Souris

2288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des mutations sont introduites par électroporation dans le cerveau de souris nouveau-nées pour y induire un glioblastome, avant une euthanasie par perfusion intracardiaque précédée d'une thoracotomie sous anesthésie. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet dommageable jusqu'à six semaines, tout en décrivant au-delà une prostration et un poil hérissé qui le conduisent à ne pas garder les animaux plus longtemps. Il conclut qu'aucun modèle cellulaire ne récapitule les niches où se développent ces tumeurs et justifie l'étude sur l'animal entier.

Objectifs

Les glioblastomes (GBM) représentent la forme la plus fréquente et la plus agressive des tumeurs primaires du cerveau avec un pronostic de survie très bas. Lors d’experiences pilotes décrites dans une DAP précédente, nous avons établi un modèle de GBM chez la souris, qui permet d’étudier les étapes précoces de l’apparition des tumeurs. Ces tumeurs se déclanchent à cause de mutations qui surviennent dans des cellules souches du cerveau. Notre équipe travaille depuis longtemps sur ces cellules souches et nous sommes capables d’introduire des mutations en utilisant la méthode d’électroporation in vivo du cerveau de nouveaux-nés décrite dans les procédures et que nous utilisons régulièrement depuis plus de 10 ans. L’analyse de ces cellules ainsi modifiées sera effectuée à différents temps après l’induction des mutations et permettra de caractériser les évènements cellulaires et moléculaires qui interviennent pendant la période d’induction et de développement précoce des GBM.

Bénéfices attendus

Grâce à notre méthode qui permet d’introduire des mutations dans les cellules souches du cerveau, nous avons le moyen unique de pouvoir étudier les étapes précoces du développement des glioblastomes chez l’animal entier, possibilité qui n’existe pas à l’heure actuelle. Notre modèle pourra être utilisé pour tester l’effet de molécules particulières dans le développement précoce de ces cancers ou dans leur régression. Enfin, nous pourrons générer un modèle adulte des glioblastomes reflètant plus fidèlement ce qui se passe chez les patients atteints de ce type de cancer, dans le but ultime d’identifier des pistes thérapeutiques.

Procédures

Interventions: 1) electroporation du cerveau: geste réalisé sous anesthésie générale. Durée de l'acte: 1 minute maximum, effectué sur 2288 animaux nouveau-nés, 1 seule fois par animal. 2) Injection intrapéritonéale, durée moins de 1minute, effectuée 1 fois sur 336 animaux vigiles âgés de 2 à 30 jours, ou 2 fois sur 108 animaux âgés de 21 à 35 jours. 3) Thoracotomie dans le cadre d'une euthanasie par perfusion intracardiaque. Geste réalisé sous anesthésie générale sub-létale (surdosée) après une pré-médication avec un analgésique morphinique. Durée: 5 minutes, 1 seule fois car conduit à la mort de l'animal, sur 2288 animaux.

Impact sur les animaux

Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 77 jours après. Nous pratiquons en routine depuis une douzaine d’année les procédures décrites dans ce projet et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à ces actes sur la santé et le bien être des animaux. L’animal peut ressentir un stress au moment de sa contention et lorsqu’on introduit une aiguille fine dans son abdomen mais au regard de la durée extremement courte de l’intervention (moins d’une minute) nous pouvons estimer que le stress et la douleur induits sont très limités dans le temps. Les produits injectés n’entrainent pas d’effet indésirable sur les animaux. Nous n’avons jamais observé d’effet toxique du tamoxifène (molécule qui permet de réguler le récepteur à l’hormone oestrogène) injecté à des animaux dans d’autres projets. Les lignées transgéniques que nous utilisons dans ce projet sont non dommageables. Les autres effets indésirables attendus sont les effets du développement des tumeurs cérébrales. Dans un précédent projet, nous avons réalisé des expériences pilotes sur plusieurs animaux pour évaluer la taille des tumeurs et leurs conséquences sur leur santé et nous n’avons jamais observé d’effet dommageable selon la grille de score sur des animaux jusqu’à 6 semaines après l’induction des glioblastome malgré que la tumeur occupe une partie importante du cerveau. Il est possible que la tumeur engendre une augmentation de la pression intracranienne mais sans impact visible sur la santé de l'animal. Toutefois, nous avons observé sur quelques animaux l’effet de la tumeur après 6 semaines, qui apparait de façon soudaine et se caractérise par le comportement prostré de l’animal ayant un poil hérissé. Cependant nous ne gardons pas les animaux au-delà de ces 6 semaines car notre projet ne nécessite pas de garder des animaux présentant des tumeurs délétères pour leur santé.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélever leur cerveau en vue de leur analyse

Remplacement

Le but de notre projet est d’étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans les phases précoces de développement des GBM dans le contexte écologique de l’avènement des tumeurs en ciblant les cellules souches neurales de la ZSV des ventricules latéraux qui sont à l’origine de ces GBM. La prolifération et la différenciation de ces cellules souches sont contrôlées par des facteurs extrinsèques ou environnementaux présents au niveau de niches cellulaires qui entourent ces cellules. Ces facteurs sont sécrétés par exemple par les cellules gliales ou celles du système vasculaire. Malheureusement il n’existe pas de modèles cellulaires capables de récapituler ces niches cellulaires.

Réduction

Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules souches directement dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette méthode par électroporation des cerveaux in vivo est utilisée en routine depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin d’optimiser le nombre de nouveaux-nés utilisés par portée et donc de réduire le nombre de portée par expérience. Pour les analyses histochimiques, le nombre d’animaux nécessaires à l’étude a été réduit grâce au fait que chaque cerveau prélevé servira à l’analyse de plusieurs marqueurs. Le nombre d’animaux a été estimé en s’appuyant sur des tests statistiques appropriés pour ce type de procédure (test non paramétrique adapté aux petits échantillons, qui ne sont pas distribués selon une loi normale). De plus grâce à notre expérience concernant l’analyse statistique de résultats obtenus en utilisant ces méthodes dans d’autres projets, le nombre d’animaux pour ce projet a pu être réduit au strict nécessaire.

Raffinement

Selon les recommandations règlementaires, les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 5 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Les animaux sont systématiquement anesthésiés avant toute procédure. Après l’expérimentation, ils sont hébergés dans une salle spécifiquement dédiée à la stabulation post-expérimentation, avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Tout au long de l’expérimentation et de la surveillance post-expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété et à les soulager si elles apparaissent, à agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, à noter les observations faites et les actions entreprises. -Lors de la perfusion intracardiaque, pour éviter toute souffrance, une prémédication de buprénorphine est administrée avant la perfusion, puis les animaux sont anesthésiés par un surdosage d’anesthésique. L’acte n’est réalisé qu’après s’être assuré que l’animal est sans réaction.

Choix des espèces

De façon générale, la souris est le modèle mammifère le plus utilisé par la communauté scientifique pour établir des modèles de cancers in vivo permettant l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des phases précoces de développement de cancer. Le modèle d'induction de glioblastome par mutation de 3 gènes critiques a déjà été décrit chez la souris par d'autres équipes scientifiques et mime différentes caractéristiques cellulaires et moléculaires de la genèse et du développement des glioblastomes. Ce modèle est donc réalisable et pertinent. De plus, grâce à notre adaptation basée uniquement sur l’électroporation, nous pouvons étudier les étapes d’induction et de développement précoce des glioblastomes dans des contextes génétiques mutants existant uniquement chez la souris. Tous les animaux seront électroporés au stade nouveau-né car c’est le stade où les cellules souches neurales qui bordent les ventricules latéraux sont extrêmement nombreuses et peuvent être modifiées génétiquement en introduisant facilement des molécules d'ADN. Les animaux seront euthanasiés à différents temps après l’électroporation, de 2 jours jusqu’à un maximum de 11 semaines, pour suivre l’évolution des cellules génétiquement modifiées. Toutefois la plupart des animaux sera euthanasiée avant 4 semaines.

1392 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire le syndrome de Leigh, une maladie mitochondriale mortelle, elles développent une perte de poids, un retard de croissance puis une faiblesse musculaire et des difficultés respiratoires avant d'être tuées à des âges définis pour prélever leurs organes. Le porteur présente cette première étude comparative de deux modèles murins comme une source de connaissances sur une maladie sans traitement. Il affirme que les lignées cellulaires ne peuvent pas reproduire les mécanismes d'adaptation de l'organisme entier.

Objectifs

Les maladies mitochondriales sont des maladies causées par des mutations du génome des mitochondries, les centrales énergétiques des cellules, ou du génome nucléaire, et à l’issue souvent fatale. Elles peuvent se manifester à tout âge et se présentent comme des maladies qui affectent généralement les muscles et le cerveau. Il n’existe pas de thérapies efficaces contre ces maladies à ce jour, en raison d'une compréhension insuffisante des mécanismes sous-jacents. Des mécanismes complexes impliquant une réponse au stress lié aux déficits des mitochondries sont de plus en plus suspectés d’être impliqués dans ces pathologies. Le syndrome de Leigh représente la maladie mitochondriale pédiatrique la plus courante. C'est une maladie mortelle affectant à la fois le cerveau et les nerfs. Elle est causée par des mutations de plus de 75 gènes impliqués dans le métabolisme mitochondrial. Ce projet, financé par l’Association Française contre les Myopathies, vise à caractériser de manière exhaustive les mécanismes de réponse précoce au stress induits dans les organes par un dysfonctionnement des mitochondries, en comparant différents modèles de souris du syndrome de Leigh. Ceci devrait permettre d’avoir une meilleure connaissance des mécanismes physiopathologiques du syndrome de Leigh, afin de définir de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Il s'agit de la première étude comparative métabolomique de 2 modèles murins du syndrome de Leigh, et qui, de ce fait, devrait apporter des connaissances importantes sur cette pathologie qui ne dispose d'aucun traitement à l'heure actuelle. Elle pourrait nous aider à identifier des cibles thérapeutiques concrêtes et jusqu'à aujourd'hui non suspectées.

Procédures

Les animaux ne vont pas subir d'intervention puisqu'ils seront euthanasiés dès qu'ils atteignent l'âge requis pour un prélèvement d'organes post-mortem (7 jours, 14 jours, 21 jours, 28 jours, 35 jours et 42 jours).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans ce projet ont un phénotype dommageable qui commence par une perte de poids et un retard de croissance (à respectivement 4 et 3 semaines), puis des difficultés progressives à se mouvoir qui vont à terme résulter en phénotype de faiblesse musculaire, avec difficultés respiratoires peu avant le décès (vers 8 et 7 semaines respectivement).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure, car nous réalisons uniquement des prélèvements d'organes post-mortem à différents âges d'analyse.

Remplacement

Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle par un modèle in vitro, car les modèles physiopathologiques par définition étudient les conséquences pathologiques de la mutation sur l’ensemble de l’organisme. Les lignées cellulaires tels que les cellules de peau de patients atteints par le syndrome de Leigh ne peuvent pas reproduire les mécanismes complexes d'adaptation physiologique systémiques liés à ces dysfonctionnements des mitochondries.

Réduction

Nous réduisons au maximum le nombre d'animaux à utiliser pour obtenir des résultats exploitables au niveau statistique. Ainsi nous allons utiliser les mêmes souris pour les échantillons tissulaires destinés à la protéomique et la transcriptomique. Pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique, nos expériences solides de ces méthodes Omics nous impose d'utiliser au minimum 15 souris/groupe expérimental pour la métabolomique.

Raffinement

Nous raffinons nos conditions d'expérimentation et d'hébergement pour le bien-être de nos animaux. En concertation avec la structure de bien être animal, les animaux sont hébergés dans des cages aux normes (au minimum par 2 et au maximum par 5) suivant l’âge et le poids des animaux. De plus les cages sont enrichies par des jouets (maisons, copeaux, papier…). Les animaux sont surveillés quotidiennement par le personnel compétent. En raison du phénotype dommageable des souris, nous ajoutons de la nourriture directement dans les cages, et utilisons des biberons avec tétine longue, pour permettre aux animaux de s'alimenter plus facilement.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour les maladies humaines, car l'organisation de son génome est très similaire à celles de l'homme. De plus, la disponibilité de souris génétiquement modifiées permet d'étudier finement les mécanismes sous-tendant la pathogenèse de ces maladies mitochondriales. Dans le cas présent, l'utilisation de deux modèles du syndrome de Leigh, qui présentent des atteintes mitochondriales différentes , permettra de mieux comprendre la pathogenèse de cette maladie. Les souris seront utilisés à divers stades post-naissance, de 7 jours à 42 jours, afin de déceler les changements rapides qui s'opèrent lorsque le syndrome de Leigh se développe chez ces animaux.

1000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut recevoir jusqu'à 240 administrations de composés et subir jusqu'à 44 prélèvements sanguins sur 120 jours, avec des mesures d'écartement des doigts et d'influx nerveux sous anesthésie, pour tester des molécules myorelaxantes contre la spasticité. Le porteur résume les bénéfices attendus à l'espoir de "participer à la sélection de nouveaux traitements". Il affirme qu'aucune méthode de remplacement n'est disponible pour un phénomène aussi complexe que la myorelaxation.

Objectifs

12 millions de personnes dans le monde souffrent d’un désordre moteur appelé spasticité. Il s’agit de contractions exagérées d’un muscle entraînant des troubles des mouvements et/ou de la posture qui peuvent être chroniques et douloureux. Ainsi, tout mouvement locomoteur devient difficile voire impossible ; les conséquences sont très invalidantes et peuvent aller jusqu’à la mise en danger de la vie des personnes. Sa prise en charge médicale repose sur des traitements dont l’objectif est soit de provoquer la relaxation musculaire, soit d’empêcher la stimulation du muscle par le nerf. Ainsi, les médecins utilisent les myorelaxants mais leur niveau d’efficacité reste faible. Les patients peuvent aussi être pris en charge par l’utilisation de la toxine botulique. Ce traitement est efficace mais n’agit qu’après quelques jours et doit être renouvelé régulièrement. Des recherches sont donc faites pour améliorer l’efficacité, la puissance, la rapidité et la durée d’action de ces traitements. Après une évaluation in vitro des nouvelles molécules, les plus prometteuses sont testées dans ce projet chez la souris, afin de valider leur efficacité.

Bénéfices attendus

Avec ce projet nous espérons participer à la sélection de nouveaux traitements pour la spacticité.

Procédures

Nous évaluerons sur l’ensemble des animaux les écartements entre les doigts et mesurerons l’influx nerveux et musculaire sous anesthésie une fois avant le début du traitement. Une fois les traitements commencés, le premier jour nous évaluerons jusqu’à 6 fois l’écartement des doigts et nous mesurerons jusqu’à 4 fois l’influx nerveux et musculaire et nous pourrions être amener à évaluer jusqu’à 4 fois la répartition du poids de l’animal sur ces pattes. Les deux semaines suivant l’injection, les tests seront effectués un maximum de 4 fois par semaine pour les deux tests puis 2 fois si l’étude dure plus de 2 semaines. Concernant l’écartement des doigts, il pourra être évalué 2 fois par jour les deux premières semaines puis 1 fois par jour au-delà de deux semaines. Ce qui donne un total de 226 tests (140 écartements des doigts, 43 mesures d’influx neuromusculaire et 43 mesures de distribution pondérale). En considérant un début de traitement des animaux en J0, le composé sera donné au maximum 240 administrations per os, sous-cutanés ou intrapéritonéale ou par 120 administrations intra-nasales ou intramusculaires ou encore par 10 injections intra-veineuse. En parallèle des teste des prélèvements de sang peuvent avoir lieu en cours d’expérience. Selon les tests et la voie d'administration choisie, les animaux pourront subir de 1 à 44 prélèvements sanguins sur la période de 120j en ne dépassant pas les recommandations éthiques en terme de volume prélevé et en garantissant le délai de récupération réglementaire

Impact sur les animaux

Dans ce modèle, les molécules testées peuvent induire une myorelaxation, ce qui pourrait gêner les animaux dans leurs activités quotidiennes. De plus, le test mesure de l’influx nerveux et musculaire (EMG) met en œuvre une anesthésie générale qui peut créer un certain inconfort pour l’animal. Les administration répétée ainsi que les potentiels prélèvements sanguins peuvent également induire des nuisances au niveau des sites d’administration et de prélèvement : comme une douleur passagère, une irritation, une inflammation, une induration. Un stress lié au différentes manipulation et aux tests comportementaux peut également apparaitre.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. « Une partie des animaux est sacrifiée pour faire des prélèvements, l’autre partie ne peut pas être replacée ou ré-utilisée car les animaux sont traités avec des substances à long terme.

Remplacement

La myorelaxation étant un phénomène complexe qui met en jeu plusieurs acteurs (muscles, nerfs, …) et différents processus de contrôle, actuellement aucune méthode de remplacement n’est disponible pour étudier la problématique du présent projet. Néanmoins, les molécules testées dans ce projet ont fait l’objet d’une sélection sur des tests in vitro afin de choisir celles qui ont le plus fort potentiel thérapeutique.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’informations scientifiques par test. Les groupes expérimentaux seront constitués au maximum de 10 animaux. Si des informations préalables existent pour permettre de tester seulement 8 animaux par groupe, nous le ferons. Toujours dans l’idée de diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés les animaux subiront un enchaînement de gestes expérimentaux au sein d'une même procédure. Des analyses statistiques seront réalisées.

Raffinement

Le bien-être des animaux est primordial pendant les expérimentations. Ainsi un certain nombre de mesures sont mises en œuvre notamment une inclusion de phase d’acclimatation (minimum 1 semaine) avant toute expérimentation. Les animaux sont hébergés dans des conditions optimales afin de réduire au maximum le stress lié à la captivité et aux expérimentations. Les animaux seront hébergés en cohorte pour respecter leurs besoins sociaux. Nous portons une attention particulière à ce que les animaux puissent exprimer certains de leurs comportements propres par un enrichissement important du milieu. L’enrichissement du milieu comporte un tunnel en carton accroché à la grille de la cage afin d’en augmenter le volume utile, une maisonnette en carton afin de permettre aux animaux de se cacher et de la frisure pouvant servir de matériel de nidification, de jeu et de matériel à grignoter. Les animaux sont observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. De plus dès la première administration les animaux sont pesés tous les jours. Les manipulations sont faites par du personnel compétent. Le nombre et la durée des tests sont réduits et espacés autant que possible. Les mesures d’EMG sont réalisées sous anesthésie générale (isoflurane/oxygène) afin d’éviter que l’animal ne bouge. Les mesures de DAS sont autant que possible couplées à la prise du poids afin de ne manipuler les animaux d’une seule fois. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec notre Structure du Bien-Être Animal (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des souris non transgéniques. Le choix de l’espèce a une importance primordiale dans la recherche à visée médicale. Ce choix prend en compte plusieurs critères mais le critère majeur est la pertinence scientifique du modèle. Nous n’utilisons que des modèles fiables qui présentent une prédictivité reconnue, une bonne reproductibilité et dont l’extrapolation des conclusions à l’homme est largement admise. De plus, cette espèce dispose d’une énorme base d’informations physiopathologiques et d’outils de diagnostiques permettant ainsi de réduire considérablement les expérimentations pilotes. Etant donné que ces études nécessitent des systèmes neurobiologiques matures mais que nous n’étudions pas de pathologie liée à l’âge, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines)

135 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous la peau du dos des hydrogels nutritifs porteurs de cellules souches humaines, avec des séances d'imagerie répétées et, pour une partie, une thoracotomie avec injection d'un agent radio-opaque, pour évaluer la survie de ces cellules en vue de réparer l'os. Le porteur signale des douleurs, des risques d'infection et une gêne liée à la taille des implants. Il conclut qu'aucune méthode in vitro ne reproduit l'environnement complexe suivant l'implantation et qu'un "modèle in vivo" est nécessaire.

Objectifs

Les greffes osseuses autologues (autogreffes) sont largement utilisées en clinique pour des interventions de reconstructions osseuses mais présentent plusieurs limites. L’ingénierie tissulaire osseuse se développe comme une alternative à la greffe osseuse en associant des biomatériaux à des cellules souches, principalement des cellules stromales mésenchymateuses (CSMs) capables de se différencier en ostéoblastes (cellules de l’os) et de promouvoir la revascularisation du site afin de régénérer le tissu osseux. Malgré des résultats encourageants et la preuve de la sécurité de l’utilisation des CSMs chez l’Homme, l’efficacité de ces matériaux cellularisés dans la réparation osseuse reste inférieure à celle de l’autogreffe. La forte mortalité des cellules implantées (90%) observée lors des deux premières semaines post-implantation est un des facteurs clés expliquant ces résultats suboptimaux. Cette mortalité serait due aux conditions ischémiques (manque d’oxygène et de nutriments) rencontrées après implantation. Comme nous avons démontré que les CSMs survivaient in vitro et in vivo à l’absence d’oxygène mais pas à celle de nutriments, nous avons développé, en collaboration avec une autre équipe, un hydrogel nutritif à base de fibrine (couramment utilisée en clinique) capable de libérer du glucose après implantation par digestion d'un polymère de glucose par une enzyme, tous deux contenus dans l’hydrogel. Des expérimentations in vitro ont déjà démontré que ces hydrogels amélioraient significativement la survie et la fonctionnalité des CSMs en conditions ischémiques. Les premiers résultats in vivo ont également été encourageants mais suboptimaux et nous avons donc amélioré la composition de nos hydrogels afin de prolonger la libération du glucose. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer in vivo l’effet bénéfique de ces hydrogels nutritifs optimisés sur la viabilité et la fonctionnalité (potentiels à induire des vaisseaux sanguins et de l’os) des CSMs.

Bénéfices attendus

L’objectif ultime du projet est de développer une alternative à la greffe osseuse pour combler des grandes pertes osseuses chez l’Homme. L'os est en effet le deuxième tissu le plus transplanté après le sang, avec plus de 2,2 millions de greffes osseuses réalisées chaque année dans le monde. Les transplants osseux sont généralement récoltés chez le patient (autogreffes), mais les complications associées au site donneur, ainsi que la faible quantité et/ou qualité de l'os récolté chez les patients âgés, pédiatriques ou cancéreux constituent des limites sérieuses pour cette technique. Les produits d’ingénierie tissulaire osseuse représentent donc un traitement alternatif aux autogreffes prometteur. Toutefois, plusieurs études ont montré que les cellules implantées ne survivent pas assez longtemps pour induire une formation osseuse suffisante pour combler des défauts osseux de grande taille. Le développement d’un hydrogel nutritif améliorant la survie et la fonctionnalité des cellules implantées permettrait donc d’améliorer le potentiel réparateur de ces produits d’ingénierie tissulaire osseuse.

Procédures

Pour tous les animaux (135 souris) : Les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale est bien établie deux à quatre incisions cutanées seront effectuées dans le dos et les hydrogel mis en place (1x, durée 20-30 min). Les incisions seront suturées. Dans les 24h suivant l’opération, les animaux vigiles auront deux injections sous-cutanées d’analgésique à 12h d’intervalle. Pour les animaux de l'étude 1 (30 souris) : ils subiront une anesthésie générale gazeuse avant injection sous-cutanée d’un réactif bioluminescent puis 40 min après seront à nouveau anesthésiés au gaz pour l’acquisition du signal bioluminescent. La procédure sera répétée 6 fois pendant la période d’implantation (6x, durée 5+5min, sur 4 semaines). Au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min). Pour les animaux de l'étude 2 (90 souris) : les animaux vigiles auront une injection sous-cutanée d’analgésique 30 min avant l’injection intra-péritonéale d’anesthésiant. Lorsque l’anesthésie générale profonde est bien établie, les animaux auront une thoracotomie suivie d’une infiltration du réseau vasculaire par un agent radio-opaque (1X, durée 30 min). Pour les animaux de l'étude 3 (15 souris) : au temps terminal de l’étude les animaux seront anesthésiés au gaz et auront une injection intrapéritonéale d’une surdose d’anesthésiant (1x, durée 10 min).

Impact sur les animaux

La chirurgie d’implantation en sous-cutané (135 souris) peut entraîner de la douleur et du stress chez l’animal. La douleur sera néanmoins prise en charge par un traitement analgésique approprié. La perte d’un ou plusieurs points de suture en post-opératoire peut-être également observé occasionnellement, mais sans impact sur le bien-être animal. Une autre complication éventuelle est l’infection cutanée (bien que jamais observée dans notre laboratoire). Enfin, la taille des implants pour 90 souris peut entraîner une gêne de l’animal mais qui disparait dans les 48h post-implantatoire. Les anesthésies gazeuses nécessaires à l’imagerie non invasive en bioluminescence (30 souris) vont entrainer du stress au moment de la contention et de la perte de conscience, mais n’entrainent aucune séquelle après le réveil. Enfin, les animaux subiront également plusieurs injections sous-cutanées pour la gestion de la douleur, l’anesthésie et l’imagerie en bioluminescence. Celles-ci suivront les bonnes pratiques vétérinaires.

Devenir

Les animaux seront mis à mort aux temps terminaux de chaque étude afin de permettre l’explantation des hydrogels et des analyses post-mortem (radiologiques, histologiques et/ou analyses de l'expression génique).

Remplacement

L’environnement ischémique post-implantatoire est un environnement complexe dont de nombreux facteurs (pH, oxygène, osmolarité, etc.) peuvent affecter la survie et la fonctionnalité des cellules implantées. Bien que certains de ces facteurs soient bien caractérisés (oxygène) d’autres n’ont pas ou peu étaient explorés (glucose, pH, etc.). Il n’est donc pas possible à ce jour de reproduire cet environnement post-implantatoire dans des modèles in silico ou in vitro. De plus, de nombreuses interactions cellulaires (avec les cellules vasculaires ou les cellules de l’inflammation, par exemple) et moléculaires (par l’effet d’hormones ou de facteurs de croissance) peuvent également affecter le devenir des cellules implantées. Bien que des modèles in vitro (organoide, co-culture) permettent de reproduire certaines des interactions cellules-cellules, ils n’incluent que 2 ou 3 interactions (cellules souches/macrophages, par exemple) et ne capturent pas toute la complexité moléculaire et cellulaire de l’environnement post-implantatoire. Pour toutes ces raisons les alternatives non animales actuellement disponibles ne sont pas appropriées pour étudier la survie des CSMs en vue d’une réparation osseuse et il est nécessaire d’avoir recours à un modèle in vivo.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux l’étude 1 est une étude de suivi longitudinal, où les mêmes animaux seront imagés au cours du temps (et non un animal/temps). Basé sur les premiers résultats d'un précédent projet nous avons supprimé un temps d’analyse (semaine 1) pour l’étude du potentiel des CSMs à induire des vaisseaux sanguins, une procédure (imagerie rayon X) pour l’étude du potentiel des CSMs à former du tissu osseux, et un groupe contrôle pour ces deux études car les premiers résultats apportent peu de renseignement sur la capacité de nos hydrogels à promouvoir la fonctionnalité des CSM. En se basant sur les variations de résultats observées dans nos études in vivo précédentes en site sous-cutané, nous affecterons 10 implants/groupe afin d’avoir un pouvoir statistique suffisant. Pour les analyses statistiques, un test non paramétrique sera effectué pour une comparaison globale entre les groupes suivi d’une comparaison des groupes deux à deux.

Raffinement

Une période d’acclimatation et de désensibilisation de 7 jours sera accordée aux animaux avant leur entrée dans le protocole expérimental. La souffrance liée à l’implantation sous-cutanée sera limitée par analgésie pré- et post-opératoire toutes les 12 heures pendant 24h. Un gel nutritif sera ajouté lors des 3 premiers jours post-opératoires, pour faciliter la prise de nourriture et l’hydratation des animaux. Suite à la procédure chirurgicale, des points limites définis au préalable sur le comportement, l’aspect général et les signes cliniques spécifiques à l’acte chirurgical seront surveillés et scorés et permettront d'objectiver la douleur ou la gêne de l’animal deux fois par jour pendant les 3 premiers jours post-opératoires, puis deux fois par semaine jusqu’aux points terminaux. En cas de manifestations douloureuses et/ou d’inconfort l’analgésie sera augmentée ou prolongée. Si ces manifestations sont réfractaires aux soins adaptés et/ou si des points limites sont atteints, l’animal sera retiré de l’étude et euthanasié. Une analgésie pré-opératoire appropriée sera administrée aux animaux avant tout geste chirurgical.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est la souris immunodéficiente non consanguine. Le modèle souris est le mieux connu en termes de caractérisation génétique et immunologique. De plus, la fine épaisseur de la peau murine atténuant peu le signal, ce modèle permet d’utiliser des appareils d’imagerie non-invasive, tel que la bioluminescence, pour un suivi longitudinal des implants. L'utilisation de souris immunodéficientes (souris Nude) permet d’éviter une réaction immunitaire averse (rejet) lors de greffes d'origine humaine et ainsi d'évaluer le potentiel de cellules d'origine humaine. Jeunes adultes de 10 semaines pour avoir des animaux entre 25 et 30g et dont la croissance et le développement, toujours en cours, permettent d'avoir un potentiel de néovascularisation et de néoformation osseuse optimal.

192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de la moelle épinière par stéréotaxie créant une lésion de la myéline, ainsi qu'une castration ou une ovariectomie, pour étudier le rôle du récepteur des androgènes des astrocytes dans la réparation de la myéline. Le porteur indique que la lésion n'a pas entraîné de handicap dans ses études antérieures et prévoit la dissection du cerveau et de la moelle après mise à mort. Il affirme que les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer l'analyse chez l'animal pour ce processus de remyélinisation.

Objectifs

Bien que nous ayons identifié le récepteur des androgènes (AR) comme une cible thérapeutique clé pour promouvoir la réparation de la myéline, le mécanisme responsable de cet effet remyélinisant de la testostérone via ce récepteur n'est pas encore bien élucidé. L'objectif de notre projet d’étude consiste à déterminer quel type de cellule neurale est nécessaire pour exprimer AR (astrocytes, neurones...) afin de permettre l’activation des chimiokines et par conséquent le recrutement, au sein de la lésion démyélinisante, des oligodendrocytes matures et myélinisants, capables de promouvoir la réparation de la myéline. Au cours de nos travaux de recherche nous avons montré que la présence des cellules astrocytes au sein de la lésion démyélinisante est indispensable au recrutement d’oligodendrocytes et par conséquent à la remyélinisation. Au niveau fondamental, il est très important de caractériser la cellule cible, astrocytes, qui permet à la testostérone et son AR de promouvoir cet effet remyélinisant. Pour cela, nous utiliserons des souris transgéniques dont les astrocytes sont dépourvus du AR. Sur le plan clinique, les deux sexes, mâles et femelles, seront utilisés vu que cette maladie touche 3 fois plus de femmes que d’hommes. De même, Le statut hormonal des patients atteints de sclérose en plaques, souvent négligé, mérite une attention particulière pour des stratégies de remyélinisation efficace. Chez les hommes atteints de sclérose en plaques, de faibles niveaux de testostérone résultant de dysfonctionnements de l'hypothalamus et de l'hypophyse ont en effet été associés à une incapacité neurologique et à des résultats cliniques défavorables. En outre, le risque d'admission à l'hôpital pour une sclérose en plaques est significativement plus élevé chez les hommes diagnostiqués pour un hypofonctionnement testiculaire (baisse du niveau de testostérone et de son récepteur).

Bénéfices attendus

A terme, ce travail permettra de confirmer ou infirmer l’implication du récepteur astrocytaire des androgènes dans l’effet remyélinisant de la testostérone. Ce travail permettra de valider l’efficacité des protocoles proposés dans la réparation de la myéline des souris malades et il apportera des informations importantes sur les moyens d’optimiser le traitement de ces pathologies démyélinisantes chez les patients. En effet, et comme indiqué plus haut, les taux d’androgènes sont réduits chez les malades de sclérose en plaques, à travers nos travaux, nous suggérons un rétablissement de taux normaux de testostérone lors des traitements de ces malades en fonction du sexe. Il conviendrait donc de proposer des traitements personnalisés de remyélinisation et de la médecine de précision dans la sclérose en plaques. Il serait également possible et intéressant d'utiliser des androgènes synthétiques actifs par voie orale pour favoriser la réparation de la myéline

Procédures

Chacun des animaux inclus de ce projet subira une opération chirurgicale au niveau de la maoelle épinière par stéreotaxie. La durée de l'opération ne dépassera pas 10 min. L'animal sera sous anésthésie avant, pendant et après l'opération et durera entre 30 à 50 min. Le génotypage se fait sur des prélevements de queues de souriceaux de 11 jours, en quelques secondes.

Impact sur les animaux

Nos études précédentes, concernant la lésion in situ de la myéline par la LPC, au niveau d’une seule région de la moelle épinière, n’ont pas montré d’handicape chez les souris. Une fois l’effet de l’anesthésie est terminé, les animaux reprennent doucement leur activité et mobilité et quelques heures après l’opération, ils se comportent normalement. Néanmoins, le suivi sera effectué quotidiennement afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress et des fiches d’évaluations individuelles nous permettront de suivre la bonne récupération des animaux après les chirurgies. En Tous les autres animaux inclus de ce projet et ayant répondu à tous les critères du bienêtre animal seront euthanasiés à terme (4 semaines après l’opération chirurgicale). Leurs moelles épinières seront disséquées et utilisées pour les analyses nécessaires à ce projet.

Devenir

A la fin de l'expérience qui aura duré 4 semaines, le sang des animaux sera recueilli pour des analyses d’hormones stéroïdes (testostérone, estradiol…). Les restes des corps seront disséqués pour isoler les cerveaux et moelles épinières. Ces derniers seront maintenus dans le fixateur jusqu’au moment de les couper. Ces coupes serviront entre autres aux analyses immunohistologiques afin d’analyser l’état de la myéline chez ces différents types de souris, traitées ou non avec la testostérone.

Remplacement

Malgré une analyse de l’effet faisant l’objet de cette demande dans des cultures cellulaires, ces dernières ne peuvent pas remplacer l’analyse de l’effet chez l’animal. Les cultures mixtes (neurones, astrocytes et oligodendrocytes) sont compliquées à réaliser et en plus la myélinisation des axones in vitro ne donne pas de bons résultats. Le processus de remyélinisation met en jeu des interactions complexes entre tous les types cellulaires présents dans la moelle épinière, et que toutes ces interactions ne peuvent être reflétées dans des cultures cellulaires. Cependant, les cultures organotypiques de cervelet ou de moelles épinières peuvent les remplacer car la myélinisation se fait convenablement, mais seulement chez des souriceaux (entre jours postnataux 0 et 10). Cette étape du projet (effet du AR astrocytaire sur le développement de la myéline) est d’ailleurs réalisée sur des cultures organotypiques, réduisant le nombre d’animaux utilisé dans notre projet. Ainsi, nous ne pouvons utiliser des animaux adultes pour étudier les processus de myélinisation et remyélinisation en culture organotypique. Le recours à l’animal est donc nécessaire à notre projet d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux sera réduit à 8 par point expérimental, le minimum requis lors de nos travaux précédents de façon à mettre en évidence des différences statistiques. Nous utiliserons 192 souris en 5 ans. Pour utiliser le strict nécessaire de souris, nous n’utiliserons pas de souris pour des contrôles absolus (exemple de souris non traitées ou traitées que par la testostérone) car nous utiliserons les souris des groupes expérimentaux pour servir d’autocontrôles (régions éloignées des zones lésées) et des souris dont le génotypage est de type sauvage. De même, si les résultats sont statiquement significatifs dès les premières expériences, nous tacherons à réduire sensiblement le nombre total de souris. Nous pourrions par exemple nous affranchir des souris prévues pour la 3ème année ; ce qui réduirait le nombre à 128 seulement !

Raffinement

Nos animaux seront hébergés par groupe de 5 animaux par cage dans des conditions optimales d’hébergement (nourriture et eau disponible à volonté, présence de lambeaux fins de papier pour faire un nid, petits cubes de bois à ronger). Avant la procédure chirurgicale, les animaux seront manipulés avec soin pour qu’ils soient habitués aux procédures expérimentales. Pendant la procédure chirurgicale, des mesures thérapeutiques seront mises en place telles qu’un traitement analgésique et un tapis chauffant sera utilisé pour l’animal, sous anesthésie générale.

Choix des espèces

Nous utilisons l'animal le plus utilisé par les chercheurs, la souris C57BL/6, pour leur facilité d’hébergement et d’élevage. Leur génome est très bien connu, ce qui permet de les "modifier génétiquement". Cet avantage nous permet d’utiliser des souris transgéniques et des souris sauvages du même fond génétique dans nos études expérimentales. Nous utiliserons des souris transgéniques, dépourvues du récepteur AR dans les astrocytes. Pour les études in vivo, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines pour la castration et l’ovariectomie et des souris de 10 à 12 semaines pour la lésion LPC. Puisque nous traitons nos animaux par les stéroïdes tels que la testostérone, la castration et l’ovariectomie des animaux est indispensable pour éliminer tout effet des stéroïdes endogènes, synthétisés par les testicules et les ovaires (voir§ 4.2.1.). Notre projet d’étude de démyélinisation et remyélinisation chez ces souris adultes nous permettront de mieux comprendre les processus pathologiques de la gaine de myéline, rencontrés chez l’homme, atteint de sclérose en plaques.

Prises de sang à la veine de la joue, injections dans la veine de la queue, gavage par sonde gastrique : des souris transgéniques porteuses de gènes humains, qui développent une maladie auto-immune des reins, reçoivent des anticorps, des ARN messagers ou des nanoparticules. 336 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue de chaque traitement pour l'analyse de leurs reins. Le laboratoire, sollicité par l'industrie pharmaceutique, cherche un traitement de la maladie de Berger, et le porteur écrit qu'il n'y a "pas de nuisances lié à la maladie de Berger", chez des souris qui ont dès 12 semaines du sang et des protéines dans les urines. Le texte ne précise pas ce que les souris reçoivent par gavage.

Objectifs

Nous disposons d'un modèle unique dans le monde, le modèle de souris avec des gènes humains exprimant des anticorps spécifiques et un récepteur pour les anticorps spécifiques. Ces souris développent une maladie auto-immune rénale (c'est à dire qui résulte d'un dysfonctionnement du système immunitaire qui conduit ce dernier à s'attaquer à l'organisme) et ainsi cause l'accumulation anormale des anticorps dans les reins avec de la protéinurie (présence de protéines dans les urines) et d'hématurie (présence de sang dans les urines) à partir de 12 semaines. Comme il n'existe pas de traitement curatif pour cette maladie, notre laboratoire cherche à développer des nouveaux traitements. Nous avons généré cinq anticorps anti-inflammatoires et l'industrie pharmaceutique nous a sollicité pour des études sur l'animal basées sur nos recherches précèdentes . En effet, nous avons démontré une belle efficacité d'une enzyme, une protéine capable de couper les anticorps et ainsi réduire l'inflammation liée à la maladie. Le problème était que comme il s'agit d'une protéine d'origine bactérienne, il y a une réponse immunitaire contre cette enzyme , des anticorps anti-enzymes bloquant son activité. L'objectif de notre étude est de traiter les souris exprimant la maladie avec les anticorps anti-inflammatoires, des ARN messagers (molécule capable d'induire la production d'une protéase qui est une enzyme (=protéine) capable de cliver les anticorps responsable de la maladie) ou avec des nanoparticules (particules de petite taille) permettant d'induire une tolérance au traitement avec la protéase recombinante d'origine bactérienne. Ces traitements sont bien tolérés sans aucun dommage chez la souris (résultats obtenus au laboratoire). L'objectif est d'évaluer l'action de ces traitements sur les anticorps circulants, sur les dépôts rénauxd'anticorps, l'inflammation tissulaire rénale et sur la protéinurie.

Bénéfices attendus

La néphropathie (ou maladie de Berger) est l'une des premières causes d'insuffisance rénale en France et dans le monde. Cette maladie est causée par une accumulation anormale d'anticorps dans les reins. Il n'existe actuellement pas de traitement spécifique de cette maladie, les patients n'ont que des traitements de suppléance (dialyse, greffe). Le développement d'un traitement pourrait éliminer la cause de la maladie et ainsi pouvoir proposer un traitement curatif. Les traitements proposés chez les souris qui développent la maladie seront une étape pré-clinique cruciale avant le passage à l'homme pour des essais cliniques.

Procédures

Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les anticorps anti-inflammatoires : les souris seront soumises à des prélèvements sanguins au niveau de la veine de la joue (deux fois par mois). Des prélèvements d'urines (2 fois par mois) les prélèvements seront faits sur animaux non anesthésiés, lors de la contention de la souris, la miction est en général spontanée . Des injections d'anticorps par voie intraveineuse (une fois par semaine pendant 1 mois) seront faites principalement par la veine caudale qui est située sur la queue de l'animal. Le gavage par une sonde gastrique (1 fois par mois pendant 1 mois). Afin d'évaluer le traitement de la maladie par les ARNmessagers (ARNm) : les souris seront soumises à des injections d'ARNm (une molécule retrouvée dans toutes les cellules qui sera traduite en protéine) principalement par la veine caudale (veine sur la queue) une fois par semaine pendant un mois puis une fois par mois pendant 6 mois. Les prélèvements de sang (au niveau de la veine de la joue) se feront à J0 puis une fois par mois pendant 6 mois, en même temps que les urines. Afin d'évaluer la traitement de la maladie par les nanoparticules : les souris seront soumises à des injections par voie intraveineuse (veine de la queue) 3 fois pendant 1 mois puis à des prélèvements sanguins et d'urines à J0, J1 et J7.

Impact sur les animaux

Les traitements donnés sont très bien tolérés et bénéfiques pour cette maladie de Berger. Les seules nuisances attendues sont celles liées aux injections intraveineuse des produits, au gavage et aux prélèvements de sanguins et d'urines. Ceux-ci pourraient occasionner un stress et un inconfort pour la souris de courte durée lors de la contention et de l'injection. Il n'y a pas de nuisances lié à la maladie de Berger.

Devenir

A l'issue de chaque traitement, les animaux seront euthanasiés et des analyses complementaires seront réalisées au niveau des reins afin d'évaluer l'inflammation rénale.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthode alternative pour modéliser la réponse d'un organe en entier dans le cas du developpement de la nephropathie. Le travail à l'échelle de l'organisme en entier est nécessaire, compte tenu de la complexité physiologique de la réponse inflammatoire et de la fonction rénale. Il est indispensable de travailler sur l'organisme entier, vivant et proche de l'homme pour pouvoir ensuite envisager un traitement curatif chez l'homme.

Réduction

Nous avons estimé qu'il faudra 6 animaux par groupe afin obtenir des résultats statistiquement exploitables et mener à bien notre projet. En effet, nos expériences précèdentes nous ont permis de préciser ce nombre d'animaux nécessaire.

Raffinement

Dans le but de répondre à la loi des 3R (Raffiner) et dans un souci de bien-être animal de l'enrichissement (coton, Kraft ) sera mis en place pour les animaux tout au long de l'expérience pour que les animaux puissent faire des nids. Nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. Les souris sont placées sur des portoirs ventilés par groupe de 5 individus. La température, l'hygrométrie , la nourriture et l'eau sont contrôlées tous les jours par le personnel technique. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis pour anticiper toute douleur ou angoisse infligée aux animaux. Les gestes experimentaux seront effectués par une personne compétente. Les animaux seront suivis quotidiennement par le personnel de zootechnie et les points limites seront surveillés 1 fois par semaine par l'expérimentateur ( état général, comportement et pesées). Un analgésique sera administré si l'état de l'animal le nécessite et toutes les 12heures. Si l'animal présente des points limites atteints, il sera euthanasié. A la fin des procédures tous les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour développer la maladie de Berger car elle n'exprime pas la maladie, ce qui permet après transgénese c'est à dire la fait d'incorporer des gènes humains dans son génome d'induire et d'exprimer cette maladie en question chez ces souris transgéniques. De plus, son comportement et sa génétique sont largement connus ce qui nous permet une meilleure évaluation et prise en charge de son bien-être tout au long du projet. Il est donc indispensable pour nous d'utiliser ce modèle de souris transgéniques exprimant la maladie pour évaluer l'action et l'efficacité des traitements que nous proposons. A 12 semaines d'âge car c'est à cet âge là que les souris développent la maladie rénale.

948 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies d'induction de fibrose du foie, des injections répétées et un suivi hebdomadaire par imagerie et prélèvements sanguins sous anesthésie, pour valider des vecteurs de thérapie génique ciblant les cellules du foie malade. Le porteur signale des pertes de poids, des risques d'infection et des ruptures de suture liés aux interventions. Il conclut qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité de l'"organisme entier" et que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Les maladies du foie, de causes très variées (excès de gras, alcool, virus, médicaments, atteinte biliaire, génétique etc), sont un enjeu majeur de santé publique. Elles mènent à la cirrhose qui est la 14ème cause de mort dans le monde et au cancer du foie, 3ème cause mondiale de décès par cancer. Quelle que soit l’origine de la maladie, un tissu cicatriciel excessif responsable de la maladie est fabriqué par des cellules appelées « myofibroblastes ». En même temps, les cellules assurant les principales fonctions du foie appelées « hépatocytes » meurent. De nombreux traitement ont été proposés mais jusqu’à présent aucun ne s’est montré satisfaisant par manque d’efficacité de ciblage sécurisé d’un type cellulaire présent dans le foie et l’apparition d’effets secondaires indésirables (ex : l’élimination de cellules saines en même temps que les cellules pathogéniques). Ce projet vise à développer et tester l’efficacité préclinique d’un vecteur de thérapie génique permettant l’élimination spécifique des myofibroblastes rendant le foie malade quelle que soit l’origine de la maladie, et d’un vecteur de thérapie génique protégeant les hépatocytes de la mort au cours des maladies chroniques du foie.

Bénéfices attendus

Il n’existe aucun traitement curatif des maladies chroniques du foie. Ce projet comprend des études précliniques de validation de vecteurs de thérapie génique ciblée pour les maladies chroniques du foie chez les animaux en vue d’application clinique thérapeutique chez l’humain.

Procédures

Des souris auront une intervention chirurgicale unique et terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris subiront une opération chirurgicale d’environ 15min sous anesthésie générale et sous analgésique. 15 jours après ces souris auront une intervention chirurgicale terminale, sous anesthésie générale et sous analgésique (10 min). Des souris recevront une injection (5min). Une partie d’entre elles recevront une deuxième injection 1 à 3 semaines après (5 min). 1 fois par semaine, pendant 2 mois maximum, ces souris seront soumises, en même temps, à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront opérées chirurgicalement (environ 15min) sous anesthésie et sous analgésique. Ces souris recevront deux injections à 1 semaine d’intervalle en 5min. 1 fois par semaine pendant 2 semaines, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie. Des souris seront nourries avec un régime particulier pendant 16 semaines maximum et recevront deux injections à 1 à 3 semaines d’intervalle (5min/acte). 1 fois par semaine pendant 8 semaines maximum, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin, le tout sous anesthésie générale. Des souris seront injectées 2 à 3 fois par semaine pendant 12 semaines (5min). 1 fois par semaine pendant 6 semaines, sous anesthésie, ces souris seront soumises en même temps à une imagerie médicale d’une durée de 10 min et à un prélèvement d’un faible volume sanguin.

Impact sur les animaux

Pour induire la fibrose du foie, un des modèles expérimentaux est chirurgical (15 minutes par intervention). Une perte de poids post-opératoire, des infections ou des ruptures de sutures pourraient survenir. Plusieurs actes seront pratiqués sous anesthésie (10 minutes environ par intervention) pouvant induire des nuisances comme le risque d’arrêt cardio-respiratoire, l’hypothermie et la perte de repère transitoire au moment du réveil. Des nuisances peuvent également être induites par les prélèvements sanguins et les injections comme un stress émotionnel de courte durée (5min maximum par acte) liés à la contention et la douleur de l’introduction de l’aiguille ou des saignements et irritations. Les régimes alimentaires ou le produit injectable utilisés pour induire une fibrose hépatique aux animaux entrainent une perte de poids pendant les 3 premières semaines qui se stabilise ensuite. Un des modèles de fibrose nécessite l’utilisation de souris transgéniques développant spontanément une fibrose hépatique qui reste asymptomatique jusqu’à l’âge de 12 mois. Dans ce projet ces souris seront maintenues jusqu’à l’âge de 4 mois maximum.

Devenir

L'euthanasie de tous les animaux de toutes les procédures est nécessaire pour pouvoir isoler les cellules du foie, évaluer la maladie du foie et pour valider le ciblage cellule spécifique des vecteurs de thérapie génique. Le prélèvement du foie entier ne permet pas la survie des animaux.

Remplacement

Les maladies du foie reposent sur de multiples interactions dans l’organisme entier entre les processus de régénération, d'inflammation, de vascularisation et de cicatrisation impliquant le support des autres organes du corps et n’est pas modélisable in vitro. Le ciblage spécifique d'un organe par rapport à un autre via l’injection d’un vecteur génique dans la circulation sanguine et l’étude de sa répartition corporelle n’est pas modélisable in vitro. De même, le ciblage spécifique d’un sous type cellulaire du foie par rapport aux autres cellules du foie nécessite d’étudier l’organe en entier. Aucun modèle 3D in vitro du foie ne reproduit actuellement la réelle complexité cellulaire du foie ni sa structure. Enfin, Il n’existe pas de lignées cellulaires proche de la physiologie réelle du foie. Pour étudier les signatures cellulaires saines ou malades dans l’organe entier, nous serons donc contraints d’utiliser des cellules primaires dont la survie est limitée en culture et qui ne peuvent être obtenues qu’à partir du foie des souris. Ainsi, pour développer cliniquement une thérapie génique ciblée, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire.

Réduction

A cause des variabilités entre animaux et des risques d’échec des procédures, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés pour le projet est le minimum requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre notre objectif scientifique. Le nombre d’animaux a été évalué à 948 maximum. Les tests in vitro seront réalisés sur des cellules primaires mais qui ne peuvent être maintenues à long terme après isolement. Pour les types cellulaires qui le permettent, une amplification sera réalisée en culture. Afin de réduire le nombre d’animaux, un seul modèle de fibrose sera utilisé pour réaliser les expériences in vitro. Autant que faire se peut, nous nous efforcerons d’isoler plusieurs types cellulaires à partir des mêmes animaux. Le nombre de candidats vecteurs sera réduit de 3 vecteurs à 1 au cours des procédures réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Grâce aux prélèvements sanguins et au suivi du transgène fluorescent qui nous permettent d’observer dans le temps la pathologie et l’expression de notre vecteur au cours des expérimentations, 1 seul temps d’euthanasie est nécessaire. Ceci permet de réduire le nombre d’animaux utilisés dans cette étude.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats scientifiques dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les animaux seront anesthésiés pour chacune des procédures et un analgésique sera administré en per et/ou post opératoire pour éviter toute souffrance liée à l’intervention chirurgicale. Au cours des chirurgies, les souris seront placées sur une plaque chauffante pendant et après l’opération, jusqu’au réveil total, et leurs yeux seront protégés au cours de l’anesthésie par application d’ocry-gel. Au cours des expériences impliquant le produit médicamenteux induisant la fibrose, aucun analgésique ne sera administré en même temps aux souris afin d’éviter toute surdose et une insuffisance hépatique. Dans le cas des injections répétées, plusieurs sites d’injection seront alternés au cours des procédures pour éviter une irritation locale et diminuer le risque d’ascite. Des points limites ont été définis suivant une grille d'évaluation établie sur l’apparence physique, le poids et le comportement animal, adaptés à chaque procédure. Si l’animal atteint un point limite il sera soulagé par l’administration d’un analgésique et si les symptômes persistent où sont trop sévères, l'animal sera euthanasié. Les prélèvements sanguins et l’imagerie médicale réalisés au cours des procédures permettent également de surveiller précisément toutes déclarations de symptômes. Les souris seront prises en charge par du personnel qualifié et entrainé aux procédures, et examinées quotidiennement. Les animaux seront hébergés 7 jours avant le début des procédures jusqu’à l’euthanasie en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles dans un environnement enrichi favorisant les comportements exploratoires et réduisant ainsi le stress. Les animaux seront hébergés dans une pièce où les paramètres environnementaux (température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Au cours des 7 jours d’hébergement avant procédure, les souris s’adapteront à leur nouvel environnement et un contact sera mis en place afin de les habituer aux manipulations et ainsi réduire leur stress au cours des procédures. Les personnes non formées agiront en tant qu’observateurs et toujours accompagnés par un membre formé.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris, dans la littérature est la plus référencée pour les modèles de maladies hépatiques notamment pour leur grande reproductibilité et leur capacité à développer une pathologie très proche de l’homme. De plus la souris possède une vésicule biliaire tandis que le rat n’en possède pas. Or la vésicule biliaire possède un rôle dans la régénération du foie et son absence au cours des modèles biliaires pourrait biaiser les résultats. La fibrose hépatique est un processus insidieux et indolore pouvant mettre plusieurs années à se déclarer chez l’humain adulte. Chez la souris elle est également asymptomatique et peut prendre jusqu’à 3 mois pour s’installer en fonction des modèles. Dans ce projet, les souris utilisées seront donc de jeune adulte de 8 à 10 semaines afin de participer à des procédures pouvant durer plusieurs mois sans être affectées par un vieillissement avancé.

3720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation est déclenchée pendant la gestation par injection, avec un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40 %, puis la descendance subit une série de tests comportementaux dont un conditionnement de peur, pour étudier le rôle des microglies dans les troubles neurodéveloppementaux. Le porteur indique que ces tests provoquent un stress léger à modéré et prélève ensuite les structures cérébrales après mise à mort. Il conclut que les modèles in vitro ne reproduisent pas ces étapes du développement et qu'un recours à des animaux non-humains vivants est nécessaire.

Objectifs

Les troubles neurodéveloppementaux ont des causes multiples y compris environnementales. Un lien entre des épisodes inflammatoires pendant la gestation et une augmentation du risque de développer des troubles neurodeveloppementaux chez le descendant ont été démontrés. Récemment, le rôle des microglies (cellules immunitaires du cerveau) dans ces troubles a été mis en évidence chez la descendance mâle. Cependant, aucune donnée sur la descendance femelle, ni sur les troubles cognitifs de la descendance n'ont été générées. Ce projet se base sur un modèle d'inflammation gestationnelle couramment utilisé et maîtrisé par les porteurs du projet. L'objectif est d'étudier le rôle des microglies dans les troubles cognitifs neurodéveloppementaux chez le mâle et la femelle.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'établir le rôle des microglies dans la mise en place des troubles cognitifs à l'âge adulte des descendants mâles et femelles après inflammation gestationnelle. Cette étude permettra d'obtenir des données concrètes sur les deux sexes, ce qui n'est actuellement pas disponible mais également sur la sphère cognitive, très peu documentée à ce jour. L'approche par renouvellement des microglies permettra par ailleurs d'établir une nouvelle approche thérapeutique dans le traitement des troubles neurodéveloppementaux.

Procédures

Prélèvement de sang unique de quelques secondes sur animal vigile pour la présélection des femelles. Injection unique de quelques secondes durant la gestation pour la mère gestante. Tests comportementaux à la période juvénile quotidien durant en tout moins de 15 minutes afin d'évaluer les comportements émotionnels et le développement général (6 tests en juvénile), pouvant engender un léger stress chez l'animal. Tests comportementaux à l'âge adulte afin d'évaluer les capacités de mémoire et les comportements émotionnels ( 5 tests, un test par jour, espacés d'au moins un jour entre les tests, sur une période de 2 semaines– quelques minutes par test), pouvant engender un léger stress, voir modéré lors de l'apprentissage de peur conditionné chez l'animal.

Impact sur les animaux

Le modèle d'inflammation gestationnelle présente un risque de fausse-couche pouvant atteindre 40% sans impacter la survie des mères. Les mères gestantes injectées peuvent présenter une baisse de leur prise de poids sans signe majeurs de comportement de maladie. Les bébés mâles présentent généralement un poids inférieur par rapport aux contrôles. Aucune différence de poids n'est trouvée chez les femelles. Aucune mortalité après mise bas n'est documentée sur ce modèle. Les autres tests comportementaux réalisés ne durent que quelques minutes, peuvent entraîner un léger stress notamment durant les deux tests sur les réponses émotionnelles, mais n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou cellules et/ou vésicules extracellulaires nécessaires pour les études cellulaires et moléculaires.

Remplacement

L’étude des phénotypes microgliaux au cours du développement nécessite des modèles non humains. L'étude des effets de l’inflammation maternelle ne peut se faire de manière fine chez l'homme et nécessite de fait l'utilisation d'animaux vivants. Les modèles in vitro ne permettent pas de modéliser ces étapes du développement cérébral et la recherche bibliographique indique que la réponse inflammatoire correspondant à nos modèles n'est pas développée in vitro à ce jour. La proximité des signatures microgliales entre l'homme et l'animal permettra un transfert à l'homme à la suite de ce projet, ce qui reste notre priorité et notre objectif scientifique premier : comprendre chez l'homme le développement des microglies durant les phases développementales.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, nous avons utilisé le site Idele.fr permettant de calculer la taille des effectifs en prenant en compte le nombre de groupes, une significativité à 5%, une puissance statistique à 80% et des moyennes et écarts types fictifs basés sur nos expériences passées. Nous avons alors choisi un nombre permettant un équilibre entre la robustesse des données omiques générées malgré la faible puissance statistique liée au nombre de groupes générés. Réduire ce nombre serait prendre le risque de générer des données non concluantes, ce qui pousserait à reproduire ces expériences avec un nombre plus grand et donc à terme consommerait plus d'animaux. La pertinence du nombre de destinations expérimentales repose sur la limite de détection du matériel que nous cherchons à évaluer sur une population cellulaire triée à partir de structures cérébrales. Nous ne pouvons réduire ce nombre au risque de passer sous la limite de détection des appareils de mesure. Les femelles sont également étudiées, ce qui nous permet d'utiliser tous les animaux générés durant cette étude.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur et la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine à 0.1 mg/kg) les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Une anesthésie par injection intrapéritonéale de pentobarbital (Exagon 300 mg/kg, 100ul/10g de poids corporel) avec une prise en charge de la douleur préalable par utilisation de buprénorphine (0.1 mg/kg) 30 min avant sera utilisée pour réduire la douleur des animaux. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupes sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire. Enfin, nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique.

Choix des espèces

Ce projet s'inscrit dans la continuité des recherches menées par les porteurs du projet. Leurs données préliminaires ont été générées chez la souris et l'accrétion de données nouvelles sur modèle murin permettra de raffiner les données existantes par leur analyse commune avec les nouvelles données générées. De plus, les microglies de la souris et de l'homme partagent de nombreux gènes en commun et permettent de conduire à une valorisation des données chez l'animal par transfert chez l'homme, rendant cette étude pertinente au vu du choix du modèle animal. Les analyses seront conduites au cours de la période post-natale pour le comportement juvénile et à l'âge adulte pour l'évaluation comportementale et les études biologiques subséquentes.