Souris

4 800 animaux, 2 400 souris et 2 400 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés par voie orale ou par injection, puis sont soumis à un test d'évitement passif où ils subissent jusqu'à cinq stimulus aversifs, un stimulus douloureux servant à créer une mémoire de peur. Le porteur teste des molécules ciblant le système nerveux central pour la mémoire et l'impulsivité, et précise que les animaux ne seront pas réutilisés pour ne pas biaiser les résultats. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit pour un comportement "aussi complexe et intégré que la mémoire".

Objectifs

La mémoire émotionnelle correspond à la mémoire d'un évènement ayant suscité une émotion. De nombreuses pathologies sont associées à une altération de cette mémoire émotionnelle (schizophrénie, alzheimer, syndrome de stress post traumatique) et il est nécessaire de passer par des modèles animaux afin d'évaluer de nouvelles pistes thérapeutiques. Chez le rongeur c'est la mémoire de peur qui est classiquement évaluée comme modèle de mémoire émotionnelle humaine, c'est une émotion très conservée entre les espèces car indispensable à la survie. Cette mémoire émotionnelle s'acquière très facilement et souvent en un seul essai chez le rongeur. Une des activités de notre centre de recherche est de développer de nouveaux composés ayant pour cible le système nerveux central et des pathologies associées. C'est pourquoi l'objectif de ce projet va être d'évaluer les effets de nouvelles molécules et de molécules de référence sur des animaux dans un dispositif d'évitement passif qui permet de tester la mémoire basée sur l'association entre un environnement et un stimulus aversif. Ce dispositif va permettre également d'évaluer l'impulsivité excessive que peuvent présenter certains modèles animaux. Ainsi le second objectif de ce projet sera de mesurer les effets de nouveaux composés ciblant le système nerveux central sur une impulsivité exacerbée que l'on retrouve dans des pathologies du type trouble de l'hyperactivité et déficit de l'attention.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'identifier et de caractériser de nouvelles molécules afin d'apporter les données précliniques nécessaires avant de passer au stade de développement clinique. A moyen - long terme ces données scientifiques permettront de développer de nouveaux candidats médicaments permettant de traiter certaines pathologies à l'origine de déficits de mémoire (schizophrénie par exemple) ou de troubles de l'impulsivité (syndrome d'hyperactivité et de déficit de l'attention par exemple).

Procédures

Les animaux vont recevoir une administration aigüe par voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée ou intramusculaire de molécules à tester. Lors des tests de comportement les animaux pourront être exposés au plus à 5 stimulus aversifs d'une durée maximale de 3 secondes.

Impact sur les animaux

Deux effets indésirables principaux sont attendus sur les animaux : -le stress lié à la courte contention le temps de l’administration de produit, qui pourra également causer une courte et légère douleur sur le site de l'injection intrapéritonéale, intramusculaire ou sous-cutanée. -la douleur passagère liée aux stimulus aversifs de courte durée (1-3s) et répétés maximum 5 fois.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés dans d'autres projets et seront mis à mort à l'issue des 2 procédures. En effet l'objectif du projet étant de travailler sur les mécanisme de mémoire et/ou d'impulsivité, toute réutilisation des animaux dans d'autres études comportementales pourrait être biaisée par les tests précédemment réalisés.

Remplacement

Ce projet ayant pour but de tester l'action pharmacologique de nouveaux composés sur la mémoire émotionnelle à court ou long terme ou sur l'impulsivité, il est nécessaire de passer par des modèles animaux. En effet, l'évaluation d'un comportement aussi complexe et intégré que la mémoire mettant en jeu de multiples aires cérébrales ne peut être réalisée que sur un animal vigile. Il n'existe pas à ce jour de méthode de substitution (in vitro ou in silico) suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet.

Réduction

En raison de la variabilité liée aux études comportementales, un effectif de 12 animaux est nécessaire afin d'obtenir un traitement statistique des résultats satisfaisant. Ces analyses statistiques, réalisées à l'aide d'un logiciel spécifique (Graphpad Prism) nous permettront de nous assurer de la réalité et de la reproductibilité d'éventuelles différences observées entre plusieurs groupe ayant reçu différentes molécules à tester. Les tests de plusieurs molécules ou plusieurs doses d'une même molécule pourront être groupés afin de n'utiliser qu'un seul groupe témoin et le cas échéant un seul groupe recevant une molécule de référence.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie centrale (température et hygrométrie contrôlées) groupés par 3 ou 4 par cage. Une période de 5 jours d'acclimatation après livraison est prévue avant toute expérimentation. Tout au long des études les animaux sont hébergés dans des cages adaptées à l'espèce avec la présence d'enrichissement de milieu (tunnel, igloo, bandes de papier pour nidification, briques de bois à ronger....) et avec accès à l'eau et à la nourriture. Les animaux sont observés chaque jour (week-end compris), une fiche de contrôle du bien-être animal comprenant 30 critères est renseignée chaque semaine. Si plus de trois critères ne sont pas satisfaits sans possibilité d'action correctrice, alors l'animal est exclu du protocole et mis à mort si nécessaire. Les membres de la structure bien-être animal effectuent une observation mensuelle de tous les animaux.

Choix des espèces

Le rat et la souris sont largement caractérisés d'un point de vue comportemental. Ce sont deux espèces très classiquement utilisés et décrites dans la littérature concernant les tests d'évaluation de la mémoire émotionnelle, les protocoles sont très bien établis. Le rat et la souris ont un système nerveux central suffisamment évolué pour envisager une extrapolation à l'homme de certains résultats. En effet, de nombreux parallèles existent entre les caractéristiques de la mémoire étudiées chez le rat ou la souris et les caractéristiques de la mémoire chez l'humain. De plus, la souris et le rat sont deux espèces pour lesquelles il est possible d'avoir des effectifs suffisants permettant d'obtenir des résultats statistique robustes : conditions d'hébergements en animalerie raisonnables, quantités limités de nouveaux composés à synthétiser par la chimie. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte ou jeune adulte chez la souris comme chez le rat. En effet dans la littérature, les tests de mémoire sont classiquement décrits sur des animaux adultes, avec un développement cérébral complet et des capacités cognitives et d'attention fonctionnelles. Eventuellement, des animaux plus âgés pourront être utilisés pour tester l'effet de nouveaux composés sur le vieillissement et le déclin de la mémoire associé.

20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cœur et leurs poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dix d'entre elles sont privées du gène ELK3 et dix sont des témoins sauvages, et toutes passent deux semaines dans un air appauvri à 10 % d'oxygène, ainsi que trois prises de sang à deux ou trois semaines d'intervalle et une échographie du cœur d'une vingtaine de minutes, sous anesthésie gazeuse. Le porteur dit que l'hypoxie peut entraîner "un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées", et cherche à savoir si ELK3 intervient dans la réponse au manque d'oxygène, pour traiter à terme des pathologies liées à l'hypoxie. Le prélèvement sanguin est limité à 25 % du volume sanguin total de la souris, compensé par l'injection sous la peau d'un volume équivalent de solution saline, sans que le texte précise si ce plafond vaut pour chacune des trois prises.

Objectifs

Nos cellules utilisent l'oxygène pour générer de l'énergie efficacement et, lorsqu'elles manquent soudainement d'oxygène, en cas d'hypoxie, des dommages irréversibles et rapides peuvent survenir aux organes. L'hypoxie chronique a également des conséquences, plus particulièrement dans les tumeurs, qui peuvent contribuer à des métastases et au décès. Il existe des mécanismes qui permettent aux cellules de s'adapter à l'hypoxie, dont l'élément-clé est la voie sensible à l'oxygène qui implique le facteur de transcription HIF-1. Ce mécanisme de base est une découverte fondamentale et un élément central dans la compréhension de la détection de l'oxygène dans le corps. Plusieurs composantes supplémentaires ont été découvertes plus récemment, notamment des modificateurs de la structure de l'ADN, des régulateurs des signaux de dégradation, et des facteurs impliqués dans la détection aiguë de l'oxygène. Cependant, il reste de nombreuses autres composantes qui interviennent dans le traitement des conséquences de l’hypoxie et qui restent à étudier, dont le facteur de transcription ELK3. ELK3 intervient dans des voies de signalisation conduisant à la transcription de l'ADN, et joue un rôle dans la migration cellulaire, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins (l'angiogenèse) et l'intégrité vasculaire. De plus, il a été démontré qu'il joue un rôle dans la régulation des gènes sensibles à l'hypoxie, la protéine ELK3 étant elle-même dégradée dans des conditions de faible teneur en oxygène. La plupart des mécanismes de signalisation induits par l'hypoxie impliquant les deux protéines ELK3 et HIF-1 sont distincts, mais liés. On s'attend ainsi à ce que ELK3, tout comme HIF-1, soit impliqué dans l'angiogenèse, des études in vitro en culture cellulaire ayant notamment montré qu'ELK3 est préférentiellement exprimé dans les cellules endothéliales qui tapissent la paroi des vaisseaux sanguins, mais aussi dans le mélanome. Cependant, il reste à élucider si ELK3 est impliqué dans la réponse physiologique à l'hypoxie. Dans ce contexte, nous souhaitons étudier les conséquences de la perte totale d’ELK3 dans le modèle souris, dans des conditions d’hypoxie, sur la fonction cardio-vasculaire et le remodelage vasculaire pulmonaire.

Bénéfices attendus

L'hypoxie joue un rôle important dans les causes de mortalité, notamment le cancer, l'ischémie myocardique et les maladies métaboliques, du cœur et des reins, ainsi que dans les maladies de la reproduction telles que la prééclampsie et l'endométriose. Il existe de nombreuses preuves provenant de systèmes in vitro selon lesquelles un ou des facteur(s) de transcription, joue(nt) un rôle essentiel dans la réponse hypoxique. Pour utiliser ces connaissances pour comprendre et finalement traiter les pathologies liées à l’hypoxie, nous devons étudier les rôles de ces facteurs dans un modèle animal. Les expériences prévues devraient apporter une preuve convaincante de son importance physiologique dans l’hypoxie, et nous permettre d’exploiter notre boîte à outils, notamment les molécules que nous avons développées ciblant l'un de ces facteurs de transcription, pour traiter à terme les pathologies associées à l’hypoxie.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 prélèvements sanguins, à 2-3 semaines d'intervalle et à une échographie (durée environ 20 minutes). Ils seront soumis par ailleurs à des conditions hypoxiques (10% oxygène) pendant 2 semaines.

Impact sur les animaux

Les prélèvements sanguins, ainsi que l'échographie pour explorer la fonction cardiaque peuvent entrainer un léger stress ou une douleur chez les animaux. Ils seront effectués sous anesthésie gazeuse. Par ailleurs, les souris seront exposées à des conditions hypoxiques pouvant également entrainer un léger stress, sans pour autant être nuisibles dans les conditions appliquées.

Devenir

A la fin de la procedure, toutes les souris seront mises à mort pour réaliser une nécropsie et prélever des organes (coeur, poumons) en vue des analyses post-mortem

Remplacement

Le rôle de la protéine d'intérêt ELK3 dans le processus d'hypoxie a été étudié par des approches cellulaires dans notre laboratoire, mais pour analyser les effets globaux de cette protéine sur le muscle cardiaque, les vaisseaux sanguins et les poumons, le modèle souris nous semble nécessaire pour nous rapprocher au mieux de la pathologie humaine.

Réduction

Pour chacun de nos tests, nous comparerons le groupe contrôle sauvage et le groupe mutant Homozygotes ELK3. Approche statistique: grâce aux études précédentes et les données collectées sur les animaux contrôles sur plusieurs années, et en tenant compte des tests réalisés au cours de cette étude, nous savons que le nombre de 10 animaux par génotype est suffisant pour détecter des phénotypes spécifiques s’ils existent.

Raffinement

Durant toute l'étude, y compris en cages d'hypoxie, les souris sont hébergées à raison de 3 souris par cage afin d'éviter le stress lié à l'isolement et de maintenir les interactions sociales. Afin de limiter la gêne qui pourrait survenir suite à la baisse de la concentration d’oxygène celle-ci se fera progressivement (en 3 heures). L’exploration cardiaque est indolore, mais une anesthésie sera mise en oeuvre chez la souris afin d'éviter le stress lié à la manipulation, en particulier lors de l'épilation et de l'échographie. L'anesthésie facilitera en outre l'exploration en limitant les mouvements de l'animal. En cas de ralentissement du rythme cardiaque sévère lié à l'anesthésie, la procédure sera arrêtée et les animaux surveillés jusqu'au réveil dans les minutes suivant la procédure Si les animaux présentent une faiblesse trop marquée suite à l'anesthésie, une euthanasie pourra être pratiquée. Le prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie gazeuse et sera limité à un volume de 25% du volume sanguin total de l'animal. Pour compenser la perte de volémie, nous injecterons par voie sous-cutanée un volume équivalent de solution saline (NaCl 0.9% chauffé à 37°C) après le prélèvement sanguin.

Choix des espèces

La souris (Mus Musculus) est l’espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son temps de génération permet de réaliser des études relativement rapides et de récapituler de manière assez fidèle les mécanismes chez l’humain. La nécessité d’utiliser des souris génétiquement modifiées est liée à l’absence de toute mutation spontanée dans cette espèce ou d’autres espèces de mammifères qui correspondrait à la maladie humaine. De plus, la génétique de la souris est bien connue et nous permet d'inactiver le gène d'intérêt specifiquement. Les souris auront 10-12 semaines environ (stade adulte), où l’arborescence et la structure des vaisseaux sanguins seront matures.

380 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante une sonde thermique dans le ventre sous anesthésie, puis elles reçoivent un vaccin, parfois un rappel, six injections d'une molécule faisant baisser la température et des prises de sang répétées, la mise à mort se faisant par prélèvement sanguin important. Le projet mesure l'effet de la fièvre sur la production d'anticorps. Le porteur décrit une douleur possible, une fièvre de un à deux degrés et une perte de poids, et affirme qu'il est "nécessaire" d'étudier cette réponse chez la souris.

Objectifs

La température du corps des mammifères dont l’homme est régulée, mais peut augmenter notamment dans tout le corps lors de la fièvre induite par une vaccination ou un microbe. La température est capable d’influencer la réponse du système immunitaire. L’effet de la température sur la réponse humorale, qui est caractérisée par la production d'anticorps par des cellules spécialisées, les lymphocytes B (LB), reste mal connu. La capacité des LB à produire des anticorps en réponse à la vaccination ou à des microbes est un processus complexe, nécessitant la coopération avec d'autres cellules, et la formation de structures spécialisées dans les organes du système immunitaire (ganglions lymphatiques ou rate). La réponse humorale est également caractérisée par sa capacité à mettre en place une mémoire contre la cible vaccinale ou le microbe, qui perdure plusieurs mois à plusieurs années, et dont le maintien nécessite l’interaction avec différents types cellulaires dans différents organes (rate, moelle osseuse). Le développement de la réponse humorale et la mémoire immunologique sont donc difficiles à modéliser in vitro. Notre but est donc d’étudier in vivo chez des souris l’effet de l’augmentation de la température lors de la fièvre sur la réponse humorale en réponse à une vaccination. Dans un premier temps, nous déterminerons la dose de molécule qui permet de diminuer la température des souris lors d’une fièvre induite par vaccination, sans diminuer l’inflammation. Dans un second temps, nous étudierons l’effet de la baisse de la température induite par cette molécule sur la réponse humorale.

Bénéfices attendus

Comprendre l’effet de la température sur la réponse humorale pourrait avoir un impact dans le domaine de la vaccination : l’élévation de la température pourrait, par exemple, être utilisée pour augmenter la réponse immunitaire (cette stratégie est déjà à l’étude dans le domaine des cancers). De plus, cela permettra d’établir si la prise de médicaments faisant baisser la fièvre suite à une vaccination n’empêche pas la mise en place d’une réponse humorale efficace et durable.

Procédures

Les souris seront implantées avec des sondes thermiques dans le ventre, sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Une semaine plus tard, les souris recevront une injection par voie sous-cutanée de vaccin ou d'une solution contrôle (durée de l'injection : 1 minute) sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Certaines souris recevront en plus deux mois plus tard un rappel vaccinal au même endroit (durée de l'injection : 1 minute) sous anesthésie générale de 10 minutes maximum. Pour faire baisser la fièvre, les souris recevront des injections sous-cutanées de molécules abaissant leur température (6 injections dans les 2 jours suivant l’immunisation). Du sang sera prélevé à différents temps (animaux vigiles, durée du prélèvement 1 minute), et au moment de l'euthanasie sous anesthésie (durée du prélèvement : 2 minutes).

Impact sur les animaux

La vaccination peut induire une douleur au niveau du jarret postérieur et une perte de poids (déshydratation) modérée et transitoire, associée à une élévation de la température (fièvre) de 1 à 2°C pendant 2 jours. L'implantation des sondes thermiques et les injections de molécules faisant baisser la fièvre peuvent induite une douleur. Ces injections et implantations peuvent également conduire à des saignements ou des infections. La répétition des prélèvements sanguins est une source de stress.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de pouvoir prélever différents organes nécessaires à l'analyse de la réponse immunitaire et de l'inflammation.

Remplacement

Nous avons effectué des expériences in vitro afin d’étudier l’effet d’une élévation de la température sur les lymphocyes B. Il est cependant impossible in vitro de reproduire l’environnement complexe impliquant la coopération entre de nombreux types cellulaires qui permet aux lymphocytes B de produire des anticorps in vivo et de devenir des cellules mémoires capables de survivre pendant plusieurs mois. Il est donc nécessaire d’étudier cette réponse in vivo, dans un modèle animal dont le système immunitaire et le contrôle de la température est proche de l’homme, comme la souris.

Réduction

Le nombre de souris a été défini afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

L’implantation des sondes thermiques ainsi que la vaccination se fait sous anesthésie générale. Les animaux sont observés tous les jours, et un suivi clinique des souris est réalisé suite aux différentes interventions. Dans ce but, nous avons mis au point une grille permettant de quantifier la douleur des souris, suivant différents critère comme la perte de poids et le comportement des souris. Les animaux seront observés le lendemain puis deux fois par semaine suite à l'injection des sondes thermiques, tous les jours pendant 7 jours suite à la vaccination, puis 2 fois par semaine. Des points limites ont été établis, et selon le score de douleur et sa persistance, la douleur sera traitée soit par analgésie sauf la première semaine (étude de la fièvre), soit les animaux seront euthanasiés. La perte de poids pouvant être signe de déshydratation sera traitée par injection de solution de réhydratation. L'euthanasie est réalisée par une prélèvement de sang important sous anesthésie générale et traitement analgésique. Afin de diminuer le stress potentiel des souris, elles sont habituées avant les expériences à être manipulées et à des changements d'environnement. Enfin, les animaux sont maintenus sans isolement, avec enrichissement (bâtons à ronger, éléments permettant la nidification, accès illimité à la nourriture et l’eau de boisson).

Choix des espèces

La souris dispose d'un système immunitaire proche de l'homme, bien caractérisé. De plus, c'est un animal qui régule sa température comme l'homme. Les animaux seront utilisés entre 8 et 20 semaines (âge adulte).

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues diabétiques par cinq injections de streptozotocine, elles reçoivent des îlots humains encapsulés par chirurgie abdominale, puis sont suivies trois mois avec prises de sang par section de la queue et tests de tolérance au glucose avant une seconde chirurgie et la mise à mort. Le porteur liste parmi les effets une perte de poids, une hyperglycémie et une possible nécrose de l'extrémité de la queue. Il juge le recours à l'animal "indispensable" et choisit la souris pour consommer moins d'îlots humains, "tissu rare", que le rat.

Objectifs

La transplantation d’îlots pancréatiques est une thérapie prometteuse du diabète de type 1. Celle-ci vise à remplacer les cellules béta pancréatiques (sécrétrices d’insuline) défectueuses par l’injection d’îlots sains (issus de dons multi-organe) par voie intra-portale dans le foie de patients diabétiques. Cette stratégie thérapeutique qui permet une régulation glycémique plus physiologique et moins contraignante que les injections pluriquotidiennes d’insuline. Cependant, cette approche thérapeutique comporte encore de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Depuis les années 80, de nombreuses équipes ont tenté de mettre en place un pancréas bioartificiel basé sur l’encapsulation des îlots pancréatiques. Néanmoins, à ce jour, aucun système n’a réellement montré d’efficacité à long terme sur la survie et la fonction des îlots. Ainsi, cette approche de protection des îlots doit être encore améliorée et c’est dans ce contexte que nous situons notre projet de recherche. Ainsi, dans le but de promouvoir cette thérapie en levant ces verrous, nous souhaitons tester différentes méthodes d’encapsulation des îlots à l’aide d’hydrogels. Nous souhaitons donc tester in vivo l’impact de l’encapsulation d’îlots humains dans le cadre d’une xénogreffe (le donneur est d'une espèce biologique différente de celle du receveur) dans la cavité abdominale de souris rendues diabétiques par injection intra-péritonéale de streptozotocine. Cette étude permettra d’évaluer l’effet protecteur de notre encapsulation sur les réactions de rejet et les réactions inflammatoires.

Bénéfices attendus

La transplantation d’îlots pancréatiques comporte de nombreux verrous limitant son application clinique à grande échelle. En effet, un des verrous majeurs est la réaction inflammatoire massive générée au moment de la transplantation qui est à l’origine de la perte de près de 40% de la masse d’îlots implantée. Un second verrou majeur est la réaction immunologique de rejet qui nécessite la mise en place d’un traitement immunosuppresseur connu pour être délétère pour la survie et la fonction de la greffe à plus ou moins long terme. Ainsi, l’encapsulation d’îlots pancréatiques permettrait de protéger leur destruction par les réactions inflammatoires et de rejet. De plus au vu de la pénurie d’organe inhérent à toute greffe d’organe, l’encapsulation permettrait d’utiliser des îlots pancréatiques d’espèces différentes. Par ailleurs, l’implantation de d’îlots encapsulés dans la cavité abdominale permet de se soustraire de ces réactions inflammatoires médiées par le sang à l’origine d’une destruction massive des îlots post transplantation. Ainsi, notre stratégie permettrait de maintenir à long terme la survie et la fonction des îlots et d’appliquer la stratégie de transplantation d’îlots pancréatiques à un plus grand nombre de patients diabétiques.

Procédures

L’injection de streptozotocine se fera en intra péritonéale à l’aide d’une aiguille 23G. L’injection réalisée sur animal vigile par 1 injection par jour sur 5 jours. La durée de l’intervention (et la contention) durera quelques secondes pour chaque injection. 24 h après la dernière injection, une mesure de glycémie sera effectuée à l’aide d’un glucomètre à partir d’une micro goutte de sang prise à la queue pour vérifier si l’animal est bien diabétique (durée de l’acte quelques secondes). Chez les souris devenus diabétiques, 2 modules d’encapsulation seront implantés dans l’abdomen. Ceci nécessitera une incision de l’abdomen de 1 cm. Chirurgie réalisée sous anesthésie générale et analgésie adaptée et durera environ 15 minutes. Des anti-inflammatoires seront administrés post-chirurgie au maximum pendant 3 jours. Concernant le suivi de la survie et de la fonction des îlots implantés, celui-ci durera 91 jours. Pour cela, tous les 15 jours la prise de poids (quelques secondes), la glycémie capillaire (lecteur de glycémie, quelques secondes) seront mesurées, une prise de sang par incision de l’extrémité de la queue sera effectuée pour la réalisation de divers dosage plasmatique (durée 5 minutes par souris) et un test de tolérance au glucose sera réalisé. Ce test est nécessaire afin de déterminer la fonction réelle de la greffe. Ce test durera deux heures et consistera à injecter dans le péritoine une solution sucré en utilisant une aiguille 23G et de mesurer la glycémie capillaire à l’aide d’un lecteur de glycémie toutes les 5, 10, 15, 30, 45, 60 et 120 min post injection du sucre. Avant le test, les animaux seront mis à jeun 4h (accès à l'eau ad libitum). Une mesure de la glycémie sera effectuée à jeun juste avant l'injection intrapéritonéale du glucose (durée par mesure de quelque seconde). 84 jours après implantation, les implants seront retirés (même méthodologie dispositions prises et durée d’intervention que pour l’implantation). Enfin, 7 jours plus tard les animaux seront mis à mort pour prélèvement final des organes.

Impact sur les animaux

Les principaux effets indésirables attendus sont : - Perte de poids en lien avec l’induction du diabète - Douleurs post-opératoires faisant suite à la chirurgie réalisée pour la mise en place des hydrogels (Laparotomie) - Risque d’infection suite aux implantations des hydrogels - Stress en lien avec la répétition des injections d’insuline (si nécessaires) ou les mesures de glycémies et prises de sang au cours du suivi - Hyperglycémie lié au développement du diabète au cours de l’étude et durant les tests de tolérance au glucose - Détérioration (infection, nécrose) de l’extrémité de la queue suite aux prises de sang et aux mesures glycémiques -Hémorragie post section de la queue - Périodes de mise à jeun.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour la collecte de sang/organes et analyses.

Remplacement

Nous souhaitons valider de nouveaux hydrogels sur la fonction du greffon chez un sujet diabétique. Or la régulation glycémique est un mécanisme complexe faisant intervenir de nombreux organes tous interconnectés entre eux. Ainsi, afin d’étudier si un pancréas bio artificiel est efficace, il ne suffit pas de s’intéresser uniquement à la cellule à insuline isolé mais il est impératif de l’évaluer dans un environnement complexe où tous les acteurs impliqués dans l’homéostasie du glucose sont présent. Le recours à une étude in vivo est alors indispensable.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum tout en permettant, grâce à des tests statistiques adaptés, de mettre en évidence des différences significatives au niveau des paramètres étudiés. De plus, ce nombre est basé sur les différences interindividuelles des animaux et des préparations d’îlots humains que nous isolerons mais aussi sur notre longue expérience obtenue au cours de la réalisation de nombreuses études métaboliques réalisées sur animaux rendus diabétiques par injection de STZ. Cette étude nécessitera 360 souris. Enfin, la succession des interventions sur les mêmes animaux permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour répondre à nos hypothèses.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des cages collectives ventilées et enrichies. En cas de procédure invasive une anesthésie et une analgésie adaptées seront mise en place. De plus, des points limites prédictifs et précoces ont été établis permettant de soustraire l’animal à la souffrance. Les animaux demeurant diabétique recevront une insulinothérapie. Les souris immunodéficientes seront maintenues et manipulées dans des conditions permettant de garantir leur état de santé.

Choix des espèces

Pour répondre à nos objectifs, nous avons choisi le modèle de la souris pour recevoir les îlots encapsulés car celui-ci a l’avantage d’avoir des caractéristiques physiologiques proches de l’Homme. De plus, dans un implant nous souhaitons encapsuler 10000 îlots/kg de poids corporel (quantité utilisée dans le cadre de la transplantation d’îlots chez l’homme nécessaire pour rétablir un équilibre glycémique). Ainsi, nous utiliserons moins d’îlots humain (tissus rare) que si nous utilisions le modèle du rat qui est 10 fois plus gros que la souris. La souche C57BL/6 nous permettra d’évaluer la capacité immuno protectrice de nos hydrogels sur les îlots pancréatiques humains. La souris de souche NSG nous permettra de contrôler la survie et la fonction de nos îlots humains encapsulés et implantés dans un environnement immunodéficient (Contrôle). Pour ce projet les souris seront uniquement utilisés à un stade adulte (Age: 8-12 semaines à leur arrivée à l’animalerie), stade de maturité sexuelle et possédant un système immunitaire mature.

312 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent deux chirurgies, l'une cérébrale l'autre sur la moelle épinière, une stimulation par lumière, un entraînement comportemental dont la nature n'est pas précisée et une mesure du retrait de la patte par un faisceau infrarouge pouvant provoquer une rougeur. Le projet étudie la transmission de la douleur dans un modèle de la maladie de Parkinson. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit ces réseaux nerveux et que les études in vivo sont "indispensables".

Objectifs

En plus du système dopaminergique, les autres systèmes monoaminergiques notamment sérotonergiques sont aussi affectés dans la maladie de parkinson. La sérotonine (5HT) exerce une action analgésique au niveau de la corne dorsale de la moelle épinière. Dans cette étude, nous proposons d'étudier la transmission nociceptive spinale sur un modèle expérimental de la maladie de Parkinson chez la souris. Nous utiliserons des souris transgéniques qui permettront de cibler les neurones à sérotonine par des approches d'optogénétique.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mettre en évidence le rôle des neurones à sérotonine dans le contrôle de la transmission nociceptive et son altération dans un modèle de douleur induit par la maladie de parkinson. L’identification des réseaux impliquant les neurones à sérotonine permettra de mettre au jour de nouvelles pistes thérapeutiques qui pourront ensuite amener de nouveaux traitements pour améliorer le bien-être des patients parkinsoniens. Associés aux traitements des symptômes moteurs, ils apporteront un réel bénéfice aux patients dont la qualité de vie tendra à s’approcher de celle des sujets sains.

Procédures

Dans cette étude, 312 animaux recevront : -Une chirurgie stéréotaxique cérébrale (environ 1h30) et une spinale (environ 45min), -Une stimulation optogénétique d'une durée de 3 min également de l'entrainement comportemental de 10 min. -Electrophysiologie : 2h

Impact sur les animaux

Les animaux subiront deux interventions chirurgicales par stéréotaxie au niveau cérébral et spinal qui présentent des risques potentiels d'infection, d'hypothermie et de douleur. La stimulation thermique à l'aide d'un faisceau infrarouge utilisée pour mesurer le seuil du retrait de la patte arrière peut provoquer une rougeur cutanée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour l'analyse histologique

Remplacement

Il n'existe aucun modèle in vitro sur culture cellulaire pouvant reproduire la physiopathologie étudiée dans ce projet. En effet, nous travaillons sur les relations entre réseaux nerveux matures et interconnectés dans le système nerveux. Ces connexions sont impossibles à reproduire in vitro. Les études in vivo sont donc indispensables.

Réduction

Le nombre d’animaux est réduit au maximum en tenant compte des contraintes expérimentales pour obtenir des résultats statistiquement cohérents et significatifs. La taille des cohortes par groupe a été ajustée aussi pour tenir compte de la variabilité inter-individuelle comportementale et du taux de succès des différentes procédures réalisées chez l’animal.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe au sein de l’animalerie dans un environnement enrichi comprenant des tubes en carton et matériel de nidification. Leur entretien sera pris en charge par le personnel zootechnique. Les chirurgies seront réalisées par des experts et optimisés pour soulager le stress et la douleur post-op et des analgésiques seront adaptés. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long de l’étude. Après la chirurgie, les animaux seront surveillés avec une attention renforcée pour limiter la perte du poids (cage de stabulation 24h sur 24 sur un tapis chauffant, réhydratation, injection bi quotidienne sous-cutanée de saline 0,9% et saline-glucose 5%, nourriture humidifiée sera déposée dans la cage). En cas de problème, une intervention immédiate et selon les points limites spécifiques une conduite à tenir en fonction des points limites généraux et spécifiques. En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées. En cas de non amélioration de l'état général de l'animal, le responsable du projet prendra la décision de la nécessité de mise à mort de l'animal.

Choix des espèces

La souris est largement utilisée car ce modèle d'espèce génétiquement modifiée permet de cibler des populations de neurones identifiées. D'autre part, le modèle inflammatoire a été largement utilisé chez la souris. Il s'agit d'un modèle animal très reproductible, permettant d'inclure le plus faible nombre d'animaux possible dans les protocoles. L’étude doit être réalisée à l’âge adulte lorsque les réseaux neuronaux sont mis en place et le système nerveux est mature. D’où le choix de souris adultes âgées de 8 à 12 semaines.

1 470 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur colorectale, une irradiation puis l'injection d'un produit radioactif au lutétium-177, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur n'attend qu'une "perte de poids légère" et décrit peu d'effets, tout en fixant la gravité à modérée. Il justifie le choix de la souris par sa "petite taille", sa "grande fécondité" et son "coût de production peu élevé", et affirme que l'in vitro ne simule pas la complexité de l'organisme.

Objectifs

Nous proposons dans cette étude de développer, dans une première étape, un nouveau vecteur de TRT (radiomarqué avec le lutétium-177 - 177Lu) ciblant des protéines cibles radioinduites par une radiothérapie (RT) externe de 8 Gy. La RT va ainsi réchauffer la tumeur et induire l’augmentation des antigènes cibles mais aussi l’infiltration de la tumeur par des cellules immunitaires. Dans la seconde étape, nous évaluerons cette réponse immunitaire intra-tumorale et systémique induite par la combinaison de RT et TRT pour deux modèles syngéniques de cancer colorectal de souris

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de développer un nouveau radiopharmaceutique (candidat-médicament) de TRT marqué au 177Lu qui pourra être administré en combinaison avec une fraction de RT externe +/- une immunothérapie

Procédures

- Injection sous cutanée de la tumeur (une seule fois). Le développement de la tumeur prends 10 jours à partir de la date d'injection. - Ensuite le radiopharmaceutique est injecté par voie intra-veineuse (une seule injection sera faite sur les souris, durée d'injection =1h à 2h dépendament du nombre de souris à injecter) - Prélèvement d’organes en fin de manip ou à des temps d’étude bien définis (durée = environs 3 h).

Impact sur les animaux

Une perte de poids légère pourra être observée chez les souris traitées avec la radioactivité durant les trois premiers jours qui suivent l’injection. Aucun autre effet secondaire ou nuisance n’est attendu.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, selon le schéma décisionnel suivant : - Les animaux dont la greffe n’aura pas prise - Euthanasiés à des temps différents selon le planning de l’étude - Euthanasiés si points limites atteints

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet des modalités d’administration de la RT sur la réponse immunitaire, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur culture cellulaire permet de s’affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

En comparaison avec une étude de biodistribution « classique » qui nécessite l’euthanasie des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie par SPECT (Single photon emission computed tomography), nous permet de suivre la biodistribution/pharmacocinétique de la molécule sur une longue période (7 jours) chez le même animal et donc de REDUIRE le nombre d’animaux d’autant. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Afin de garantir la répétabilité des résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations en triplicat.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans des cages de 10 individus en présence d’enrichissement. Les irradiations seront réalisées sous anesthésie gazeuse et aucune toxicité n’est attendue aux doses utilisées. Les injections de chimiothérapies (CT) et d’immunothérapie seront réalisées en vigile en IP ou en per os. Les traitements par CT et immunothérapie ont déjà été réalisés dans ces conditions sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires.[1] De plus, le modèle murin est parfaitement approprié car les expérimentations in vitro ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La prise tumorale dans des souris avec un fond génétique stable est homogène permettant sur un nombre d’animaux relativement réduit de traiter l’ensemble du groupe au même moment. Ainsi il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules cancéreuses syngéniques de souris permet d’étudier la réponse des cellules immunitaires à la présence de cellules cancéreuses d’un même fond génétique. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature. [1]- Schuc et al., “Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice" Toxicol Pathol (2004)

56 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection de fibrilles dans une structure cérébrale liée à la mémoire, puis sont gardées deux mois avant d'être tuées pour analyse. Le projet compare des souris porteuses de la forme APOE3 ou APOE4 pour comprendre comment ce facteur de risque aggrave une maladie du cerveau. Le porteur affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et que la souris reste un outil "unique" pour étudier ces mécanismes.

Objectifs

L’apolipoprotéine de forme APOE4 est un facteur de risque génétique dans plusieurs maladies du cerveau, contrairement à son homologue neutre APOE3. L’objectif de cette étude est de comprendre comment la présence de ce facteur de risque aggrave ces maladies du cerveau. Nous testerons par exemple si la présence de APOE4 accélère la progression de la pathologie par rapport à la présence de APOE3. Nos premiers travaux montrent que des voies de signalisations spécifiques sont altérées par la présence de APOE4 et l’objectif de ce projet est de valider ces données à l’aide de différentes techniques et sur un plus grand nombre d’individus. Cette étude permettra de mieux comprendre le mode d’action du facteur de risque pour pouvoir ensuite mieux diagnostiquer et/ou prévenir ces maladies.

Bénéfices attendus

En utilisant des modèles animaux exprimant un facteur de risque (tel que APOE4), nous pouvons étudier la manière dont il aggrave une pathologie. La mise en évidence d’un lien de cause à effet entre APOE4 et un marqueur de la maladie pourrait permettre de comprendre certains aspects cliniques chez l’Homme car le facteur APOE4 est un facteur de risque associés à certaines maladies du cerveau seulement. En élucidant des bases mécanistiques à leur mode d’action, ces études apporteront des bénéfices en santé humaine en permettant par exemple d’adapter de nouvelles thérapeutiques. Une validation de nouvelles cibles altérées par le facteur de risque dans la maladie ouvrira de nouvelles pistes thérapeutiques, et pourraient également aider à un meilleur diagnostic de cette maladie. En effet, avec le vieillissement, il est parfois difficile de diagnostiquer certaines maladies du cerveau qui présentent des symptômes similaires, malgré la présence de marques pathologiques différentes. La validation de nos cibles est importante à ce niveau car elles pourraient servir de biomarqueurs pour mieux diagnostiquer les patients.

Procédures

Procédure chirurgicale : chirurgie stéréotaxique pour injections de fibrilles aSyn dans une structure cérébrale liée à la formation de la mémoire sur 56 animaux. Le délai post-chirurgical avant la mise à mort de l’animal est de 2 mois. Les souris transgéniques exprimant le facteur neutre humain APOE3 (28 animaux) ou APOE4 (28 animaux) sous la forme KI (en lieu et place du gène murin) seront élevées pendant 5 mois. Elles ne présentent à cet âge aucun signe de dysfonctionnement connu (Jackson laboratories).

Impact sur les animaux

Douleurs sur la zone d’incision chirurgicale prévenue par l’application d’un analgésique local. Douleurs post-opératoires minorés par des antalgiques. Potentielle inflammation évitée par une injection d’anti-inflammatoire non stéroidien. Stress ou un comportement anormal peuvant survenir suite aux chirurgies surveillés quotidiennement pendant une semaine complète de récupération.

Devenir

Tous les animaux (56) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.

Remplacement

La propagation de protéines mal conformée dans différentes structures du cerveau est une caractéristique majeure des maladies du cerveau. Nous utilisons un modèle animal, la souris, pour mimer cette propagation (dans ce projet des fibrilles de synucléine) afin d’étudier les mécanismes moléculaire et cellulaires que cela provoque. Une fois injectées, ces fibrilles de synucléine induisent des altérations mesurables dans différentes structures cérébrales grâce aux connections qu’elles ont entre elles. Il n’est donc pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur les groupes expérimentaux selon les techniques utilisées (approches moléculaires et analyses immunohistologiques). Les calculs faits tiennent compte de la variabilité inter-individuelle qui sera réduite compte tenu que nous utiliserons seulement des animaux mâles dans nos expériences, mais augmentée selon l’efficacité des injections de fibrilles aSyn. Ces dernières seront évaluées à l’aide de tests statistiques adaptés après analyse par immunohistologie.

Raffinement

Afin de raffiner les conditions de vie des animaux, ceux-ci bénéficieront de soins appropriés pour optimiser le bien-être des souris, tels que des éléments d’enrichissement (matériel de construction du nid, barre à ronger) et d’un suivi quotidien. De plus, ils seront maintenus en groupe sociaux avant et après la chirurgie. Des mesures de raffinement sont prises lors de la chirurgie : anesthésie gazeuse supplémentée par une couverture analgésique locale, pommade d’anesthésique au niveau des oreilles (barres d’oreille du cadre stéréotaxique), injection sous cutanée d’un anti-inflammatoire non stéroïdien, pommade à base de vitamine A contre le dessèchement occulaire, tapis chauffant thermostaté préservant la température de l’animal et cage placée en zone réchauffée apr ès l’opération. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance si un problème devait survenir après la chirurgie : la surveillance des souris se fait 1X par semaine de façon détaillée (observation visuelle, suivi de l’aspect général et de la posture, pesées) permettant de s’assurer du bien-être des souris. Un personnel autorisé et expérimenté pratiquera la chirurgie (formation à la pratique des actes chirurgicaux sur les animaux utilisés à des fins scientifiques) et la mise à mort si un point limite est atteint.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie est la souris. Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau car il possède des structures neuro-anatomiques comparables à celle du cerveau humain. En particulier l’hippocampe, le cortex frontal, et les connections nerveuses qui leur sont associées, sont des structures affectées de façon primaire dans ces maladies qui touchent la mémoire. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (3-5 mois) pour avoir des informations sur les interactions entre le facteur de risque génétique étudié dans un cerveau mature et non en formation/développement. Cet âge nous permet également de nous affranchir des effets du vieillissement, pour éviter les facteurs confondants, le vieillissement étant également un facteur de risque des maladies du cerveau en général.