des tests comportementaux non invasifs de brève durée (5 minutes chacun). Les deux premiers sont réalisés l'un à la suite de l'autre. Le second le jour suivant. Ces tests sont réalisés à deux reprises, à une semaine d'intervalle.

Impact sur les animaux

Deux nuisances peuvent résulter du projet. D'une part, les animaux seront soumis à des situations anxiogènes lors des procédures de test, Un certain stress pourra donc en résulter. D'autre part les animaux sont placés activement par l'exprimentateur dans des situations qu'il éviterait probablement en conditions naturelles. Sa liberté comportementale est donc affectée. Les tests comportementaux non invasifs effectués sont communément utilisés pour évaluer l’anxiété des animaux et sont donc potentiellement modérément anxiogènes. Ces tests ne durent que 5 minutes chacun, limitant ainsi la durée de l’exposition des animaux à cette situation anxiogène. Les animaux conservent la possibilité de rester en retrait des zones les plus anxiogènes des dispsitifs de test.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, les animaux n'ayant pas été, en apparence, particulièrement perturbés par les tests comportementaux (après avis du vétérinaire et de la personne en charge de la structure bien être animal), sont maintenus dans l'élevage afin de servir de reproducteurs pour la génération suivante d'animaux.

Remplacement

Le projet visant à élaborer une méthode moins stressante de manipulation des souris ne peut se passer de l’expérimentation sur l’animal. Il est en effet nécessaire que les animaux puissent exprimer leur comportement pour évaluer l'efficacité de cette nouvelle méthode sur une base comportementale. Ce projet demeure d'intérêt tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs, impliquant systématiquement une manipulation des animaux existe.

Réduction

Un total de 4 groupes de 12 individus est prévu. Deux groupes (24 individus) ayant appris à répondre à un stimulus sonore. La comparaison de ce 2 groupes a pour objectif d'évaluer chez des individus ayant connu un même apprentissage, les niveaux de stress liés à un accès volontaire (à un signal sonore), ou incité par l'expérimentateur dans la boite de transport (méthode classique). Deux autres groupes (24 individus) ne sont pas soumis à l'apprentissage. Ces deux groupes permettent d'évaluer l'effet de la procédure d'apprentissage sur les niveaux de stress des animaux. Ils permettent d’évaluer cet effet lors d'un accès via la boite de transport connectée au dispositif et lorsque les animaux sont manipulés de manière classique. Des comparaisons statistiques pourront alors être effectuées sur ces 4 groupes de 12. Cet effectif tient compte de la variabilité interindividuelle relativement importante pouvant exister chez cette souche sauvage de souris. En outre, ces mêmes individus seront testés une nouvelle fois une semaine plus tard, où les individus des différents groupes seront alors incités à entrer dans la boite de transport de manière différentes à celle qu'ils ont connu la fois précédente. Nous tentons d'assurer avec cette répétition qui accroît la puissance des tests statistiques que malgré le nombre relativement réduit d'individus par groupe, un effet marquant de l’accès volontaire à la boite de transport sur les niveaux d'anxiété des animaux sera mis en évidence.

Raffinement

Toutes les cages utilisées pour l’hébergement des animaux dépassent largement le minimum requis pour l ‘hébergement de deux individus (31 x 20 x 14 cm) et sont enrichies par deux tubes de carton, du matériel de construction pour faire un nid et des bûchette de bois. Un suivi quotidien des animaux utilisés permet de vérifier que les procédures d’apprentissage employées, les moyens utilisés pour le transport des animaux et les tests comportementaux ne conduisent pas les animaux à adopter des comportements pouvant traduire un stress ou mal-être chronique. Des points limites sont définis en amont et des mesures appropriées seront prises en cas de blessures ou de comportements anormaux.

Choix des espèces

Les souris domestiques sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale, cette espèce est donc celle qui est la plus concernée par les questions relatives aux manipulations par les expérimentateurs. Nous n’utilisons pas une souche de souris particulière, mais des animaux d’origine sauvage élevés en laboratoire depuis de 15 générations dans notre laboratoire en tentant de préserver au mieux une forte diversité génétique. Nous espérons de ce fait que résultats obtenus sur ce modèle seront d’autant plus généralisables aux diverses souches de souris de laboratoire. Tous animaux utilisés sont des adultes (70 à 160 jours). Cette tranche d’âge est communément utilisée dans bon nombre d’études chez la souris, permettant le transfert de nos résultats à ces nombreuses études.

330 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont exposées à des sensibilisants chimiques par application cutanée et par voie respiratoire, cette dernière réalisée en tube de contention, ce qui peut provoquer une irritation de la peau, des voies aériennes et des signes d'asthme. Les ganglions lymphatiques sont prélevés après mise à mort à des temps successifs. Le porteur affirme qu'aucun modèle cellulaire n'est validé pour ce travail et présente le projet lui-même comme une étape vers un tel modèle alternatif.

Objectifs

L’allergie est classée au 4ème rang des affections chroniques les plus fréquentes par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les symptômes allergiques peuvent prendre des formes cutanées ou respiratoires et font suite à l'exposition répétée des sujets à une substance dite sensibilisante. Jusqu'à 25% des cas d'asthme déclarés sont d'origine professionnelle et font suite à une exposition répétée, par voie respiratoire ou cutanée, à des substances sensibilisantes chimiques. A ce jour, aucune méthode n'a été validée par les instances règlementaires européennes pour identifier les substances chimiques avec un potentiel sensibilisant respiratoire. Or, ces substances présentent un danger pour les individus exposés. La différenciation des lymphocytes T dans les ganglions lymphatiques locaux est une étape déterminante dans le développement de la maladie allergique. L’objectif de ce projet est d’identifier des gènes régulant la différenciation des lymphocytes T au cours du processus de sensibilisation respiratoire chez la souris. Afin d’atteindre cet objectif, deux voies d’exposition seront utilisées sur un modèle murin de sensibilisation qui sera combiné à des outils d’analyse de l’expression des gènes afin d’identifier les gènes cibles exprimés par les cellules immunitaires d’intérêt activées par des sensibilisants respiratoires et des sensibilisants cutanés. L’objectif final est de développer un modèle de culture cellulaire, alternatif au modèle animal, qui permettra d’identifier spécifiquement les substances chimiques ayant le potentiel de déclencher une maladie allergique respiratoire, grâce aux biomarqueurs qui auront été identifiés dans ce projet.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’améliorer les connaissances sur les mécanismes immunologiques mis en jeu au cours de la sensibilisation respiratoire. Ces connaissances sont nécessaires pour améliorer la description des évènements clés menant au développement de l’allergie respiratoire. En outre, de nouveaux biomarqueurs seront identifiés au cours de ce projet, ils permettront de développer un modèle de culture cellulaire alternatif au modèle in vivo permettant de prédire le potentiel sensibilisant respiratoire des substances chimiques. De telles méthodes sont nécessaires, pour identifier le risque associé à l'exposition aux substances sensibilisantes, afin de prévenir le développement de maladies allergiques. Aucun modèle de culture cellulaire n’est validé à ce jour par les instances européennes pour identifier les substances chimiques avec des propriétés sensibilisantes respiratoires.

Procédures

Un lot de 52 souris vigiles sera exposé par application cutanée à 2 sensibilisants allergiques et au solvant approprié. La veille de la première application, les flancs des animaux seront tondus sous anesthésie gazeuse. Les produits seront appliqués sur les flancs des souris à J0 et J5, puis derrière les oreilles à J10, J11 et J12. Les animaux seront mis à mort J0, J3, J7, J10 et J13 après sédation suivie d’une anesthésie profonde (comme pour tous les animaux mis à mort dans ce projet) et les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour être analysés en cytométrie en flux (analyse des protéines d’intérêt par marquage fluorescent). Ensuite, trois lots de 28 souris et un lot de 20 souris vigiles seront exposées par application cutanée à 7 substances et au solvant approprié. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps déterminés par les analyses en cytométrie en flux. Les ganglions lymphatiques locaux seront prélevés pour les analyses d’expression génétique. Un lot de 10 souris sera exposé par voie respiratoire à un mélange d’acétone et d’huile d’olive dans un but de formation. Ces animaux, ainsi que tous ceux qui seront exposés par voie respiratoire au cours du projet, bénéficieront d’une anesthésie légère précédée d’une sédation. Leur réveil sera ensuite induit par injection médicamenteuse après l’instillation. L’exposition respiratoire sera faite à J0, J5, J10, J11 et J12 dans cette procédure. Les animaux seront mis à mort à J13. Un lot de 68 souris sera exposé à un sensibilisant respiratoire et au solvant approprié comme suit : trente-deux de ces animaux seront exposés de façon vigile par voie cutanée à J0 et J5 et 32 autres animaux seront exposés par voie respiratoire à J0 et J5. Tous les animaux seront ensuite exposés à J10, J11 et J12 par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0, J3, J7, J10 et J13. Un lot de 36 animaux sera utilisé pour tester un sensibilisant cutané selon la méthode définie à l’issue du 1er lot de 68 souris. Ensuite, trois lots de 28 souris et 1 lot de 20 souris seront exposés aux mêmes 7 substances que pour l’exposition cutanée par voie respiratoire. Les animaux seront mis à mort à J0 et deux autres temps pour les analyses d’expression génétique.

Impact sur les animaux

Les nuisances subies par les animaux seront principalement dues aux voies d’administration des substances chimiques. Malgré le plus grand soin apporté pour limiter l’inconfort des animaux, la procédure de sensibilisation par application cutanée pourra induire de l’irritation cutanée. L’exposition des animaux par voie respiratoire pourra induire de l’irritation des voies aériennes. L’exposition par inhalation, qui sera faite par voie oro-nasale, pourra induire du stress chez les animaux qui seront mis en tubes de contention. Avec les deux procédures, des signes d’asthme pourront également apparaitre. Dans tous les cas, dès l’apparition de signes de souffrance non réversibles, les animaux seront mis à mort.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de prélever les différents tissus nécessaires aux analyses prévues dans ce projet.

Remplacement

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux à des fins expérimentales car le modèle animal permettra d’étudier les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la différenciation des lymphocytes T lors du processus de sensibilisation in vivo. Aucun modèle de culture cellulaire n’est à ce jour établi et validé pour étudier ces mécanismes. C’est d’ailleurs l’objectif au terme de ce projet : le développement d’un modèle de culture cellulaire à partir des données issues de ce projet afin de proposer un modèle alternatif pour l’évaluation du potentiel sensibilisant respiratoire.

Réduction

Nous avons réduit au minimum le nombre d’animaux utilisés afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques valables entre les groupes expérimentaux. En accord avec la littérature, nous avons porté à 4 le nombre de souris par groupe. En outre, nous allons collecter le maximum de tissus afin de pouvoir effectuer les analyses post-mortem nécessaires à ce projet en utilisant un nombre minimal de souris. L’analyse sur cellule unique permet de diminuer la variabilité entre les individus, car environ 2000 cellules seront analysées dans chaque échantillon, ce type d’analyse permet donc de réduire le nombre d’animaux à inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera évalué chaque jour lors des soins quotidiens apportés par les zootechniciens et lors des contrôles quotidiens effectués par les autres membres participant à ce projet (techniciens de recherche et chercheurs). Les souris seront manipulées par préhension dans le creux des mains. Toutes les personnes intervenant dans ce projet sont formées initialement et de façon continue à l’expérimentation animale et en particulier au bien-être animal. Les gestes réalisés seront maitrisés afin de garantir le confort maximum des animaux lors des traitements. Les animaux seront hébergés par groupe dans des cages répondant aux exigences de la réglementation en terme de dimensions. Un enrichissement varié (maisonnette et éléments de nidification) leur sera apporté. Une observation renforcée après les expositions aux substances chimiques permettra la prise en charge rapide des animaux en cas de souffrance ou d’atteinte de point limite.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris est justifiée pour plusieurs raisons : -la souris est l’espèce couramment utilisée pour les études de toxicologie, elle est notamment l’espèce sélectionnée dans la ligne directrice 429 de l’OCDE (Organisation de Coopération et de Développement Economiques) portant sur le modèle Local Lymph Node Assay qui permet d’identifier les substances chimiques allergéniques; -la composition et le fonctionnement du système immunitaire de la souris sont semblables à celui de l’Homme et les résultats issus des expériences pourront donc être extrapolés raisonnablement aux effets attendus chez l’Homme ; -la souche BALB/c est choisie car son système immunitaire est adapté aux études de sensibilisation allergique. Cette souche, bien qu’orientée Th2, permet d’étudier la différenciation des lymphocytes T en ses différents sous-types et plusieurs études ont montré qu’elle permet le développement d’une réaction allergique respiratoire aux substances chimiques. Les animaux seront utilisés à l’âge de 8-10 semaines, stade de développement auquel la souris atteint l’âge adulte. Nous souhaitons étudier la réponse allergique sur des animaux ayant un système immunitaire mature.

84 souris mâles âgées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur pulmonaire par voie veineuse, une immunothérapie anti-PD1, une supplémentation nutritionnelle, et passent des tests de force et d'endurance sur dynamomètre, tapis roulant et rotarod. Le porteur indique que la pousse tumorale peut entraîner difficultés respiratoires, perte de poids, isolement et léthargie. Il affirme que la culture cellulaire ne permet pas d'aborder les relations inter-organes et conclut à la nécessité de l'animal.

Objectifs

L’immunothérapie est une stratégie thérapeutique en plein essor, notamment dans le cancer du poumon, car elle n’induit pas de toxicité secondaire comme les traitements par radiochimiothérapie. Son efficacité reste cependant à améliorer car tous les patients ne répondent pas aux traitements d’où la nécessité de travailler sur des traitements adjuvants. Nous souhaitons combiner 2 approches pour améliorer cette efficacité : - nutritionnelle : supplémentation en acides gras polyinsaturés et en béta-hydroxybutyrate - activité physique : mise en place d’enrichissement dédié à l’augmentation de l’activité physique volontaire.

Bénéfices attendus

Nous attendons à ce que nos traitements améliorent l’efficacité de l’immunothérapie. Pour voir cela, nous suivrons l’évolution du volume tumoral. Des traitements adjuvants tels qu’une supplémentation nutritionnelle ou la mise en place d’une activité physique adaptée est envisageable au cours du traitement par immunothérapie chez les patients. Il y a donc une réelle possiblité de transfert des résultats obtenus dans ce projet en clinique.

Procédures

Les supplémentations nutritionelles se feront ad libitum, par remplacement de l’eau de boisson par le béta-hydroxybutyrate et avec des croquettes pour les acides gras en débitant une semaine vant la tumorigenèse puis pendat les 30 jours du suivi tumoral. L’implantation des tumeurs sera effectuée par injection I.V dans la veine de la queue. Le suivie du volume tumoral par imagerie de biolomuminescence durera 30jours. L’administration de l’immunothérapie sera effectuée tous les 4 jours pendant les 30 jours de tumorigenèse par injection intra-péritonéale d’anicorps anti PD-1. La tumorigenèse sera suivie par imagerie avec calcul du volume tumoral sous anesthésie à l’halothane. La mesure de la synthèse protéique sera effectuée après injection sous cutané d’un traceur (isotope stable). Le test d'agrippement sera réalisé à l'aide d'un dynamomètre munie d'une grille où la souris s'accroche, le manipulateur tire alors la souris par la queue. La mesure de la vitesse maximale de course sera effectuée sur un tapis roulant, le test s'arrête quand la souris est épuisée, elle reste alors sur une grille en bout de tapis. Le test dure en moyenne une quizaine de minutes. Une habituation au tapis de course aura leiru en amont du test. Le test d'équilibre au rotarod se déroule sur un cylindre en rotation, les souris seront habituées à cette procédure en amont. Le test dure en moyenne 2-3 minutesLe passage en echoMRI implique une légère contention des animaux dans un tube placé dans l'appareil. La mesure dure 1 minute environ. Les mesures de performances physiques ainsi que l'echoMRI auront lieu juste avant l'implanttaion (J0) puis à J15 et J30 post-implantation.

Impact sur les animaux

La tumorigenèse peut s'accompager de difficultés respiratoires, d'une perte de poids, de comportements anormaux, tels que l'isolement social, la léthargie, l'agressivité́ accrue ou une altération de la locomotion. Les souris seront surveillées quotidiennement pour suivre leur comportement général.

Devenir

tous les animaux seront euthanasiés à la fin du protocole pour prélèvements de sang et de tissus

Remplacement

L’utilisation d’animaux, dans ce projet est absolument nécessaire et ne peut être remplacer par l’utilisation de systèmes de culture cellulaire à 2 voire 3 dimensions. En effet, ces systèmes ne permettent pas d’aborder les relations inter-organes et de mesurer simultanément la digestibilité des acides gras polyinsaturés w3 et du béta-hydroxy-butyrate, l’évolution de la fonctionnalité musculaire, de la performance et de la mobilité, le métabolisme protéique musculaire et le statut inflammatoire circulant et enfin l’évolution du volume tumoral.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans en compromettre les objectifs. Il a été déterminé par un calcul d’échantillonnage. Le nombre de souris nécessaires à l’étude est calculé pour une différence attendue de 25% pour le volume tumoral entre les souris supplémentées en acides gras ou en béta-hydroxybutyrate + activité physique et les souris nourries avec un régime standard. Des études antérieures ont montré que la variabilité du paramètre choisi est de 14%. L’effectif est calculé pour un risque de 1ère espèce alpha de 5% et un risque de 2ème espèce béta de 5%. Ainsi, le nombre de souris nécessaires par groupe est de 8. Toutefois, afin d’anticiper une mortalité éventuelle liée à la tumorigénèse, nous avons choisi de débuter l’étude avec des groupes de 12 souris. Le nombre total de souris nécessaires à la réalisation de ce projet est donc de 84. Pour comparer les résultats des différents paramètres mesurés, nous utiliserons une ANOVA (analyse de la variance) à 2 voies (effet régime, effet activité physique, interaction) suivie d’un test de comparaisons multiples, le test de Tukey si les conditions d’utilisation de l’ANOVA sont remplies (normalité des résidus et égalité des variances). Dans le cas contraire, le test non paramétrique de Kruskal-Wallis suivi d’un test de comparaisons multiples non paramétriques, le test de Dwass-Steel, seront réalisés.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement, de soin et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour éviter et réduire au maximum toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable que pourraient ressentir les animaux. Les souris seront hébergées par 6. Tous les animaux auront un accès illimité à leur régime et à l’eau de boisson. Quotidiennement, l’animalier observera le comportement général de chaque souris, son apparence et contrôlera la présence d’eau et de nourriture. Hebdomadairement, les animaux seront pesés et un contrôle de consommation sera réalisé. L’état général de l’animal sera noté sur le cahier de suivi et l’expérimentateur sera informé de toutes observations anormales. Une grille d'évaluation définissant des points limites sera mise en place. Elle permettra d'identifier des points limites notables et des points limites graves. Si un animal présente 3 points limites notables ou 1 point sévère, il sera pris une décision afin de limiter la douleur à son maximum.

Choix des espèces

Pour réaliser notre projet d’étude, nous avons choisi la souris C57BL/6 car nous allons leur injecter des cellules tumorales issues de souris C57BL/6. Le modèle de tumorigenèse est donc syngénique et orthotopique. De plus, ces souris sont très actives en environnement enrichi ce qui est crucial pour tester l’effet de l’activité physique volontaire. Nous avons utilisé cette espèce par le passé et validé toutes les procédures détaillées dans ce dossier avec ces souris. Chez l’homme, le cancer du poumon non à petites cellules est diagnotiqué à l’âge moyen de 65 ans. Nous utiliserons par conséquent des souris mâles adultes de 50 semaines.

540 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales pancréatiques humaines et des injections répétées, la tumeur pouvant provoquer gêne, douleur et démangeaisons au-delà d'un certain volume. Le porteur indique que les souris ne peuvent être ni replacées ni réutilisées, aucune technique ne garantissant l'absence de prolifération des cellules greffées. Il affirme qu'il est "primordial" de tester d'abord le composé chez la souris avant les patients.

Objectifs

Le cancer du pancréas est un cancer rare, l'un des plus difficiles à soigner. En effet, étant longtemps asymptomatique, il est souvent détecté à des stades avancés, ce qui rend son traitement difficile. Un composé d'intérêt donne de bons résultats sur des cellules cancéreuses du pancréas en culture. L'objectif de ce travail est donc d'évaluer l'impact thérapeutique de ce composé chimique sur l'évolution du cancer du pancréas, dans un modèle de tumeurs pancréatiques, greffées chez la souris immunodéprimée.

Bénéfices attendus

En validant l'efficacité de cette chimiothérapie sur un modèle de cancer pancréatique chez la souris, ce projet pourrait améliorer à long terme la survie des patients souffrant d'un cancer du pancréas.

Procédures

Tous les animaux subiront les traitements suivants: Injections sous-cutanées, 1 fois par animal, 10s; Greffe cellules tumorales, 1 fois par animal, durée maximale: 2 mois; Injection intrapéritonéale, 5 fois par animal, 10s ; Anesthésie gazeuse, 1 fois par animal, 3 min maximum.

Impact sur les animaux

S’il y a prise de greffe et formation de tumeurs sous-cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer une gêne et une douleur lorsqu’elles dépassent un certain volume. La tumeur peut induire une tension de la peau, ce qui peut engendrer des démangeaisons et des irritations. Les injections intrapéritonéales répétées peuvent induire aussi une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Une hypothermie peut être observée à l'issue de l'anesthésie gazeuse.

Devenir

Tous les animaux entrant dans la procédure seront mis à mort en fin de procédure. L'injection de cellules tumorales entraîne le développement de tumeurs, développement qui doit être surveillé. Ces souris ne peuvent donc pas être replacées, ni réutilisées, même si la greffe ne semble pas avoir pris: ces cellules peuvent à plus ou long terme induire le développement de tumeurs. Nous n'avons pas de techniques qui permettent d'affirmer qu'aucune des cellules injectées ne prolifère, dans le cas où la greffe ne semble pas avoir pris.

Remplacement

Nous avons démontré en culture l'efficacité du composé chimique sur la survie des cellules tumorales pancréatiques. Pour tester son efficacité chez les patients, il est maintenant primordial de le tester d’abord sur un modèle murin, animal proche de l’homme dans le développement tumoral.

Réduction

Nous avons effectué des hypothèses statistiques pour calculer la taille d'échantillon optimale pour chaque procédure.

Raffinement

Pour s’assurer du bien-être des souris durant la prise de greffe tumorale, elles bénéficieront d'un milieu avec un enricissement adapté. Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l’animalerie et par la personne en charge de la procédure tous les deux à trois jours, afin de détecter tout signe de douleur. Pour limiter la possibilité de souffrance induite par des injections intrapéritonéales répétées, les injections seront réalisées à l’aide d’aiguilles très fines, quasi indolores. Des points limites spécifiques à chacune des procédures ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques, en particulier grâce à l'utilisation d'animaux génétiquement modifiés et à l'élaboration de nombreux outils d'analyse mis en point pour cet animal. L'expérimentation sur animal est d'autre part indispensable pour tester nos modèles in vitro chez l'animal et ainsi vérifier la faisabilité d'études cliniques. Le modèle de souris utilisé ici est le meilleur modèle animal connu pour éviter tout rejet de greffe de cellules tumorales humaines. En effet, ces souris peuvent supporter une greffe de cellules humaines.

Nourries d'un régime pauvre en protéines qui leur fait perdre environ 15 % de leur poids et bloque leur croissance, 360 jeunes souris subissent sept jours de gavage quotidien et reçoivent pendant 50 jours, cinq minutes par jour dans une cage vide, un aliment thérapeutique ou un aliment standard. Au total, 420 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec pesée et mesure quotidiennes sous contention, huit prises de sang sous anesthésie, cinq séjours de dix heures en cage à fond grillagé et deux passages de dix minutes dans une boîte de 40 cm de côté pour évaluer leur anxiété. L'équipe veut montrer qu'un aliment thérapeutique qu'elle a développé, sans huile de palme, fait mieux que la formule actuelle contre la malnutrition aiguë sévère de l'enfant. Le porteur ne précise pas ce que les souris reçoivent par gavage pendant ces sept jours.

Objectifs

Selon un récent rapport de l’Organisation des Nations Unies, 828 millions de personnes ont été touchées par la faim dans le monde en 2021. Parmi les affections liées à la faim, la malnutrition aiguë sévère (MAS), qui se caractérise par une perte de poids très importante et une dysfonction du tube digestif, est une pathologie qui touche à l’échelle mondiale plus de 13 millions d’enfants âgés de moins de 5 ans. La perte de masse sévère chez les enfants de moins de 5 ans cause un cinquième de la mortalité infantile mondiale. Afin de lutter contre cette pathologie un aliment thérapeutique prêt à l’emploi (ATPE) a été développé à la fin du XXème siècle. La composition de cet ATPE n’a pas évolué depuis sa première formulation et pourrait être considérée comme désuète compte tenu des connaissances actuelles en physiologie de la digestion. Ce projet propose de montrer l’efficacité accrue d’un nouvel ATPE par rapport à l’ATPE existant sur la reprise de poids, la fonction intestinale et les fonctions cognitives de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère.

Bénéfices attendus

Au terme de cette étude nous espérons apporter la preuve d’une meilleure efficacité d'un nouvel aliment prêt à l'emploi (ATPE2) par rapport à un ATPE1 de souris atteintes de malnutrition aiguë sévère et valider l’ATPE testé en tant qu’aliment thérapeutique pour combattre la malnutrition aiguë sévère. En plus d'apporter une nouvelle solution pour lutter contre la malnutrition aiguë sévère, la composition de l’ATPE2 est plus respectueuse de l’environnement car il ne contient pas de graisses hydrogénées ou d’huile de palme.

Procédures

Interventions sur animaux : 1) Alimentation hypo-protéinée à volonté pour 360 souris vigiles. 2) Administration par gavage sur 360 souris vigiles (Durée 15 sec ; 1x tous les jours pendant 7 jours) 3) Administration à volonté de l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi sur 360 souris vigiles (Durée 5 min/jours pendant 50 jours). Les souris seront placées dans une cage vide avec une boite de pétri contenant l’aliment thérapeutique prêt à l’emploi ou d’aliment standard. 4) Contention pour mesure de la masse (1x/jours tous les jours, 10 sec), de la longueur de la queue (1x/jours tous les jours, 10 sec) sur 420 souris vigiles. 5) Prélèvement sanguin (1x/7 jours, soit 8 fois, durée 2 min) sur 420 souris anesthésiées. 6) Mesure de l’activité métabolique (cage avec un fond grillagé permettant de collecter l’urine et les fèces) avec une durée de 10h sur 420 souris vigiles (5x) 7) Mesure de l’anxiété et de l’activité locomotrice (1x avant traitement et 1x en fin de traitement, durée 10 min) sur 420 souris vigiles. Les souris sont placées dans une boite de 40x40 cm et sont libres d’explorer cette boite pendant 10 min.

Impact sur les animaux

Un des effets indésirables de la malnutrition aiguë sévère est l’importante perte de poids qui, pour la souris, est de l’ordre de 15%. Cet effet est visible après 4 jours de régime hypo-protéiné. De plus, les souris modèles de malnutrition aiguë sévère n’ont pas une courbe de croissance normale, leur masse n’augmentant pas en fonction du temps. Les aliments thérapeutiques prêts à l’emploi sont des produits alimentaires destinés à l’humain et pourraient avoir des effets indésirables sur les souris (Ex : diarrhée). L’induction de la dysfonction intestinale peut provoquer une inflammation du système digestif chez la souris, ce qui pourrait aussi nuire à la digestion normale de l’animal. Enfin, les prélèvements sanguins répétés sur les souris (1 fois par semaine) lors de nos expérimentations pourraient engendrer des nuisances.

Devenir

A la fin de la procédure les animaux seront mis à mort afin de prélever leurs organes pour des analyses biologiques. Ces analyses permettront de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents à l’effet thérapeutique du nouvel ATPE. Les animaux ne seront donc pas gardés en vie car nous allons collecter l’appareil digestif, le foie, la rate, les reins et le cerveau pour procéder à des analyses biologiques.

Remplacement

L’utilisation de l’animal est inévitable pour notre projet car nous cherchons à caractériser l’effet bénéfique d’un régime alimentaire au niveau systémique. Actuellement aucun modèle in vitro ne permet de mimer le phénomène étudié dans son ensemble et dans sa complexité.

Réduction

L’utilisation de l’animal est réduite au maximum. Dans cette optique, nous utiliserons des groupes de 20 souris par groupe expérimental et nous répéterons les expériences 3 fois afin de rendre nos résultats exploitables. Pour chaque expérience, le maximum d’échantillons autorisés réglementairement seront prélevés sur l’animal afin d’éviter d’avoir à reproduire l’expérience par manque de tissus. Chaque fois que cela sera possible, nous analyserons un maximum de paramètres biologiques sur les mêmes individus afin de limiter le nombre d’expériences.

Raffinement

Le bien-être des animaux sera suivi tout au long de nos expériences et fera l’objet de procédures strictes. Les souris seront toujours hébergées en groupes dans des cages avec une surface réglementaire, avec un libre accès à l’eau et la nourriture. Un suivi des animaux a été mis en place en accord avec le comité de suivi du bien–être animal de notre établissement pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Les animaux auront à disposition des igloos, des bâtons à ronger et cotons pour la nidification. Les animaux seront suivis quotidiennement, permettant la détection précoce d’anomalies éventuelles. Des périodes d’acclimatations à l’hébergement comme à la manipulation permettront de limiter l’angoisse des animaux. Dans le cadre de notre projet la perte de poids est l’élément majeur à prendre en compte. Dans le cas d’un animal montrant une perte de poids supérieur à 20% de son poids initial, l’animal sera exclu de l’étude le temps de son rétablissement et à nouveau alimenté pendant la période de convalescence. Si ce nouveau régime alimentaire ne permet pas une reprise de poids et que l’animal atteint les points limites définis il sera euthanasié. Par exemple, un animal sera euthanasié s’il présente une prostration continue, une déshydratation ou une perte de poids supérieure à 20% de son poids initial. Enfin, les études sont systématiquement optimisées (durée du régime) d’après la littérature. De plus, les traitements sont administrés de la façon la moins invasive possible : alimentation (Administration à volonté). Enfin, les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie générale gazeuse afin de minimiser le stress induit par cet acte sur les animaux.

Choix des espèces

L’utilisation d’animaux vivants est un jalon nécessaire dans la conception de nouveaux médicaments, en particulier pour obtenir la preuve de concept de l’efficacité thérapeutique du produit que nous avons développé. Ce projet a pour but de démontrer qu’un nouvel aliment thérapeutique prêt à l’emploi est efficace dans un modèle de malnutrition aiguë sévère (MAS). Les rongeurs et en particulier les souris, sont fréquemment utilisés pour modéliser les maladies humaines. La pathologie dans notre étude est induite par une diminution de l’apport journalier en protéine. Les souris présentent, dans ce cas, bon nombre des signes physiopathologiques caractéristiques de la maladie (dont la perte de poids, ralentissement du développement). Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il est simple, rapide d’utiliser cette espèce et qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles, par rapport aux autres espèces. La malnutrition aiguë sévère est une pathologie qui peut affecter les individus à tout âge. Nous focaliserons notre étude sur la période de développement post-sevrage jusqu’à l’âge adulte. Les symptômes induits par la MAS, ainsi que les effets indésirables, ont une influence délétère à long terme lorsque cette pathologie intervient pendant l’enfance. Il s’agit donc ici de modéliser cette affection durant le développement, ce qui correspondra à la MAS observée durant l’enfance. De plus, des paramètres de développement pourront être mesurés durant l’expérimentation et comparés à ceux d’un développement normal (Poids, dimension des organes) en fonction de l’âge des animaux.