Souris

1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies du crâne pour implanter des électrodes de stimulation et des fibres optiques et injecter des virus dans le cerveau, avant deux mois de tâches de prise de décision et un enregistrement neuronal terminal sous anesthésie. Le porteur signale des douleurs possibles liées aux craniotomies, des infections des sutures et des bagarres entre souris pouvant les blesser. Il justifie le recours à la souris par le fait que l'étude ne serait "réalisable que sur des animaux", et rattache les retombées, de futures pistes de traitement de l'addiction à la nicotine, au long terme.

Objectifs

L’exposition à la nicotine pendant le développement peut augmenter la vulnérabilité à l’addiction, vu que plus de 90 % des fumeurs adultes ont commencé à fumer pendant leur adolescence. Cependant, la manière dont la nicotine produit cette vulnérabilité reste peu connue, limitant ainsi notamment nos pistes d’intervention et de traitements visant à réduire l’usage de la nicotine. L'adolescence est une période où le cerveau est supposé subir une poussée de plasticité qui sous-tend en particulier l'émergence des aspects cognitifs, émotionnels et motivationnels des comportements chez l’adulte, qui sont tous liés à l'activité des neurones dopaminergiques (DA) de l’aire tegmentale ventrale (ATV). L'apprentissage par renforcement et la flexibilité comportementale sont des domaines comportementaux-clés, qui ont été largement associés aux changements d'activité des neurones DA. La flexibilité comportementale fait référence à la capacité d'abandonner des activités précédemment gratifiantes pour explorer de nouvelles stratégies lorsque les conditions environnementales changent. L'exploration est un processus adaptatif important qui permet de découvrir des alternatives plus avantageuses. En particulier, l'exploration peut être orientée vers des options incertaines, puisque la réduction de l'incertitude a une valeur informative. La flexibilité comportementale est donc un comportement-clé dans le cadre de la vulnérabilité à l’addiction, qui peut être changée par l’exposition à la nicotine pendant l'adolescence. D’un point de vue fondamental, ces travaux visent donc à améliorer notre compréhension des effets de la nicotine sur le développement du système dopaminergique pendant l’adolescence, et les effets à long terme d’une exposition à la nicotine pendant cette période sur la prise de décision chez les adultes. De manière importante, si l’exposition à la nicotine pendant l’adolescence produit des changements dans la prise de décision quand ces souris atteignent l’âge adulte, nos résultats nous permettront aussi d’envisager de développer des interventions visant à réduire la vulnérabilité à l’addiction à la nicotine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière les voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle face aux substances addictives et de comprendre comment celles-ci sont impactées par l’usage de nicotine pendant l’adolescence. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité, et elles sont liées à la prise de la nicotine pendant l’adolescence, qui – bien qu’étant un enjeu de santé majeur en France- se généralise avec l’introduction des « e-cigarettes ». Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique permettra d'appréhender efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à cet enjeu sociétal majeur.

Procédures

Une biopsie d’oreille et/ou de queue va être réalisée sur les souris transgéniques. Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'implantater d'électrodes de stimulation electriques, mais aussi d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Tous les chirurgies durent environ 1h chacune. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3-4 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 2-3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 mois environ, et à la fin les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques pourront connaître un inconfort transitoire lors du prélèvement rapide des biopsies. Les souris qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Des infections au niveau des sutures peuvent également survenir. Des bagarres entre souris blessant superficiellement ou gravement certaines souris peuvent aussi survenir. Il peut également y avoir des effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique, pouvant troubler l'activité locomotrice des animaux.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure en tant qu'étude électrophysiologique – Soit si des points limites sont atteints, - Soit que pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous prélevons systématiquement le cerveau de tous les animaux testés afin de confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée. Donc on étudie les cerveaux de tous les animaux utilisés dans ces expériences après leur mort.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité́ du comportement de la souris. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires ainsi que les tests de puissance statistique. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Vu que notre projet porte sur les variations inter-individuelles en identifiant les stratégies idiosyncratiques/personnalisées de souris, un nombre minimum de 50 animaux par groupe pour les expériences comportementales est nécessaire pour atteindre la puissance statistique pour pouvoir comparer ces variabilités. Pour les expériences ne concernant que l’électrophysiologie, notamment en procédure 5, on peut réduire le nombre de souris nécessaires vu que l’analyse est faite par groupe et pas par individu. Pour ces expériences, le nombre de souris nécessaire pour une puissance statistique est 20.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux taches comportementales progressivement pendant la première semaine de conditionnement. Pour faciliter l’habituation des animaux aux manipulations et aux environnements de test, les animaux seront toujours tenus en « berceau » c’est-à-dire sortis de leur cage en glissant les mains ouvertes sous la souris pour la transporter entre les environnements sur les mains ouvertes. Toutes manipulations par la queue de la souris seront évitées. Pour la gestion de la douleur, les souris vont être examinées par le même expérimentateur chaque jour, dès le jour de leur chirurgie. Des points limites adaptés aux procédures ont été définis entrainant une réponse appropriée. Cependant, des bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris. Si l'étendue des blessures n'est pas trop grave, des soins seront apportés aux souris blessées (en fonction de la grille d’évaluation) et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Une fois le regroupement effectué, les souris seront surveillées pendant quelques heures pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si certains effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique sont constatés, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. Les critères d'arrêt surtout pour les phases post-opératoires concernent des signes de douleurs accrues constatés.

Choix des espèces

La souris a été choisie car le système dopaminergique mésocorticolimbique est bien conservé chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs par rapport à l'Homme, anatomiquement et fonctionnellement. En addition, il y a une période adolescente bien marquée chez la souris, ce qui n'est pas le cas chez les espèces comme les invertébrés, les poissons ou encore les oiseaux. Ces deux points indiquent que les souris sont l’espèce idéale pour ce projet. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d'autres modèles. Ces outils génétiques sont des moyens de moduler les réseaux neuronaux (par exemple l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés permet l’invalidation d'un gène, sa réexpression ciblée en utilisant l’optogénétique) difficilement accessibles même chez d'autres mammifères, tels que le rat ou le singe. Les souris sont considérées juvéniles lorsqu'elles sont à moins de 21 jours après la naissance, l'adolescence commence quand les souris sont naturellement sevrées environ 21 jours après la naissance. L'âge adulte est atteint quand les souris complètent leur maturation sexuelle et hormonale à environ 60 jours après la naissance. Des animaux âgés de 3 semaines sont utilisés pour les pré-traitements nicotiniques et les expériences, mais toutes les étapes de chirurgie, conditionnement comportemental, et neurophysiologie/euthanasie ne sont réalisées qu’une fois atteint l'âge adulte.

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de lymphome ou de leucémie puis des injections de vésicules liposomales, pour tester un candidat traitement contre ces cancers du sang. Le porteur indique que les animaux peuvent présenter fatigue, pâleur, difficultés à s'alimenter et signes d'aplasie de la moelle. Sur le remplacement, il affirme avoir déjà validé les composés in vitro et conclut qu'à ce stade préclinique le recours aux méthodes sans animaux "n'est plus possible".

Objectifs

Les Lymphomes et les leucémies sont des cancers des cellules du tissu hématopoïétique caractérisé par un blocage de maturation et une prolifération excessive des cellules cancéreuses. Près de la moitié des cancers du sang sont des lymphomes. Ce sont des cancers du système lymphatique, avec environ 80 % de lymphomes non hodgkinien (LNH) et 20% de lymphomes hodgkiniens (LH). Les lymphomes se caractérisent par la prolifération excessive des lymphocytes (B, le plus souvent, ou T) au niveau des ganglions, du foie, de la rate et plus rarement d'autres organes. Ils provoquent une augmentation de leur taille. La Leucémie Aiguë Lymphoblastique (LAL) concerne les cellules de la lignée issue du progéniteur lymphoïde. Elle représente environ 1,5 nouveau cas pour 100.000 habitants par an, soit environ 1000 nouveaux cas par an en France. Elle se déclare en majorité chez l’enfant de 2 à 5 ans, 75% des malades ont moins de 18 ans, et représente 30% des cancers de l’enfant. La LAL est une maladie hétérogène qui touche les précurseurs des lymphocytes T ou B dans respectivement 25% et 75% des cas. Malgré les améliorations des traitements actuels chez l’homme, les taux de rechute restent élevés. Ainsi, pour réduire l’intensité de la chimiothérapie et traiter avec succès les patients en rechute, il est encore nécessaire de développer de nouvelles thérapies. Nous avons identifié de nouveaux candidats thérapeutiques (immunoliposomes et liposomes biologiques) susceptibles d’être utilisés dans le traitement de ces pathologies. Nous les avons validés dans un premier temps par des méthodes alternatives, à l’aide d’outils in vitro. Nous souhaitons maintenant étudier leurs efficacités dans cette étude préclinique in vivo. Pour cela, nous allons utiliser des modèles murins incluant des xénogreffes de cellules humaines (lignées cellulaires humaines déjà établies) dans des souris immunodéficientes, ou des greffes de cellules leucémiques humaines et lymphomateuses murines (lignées cellulaires murines déjà établies) dans des souris. Lors de cette étude préclinique, les souris seront traitées avec les immunoliposomes afin d’étudier leurs effets sur l’activation de l’immunité antitumorale et le ralentissement de la croissance tumorale.

Bénéfices attendus

En effectuant des expérimentations in vitro sur nos modèles de leucémie et de lymphomes, nous avons identifié de nouveaux composés (Immunoliposomes artificiels) qui bloquent la prolifération des cellules cancéreuses. Après avoir validé in vitro leurs actions, nous souhaitons maintenant tester leurs efficacités sur nos modèles murins in vivo lors d’études précliniques. Le bénéfice attendu du projet concerne la découverte de nouvelles stratégies thérapeutiques moins intenses et susceptibles d’être utilisées dans le traitement des leucémies et des lymphomes et leurs rechutes.

Procédures

Pour les lymphomes, les animaux seront soumis à des implantations de cellules lymphomateuses par des injections sous cutanées (s.c.) sur leur flanc sous anesthésie générale. Une seule injection est prévue par souris, (durée de 30 secondes). Après la greffe, des injections par voie intra-veineuses (i.v.) d’immunoliposomes (2 injections par souris sont prévues, à J6 et J9, durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes soit au maximum durée de 1 minute) sera réalisé Pour les leucémies, les animaux seront soumis à des transplantations de cellules leucémiques par des injections intraveineuses (i.v.) (une seule injection d’une suspension tumorale est prévue par souris, durée totale de 5 secondes sur souris vigile). Après la transplantation, des injections par voie intraveineuses (i.v.) d’immunoliposomes (3 injections par souris sont prévues, à J15, J20, J25 , durée par injection de 5 secondes sur souris vigile). Un prélèvement de sang à partir de la veine de la queue (un seul prélèvement par souris, 1 à 2 gouttes, durée de 1 minute) sera réalisé à J35 jours après la transplantation.

Impact sur les animaux

. Dans moins de 1% des cas, une nécrose de la tumeur peut être observée. les souris peuvent présenter un état de fatigue et une couleur pâle de la peau au niveau des oreilles et aux extrémités des pattes avants et arrières. , elles pourront avoir des difficultés pour s’alimenter , montrer des signes d’aplasie médullaire, Les injections peuvent provoquer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après la procédure.

Remplacement

Pour remplacer des modèles animaux, il est parfois possible de travailler sur des cellules ou des tissus (in vitro). Le recours aux modèles in vitro doit être l’objectif du chercheur si son expérimentation le permet. Les immunoliposomes et les liposomes biologiques que nous allons tester dans ce projet préclinique ont d’ores et déjà été testés in vitro par des méthodes alternatives, sur des lignées cellulaires. Ceci nous permet d’être sûr que les composés qui vont être étudiés in vivo sont fonctionnels sur les cellules cancéreuses. Il nous faut maintenant valider sur des études précliniques in vivo l’efficacité de ces molécules et le remplacement par des méthodes alternatives n’est plus possible à ce stade du projet de recherche.

Réduction

Dans ce projet, nous allons diminuer le nombre d’animaux utilisés à des fins de recherche. S’il est essentiel d’utiliser le plus petit nombre d’animaux possible, il faut néanmoins éviter que cet effort de réduction nuise à la fiabilité des résultats. Une réflexion biostatistique a alors été intégrée à la construction de ce projet. Pour les tests, nous utiliserons des groupes de de 7 souris afin d’effectuer des tests du Logrank, pour les tests sur la viabilité cellulaire, nous utiliserons des groupes de 5 souris afin de réaliser des tests de Student (t test ou ANOVA).

Raffinement

Afin de réduire, supprimer ou soulager la douleur ou la détresse des animaux, et ainsi améliorer leur bien-être, en amont des expériences, nous allons planifier les protocoles nous allons aussi planifier et établir les points limites (ou critère d’arrêt anticipé) de la procédure. Afin de limiter le stress des animaux, ils sont placés par groupe de 5 à 10 dans des cages agrémentées d’éléments en carton ou en plastique leur permettant de se regrouper dans un nid. La litière des cages est changée une fois par semaine et les animaliers veillent quotidiennement à ce que les animaux ne manquent ni d’eau, ni de nourriture. Afin qu’une prise en charge des animaux puisse se faire le plus rapidement possible, nous communiquerons les points limites au personnel de l’animalerie. Après le prélèvement de sang et les injections, nous donnons des soins adéquats, la queue de la souris en légèrement pincée pendant 30 secondes pour éviter tout saignement. Les souris pour lesquelles nous avons prélevé le sang ou injecté sont placées dans une nouvelle cage et dans une litière propre. Une surveillance des animaux sera également réalisée par les expérimentateurs tout le long de la procédure (au minimum 2 fois par semaine puis tous les jours à l’approche du J35 ). Nous avons établi les points limites de nos procédures expérimentales. Les procédures d’euthanasie appropriées seront appliquées des lors où un des points limites est observé.

Choix des espèces

Pour qu’un nouveau traitement puisse être commercialisé, il est nécessaire de mener des études précliniques et cliniques, afin de prouver son efficacité, d'optimiser les dosages mais aussi d'identifier ses effets indésirables possibles. Les études précliniques nécessitent d’avoir recours à des animaux. Nous disposons d’échantillons de cellules lymphomateuses qui sont des lignées cellulaires murines établies et commercialisées et de cellules leucémiques provenant de patients que l’on peut transplanter à des souris immunodéficientes sans crainte de rejet de greffe. L’hématopoïèse et la leucémogénèse des souris (A1, mus musculus) est l’une de celle qui se rapproche le plus de l’homme. L’infiltration des cellules leucémiques dans la moelle osseuse ainsi que dans la rate reproduit la physiopathologie de la maladie. Nous utilisons des souris, car nous possédons des modèles de xénogreffes reproduisant de façon assez fidèle le développement des leucémies humaines. C’est pourquoi l’étude de l’immunité anti tumorale des souris est en effet celle qui se rapproche le plus de l’homme. Les animaux âgés entre 2 et 5 mois seront utilisés, ceci correspond à un âge optimal pour la greffe des cellules lymphomateuses sur le flanc des animaux et des cellules hématopoïétiques saines et leucémiques.

168 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une brûlure du troisième degré, une greffe de peau humaine puis une infection par une bactérie, pour tester un traitement au plasma froid contre les biofilms, avant d'être tuées pour prélever la peau et le sang. Le porteur reconnaît que la brûlure est un dommage inhérent au projet, avec un stress thermique et une infection attendus, et évoque un risque de diffusion sanguine des bactéries. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle de peau reconstruite ne reproduit la véritable inflammation et conclut qu'il est "indispensable" de tester in vivo.

Objectifs

La peau est une barrière physique essentielle pour le corps humain : elle protège l’organisme contre le milieu extérieur. Cependant, lorsqu’elle subit une grave agression comme une brûlure profonde ou que les mécanismes de cicatrisation sont mis à mal comme dans le cas d’ulcères diabétiques, la fonction barrière de la peau n’est plus efficace et l’organisme entier peut être mis en danger. En effet, dans le cas des brûlures étendues ou des plaies chroniques, les infections sont très fréquentes et peuvent mener à des complications comme des amputations ou des septicémies, premières causes de mortalité des grands brûlés. Les infections les plus fréquentes sont provoquées par la bactérie pathogène opportuniste Staphylococcus (S.) aureus. Hypothèse de travail et contexte scientifique : Le plasma froid (PF) contient des électrons, des ions positifs et négatifs, des radicaux, des molécules excitées, des ultraviolets (UV) et génère un champ électrique transitoire. La température du gaz généré est proche de la température ambiante. Le PF est capable d’initier des réactions variées dans les systèmes biologiques et pourrait être utilisé dans le traitement de désordre cutané comme les brûlures et les plaies chroniques. Le plasma permet un traitement local et non pas systémique et n’induit pas de sous-produits à éliminer. Nos expériences in vitro non publiées ont démontré que le plasma froid active des molécules toxiques pour les bactéries. Projet : Pour donner suite à ces résultats prometteurs, nous souhaitons caractériser les mécanismes antibactériens du PF et son potentiel anti-biofilm in vivo. Notre objectif est de démontrer que l’application directe de PF sur une brûlure du troisième degré infectée par S. aureus permettrait d’empêcher la formation de biofilms ou de les éliminer, ainsi que d’en comprendre le mécanisme.

Bénéfices attendus

Ce projet, mené sur un modèle de plaie cutanée par brûlure au troisième degré traitée par une greffe de peau humaine et infectée par des bactéries, permettra de révéler le mécanisme d’un traitement direct par plasma sur la désinfection de ce type de plaie et la prévention de formation de biofilms, une nouvelle piste thérapeutique.

Procédures

Type d'intervention sur animaux vivants : - Anesthésie générale (durée 20 min) - Intervention chirurgicale (durée 20 min) - Injection (durée 1 min, 3 fois par jour pendant les 72 premières heures après la chirurgie) - Infection sur la peau (durée 1-2 min) - Analyse du signal bioluminescent (10 min) Nuisances attendues : - Stress physique d’origine thermique - Lésions et infection cutanée

Impact sur les animaux

La brûlure cutanée sera un dommage inhérent au projet. Un stress physique d’origine thermique est donc attendu. De même, des lésions et une maladie sont attendues suite à l’infection des greffons. D'autres dommages pourraient se produire suite à la diffusion par voie sanguine des bactéries à partir du foyer initial cutané (endocardite, ostéomyélite, choc septique) bien qu'ils n'aient pas été observés dans notre étude précédente.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort à la fin de la procédure qui permettra d‘étudier la formation des biofilms et leur traitement par le plasma froid. Au cours de l'expérimentation, des animaux seront infectés par Staphylococcus aureus. À la fin de l'expérience, des tissus comprenant de la peau infectée et du sang seront prélevés. Le prélèvement de tissus biologiques nécessite l'euthanasie.

Remplacement

Il n'existe pas d'alternative à l’expérimentation animale pour cette étude. En effet, le plasma, en distribuant des espèces actives, agit non seulement sur les cellules cibles mais aussi sur l’équilibre moléculaire in vivo à la fois localement mais aussi de manière plus diffuse autour de la zone traitée. Afin de réduire le nombre d’animaux en expérimentation, la précision et la reproductibilité de la technique ont été validés précédemment sur des cellules cutanées isolées in vitro. Des modèles de peau bio-imprimés en 3D et ex vivo sont également utilisés au laboratoire. Mais ceux-ci ne permettent pas de reconstituer la véritable inflammation et ne contiennent que 3 types de cellules différentes. Il est donc indispensable de tester cette technique in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour mener à bien ce projet est réduit au strict minimum pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative, à savoir 6 animaux par condition, à raison de 7 conditions, en 3 réplicas et 42 animaux donneurs, soit un total de 168 souris. Une précédente expérimentation avait permis de montrer que ce nombre d’animaux par groupe était suffisant pour conclure de manière significative.

Raffinement

Avant et après la brûlure et la chirurgie une analgésie sera maintenue. Les souris anesthésiées seront réchauffées pour prévenir l'hypothermie. Pendant 48 heures après la brûlure, une réhydratation des animaux par injection de solution de réhydratation sera réalisée. Des gels hydriques seront disposés dans les cages. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. La pose de la greffe de peau sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Les souris anesthésiées seront réchauffées. L’injection d’analgésie sera administrée 30 min avant la pose d'une greffe de peau, puis toutes les 8 heures 3 fois par jours après la greffe. Une solution de réhydratation sera injectée pour éviter la déshydratation. Les animaux sortis de l'anesthésie générale seront surveillés pendant 30 min. La mise à mort sera anticipée si l'état de l'animal se détériorait progressivement sans retour à la normale jusqu'à conduire à la prostration, l'immobilité, l'apathie, le hérissement des poils, le tremblement et la cyanose. L’analgésique sera injecté 3 fois par jour. Toutes les souris seront pesées quotidiennement. Les souris seront surveillées une fois par jour pour les activités naturelles telles que l'exploration, le repos, l'escalade, le toilettage, la recherche de nourriture, la nidification et le comportement social. Les points limites généraux seront : une perte de poids significative, des changements de comportement, tels que l'agressivité, l'isolement dans le groupe, l'agitation et l'automutilation, ainsi que des réactions autonomes telles que des pupilles dilatées, une respiration rapide et la piloérection persistante. Un autre point limite spécifique sera la surinfection non liée à la procédure.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour l'étude de l'infection par Staphyloccus (S.) aureus : espèce naturellement colonisée par S. aureus comme l'homme, pathogenèse infectieuse proche de celle de l'homme, espèce permissive à l'infection par S. aureus. Il y a une abondante littérature et des modèles expérimentaux bien établis chez la souris de laboratoire. De plus, nous avons l'expérience de l'expérimentation animale sur cette espèce au laboratoire. Cet animal sera bien adapté à notre problématique. En effet, les plaies étudiées sont faiblement étendues limitant la douleur et les dommages : l'utilisation d'une autre espèce mammifère de plus grande taille comme le rat nécessiterait plus de matériel de départ pour un gain nul. Enfin, une précédente étude réalisée chez la souris a donné des résultats très prometteurs. Les souris auront environ 6 semaines à leur livraison. Une phase d’acclimatation d’une semaine minimum sera observée avant que les animaux ne rentrent dans le protocole. Les souris seront utilisées au stade de jeunes adultes (environ 8 semaines). A cet âge, nous limitons les biais liés à l’utilisation de souris vieillissantes. De plus, leur taille est suffisante pour une manipulation et une brûlure aisée de la peau.

840 souris rendues obèses vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles portent un gilet plusieurs semaines, subissent rasages et applications cutanées quotidiennes ainsi que des séries de piqûres à la queue pour mesurer la glycémie, pour étudier le passage de médicaments à travers la peau et leur accumulation dans la graisse. Le porteur décrit un régime hypercalorique imposé et des manipulations répétées, tout en jugeant leur impact sur le "bien-être" limité. Sur le remplacement, il affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas compte des interactions entre les tissus et qu'il faut prendre en compte "l'ensemble de l'organisme".

Objectifs

Notre projet vise à comprendre comment la composition des formulations utilisées pour appliquer des médicaments sur la peau influe sur la manière dont ces molécules pénètrent la peau et s'accumulent dans le tissu adipeux. Nous cherchons à établir une corrélation entre la nature chimique des substances actives et leur accumulation dans le tissu graisseux en fonction des formulations utilisées. En d'autres termes, nous étudions comment différentes molécules médicamenteuses se déplacent à travers la peau en fonction des composants qui les accompagnent. Cela nous permettra de formuler des médicaments de manière à minimiser leur passage dans le système sanguin, favorisant ainsi leur effet local dans les tissus sous-cutanés. L'objectif est de mieux comprendre la biodistribution des médicaments chez les personnes obèses lors d'une application cutanée.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de découvrir comment les produits utilisés pour appliquer des médicaments sur la peau peuvent influencer la façon dont ces médicaments se répartissent dans notre corps. Nous voulons comprendre comment ces produits affectent la manière dont les médicaments atteignent et restent dans les cellules graisseuses. Ces données permettront de mieux comprendre comment les médicaments se propagent dans le corps des personnes obèses lorsqu'ils sont appliqués sur la peau

Procédures

• Rasage des poils avec une tondeuse spécifique : cela concerne tous les animaux à la fréquence d’1/10j pendant 30j max • Application des formulations cutanées : cela concerne tous les animaux, tous les jours pendant 10 à 30j (durée du traitement) • Mise en place du gilet protecteur : il va représenter une gêne pour l’animal, il est donc nécessaire de l’habituer au port du gilet qui durera 10 à 30j. • Prélèvement sanguin mandibulaire : cela concerne tous les animaux qu’1 fois et sera réalisé sous anesthésie • Prélèvement d’une goutte de sang par piqure au niveau caudal pour la mesure de glycémie. Ce geste est réalisé sur animal vigile à la fréquence de 5 piqures en 2h qui sera renouvelé 3 fois sur l’expérimentation. Ce geste concernera tous les animaux.

Impact sur les animaux

Une période d’acclimatation d’une semaine est prévue avant le démarrage de l’expérimentation afin de réduire le stress des animaux à leur arrivée à l’animalerie. Le régime va engendrer une prise de poids ayant un impact minimal sur leur bien être. Le rasage des poils, l’application des formulations n’induiront pas de nuisances et d’effets indésirables aux doses choisies. En effet, les composés associés à la substance active sont connus pour avoir des propiétées non irritantes. Les doses utilisées pour chaque molècule modèle ne devront pas induire d’effets irritant au niveau cutané ou générer des effets indésirables systémiques. L’apparition d’effets indésirables a été prise en compte dans le cadre des points limites et sera anticipée dans le choix des molécules modèles et des deux doses appliquées. Les souris porteront des gilets aérés afin d’éviter qu’elles lèchent les formulations déposées sur leur peau ou celle de leurs congénères ce qui limite le risque d’effets indésirables ou de modifier les résultats. Par le biais de ce dispositif, l’isolement des individus sera évité. Le gilet sera maintenu en place pendant toute la durée du traitement (10-30 jours) et une acclimatation sera prévue dès le début de l’expérimentation (1h/jour puis une pause d’une journée puis une augmentation du temps pour qu’au bout de deux semaines l’animal soit habitué à le porter pendant 24h. Le dernier mois il portera en permanence le gilet).

Devenir

Mise à mort car un prélèvement de différents organes doit être réalisé

Remplacement

Cette étude consiste à comparer la répartition dans le corps de substances actives en fonction des produits utilisés et des individus (obèses ou non). Nous examinons comment ces substances sont absorbées par la peau, comment elles se déplacent à l'intérieur de celle-ci, et dans quel type de graisses, ils se stockent. D'autres modèles notamment cellulaires ne nous permettent pas de comprendre comment ces deux types de tissus interagissent sur le long terme ni comment ces substances s'accumulent dans les différents types de gras corporel, comme le gras blanc ou brun. C'est pourquoi il est important de prendre en compte l'ensemble de l'organisme dans cette étude.

Réduction

Avant de réaliser des tests sur les animaux, nous allons d'abord vérifier si les substances que nous utilisons pour administrer les médicaments se mélangent bien entre elles en laboratoire. Cela nous aidera à réduire le nombre de combinaisons que nous devrons tester. Ensuite, après avoir fait des tests sur les animaux, nous pourrons éliminer certaines de ces combinaisons. C'est pourquoi nous avons prévu de tester 15 combinaisons différentes, en utilisant 10 médicaments modèles et 5 substances de transport.

Raffinement

Des personnes formées s'occuperont des animaux en veillant à minimiser leur stress. Nous avons veillé à ce que les souris s'habituent à porter les gilets de protection afin de ne pas les stresser. Pendant le traitement, nous veillerons à ce que les souris gardent une interaction sociale durant toute l’expérimentation et un enrichissement de leur environnement. Pour les souris en surpoids, nous tiendrons compte du fait qu'elles peuvent rencontrer des difficultés à bouger, et nous les surveillerons de près afin qu’elles aient accès à la nourriture et à l’eau de boisson. Si elles semblent avoir du mal, nous mettrons la nourriture près d'elles et leur donnerons de l'eau sous forme de gel. Pendant le traitement, nous vérifierons tous les jours si les souris réagissent bien aux médicaments. Si elles semblent avoir mal, nous évaluerons leur niveau de douleur grâce à des critères spécifiques décrits par Lloyd et Wolfensohn (1998).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce a été défini suite à une étude bibliographique de référence qui a été établie sur cette espèce avec des souris âgées de 6 semaines en début de régime alimentaire adapté afin qu’elles atteignent un poids d’environ 150 g pour celles qui auront le régime hautement énergétique.

229 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une anomalie liée aux leucémies aiguës myéloïdes, elles développent avec l'âge des maladies du sang et subissent des injections et jusqu'à dix prélèvements sanguins, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus. Le porteur indique que ces souris peuvent former, rarement, des tumeurs solides de gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que le recours aux animaux est "incontournable" pour saisir les conséquences de ces anomalies au sein d'un "organisme vivant".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier l’un des mécanismes à l’origine de l’apparition d’hémopathies malignes chez l’homme. Les hémopathies malignes sont des affections de la moelle osseuse, tissu qui est responsable de la fabrication de l’ensemble des cellules du sang (globules rouges, globules blancs et plaquettes). Les hémopathies malignes regroupent un ensemble hétérogène de cancers des cellules sanguines ; on distingue les leucémies, les syndromes myélodysplasiques, les syndromes myéloprolifératifs et les lymphomes. Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) représentent la majorité des leucémies aiguës de l’adulte. Comme toutes les hémopathies, les LAM sont la conséquence de nombreuses anomalies génétiques acquises au cours du temps.

Bénéfices attendus

L'étude de modèles animaux reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine pourrait permettre potentiellement de comprendre les mécanismes moléculaires qui sous-tendent la prédisposition au cancer chez les individus présentant des hématopoïèses clonales à potentiel indéterminé (dont les anomalies IDH2). Ceci pourrait permettre également de tester des nouveaux traitements pertinents.

Procédures

Les animaux pourront avoir des injections uniques sous anesthésie locale (durée 1 minute). Des prélèvements de sang sous anesthésie locale seront faits (durée 3 minutes) chez certains animaux, au maximum une fois par semaine quand les animaux développent une hémopathie. Le nombre de ces prélèvements pourra être de 10 au maximum par animal.

Impact sur les animaux

Les injections et les prélèvements de sang pourront impliquer des contraintes et un stress légers et temporaires. Les animaux pourront développer avec l'âge des syndromes hémopathiques avec (rarement) formation de tumeurs solides de gravité modérée.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

Les conséquences fonctionnelles de ces évènements « fondateurs » du cancer ne peuvent être pleinement appréhendées qu’au sein d’un organisme vivant ; en effet ces anomalies génétiques fondatrices influent sur l’expression de nombreux gènes qui eux-mêmes conditionnent le devenir des cellules en réponse aux multiples signaux extra-cellulaires présents chez un individu et au sein d’un tissu (homones, facteurs de croissance etc…). L’utilisation d’animaux est incontournable pour évaluer l’importance des processus biologiques affectés par ces anomalies fondatrices. Pour ces raisons, nous établissons des lignées de souris génétiquement modifiées reproduisant les anomalies moléculaires d’intérêt et développant à terme des pathologies proches de la maladie humaine.

Réduction

Dans toutes les procédures, nous chercherons à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.Les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés par calcul de puissance. Pour les analyses subséquentes, nous utiliserons un test statistique non paramétrique Mann-Whitney-Wilcoxon. Afin de limiter le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, les différentes procédures seront mises en oeuvre séquentiellement, en fonction des résultats obtenus. Les nombres indiqués dans ce projet sont des nombres maximaux.

Raffinement

Tout signe de souffrance ou de douleur chez l’animal entrainera la mise en place d’un soin particulier, antalgiques et morphiniques,. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. Les souris seront maintenues à raison de 5 souris par cage dans un environnement enrichi (nid, maison, tunnel). - Toutes les injections seront réalisées sous anesthésie locale ou générale. - Les prélèvements sanguins seront tous réalisés sous anesthésie générale . Dans la mesure du possible, les souris seront déplacées de leur cage vers l’appareil à anesthésie en utilisant des tunnels pour éviter de les prendre par la queue. - Les souris auront un suivi clinique quotidien.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) est l’animal vertébré le plus utilisé dans la recherche translationnelle sur les cancers et les tests de toxicité, aussi bien qu'en recherche fondamentale. Cela se traduit par un accès à une quantité importante de publications scientifiques et techniques détaillées essentielles à nos études. C'est donc le modèle animal le plus pertinent pour ces études d'hémato-oncologie. Animaux adultes, ces pathologies se développant progressivement avec l'âge chez l'adulte.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un psoriasis provoqué par une crème appliquée sur les oreilles sous anesthésie, et un gavage répété cinq jours sur sept pendant quatre semaines, pour tester une bactérie intestinale censée atténuer les lésions cutanées. Le porteur indique que le gavage répété peut enflammer la sphère ORL et le haut de l'œsophage et provoquer une perte de poids par défaut d'alimentation. Il affirme qu'aucun test sans animal ne peut intégrer la réaction immunitaire de la peau et conclut que l'étude "ne peut être conduite qu'in vivo".

Objectifs

Le Psoriasis est une maladie cutanée chronique qui touche environ 5% de la population générale. De plus en plus d'études suggèrent un rôle du microbiote intestinal (bactéries intestinales) dans le développement des lésions de psoriasis. Ces découvertes permettent d'envisager le développement de traitements probiotiques, à base de "bonnes" bactéries intestinales, qui viendraient améliorer les lésions cutanées après administration orale. Dans cette étude, nous testerons l'impact d'une "bonne bactérie" administrée par voie orale chez une souris atteinte de psoriasis. Le but est démontrer que ce nouveau type de traitement fonctionne sur un modèle de souris (amélioration du psoriasis) avant d'envisager son développement chez l'homme.

Bénéfices attendus

En cas de résultats positifs, une étude chez l'homme sera envisagée : nous pourrons dans ce cas étudier si un traitement oral par P. distasonis (une "bonne" bactérie intestinale aux propriétés anti-inflammatoires) permet d'améliorer le psoriasis chez l'homme.

Procédures

Le traitement à base de P. distasonis, une bactérie intestinale bénéfique, sera réalisé par gavage sur animaux vigiles, 5 fois par semaine sur 28 jours (durée 30 sec). Afin de mimer des lésions de psoriasis, une crème (imiquimod) sera appliquée sur les oreilles des animaux sous anesthésie pendant 30min. Pour cela, les animaux seront anesthesiés 3 jours consécutifs sur 2 semaines consécutives et une derniere fois après resolution de l'inflammation 7 jours plus tard (7 injections = 30sec). La mesure de la réponse clinique (mesure de l'épaisseur de l'oreille) sera réalisée sous anesthésie 5jours/7 pendant 30 secondes.

Impact sur les animaux

Le gavage répété 5j/7 sur plusieurs semaines pourrait induire une inflammation de la sphère ORL et de la partie haute de l'oesophage. Cette inflammation pourrait entraîner une perte de poids par défaut d'alimentation. Ce modèle engendre une inflammation legère au niveau de l'oreille qui ne gène pas la souris et ne gènere pas de grattage. Les souris seront régulièrement anesthesiées (5j/7) durant plusieurs semaines, ce qui peut génerer un stress.

Devenir

Après anesthésie, tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude afin de récupérer les organes ce qui permettra d'analyser les propriétés anti-inflammatoires de P. distasonis

Remplacement

L’objectif de cette étude est d'évaluer l'impact d'un candidat médicament sur un modèle d'inflammation cutanée (psoriasis). Aucun test in vitro ne permet d’intégrer la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés dans leur ensemble dans le cadre de cette pathologie. Celle-ci ne peut donc être conduite qu’in vivo.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe (3 dosages de P. distasonis et un groupe contrôle non traité) est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. Trois dosages de P. distasonis seront testés, celle-ci n'ayant jamais été testée auparavant.

Raffinement

Des mesures seront mises en oeuvre pour optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimation d'une semaine sera respectée avant le debut de la procédure expérimentale, et les souris seront maintenues entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis et suffisamment précoces et prédictifs pour prévenir tout stress et toute douleur de l’animal ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 5jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cas où des animaux perdraient du poids, des aliments réhydratés seraient disposés dans la cage. Pour les gavages, des sondes gastriques souples reconnus pour etre moins irritante pour les animaux seront utilisées et les gavages seront réalisés par une personne expérimentée ayant déjà réalisé des gavages répétés.

Choix des espèces

L’espèce souris est un modèle très utilisé en pathologie immunologique, telle que l'inflammation cutanée et notamment le psoriasis, en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. De plus, l’utilisation de ce modèle, couramment employé dans ce domaine, nous permettra de discuter nos résultats par rapport aux données existantes de la littérature. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au moins une semaine au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 7-25 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

1760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales dans la patte puis plusieurs injections, pour comparer une association de deux traitements anticancéreux chez des souris pourvues ou privées d'un système immunitaire complet. Le porteur indique que la tumeur dans la patte peut réduire la mobilité et l'alimentation, entraîner une perte de poids et parfois des nécroses cutanées. Les retombées pour les patients sont renvoyées au "long terme", l'objectif immédiat restant de décrire la cascade immunitaire qui rend l'association efficace.

Objectifs

Notre intérêt pour l’immunothérapie a explosé ces dernières années grâce à l’apparition de nouveaux types de traitement. Ces traitements sont capables de permettre la mise en place d’une réponse de longue durée contre le cancer mais chez un nombre limité de patients. Un autre traitement appelé anti-VEGFR2 empêche la création de nouveaux vaisseaux sanguins dans la tumeur, limitant ainsi la croissance tumorale en la privant des nutriments et de l’oxygène apportés par le sang. Plusieurs études ont montré que l’anti VEGFR2 était également capable d’augmenter l’efficacité des traitements d’immunothérapies. Cependant, les mécanismes permettant d’expliquer cette amélioration restent encore à découvrir et plus particulièrement ceux impliquant les cellules du système immunitaire. C’est pourquoi nous souhaiterions étudier l’efficacité de cette association de traitements dans des souris possédant ou non un système immunitaire complet. Le but de ce travail est de définir la cascade d’événements menant à l’efficacité antitumorale de l’association d’un anti-VEGFR2 avec une immunothérapie. Notre hypothèse est que l’efficacité de cette association thérapeutique repose sur une réponse immunitaire précise. Pour vérifier cette hypothèse, nous allons utiliser des souris ayant un système immunitaire complet ou non afin de comparer l’importance de certaines cellules sur l’efficacité de l’association thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour les patients en améliorant notre compréhension d'un phénomène immunitaire bénéfique à l'encontre du cancer. A mi-chemin entre la recherche fondamentale et appliquée, ce projet vise à long terme à améliorer les mécanismes immunitaires naturellement mis en place chez les patients cancéreux afin d'augmenter leur chance de survie.

Procédures

Sous anesthésie générale par isoflurane, les animaux subiront 1 injection sous cutanée de 1 minute, 10 jours plus tard, 3 injections Intrapéritonéale (IP) de 1 minute, réparties sur une semaine et certaines souris auront également 1 Intra veineuse (IV), de 1 minute chacune environ.

Impact sur les animaux

Les animaux vont être soumis au maximum à 1 injection IV de 1 minute, 1 injection sous-cutanée de 1 minute sous anesthésie et 3 injections IP de 1 minute, répartie sur plusieurs jours. Les administrations IV et SC ne sont pas connues pour être particulièrement douloureuses. L’injection des tumeurs en sous-cutané dans la patte des souris pourrait diminuer la mobilité des souris ainsi que leur capacité à se nourrir. De ce fait, il est possible qu’un effet indésirable de cette expérimentation soit une perte de poids. En réalisant des injections en sous-cutané, il est parfois possible d’observer la formation de nécroses cutanées. Dans de précédentes expériences, nous avons montré que les traitements n’ont pas d’effets indésirables sur les souris mais nous continuerons de le vérifier.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des expériences afin de prélever les tumeurs.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, les expérimentations in vitro ne suffisent pas à appréhender la complexité d’un organisme. Nous réalisons à ces fins des études sur les modèles d’animaux greffés avec des cellules tumorales. Par la suite, le décryptage des mécanismes moléculaires sera réalisé in vitro.

Réduction

Les groupes expérimentaux seront constitués de n=10 individus afin de générer des cohortes avec suffisamment de puissance pour permettre d’évaluer les effets anti-tumoraux des traitements tout en permettant à une seule et même personne de prendre en charge l’expérience. Les expériences seront réalisées par des personnes parfaitement formées afin d’optimiser la reproductibilité. Le fait que ces animaux soient génétiquement identiques permet de réduire la taille des groupes tout en ayant des résultats fiables. Néanmoins, comme les variations dans les croissances tumorales peuvent être faibles, nous répèterons les expériences 2 fois de manières indépendantes. Des tests statistiques seront réalisés pour permettre d’analyser les données

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un environnement adapté et enrichi. Chaque animal sera examiné et pesé 3 fois par semaine. Si des signes anormaux sont observés chez les souris, la fréquence de surveillance sera augmentée. Les injections de cellules tumorales et les traitements seront réalisées sous anesthésie à l’isoflurane. Aucune douleur associée à ces gestes n’est donc attendue. De plus, leur habituation aux gestes de contention devrait permettre de réduire le stress dû à ces manipulations. Afin de limiter la perte de poids des souris potentiellement due à des problèmes de mobilités induits par les tumeurs, nous allons ajouter des croquettes dans les cages afin que la nourriture leur soit plus accessible. De plus, des enrichissements seront ajoutés dans chaque cage. Les souris auront à disposition des matériaux pour leur permettre de faire leurs nids. Nous avons également mis en place une grille d’évaluation des points limites chez les animaux afin de limiter leur souffrance.

Choix des espèces

Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature. Les souris, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation de par l’utilisation de souris génétiquement modifiés. Enfin, les souris autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme.