Souris
Maintien d’une banque de tumeurs épithéliales mammaires humaines par des approches de xénogreffes orthotopiques chez la souris immunodéficiente.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
904 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent par chirurgie une greffe de tumeur mammaire humaine, parfois suivie d'une résection, pour entretenir une banque de xénogreffes issues de patientes atteintes de cancer du sein. Le porteur suit la croissance tumorale au pied à coulisse et prévoit des points limites, avant une mise à mort permettant de prélever la tumeur ou de cartographier les métastases sur de nombreux organes. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité tissulaire d'une tumeur, seule la greffe in vivo la restituant selon lui.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent et le plus meurtrier chez la femme, à l’origine d’un peu plus de 11 800 décès par an en France. C’est une maladie complexe. Il existe de nombreux sous types de tumeurs mammaires qui ont des profils histologiques, génétiques et génomiques variés expliquant une évolution clinique différente. Cette hétérogénéité constitue à l’heure actuelle un des freins majeurs à une prise en charge thérapeutique optimale des patientes. Le développement de modèles précliniques mimant la complexité de la maladie est donc indispensable pour définir au mieux le traitement de demain. Pour cela, nous avons établi, dans un précédent projet (#01152.03), une banque d’une cinquantaine de xénogreffes (également appelée xénobanque) issues de tumeurs de patientes atteintes de cancer du sein (PDXs : Patient Derivated Xenograft) qui ont été archivées sous forme d’ampoules. Ce modèle a été démontré comme mimant parfaitement la biologie de la tumeur chez la patiente avec des profils histologiques, génomiques et transcriptionnels identiques (Marangoni et al., CCR 2007; Reyal F et al., BCR 2012; Derose et al., Nat med 2011). Il a également été démontré que ces modèles de xénogreffe reproduisent fidèlement la réponse aux thérapies conventionnelles observée chez les patientes (Zhang et al., Cancer Res 2013). Par ailleurs, cette xénobanque a permis d’initier la caractérisation du rôle des cellules souches cancéreuses (CSCs) présentes au sein de la tumeur et qui est à l’origine de 20 % des cancers du sein (Müller et al., 2020 ; Arfaoui et al., 2019, Guégan et al., 2019). Cette xénobanque sera donc au centre de notre projet qui aura 3 objectifs principaux: 1/ La préservation de la xénobanque; 2/ La caractérisation du développement métastatique des échantillons de la xénobanque; 3/ Le déploiement de la xénobanque dans des tests précliniques.
Bénéfices attendus
La préservation de la xénobanque réalisée grâce à ce projet permettra notamment de poursuivre la carctérisation de du développement métastatique des échantillons de cette banque et de mieux comprendre le rôle des CSCs dans ce processus permettrait de développer de nouvelles approches thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patientes atteintes de cancer du sein. Le matériel issu de cette xénobanque sera également utilisé pour l’étude des thérapies ciblant les CSCs en combinaison avec des traitements de chimiothérapie conventionnels (#16487-2018082108541206 v3), le développement de traitements ciblant la maladie métastatique (#21988-2019080815368654 v4) et l’étude de l’impact de la radiothérapie seule sur les CSCs ou combinée avec une thérapie capable de radiosensibiliser les CSCs (#26523-2020070810304662 v2). In fine, le renouvellement de cette xénobanque nous permettra d'approfondir nos connaissances sur le cancer du sein, son développement métastatique, sa résistance thérapeutique et plus particulièrement les CSCs pour pouvoir, espérons un jour, proposer une thérapie ciblée pour chaque patiente.
Procédures
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale (sous anesthésie) lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire qui durera approximativement 15 minutes. Dans le cas de la procédures 2, les souris seront soumis à une procédure chirurgicale supplémentaire de résection de la tumeur qui durera 10-15 minutes.
Impact sur les animaux
L'ensemble des animaux subira une procédure chrirugicale lors de l'implantation des cellules tumorales dans la glande mammaire. La nuisance de ces actes chirurgicaux sera prise en compte par l'application d'une anesthésie générale, d'une analgésie post-operatoire et l'utilisation d'un tapis chauffant pour éviter l’hypothermie. Les éventuelles nuisances liées à la croissance tumorale seront détectées au plus tot à l'aide d'une grille de score de la douleur intégrant des points limites les plus précoces possibles.
Devenir
A l'issue de la Procédure 1, les souris seront sacrifiées et les tumeurs seront prélevées, dissociées et soit réinjectées dans des glandes mammaires pour nos autres projets soit pour réaliser des ampoules pour notre xénobanque. Suite à la Procédure 2, les souris seront sacrifiées et différents organes seront prélevées afin de réaliser la cartographie métastatique de chaque souris (coeur, poumons, cerveau, rate, reins, foie, ovaires, cage thoracique, squelette).
Remplacement
Sur le plan physiopathologique, une greffe orthotopique de cellules tumorales obtenue chez un animal présente des caractéristiques, non pas identiques, mais similaires à celles d'une tumeur humaine, avec une complexité tissulaire impossible à reproduire in vitro. De même, la coopération spatiale des cellules, l’importance du stroma, l’angiogenèse péritumorale, le contexte cytokinien, sont des mécanismes cruciaux lors de la croissance tumorale et qui ne peuvent pas être reproduits de façon satisfaisante in vitro.
Réduction
Nous nous limiterons au nombre minimum d'animaux permettant la réalisation d’ampoules et de nos différentes études. De plus, lorsque cela sera possible, les mêmes animaux serviront aux étapes de rafraichissement et d’amplification. Ce projet de maintien d'une banque de xénogreffes nécessitera donc 904 souris immunodéficientes de type NSG.
Raffinement
Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture et eau ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). Le suivi du développement tumoral se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs : la mesure du volume tumoral à l’aide d’un pied à coulisse. Les procédures de transplantation seront réalisées sous anesthésie associée à une analgésie afin d’éviter toute douleur. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l’apport d’un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température : 20-22°C ; renouvèlement d’air : 15 volumes/heure ; éclairage artificiel : 12h jour / 12h nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés, de lanières de papier et éventuellement d’un dôme. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Des souris adultes pubères de 6 à 10 semaines seront incluses dans les procédures expérimentales, après le développement du tissu épithélial mammaire. En effet, le développement de la glande mammaire est un processus postnatal. A la naissance, chez la souris, le rudiment mammaire comprend un canal primaire bien formé et quelques ramifications secondaires. La glande mammaire reste quiescente jusqu’au début de la puberté (4 semaines), puis les canaux mammaires s’allongent et se ramifient intensivement, envahissant progressivement tout le stroma adipeux qui entoure la glande.
Effet anti-tumoral d’un pro-médicament expérimental
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
170 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur dans le coussinet adipeux mammaire sous anesthésie, puis des injections répétées trois fois par semaine pendant un mois d'un pro-médicament expérimental activé par les espèces réactives de l'oxygène. Le porteur ne détaille guère les nuisances liées à la croissance tumorale au-delà de la mention des greffes, et prévoit des points limites précoces. Il affirme qu'il est "absolument nécessaire" d'utiliser un modèle in vivo, le système immunitaire étant selon lui impossible à reconstituer in vitro.
Objectifs
Le mode d'action de la majorité des agents chimiothérapeutiques, qui ont été cliniquement approuvés pour le traitement de cancers hématologiques, reposent sur un ciblage rapide des cellules en croissance. Cependant, en dehors des cellules cancéreuses, certains types de cellules non malignes présentent également une telle propriété. Par conséquent, bien que de grands progrès aient été réalisés dans ce domaine au cours des dernières décennies, la spécificité des chimiothérapies est encore faible. Ce problème peut être approché en utilisant des médicaments anti-tumoraux ciblés. Cependant, les cancers qui dépendent d’un seul récepteur ou enzyme sont rares. Un ciblage plus robuste peut être potentiellement atteint par l’activation de pro-médicaments dans le microenvironnement spécifique du cancer. Il a été démontré que la majorité des cellules cancéreuses surproduisent les ROS (espèces réactives de l’oxygène) alors que dans les cas des cellules non-malignes, leur concentration est extrêmement faible. Étant donné que la production élevée de ROS semble être une caractéristique générale du cancer,, les pro-médicaments activés par les ROS sont potentiellement applicables pour le traitement de nombreux types de cancer différents. Nous nous intéressons particulièrement à un pro-médicament, dérivé du N-alkylaminoferrocene. Cette molécule induit une mortalité cellulaire via la perturbation des lysosomes, l’augmentation de la production de ROS, l’arrêt du cycle cellulaire en phase G0/G1 et d'autres mécanismes. Le traitement avec cette molécule chez la souris greffée nous permettra de confirmer l’effet anti-tumoral constaté in vitro. L’analyse des tumeurs (microenvironnement) après traitement nous informera sur la capacité de cette molécule de stimuler les réponses immunitaires anticancéreuses et donc à rétablir une immunosurveillance défaillante caractéristique des tumeurs.
Bénéfices attendus
Nous nous attendons à une diminution de la croissance tumorale après traitement avec le médicament testé en association aux traitements conventionnels anti-tumoraux comparée aux traitements conventionnels seuls. Cela permettra de proposer de nouvelles combinaisons de traitements anti-tumoraux aux patients par la suite.
Procédures
Les animaux seront soumis à une greffe dans dans les coussinets adipeux mammaires (animal sous anesthésie générale) une fois (durée 15 minutes) puis à des injections intra-peritonéales (anesthésie locale), 3 fois par semaine pendant 1 mois (durée
Impact sur les animaux
Greffes de tumeurs en sous-cutané.
Devenir
Pour chaque procédure, les animaux seront euthanasiés à la fin pour analyses.
Remplacement
Ce projet ayant pour objectif de tester si notre composé induit une réduction de la croissance tumorale et une activation du système immunitaire, il est nécessaire d’utiliser un modèle mimant le plus fidèlement possible l’environnement tumoral et le système immunitaire. Il est actuellement impossible de reconstituer un système immunitaire in vitro/ex vivo du fait de sa complexité. Il est donc absolument nécessaire pour ce projet d’utiliser un modèle in vivo. Nous avons choisi le modèle souris car notre projet s'applique à étudier l'implication du système immunitaire dans la lutte anti cancéreuse chez le mammifère. La souris est le mammifère le plus utilisé en expérimentation animale car suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler et suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales.
Réduction
Pour la réalisation de ce projet, nous utiliserons des groupes permettant une évaluation statistique solide des effets analysés. Ceci a été confirmé par des calculs de puissance (puissance à de 80% et risque alpha à 5%). Pour cette expérience, on peut attendre une réduction de 20% de la taille de la tumeur dans les groupes traités par rapport au contrôle, avec une déviation standard d’environ 17%. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux témoins. Les tests statistiques utilisés pour suivre la croissance tumorale seront des tests longitudinaux de suivi individuel permettant d'augmenter la puissance et de diminuer le nombre d'animaux.
Raffinement
Les animaux seront suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l’expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids, de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation (évaluation des experssions faciales), et examen clinique. Des points limites précoces ont été définis et seront strictement appliqués.
Choix des espèces
Le choix de la souris se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques : De par sa petite taille, la souris est un animal facile à manipuler et il est possible d’en héberger un nombre relativement important. C’est aussi un animal suffisamment grand pour pouvoir recevoir des injections de cellules tumorales. La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade adulte (6-9 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé).
Evaluation du potentiel anti-thrombotique d’anticorps anti plaquettaires
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
896 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant du modéré au sévère, une partie menée sous anesthésie sans réveil. Elles subissent plusieurs modèles de thrombose par pincement de l'aorte, chlorure de fer ou ponction de la carotide, un modèle d'accident vasculaire cérébral classé sévère sur vingt-quatre heures, et des modèles d'inflammation cutanée et pulmonaire. Le porteur décrit après réveil une prostration, une activité réduite et des troubles respiratoires, et évoque des souris humanisées pour la protéine GPIb. Il affirme que ces processus sont trop complexes pour des modèles in vitro "pas assez sophistiqués" et teste des anticorps anti-plaquettaires.
Objectifs
Les plaquettes jouent un rôle principal dans l’arrêt du saignement mais elles sont également impliquées dans la thrombose artérielle. Le complexe GPIb-V-IX est le récepteur clé des plaquettes au facteur Willebrand (FW). Cette interaction assure l’adhérence des plaquettes au sous-endothélium lésé. Le complexe GPIb-V-IX joue un rôle important dans la croissance du thrombus il est donc une cible anti-thrombotique reconnue. Il participe également à la formation du clou hémostatique et il est possible que son ciblage entraine un risque hémorragique. Nous avons généré trois anticorps qui bloquent l’interaction entre le complexe GPIb-V-IX humain et le facteur Willebrand. Nous avons montré ces anticorps inhibent in vitro la formation d’un thrombus dans une chambre de perfusion avec du sang humain. L’objectif du projet est d’évaluer le potentiel anti-thrombotique de ces 3 agents en les comparant à d’autres agents déjà validés dans des modèles de thrombose expérimentale. En parallèle nous utiliserons d’autres modèles in vivo pour évaluer le risque hémorragique. Ces modèles seront réalisés dans des souris humanisées pour la GP1b humaine (hGP1b), la GP1b murine étant remplacée par la GP1b humaine. Les plaquettes présentent des microfilaments d’actine impliqués en hémostase. La dynamique du cytosquelette d’actine correspond à un ensemble de processus d’assemblage et de désassemblage, dynamique indispensable pour le bon fonctionnement des cellules. Ces processus sont notamment régulés par les protéines de la famille des MICAL responsable d’oxydations, dont MICAL1 présent au niveau plaquettaire. De plus, il a été mis en évidence que ces oxydations sont importantes au niveau cardiovasculaire. Le rôle de MICAL1 plaquettaire sera évalué en thrombose artérielle grâce aux modèles de lésion mécanique suite au pincement de l’aorte abdominale ; lésion chimique suite à l’application d’un tampon imbibé de chlorure de fer sur la carotide ; lésion de la carotide par une piqure d’aiguille.
Bénéfices attendus
Le complexe GPIb-V-IX joue un rôle important dans la croissance du thrombus il est donc une cible anti-thrombotique reconnue. Il participe également à la formation du clou hémostatique et il est possible que son ciblage entraine un risque hémorragique. Nous avons généré trois anticorps qui bloquent l’interaction entre le complexe GPIb-V-IX humain et le facteur Willebrand. Nous avons montré que ces anticorps inhibent in vitro la formation d’un thrombus dans une chambre de perfusion avec du sang humain. L'évaluation de ces 3 agents pourrait conduire à l'identification d'un nouvel antiplaquettaire n'induisant pas de risque hémorragique, pouvant ainsi déboucher sur des essais cliniques afin d'en tester la sécurité et l'efficacité chez l'Homme. D'autre part, MICAL1 (responsable d'oxydations) est impliqué dans la dynamique du cytosquelette d'actine indispensable au bon fonctionnement des cellules. Il a été mis en évidence la présence de nombreuses oxydations au niveau cardiovasculaire. L'évaluation du rôle de MICAL1 plaquettaire en thrombose artérielle pourrait faire progresser les connaissances scientifiques et notamment mieux comprendre les mécanismes impliqués en thrombose artérielle.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - Un modèle de thrombose par pincement mécanique sur l'aorte de la souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 432 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes - Un modèle de thrombose au chlorure de fer sur carotide de souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 112 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes. - Un modèle de thrombose par ponction d'une carotide de souris anesthésiée, une procédure classée sans réveil. 112 souris y seront soumises. La procédure dure 30 minutes. - Un modèle d'AVC (procédure chirurgicale) classé sévère auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 24h. - Un modèle d'inflammation cutanée par formation de complexes immuns (rpA d'Arthus) induit par injections intradermiques et rétro-orbitale, classé modéré auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 4h. - Un modèle d'inflammation pulmonaire induite par l'innoculation intranasale de LPS, classé modéré auquel 80 souris seronts soumises. La procédure dure 24h.
Impact sur les animaux
Les 3 modèles de thrombose sont des procédures sans réveil réalisées sous anesthésie. On pourra s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée). Pour le modèle d'AVC ischémique, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (activité réduite voire prostration), sur l'apparence physique (apparence des poils, paupières fermées), sur la nutrition, sur la température et également sur la motricité (rotation). Pour le modèle d'Arthus, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (prostation) et sur l'oeil (fermeture de la paupière). Pour le modèle de saignement pulmonaire, durant l'anesthésie on peut également s'attendre à un impact sur le rythme respiratoire. Au moment du réveil, on s'attend à un impact sur le comportement (prostration) et la respiration (accélération, sifflements).
Devenir
Tous les animaux seront sacrifiés à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Le but de ce projet est d’évaluer le rôle d’un récepteur antiplaquettaire humain dans des processus complexes et intégrés que sont la thrombose, l’AVC hémorragique ou encore les saignements en conditions inflammatoires. Ces processus sont particulièrement complexes et font intervenir plusieurs types cellulaires ainsi que des conditions hémodynamiques (vaisseaux, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour reproduire toute la complexité de ce processus.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude sera réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 16 souris/groupe au maximum pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Nous utiliserons des tests de Mann-Whitney pour la comparaison de 2 groupes et un test Kruskal-Walis post-test Dunn pour les comparaisons multi-groupes.
Raffinement
Les conditions d’hébergement des animaux sont optimisées par l’enrichissement des cages avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet de compartimenter leur environnement selon leurs besoins. Les animaux, entre 2 et 6 par cage, ont un accès permanent à l’eau de boisson et à la nourriture. Les conditions de travail pour l’utilisation de modèles animaux ont été raffinées au maximum afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Pour ce faire, des points limites spécifiques ont été établis pour chaque procédures. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter la souffrance et l’inconfort de l’animal. Lors des procédures, les animaux sont anesthésiés, maintenus à une température de 38°C par l’utilisation d’une plaque chauffante (tout au long de la procédure) et un traitement approprié contre la douleur leur est administré. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont largement répandus et maitrisés. Les techniques de mutagénèse dirigée ont permis de générer des souris exprimant la GPIb humaine (hGPIb) et des souris déficientes en MICAL1 spécifiquement au niveau mégacaryocytaire et plaquettaire. Ces lignées sont parfaitement adaptées à cette étude et constitue un outil original et unique. Des souris hGPIb, MICAL1-/- et WT âgées de 8 à 24 semaines seront utilisées dans les procédures 1,2,4,5,6. Cet âge correspond à la période où les souris pubères et ne présentant pas encore de modifications biologiques dues au vieillissement. Pour la procédure 3, le vaisseau doit être strictement calibré. L’écart d’âge entre les individus sera restreint entre 8 et 10 semaines.
Le test d’observation d’Irwin
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 3600
7 200 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des candidats-médicaments puis passent le test d'observation d'Irwin, une batterie d'évaluations comportementales et neurologiques destinée à repérer la toxicité avant tout essai chez l'humain. Le porteur indique qu'un animal atteignant un point limite est "immédiatement mis à mort", et qu'un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie précède le prélèvement du cerveau. Il affirme qu'il "n'existe pas" de modèle sans animaux ni de méthode moins sévère fournissant des informations équivalentes.
Objectifs
Les directives réglementaires recommandent des évaluations pharmacologiques de sécurité spécialisées pour caractériser les effets induits par les médicaments sur le système nerveux central (SNC) avant leur administration chez l’humain et tout au long du développement clinique. Le test d’observation d’Irwin, couramment utilisé par l'industrie pharmaceutique, est une batterie d'observations contenant plusieurs paramètres pour évaluer l'état global comportemental, neurologique et autonome d'un animal (rat ou souris). Cela implique l'évaluation systématique de plusieurs paramètres à l'aide d'une échelle de notation détaillée. Le but de ce projet est d’évaluer les effets induits par les médicaments sur le SNC avant leur administration chez l’homme.
Bénéfices attendus
Les résultats du test d'Irwin sont utilisés pour déterminer la toxicité potentielle d’une nouvelle substance (aigüe et chronique) et peuvent aider à déterminer la gamme de doses à tester dans d'autres tests. Par ailleurs, ce test d’observation peut également fournir une première orientation, qui peut être pertinente, vers une indication thérapeutique spécifique, un mécanisme d'action spécifique ou une fonction physiologique spécifique. Il permet également d'éviter toute expérimentation inappropriée, en orientant les études d'efficacité postérieures, voire même d'interrompre celles-ci en cas d'effets secondaires.
Procédures
La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal. Selon les directives du donneur d’ordre le prélèvement de sang est réalisé en intracardiaque sous isoflurane pour un prélèvement sanguin compris pour les rats entre 1 ml à 4 ml maximum et pour les souris entre 0.5 ml à 1ml. A la suite, du prélèvement sanguin, le cerveau de l’animal est prélevé.
Impact sur les animaux
Lors de l'administration d'un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables peuvent apparaître. Ainsi pour vérifier une éventuelle toxicité et en limiter les risques, l'état général des animaux est évalué selon notre grille. De ce fait, si un animal atteint, à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Devenir
A la suite de la procédure "d'administration des produits", tous les animaux passent en test. Puis, à la fin du test d’observation d’Irwin, les animaux seront soumis à un prélèvement de sang en intracardiaque sous anesthésie générale puis à un prélèvement de cerveau.
Remplacement
Il n'existe pas à ce jour de modèle n'utilisant pas d'animaux ou ayant un degré de sévérité inférieur permettant d'obtenir des informations équivalentes à celles obtenues par le présent modèle.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles. Ces analyses statistiques ont montré qu’un nombre de 12 animaux par groupe est nécessaire pour l’obtention de résultats fiables et reproductibles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Le répertoire comportemental des rongeurs correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar ou Sprague Dawley Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J et SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées (C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2...) Stade de développement : 6-7 semaines au moment du test (âge adulte). Les produits testés sont destinés à des patients adultes.
Rôle du récepteur à l’ocytocine dans les cellules contrôlant la reproduction et les comportements
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie menée sous anesthésie sans reprise de conscience. Elles reçoivent des composés et une puce, et une délétion sélective du récepteur à l'ocytocine réduit selon le porteur leur sociabilité et leur bien-être. Après des tests comportementaux, une perfusion cardiaque termine les procédures. Le porteur affirme qu'il "n'y a aucune méthode de remplacement" pour l'étude des comportements sociaux et de la reproduction, et travaille sur des souris jeunes adultes.
Objectifs
L’ocytocine contrôle les grandes fonctions physiologiques permettant la survie des mammifères, depuis la reproduction, la mise-bas, la lactation jusqu’aux comportements sociaux. La libération de l’ocytocine au niveau du cerveau, permet de réguler tous les comportements sociaux, comme les comportements sexuels et parentaux, la mémoire sociale ou l’interaction sociale entre individus. Pour cela, l’ocytocine, en tant que neurotransmetteur, se fixe sur son récepteur exprimé dans différentes populations de neurones du cerveau. En tant qu’hormone libérée dans le sang, l’ocytocine est bien connue pour agir sur son récepteur situé dans les muscles de l’utérus et des glandes mammaires, pour la mise-bas et l’éjection du lait maternel. Le récepteur OXTR est aussi présent dans un sous-type de cellules des testicules, les cellules de Leydig, dont la fonction reste inconnue à ce jour. Récemment, nous avons mis à jour in vitro dans deux lignées transformées de neurones et de cellules de Leydig que le récepteur à l’ocytocine contrôlait directement l’expression et la traduction des gènes impliqués dans l’adaptation cellulaire au sein de ces deux types de cellules. Ayant fait la preuve de concept in vitro, nous voulons mettre en évidence 1) le rôle exact du récepteur OXTR dans les neurones et les cellules de Leydig dans un organe naturel au sein d’un organisme entier et 2) son impact sur les fonctions de reproduction et des comportements sociaux in vivo en l’inactivant spécifiquement dans chacune de ces cellules.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de comprendre le rôle du récepteur à l'ocytocine, un des cibles thérapeutiques majeurs de l’interaction sociale chez la souris. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale , et également à plus long terme de développer une nouvelle approche pharmacologique pour soulager ces troubles.
Procédures
administration de composés (1 fois, 5 sec), puçage des animaux (1 fois, 10min par animal)
Impact sur les animaux
administration de composés et puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection. délétion sléective du récepteur à l'ocytocine : diminution légère de la sociabilité entre congénères et du bien-être des animaux. Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.
Devenir
administration de composés, puçage des animaux, délétion spécifique du récepteur à l'ocytocine : les animaux sont gardés en vie afin de pouvoir réaliser les tests de comportement. Après les tests de comportement et perfusion cardiaque, les animaux sont euthanasiés.
Remplacement
Nous avons montré par des études préliminaires in vitro dans des cellules immortalisées et transformées en culture, la faisabilité de notre étude. Il n’y a aucune méthode de remplacement pour l’étude des comportements sociaux et la reproduction des animaux.
Réduction
Nous avons mis au point in vitro dans nos lignées de cellules les conditions expérimentales permettant de mettre en évidence des effets statistiquement significatifs, tout en minimisant le plus possible le nombre d’animaux utilisés. De plus, les différents tissus sont utilisés afin de pouvoir faire plusieurs méthodes d’analyse avec le même tissu d’un seul animal, réduisant le nombre d’animaux.
Raffinement
Les animaux sont gardés dans des conditions classiques d’élevage avec deux types d’enrichissement, un igloo en carton et des frisures de papier kraft pour diminuer le stress des animaux et améliorer leur thermorégulation. Les procédures expérimentales, majoritairement des tests de comportements, sont les plus brèves possibles (< 1 heure par animal) et réalisées dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser l’inconfort et l’anxiété des animaux. De plus, la plupart des tests de comportement mettent en jeu des interactions avec d’autres animaux et/ou des odeurs sociales dans les appareils de comportement ou cage, différents de leur cage d’élevage, satisfaisant leur curiosité naturelle envers leurs congénères et l’exploration spatiale de leur environnement. Ainsi, les tests de comportement permettraient de renforcer l’enrichissement des animaux. Les tests de fertilité consistent à mettre des animaux mâles avec des femelles de génotype sauvage en reproduction et ne varient pas des conditions d’élevage classique des animaux. Le suivi des animaux sera quotidien et assuré par les soigneurs et expérimentateurs habilités.
Choix des espèces
Les souris sont des petits animaux sociaux qui se reproduisent bien et vite et dont les comportements sont mesurables par des tests bien décrits. Les expériences seront réalisées chez la souris jeune adulte (7-12 semaines) à un stade post-pubère.
Ocytocine-vasopressine dans les déficits d’interaction sociale chez la souris
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
3 424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un déficit de sociabilité leur est imposé par invalidation de gènes ou par isolement, avant une longue batterie de tests comportementaux dont le test de la nage forcée, l'enfouissement de billes, l'exposition à des odeurs de prédateur et le test d'intrusion. Le porteur décrit ces atteintes comme "légères" et une perfusion intracardiaque terminale clôt les procédures. Il affirme qu'il "n'y a pas de méthode de remplacement" du comportement animal in vitro, seul l'animal vivant permettant selon lui d'évaluer l'interaction sociale.
Objectifs
L’ocytocine, plus communément appelée « l’hormone de l’amour » est un petit peptide qui régule les comportements sociaux chez les mammifères. Bien qu’elle soit bien connue pour son rôle dans la lactation et l’accouchement, l’ocytocine est également sécrétée dans le cerveau pour moduler les interactions sociales (parent-enfant, fraternel, avec un congénère inconnu, …). Le système ocytocine est en réalité beaucoup plus complexe et encore mal connu. En effet, l’ocytocine, et la vasopressine, un peptide apparenté, se lient sur les récepteurs à l’ocytocine et à la vasopressine, et l’ensemble de ces acteurs contrôle les interactions sociales. L’administration d’ocytocine comme de la vasopressine restaure l’interaction sociale chez les mammifères souffrant de déficits d’interaction sociale, dont l’Homme (autisme, schizophrénie, addiction). De plus, il semblerait que les déficits d’interaction sociale soient liés à des dysfonctions dans le système ocytocine-vasopressine. L’objectif de cette étude est de 1) déterminer les dérégulations (communes) du système ocytocine-vasopressine dans des modèles de souris souffrant de déficits d’interaction sociale (fraternel et avec un congénère inconnu) et 2) d’identifier quels récepteurs de ce système restaure l’interaction sociale.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but de déterminer quelle est la cible thérapeutique la plus importante au sein de la famille ocytocine-vasopressine permettant d'améliorer l’interaction sociale chez la souris. Dans un second temps, le meilleur agent pharmacologique va être identifié sur cette cible. Ces expériences vont significativement contribuer à l’augmentation des connaissances scientifiques des troubles de l'interaction sociale, et de développer des nouvelles approches thérapeutiques pour soulager ces troubles.
Procédures
Les procédures sont : induction d'un déficit de sociabilité par invalidation de gènes ou par isolement; administration de composés (1-14 fois, 5 sec) par voie intranasale, intrapéritonéale ou sous-cutanée, puçage des animaux (1 fois, 10min par animal), tests de comportements (1-14 fois, 5 à 40 min), perfusion intra-cardiaque (1 fois, procédure sans réveil, 30 min). Le comportement social sera évalué en utilisant le test d’interaction sociale directe et le test des trois chambres pour la sociabilité, le test de monte pour le comportement socio-sexuel et le test de déplacement du nid et l'agression maternelle pour le comportement maternel. Enfin, la préférence et la détection olfactives seront mesurées pour la préférence des odeurs sociales. Les comportements stéréotypés, persévérants et répétitifs sont évalués par le scorage des stéréotypies motrices, et en mesurant les alternations dans un petit labyrinthe en Y. Les comportements de type anxieux sont mesurés dans le test de l’enfouissement de billes, le test de suppression de prise de nourriture induite par la nouveauté, le test de reconnaissance des odeurs de prédateurs et le test de la nage forcée. L’agressivité et la dominance seront évalués en utilisant le test d’intrusion d’un mâle résident et le test du tube.
Impact sur les animaux
administration de composés et puçage des animaux : légère inflammation des tissus localement au site d'injection. Modèles de déficit de sociabilité (génétique ou par isolement) : diminution légère de la sociabilité entre congénères et du bien-être et éventuellement une augmentation légère du stress de ces animaux. Tests de comportement: léger stress des animaux dans un nouvel environnement.
Devenir
Les animaux à l'issu des procédures sont euthanasiés pour prélèvement des organes.
Remplacement
Il n’y a pas de méthode de remplacement du comportement animal in vitro. Le comportement animal et les conséquences fonctionnelles de l’interaction sociale ou des déficits ne peuvent être évalués que sur des animaux vivants. Bien que les déficits d’interaction sociale ne menacent pas la durée de vie, ils entravent la qualité de vie et la capacité à concevoir des animaux d’élevage et pour l’homme.
Réduction
Notre étude vise à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés et le temps d’expérimentation. Les expériences en aigu (jour 1) et en chronique (jour 8) sont réalisées sur les mêmes groupes expérimentaux. Tous les cerveaux des animaux sont conservés et utilisés afin de ne pas sacrifier de nouveaux animaux. Des conditions de réussite sont appliquées à l’utilisation de certains groupes. En effet, le nombre d’animaux sera réduit de moitié si aucun effet genre n’est mis en évidence.
Raffinement
Pour la procédure nous amenant à isoler certains animaux, les animaux auront plus d'enrichissement (matériau de nid) à leur disposition et seront élevés en contacts visuels, olfactifs et sonores avec les autres animaux pour minimiser leur inconfort. Les animaux sont très vite habitués aux procédures, menées dans les délais les plus courts possibles, dans le calme et sous des éclairages faibles afin de minimiser la contrainte et l’anxiété des animaux. Les animaux sont surveillés avant et après chacune des procédures et quotidiennement par les expérimentateurs et le personnel de l'animalerie. De plus, les tests de comportement permettent de satisfaire les comportements de curiosité naturelle des souris à explorer leur environnement et interagir avec leurs congénères. D’après notre expérience, les animaux ne subissent aucune altération de leur état de santé. Si un animal est blessé ou atteint un point limite (pelage négligé, posture anormale, diminution de poids ou diminution d'activité), l'animal sera traité (antiseptique et/ou analgésique) en accord avec le vétérinaire référent et sa surveillance sera renforcée. Si l'animal atteint des signes cliniques inquiétants ou une combinaison de points limites, l'animal sera euthanasié.
Choix des espèces
Les souris sont des animaux sociaux et hiérarchisés. Les souris expriment les mêmes déficits d’interaction sociale et de comportement stéréotypés que les mammifères de plus grosse taille ou les humains. De plus, leur comportement social est régulé par l’ocytocine et la vasopressine et leurs récepteurs qui sont extrêmement bien conservés chez tous les mammifères. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les conséquences moléculaires et les effets de composés sur l’interaction sociale. De plus, la souris est un petit mammifère, une taille compatible avec l’utilisation de petites quantités de composés. Les études seront menés chez le jeune adulte (7-10 semaines), le souriceau nouveau-né (0-1 semaine) ou l’animal après sevrage (3-4 semaines).
Effet de la Photobiomodulation sur des modèles murins mimant la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Modèles transgéniques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent une injection virale intracérébrale à la naissance, des injections d'un inhibiteur et des tests comportementaux dont la piscine de Morris où elles sont contraintes de nager. Le porteur qualifie la photobiomodulation d'"absolument indolore" et présente l'isolement en actimétrie comme sans conséquence, tout en reconnaissant que la nage est un "environnement stressant". Il affirme que ces tests de comportement ne peuvent pas être remplacés in vitro, ses analyses moléculaires étant menées en parallèle sur cellules.
Objectifs
Les patients souffrant de la maladie d’Alzheimer (MA) présentent dans leur cerveaux des plaques séniles dont le composant majeur est le peptide amyloïde (Ab). Chaque individu produit et dégrade de manière physiologique ce peptide Ab mais une accumulation anormale de ce peptide pourrait être à l'origine de la maladie. Nos résultats montrent que le fragment C99, le précurseur direct du peptide Ab, pourrait être tout aussi pathogène. Au laboratoire, nous avons mis en évidence une accumulation très précoce du C99 dans un modèle de souris triple transgéniques 3xTgAD modèle de la MA. Cette accumulation précoce du C99 induit un dysfonctionnement cellulaire au niveau de la dégradation lysosomale et autophagique et contribue au phénotype de type apathique et au deficit cognitif des souris. Plus recemment nous avons montré que le fragment C99 est aussi responsable d'un dysfonctionnement mitochondrial au niveau de la structure, de la fonction et de la dégradation des mitochondries. La photobiomodulation (PBM) qui consiste à exposer des souris à la lumière infrarouge est connue pour ses vertues protectrices en activant notamment la fonction mitochondriale. Cette approche sûre et non invasive a déjà prouvée son efficacité dans plusieurs essais cliniques dédiés au traitement de lésions cérébrales chroniques, à la réparation de la moelle épinière ou à la maladie de Parkinson. Concernant la maladie d'Alzheimer plusieurs études précliniques sont en cours et l'objectif de ce projet est d'étudier dans plusieurs modèles murins de MA, le mécanisme moléculaire par lequel la PBM peut protéger spécifiquement contre la toxicité précoce médiée par le C99.
Bénéfices attendus
Mon projet a pour but pricipal d'étudier l'effet protecteur et bénéfique de la photobiomodulation sur des modèles murins de maladie d'Alzheimer. Ce projet de recherche fondamentale devrait apporter des informations importantes concernant la toxicité mitochondriale médiée par le fragment C99 et permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la maladie d'Alzheimer. Il devrait également fournir des perspectives cruciales pour une future application de la photobiomodulation dans le traitement clinique de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux subiront au plus 5 interventions: La photobiomodulation (procédures 1 à 5) : 90s à 670 nm 2 fois par jour pendant 2 mois; L'actimetrie (procédures 1 à 5): 2 passages dans l'actimètre (avant et après la photobiomodulation) pendant 2jours et 2nuits consécutives; La piscine de Morris (procédures 2, 3 et 5): 5 jours d'apprentissage avec 4 essais par jour, 2 tests 24h et 72h après le dernier jour d'apprentissage et un test visible comportant 3 essais le même jour; L'administration du D6 (procédures 4 et 5) par injection intraperitonéale (30mg/kg/jour) d'environ 150µl par jour pendant 18 jours; L'injection virale (procédures 5) par injection intracérebroventriculaire à la naissance (4μL de particule virale à 5. 10puissance12 en 15 sec)
Impact sur les animaux
La photobiomodulation est absolument indolore et inoffensive pour les souris. Au cours du test de la piscine de Morris, les souris sont contraintes à nager dans l’eau, un environnement stressant. Le test d'actimétrie consiste à isoler les souris dans des cages individuelles 2 jours et 2 nuits consécutives pour comptabiliser les mouvements de chaque souris. Ce test peut éventuellement générer un léger état d’anxiété lié à l’isolement social mais nous estimons que la durée n'est pas suffisament longue pour avoir une quelconque conséquence pour le bien être des animaux. L'injection de virus se fait avec une aiguille qui pénètre dans la peau et le crâne du souriceau sans aucune douleur apparente et sans réaction inflammatoire. L'injection intrapéritonéale de l'inhibiteur D6 sera surveillée de près pour prévenir toute eventuelle inflammation du péritoine.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront sacrifiés afin de récupérer leur cerveau et effectuer les analyses biochimiques et histologiques nécéssaire au projet scientifique.
Remplacement
Les expériences de comportement de souris telles que la piscine de Morris ou l'actimétrie ne peuvent malheureusement pas être remplacées par des expériences in vitro. Cependant toutes nos expériences biochimiques, immunohistologiques et nos analyses des mécanismes moléculaires sont au préalable étudiées sur des modèles cellulaires exprimant les mêmes mutations (cellules SH-SY5Y-APPswe) ou les mêmes fragments (C99) que nos modèles murins. De plus, actuellement dans notre laboratoire, nous mettons en place l'utilisation de fibroblastes ou d'iPSC de patients Alzheimer atteints de formes sporadiques ou familiales. Ceci constituera aussi un bon modèle in vitro de la maladie d'Alzheimer qui viendra compléter nos modèle murins.
Réduction
Nous utiliserons des tailles d’échantillons garantissant une puissance statistique suffisante tout en minimisant le nombre d'animaux utilisés dans le respect éthique de la règle des 3R (remplacement, réduction et raffinement). Le nombre de souris pour chaque procédure est ainsi déterminé avec le logiciel G*power. Les tests de comportement que nous utilisons ont déjà été testés sur nos modèles de souris et nous avons déjà établi un protocole bien déterminé ce qui évitera de réaliser des expériences préliminaires de mise au point. Notre étude comportementale requière des groupes de 30 à 45 animaux minimum. Cependant, pour réduire le nombre d’animaux, les mêmes groupes de souris seront utilisés pour plusieurs test comportementaux et pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques.
Raffinement
Nos modèles de souris sont utilisés en routine dans notre laboratoire et sont désormais très bien caractérisés. Ainsi pour chaque modèle, nous connaissons très bien la cinétique d'apparition et d'évolution de la pathologie pour déterminer les âges adéquats et pouvoir traiter nos souris en préventif (4 mois) ou en curatif (12mois). Pour atténuer au maximum le stress causé par le test de la piscine de Morris pour lequel les souris sont contraintes de nager dans l'eau, une phase d’habituation sera réalisée avant le début du test. La température de l'eau est fixée à 22°C et permet un bon équilibre entre motivation et bien-être de l'animal et dès la sortie de l'eau, les souris seront séchées sur un papier absorbant. Après l'injection de virus, les souriceaux sont replacés avec leur mère le plus rapidement possible pour éviter tout rejet de la mère. Pour limiter le stress, les souris sont hébergées dans des cages comportant une maisonnette ainsi que de la ouate favorisant la nidification. L'injection intrapéritonéale de l'inhibiteur D6 sera surveillée de près pour prévenir toute eventuelle inflammation du péritoine. Pour définir le plus objectivement possible le bien être des souris et assurer au mieux leur survaillance tout au long de chaque procédure, nous utiliserons une grille de scores (voir annexe) et nous nous référons aux points limites.
Choix des espèces
Pour déterminer in vivo si la PBM est bénéfique dans le traitement contre la maladie d'Alzheimer au niveau de la cognition, nous sommes contraints d'utiliser des modèles de souris mimant la maladie et présentant des déficits cognitifs comme les souris 3xTgAD. Les souris 2xTgAD et les souris AAV-C99 seront ensuite utilisées pour étudier in vivo les mécanismes moléculaires impliqués dans l'effet neuroprotecteur de la PBM et pour vérifier que la PBM agit bien sur la toxicité liée au fragment C99 et non pas sur le peptide Ab. Cette information est importante pour déterminer la meilleure cinétique de traitement étant donné que le C99 intervient de manière beaucoup plus précoce que l'Ab. En tenant compte de nos résulats antérieurs, nous avons choisi de tester l'effet neuroprotecteur de la PBM chez les souris 3xTgAD à 2 âges : un âge précoce (4mois) où seule l'accumulation du fragment C99 est présente pour voir si la PBM est capable d'améliorer le comportement de type apathique déjà visible (actimétrie); et un âge plus tardif (12mois) où la pathologie associée au peptide Ab s'ajoute à l'accumulation du C99 pour voir si la PBM est capable de restaurer les déficits cognitifs et le retard d'apprentissage spatial présent à cet âge (Piscine de Morris). Concernant les souris AAV-C99 nous avons choisi de tester l'effet neuroprotecteur de la PBM à 6 mois puisqu'un déficit d'apprentissage spatial a déjà été observé à cet âge.
Etude pilote pour évaluer le phénotype d’une lignée de souris porteuses d’une mutation humaine du gène TAF8
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles portent une mutation humaine du gène TAF8 associée à une déficience intellectuelle, et sont génotypées par rognage de phalanges avant l'âge de dix jours puis observées jusqu'à seize semaines. Le porteur n'attend aucun effet indésirable mais surveille l'alimentation et d'éventuelles crises d'épilepsie chez les nouveau-nés. Il présente cette étude pilote comme un préalable qu'il juge impossible à remplacer, seize souris étant conservées jusqu'à seize semaines et les autres tuées au sevrage.
Objectifs
L'initiation de la transcription par l'ARN polymérase II (Pol II) est contrôlée par l'assemblage séquentiel des facteurs généraux de transcription (GTF) au niveau des promoteurs. TFIID est le premier GTF à se lier au promoteur. Chez les métazoaires, TFIID est composé de la protéine de liaison à la boîte TATA (TBP) et de 13 facteurs associés à TBP (TAFs). Il est intéressant de noter que si de nombreuses cellules ont besoin du complexe TFIID canonique, d'autres sont moins affectées par la déplétion de certaines sous-unités TAFs. Le développement du système neuronal requiert particulièrement la présence de TFIID, car des mutations dans les gènes codant pour les sous-unités TFIID ont été associées à des troubles neurologiques et à une déficience intellectuelle chez des patients humains. Chez la souris, la perte de fonction de Taf8 est létale au stade de l'implantation [1]. Nous avons récemment identifié une mutation homozygote (c.781-1G>A) du site d'épissage de TAF8 (intron7/exon8) chez une patiente présentant une déficience intellectuelle, un retard de développement et de croissance, et une légère microcéphalie [2]. En dépit de ces problèmes, d'après l'avis de son médecin, cette patiente est en relative bonne santé sans crise ni besoin d'hospitatisation. Des analyses effectuées sur des fibroblastes dérivés de cette patiente ont montré de façon surprenante que, bien que la protéine TAF8 mutante ne soit pas détectable et que l'assemblage du TFIID soit altéré, la transcription par la Pol II n'est pas significativement affectée. D'autres patients, âgés de 2 à 18 ans, porteurs de la même mutation ont été identifiés (données non publiées de nos collaborateurs): tous sont caractérisés par des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et du développement moteur (hypotonie axiale, spasticité progressive) et une déficience intellectuelle sévère. Des crises d'épilepsie pendant l'enfance ont égalemment été observées chez ces patients. Le but général de notre projet est d'analyser les conséquences moléculaires de cette mutation humaine au cours du développement et de la différenciation mais aussi d'étudier le phénotype comportemental en utilisant la souris comme modèle (mutation Taf8H). Dans un premier temps, nous souhaitons valider l'absence de phénotype dommageable des souris homozygotes adultes avant d'initier dans un deuxième temps un projet d'analyse comportementale. [1] doi.org/10.1242/dev.127.24.5449 [2] doi.org/10.1093/hmg/ddy126
Bénéfices attendus
Ce projet est un projet préliminaire qui nous permettra de confirmer l'absence de phénotype dommageable chez les souris homozygotes Taf8H/H. Une fois, l'absence de phénotype dommageable avérée, nous soumettrons une autre saisine pour l'analyse des capacités intellectuelles des animaux mutants. A terme, ces projets apporteront des connaissances fondamentales sur le fonctionnement de la transcription et permetteront de mieux comprendre la cause de déficiences intellectuelles chez l'homme.
Procédures
Les souriceaux seront génotypés par rognage de phalanges avant l'âge de 10 jours.
Impact sur les animaux
La patiente qui a été étudiée au laboratoire présente une déficience intellectuelle, un retard de développement et de croissance, et une légère microcéphalie. En dépit de ces problèmes, d'après l'avis de son médecin, cette patiente est en relative bonne santé sans crise ni besoin d'hospitatisation (âgée de 4,5 ans au moment de l'étude). D'autres patients, âgés de 2 à 18 ans, porteurs de la même mutation ont été récemment identifiés (données non publiées de nos collaborateurs). Tous sont caractérisés par des difficultés d'alimentation, un retard de croissance et du développement moteur (hypotonie axiale, spasticité progressive) et une déficience intellectuelle sévère. Des crises d'épilespie pendant l'enfance ont égalemment été observées chez deux des trois patients. Aucun effet indésirable n'est attendu chez les animaux Taf8H/H mais une attention sera portée au suivi de l'alimentation et à l'occurence éventuelles de crises d'épilepsie chez les nouveaux nés et du développement moteur.
Devenir
Le but de cette saisine est l'observation des animaux de leur naissance jusqu'à 16 semaines qui correspond à l'âge maximal prévu pour les analyses futures. Tous les animaux seront génotypés mais seules 8 souris Taf8H/H et 8 souris contrôles (+/+ ou H/+) seront conservées pour l'observation jusqu'à l'âge de 16 semaines: les autres souris seront euthanasiées au moment du sevrage. les animaux suivis seront eux euthanasiés à 16 semaines.
Remplacement
Le but de ce projet pilote est de vérifier qu'une mutation à l'état homozygote n'induit pas de phénotype dommageable ou affectant le bien être des souris, avant d'initier un projet d'analyse comportementale. Il n'est donc pas possible de remplacer ces animaux.
Réduction
Le nombre de 6 portées minimum pour obtenir au moins 8 animaux Taf8H/H homozygotes a été choisi pour nous assurer de l'absence de phénotype. Les mêmes animaux seront analysés tout au long de leur vie (naissance jusqu'à 16 semaines) pour minimiser le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Le but de cette saisine est de vérifier que la mutation Taf8H à l'état homozygote ne provoque pas de phénotype dommageable, même si aucun problème n'est attendu puisque les patients humains sont viables et se caractérisent principalement par une déficience intellectuelle. L'élevage des animaux sera fait par un personnel compétent dans des conditions du respect du bien être animal, par du personnel compétent sensibilisé à la possibilité de l'apparition d'un phénotype délétère chez les mutants. Cette évaluation sera faite en conditions normales d'hébergement avec enrichissement et en maintenant les liens sociaux entre les animaux. A la naissance, la capacité d'alimentation de tous les souriceaux sera évalué par la présence de lait dans l'estomac. L'état des animaux sera évalué 3 fois par semaine (propreté, déplacement, vivacité et posture) jusqu'à l'âge de 16 semaines. En cas de souffrance animale, l'avis du vétérinaire sera démandé pour une éventuelle action avant euthanasie si aucune solution ne se présente.
Choix des espèces
Nous souhaitons modéliser une mutation découverte chez l'homme et associée à des problèmes cognitifs. La souris est un modèle de choix qui nous permettra de dériver des lignées cellulaires utiles pour les études moléculaires in vitro tout en analysant le développement du système nerveux et le comportement des animaux mutants. Le but de cette saisine est de nous assurer de l'absence de phénotype délétère chez les homozygotes: les animaux seront donc observés de la naissance jusqu'à 16 semaines où ils seront euthanasiés.
Evaluation de l’efficacité d’un implant de titane recouvert d’une molécule antibactérienne sur la réduction du biofilm microbien dans un modèle d’infection d’implant sous-cutané à Staphylococcus aureus chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
108 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous la peau un dispositif puis on y dépose la bactérie Staphylococcus aureus, avant un prélèvement du cœur et une dislocation cervicale, pour tester un implant recouvert d'une molécule antibactérienne contre le biofilm. Le porteur écarte tout anti-inflammatoire, qui risquerait d'aggraver l'infection, et n'attend surtout que des atteintes locales. Il répond à la "demande de l'industriel" et présente l'essai in vivo comme un "besoin incontestable".
Objectifs
L’objectif de ce projet d’évaluer l’efficacité d’un implant coaté d’une molécule antibactérienne sur la réduction du biofilm microbien dans un modèle d’infection d’implant sous-cutané à Staphylococcus aureus chez la souris.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de pouvoir développer un matériel innovant permettant de réduire ou même d’inhiber l’apparition d’un biofilm bactérien sur un matériel étranger chez l’homme. Les biofilms bactériens sont généralement définis comme des agrégats de cellules bactériennes attachés à une surface et enrobés d’une matrice visqueuse. La formation d’un biofilm se fait selon un modèle bien établi et suit différentes étapes (adhésion, croissance, maturation et dispersion). On estime que 80 % de la biomasse microbienne de notre planète réside sous forme d’un biofilm. Le biofilm protège les bactéries et leur permet de survivre dans des conditions environnementales hostiles. Les bactéries du biofilm peuvent résister à la réponse immunitaire de l’hôte et sont beaucoup plus résistantes aux antibiotiques et aux désinfectants que les cellules bactériennes planctoniques (non adhérentes). Ainsi, la présence de biofilm dans les infections est particulièrement redoutée en clinique (ex : prothèse orthopédiques, sondes de ventilation mécanique, cathéters veineux…). Parmi les espèces bactériennes largement retrouvées dans les biofilms figurent les espèces du genre Staphylococcus sp.
Procédures
La mise en place de l’implant coaté ou non en position sous-cutanée chez la souris sera réalisée sous anesthésie fixe en intra-péritonéal (kétamine 50mg/kg + xylazine 10 mg/kg). Les flancs seront rasés puis désinfectés par un cycle Bétadiné. Une incision cutanée de 0.5cm sera réalisée stérilement et l’implant sera inséré dans la poche ainsi constituée. L’infection bactérienne sera effectuée dans un même temps en déposant 50µL de l’inoculum au contact de l’implant dans la poche sous-cutanée. Deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris concernées par la phase 1 du projet seront soumis à un prélèvement intracardiaque sous anesthésie fixe (kétamine 50mg/kg + xylzaine 10 mg/kg) avant la mise à mort par dislocation cervicale. Toutes les autres souris seront mises à mort comme précédemment cité sans prélèvement intracardiaque.
Impact sur les animaux
S’agissant d’un matériel étranger non connu les effets indésirables attendus pourraient principalement être de nature tissulaires (nécrose au site d’implantation, œdème, hématome, altération de la morphologie tissulaire. Aucune atteinte systémique liée à l’infection n’est attendue (vérifié dans d’autres études réalisées par le laboratoire).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de récupérer l’implant et le tissu environnant pour une quantification bactérienne.
Remplacement
Lors du développement de nouvelles stratégies anti-infectieuses, les molécules ou matériaux sont tout d’abord testées par des méthodes traditionnelles in vitro. Ces études in vitro sont indispensables à l’avancée des travaux de recherche et développement mais ne suffisent pas à déterminer l’efficacité en conditions réelles des traitements en développement. En effet, de nombreux échecs thérapeutiques ont été décrits malgré une bonne sensibilité in vitro du pathogène à la molécule d’intérêt. Ainsi, la mise en place de méthodes d’évaluation préclinique in vivo des agents anti-infectieux dans des systèmes plus complexes constitue un besoin incontestable et est devenue l’une des exigences des sociétés savantes telles que l’EMEA (European Medicines Agency).
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude a été réduit au maximum (5 souris pour la phase pilote et 10 souris pour la troisième partie du projet) qui permettront de répondre aux hypothèses énoncées et permettre une analyse statistique fiable (estimation de la diminution de la charge bactérienne sur l’implant et dans le broyat du tissu environnant par une analyse Anova (test post hoc Bonferroni)). Pour la première partie (étude de la toxicité, le nombre d’animaux a été réduit à 5 par groupe).
Raffinement
D’une façon générale pour l’ensemble de l’étude, la prise d’anti-inflammatoires est contre indiquée du fait de l’interaction reconnue avec les modulateurs de l’inflammation, et risquerait même de faire flamber l’infection. Lors de la mise en place de l’implant, les souris seront anesthésiées par un mélange de kétamine (50 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg). L’incision cutanée réalisée ne dépassant pas 5mm, deux points de suture seront appliqués à l’issue. Les souris reprennent une activité normale dès leur réveil et ne présentent pas de signes de souffrance particuliers. Par ailleurs, il s’agit d’une infection très localisée et en aucun cas une infection systémique n’est anticipée. Enfin, un enrichissement du milieu (jouets en plastique, igloos en carton) sera utilisé et une surveillance bi quotidienne sera réalisée tout au long de l’étude.
Choix des espèces
Les modèles de biofilm sur implant utilisent le plus souvent le cochon d’Inde ou la souris. Dans notre cas, la demande de l’industriel a porté sur l’utilisation de la souris. Des souris Balb/cByJ de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel de 26-27g
Etude de pharmacocinétique chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 5000
10 000 rongeurs, 5 000 souris et 5 000 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un candidat médicament par gavage ou injection puis subissent des prélèvements de sang et de tissus, parfois multiples, aux veines rétro-orbitaire, mandibulaire, saphène ou caudale, pour analyser la pharmacocinétique de molécules. Le porteur indique que l'effectif et le stade des animaux sont fixés par le "donneur d'ordre". Il conclut qu'aucune méthode alternative ne permet ces analyses et juge le recours à l'animal "nécessaire".
Objectifs
La collecte de sang et de tissu sur rongeur est une étape nécessaire lors de recherches concernant un nouveau candidat médicament. En effet, elle permet l’analyse de la pharmacocinétique d’un composé concernant son absorption / résorption, sa distribution, son métabolisme et son élimination. L’objectif de la présente étude est de déterminer les méthodes de prélèvements sanguins et / ou tissulaires qui vont être nécessaires pour ces analyses.
Bénéfices attendus
Lors du développement d’un candidat médicament il est essentiel, au-delà de la recherche d’efficacité dans l’aire thérapeutique ciblée, de connaitre ses propriétés concernant sa pharmacocinétique. Cela permet d’obtenir des informations sur différentes caractéristiques comme son absorption / résorption, sa distribution, son métabolisme et son élimination. Afin d’obtenir ces informations, il est nécessaire de réaliser des dosages à partir d’échantillons sanguins et / ou tissulaires.
Procédures
La collecte de sang et de tissu sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements sont réalisés soit à la suite d’un test comportemental soit sur des animaux ayant seulement reçus le traitement du candidat médicament (prélèvement unique ou multiple); ils sont réalisés sur tout l’effectif de tous les groupes expérimentaux.
Impact sur les animaux
1- Les administrations - Elles sont réalisées une seule fois avant le prélèvement. Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, différents effets indésirables peuvent être observés : inconfort dû à l’injection, des effets secondaires dus aux produits (comme la sédation par exemple) 2- Les prélèvements - Ils sont réalisés après l'administartion des produits. Les prélèvements de fèces sont réalisés sur des animaux vigiles, les autres prélèvements sont réalisés exclusivement sous anesthésie générale (à l’isoflurane).
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post mortem.
Remplacement
A ce jour, il n’existe pas de méthode alternative pour permettre l’analyse de la pharmacocinétique d’un candidat médicament à la suite d’un traitement, le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour étudier l’efficacité de nouvelles molécules.
Réduction
Le nombre total d'animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d'animaux par groupe nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement interprétables lors des bioanalyses. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées, ce nombre a été fixé à 10 animaux par groupe. L'utilisation d'un nombre inférieur d'animaux a une probabilité importante d'entraîner la non-validité des analyses, conduisant à les refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d'animaux plus élevé. Les données sont exprimées sous forme de moyenne et d'erreur standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA) suivi du test de Tukey. Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des locaux appropriés et dans des cages contenant des enrichissements conformément aux standards réglementaires. Dans le cas de prélèvements multiples (sang par sinus rétro-orbitaire, mandibulaire, saphène ou caudale), un suivi approfondi est effectué après chaque ponction pour vérifier : 1) que l’animal se réveille correctement; 2) qu’il y a bien un arrêt du saignement et 3) qu’il n’y a pas d’effets secondaires suite au prélèvement. Leur état sanitaire sera évalué quotidiennement selon notre grille de surveillance. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l’expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. De plus, la proximité clinique entre les modèles rongeurs et les maladies humaines rendent ces analyses de pharmacocinétiques fiables pour l’étude des caractéristiques de candidats médicaments. Les lignées de souris utilisées (selon les protocoles) sont : C57Bl/6 J ou SWISS. D'autres lignées de souris peuvent également être utilisées : C57Bl/6 N, BALB/c, DBA/2, BTBR... Les lignées de rats utilisées (selon les protocoles) sont : Wistar et Sprague-Dawley. D'autres lignées de rats peuvent également être utilisées : SHR... Le stade de développement est déterminé par le donneur d’ordre en fonction de l’âge auquel est destiné le candidat médicament chez l’homme. Selon les études : 3 à 52 semaines au moment du prélèvement.
Validation de l’ADCITMER, un nouveau biomédicament dans le traitement du carcinome à Cellules de Merkel chez des souris femelles
- Recherche appliquée
- Cancers
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
180 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées à l'issue et dix réutilisées pour la formation de praticiens. Souris immunodéficientes greffées d'un carcinome à cellules de Merkel, elles reçoivent des injections intraveineuses hebdomadaires d'un anticorps-médicament à doses croissantes, avec prélèvements sanguins, pour fixer la dose à retenir avant un essai clinique. Le porteur définit des points limites au pelage "piqué", à une perte de 20% de poids ou à un volume tumoral dépassant 1 cm³. Il présente le modèle murin immunodéficient comme "indispensable" faute d'autre modèle disponible.
Objectifs
L’objectif du présent projet est d’optimiser le schéma thérapeutique du produit étudié dans le but de mettre en place un essai clinique de phase 1 chez l’Homme. Ce projet doit donc permettre de déterminer l'effet dose-réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale en modèle de xénogreffe murin de lignées de CCM. De plus, cette étude permettra l’obtention d‘informations préliminaires sur la tolérance du produit, permettant d’orienter une étude de tolérance à mener sur une seconde espèce de rongeur (rats).
Bénéfices attendus
Ce projet doit donc permettre de déterminer l'effet dose-réponse du traitement envisagé, la dose minimale efficace et la dose optimale permettant d’observer une réponse objective durable sur la régression tumorale en modèle de xénogreffe murin de lignées de CCM. De plus, cette étude permettra l’obtention d‘informations préliminaires sur la tolérance du produit, permettant d’orienter une étude de tolérance à mener sur une seconde espèce de rongeur (rats).
Procédures
Les différentes doses préalablement définies (2, 5, 10 et 20 mg/kg) seront injectées une fois par semaine pendant cinq semaines en intra-veineuse (directement dans la veine caudale) sous un volume de 0.2 ml. Les animaux (demi-groupe) auront également un prélèvement de sang en submandibulaire à 6 et 21 jours permettant ainsi que chaque souris ne subisse qu'un seul prélèvement sanguin au cours de l'étude.
Impact sur les animaux
points limites: aspect « piqué » du pelage, perte de poids de 20% et prostration des animaux, volume tumorale supérieur à 1 cm3 ou apparition d’ulcération
Devenir
Les souris utilisées pour la formation des pratricien seront réutilisés
Remplacement
L’efficacité de l’ADCTIMER a été préalablement démontrée in vitro et in vivo en modèle de xénogreffe murin. L’étude préliminaire in vivo consistait à l’évaluation de l’efficacité des 10 mg/kg suivant le schéma thérapeutique de 3 injections IV, chacune espacée de 15 jours. Cette étude a montré que la dose de 10 mg/kg induit une stabilisation de la croissance tumorale. Dans ces nouvelles études, un nouveau schéma thérapeutique d’une injection toutes les semaines pendant trois semaines (schéma thérapeutique usuellement utilisé en clinique pour un ADC) ainsi que trois nouvelles doses (une dose faible, une dose intermédiaire et une dose forte) seront évaluées. Cette étude apportera des informations clés pour la détermination de la dose optimale permettant à la fois une réponse anti-tumorale franche et une bonne tolérance du produit. Ces éléments, essentiels pour le développement d’un nouveau biomédicament et de son évaluation en phase I, nécessitent le passage par un modèle in vivo.
Réduction
La détermination du nombre de groupes et les doses testées sont basées sur les résultats des tests de cytotoxicité in vitro et in vivo préalablement réalisés au laboratoire réduisant ainsi le nombre de souris utilisées.
Raffinement
Les souris seront dans des cages enrichies avec des maisonnettes en plexiglas et du papier absorbant. Du fait du statut immuno-déficient des souris, l’ensemble du matériel d’enrichissement sera stérilisé. La douleur et l’inconfort pouvant être subit durant ce projet par les animaux sont un maximum réduit. Afin de réduire la douleur pouvant être par l'injection du produit ou du véhicule en intraveineuse, l'utilisation d'une pomade anesthésiante sera systématiquement faite.
Choix des espèces
Le seul modèle disponible étant des lignées carcinomateuses humaines, l’utilisation d’un modèle murin immunodéficient est indispensable. Les souris NOD/SCID sont un modèle de référence dans les études de xénogreffe 7 semaines (incluant la semaine d’acclimatation. Stade physiologique : croissance) Pour la formation , des souris Balb/c seront alors utilisées comme modèle par soucis de coût par rapport aux souris NOD/SCID mais également parce que ces souris seront plus facilement réutilisées pour des expérimentations.
Impact de l’élongase ELOVL5 sur la stéatose, l’inflammation et la carcinogénèse hépatique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Rendues obèses par un régime gras, elles subissent des prises de sang, des tests de glycémie, un gavage au glucose, une irradiation de 10 Gy et une greffe de moelle osseuse, avant le prélèvement du foie, pour étudier le rôle de l'enzyme ELOVL5 dans la stéatose hépatique. Le porteur précise qu'aucun antalgique ne sera administré pour ne pas fausser l'étude de l'inflammation. Il présente la souris comme proche de l'humain pour le métabolisme des lipides et juge le modèle "nécessaire".
Objectifs
La stéatose hépatique est une atteinte du foie touchant environ 20% de la population française. Elle a une forte prévalence chez les patients atteints de diabète de type 2, ainsi que les patients en situation d’obésité (17% de la population). Elle se caractérise par la présence de vésicules graisseuses dans les cellules du foie. Cette accumulation excessive de lipides est asymptomatique mais entraine une inflammation qui a terme fourni un terrain favorable au développement de processus cancéreux. L’élongase ELOVL5 est une enzyme jouant un rôle important dans le métabolisme des lipides. Il a été démontré qu’ELOVL5 est un déterminant clé de la composition lipidiques au sein des cellules immunitaires du foie, et aurait un impact sur leur activation et donc l’inflammation. L’objectif est de mieux comprendre le rôle d’ELOVL5 dans le foie ainsi que dans ces cellules immunitaires, dans un contexte de stéatose et d’inflammation du foie, à des stades précoces jusqu’à des stades plus poussés liés à l’apparition de tumeurs. La compréhension de ces mécanismes lipidiques est un élément clé pouvant aider au développement de potentiels traitements de ces atteintes du foie.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d’établir une caractérisation du modèle de souris n’exprimant pas ELOVL5. Ainsi nous pourront évaluer l’impact d’ELOVL5, notamment sur le foie, le tissu adipeux et les cellules immunitaires, en dehors de tout contexte de stéatose induite. Cette caractérisation est essentielle pour permettre la compréhension de l’impact constitutif de la délétion d’ELOVL5. Différents régimes riches en gras induisant une stéatose seront utilisés pour étudier ELOVL5 dans un contexte d’obésité associé à une stéatose hépatique. Nous pourrons ainsi caractériser les différences induites par le régime entre des souris dites « sauvages » face à des souris n’exprimant pas ELOVL5, et ainsi nous permettre de caractériser sans rôle spécifique dans la mise en place la stéatose, à différents stades, ainsi que dans des stades précoces d’initiations de la carcinogenèse hépatique. Cependant, cette caractérisation sera la résultante d’un impact global d’une délétion d’ELOVL5. C’est pourquoi nous devrons également recourir à la transplantation de moelle osseuse (générant les cellules du sang, dont les cellules immunitaires) génétiquement modifiée (ici issue de la délétion d’ELOVL5). Celle-ci nous permettra d’étudier la contribution d’ELOVL5 dans la mise en place de la stéatose hépatique (via un régime riche en lipides) sans que les hépatocytes ne soient directement touchés par l’absence d’ELOVL5, et nous permettant ainsi de s’intéresser spécifiquement à son rôle au niveau des cellules immunitaires du foie.
Procédures
- Prises de sang au niveau caudal : maximum 3 par animal, à intervalles d’au moins une semaine - Prélèvement de gouttes de sang pour des tests de glycémie (résistance à l’insuline (test 1) ou tolérance au glucose (test 2)) : 7 gouttes par test, la durée d’un test est de 2 heures. Les test 1 et test 2 seront séparés d’une semaine, et répétés au bout de 16 semaines sous régime - Injection intra-péritonéale d’insuline - Gavage via une sonde de gavage adaptée (gavage au glucose) - Irradiation de souris (dose de 10 Gy) - Injection intraveineuse
Impact sur les animaux
Les régimes riches en gras vont induire une obésité chez les souris ainsi qu’une stéatose, qui est asymptomatique. Le régime le plus fort va induire une stéatose hépatique plus importante, pouvant mener à la formation de tumeurs (à des stades précoces) au niveau du foie. Les souris irradiées se retrouveront immunodéprimées après l’irradiation durant la prise de la greffe (2 semaines), celles-ci sont soumises à une antibiothérapie durant 4 semaines pour compenser. Un amaigrissement excessif, des signes de déshydratation, ou une immobilité / prostration peuvent être constatés : les animaux seront immédiatement euthanasiés (par anesthésie profonde et dislocation cervicale) car ces signes traduiront vraisemblablement un rejet de la greffe. Il est a noté que, selon notre expérience, ce type de situation est rare.
Devenir
Les souris seront euthanasiées à la fin de chaque procédure car il nous sera nécessaire de prélever le foie, le tissu adipeux et la moelle osseuse des souris pour des analyses plus poussées.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux pour étudier la stéatose est nécessaire car il s’agit d’un processus complexe, faisant intervenir des interactions entre lipides, inflammation, macrophages et hépatocytes ne pouvant être modélisé in vitro. De manière générale, il existe de fortes similarités génétiques, développementales, physiologiques et biochimiques entre la souris et l’homme. Notamment, le rôle et le profil d’expression d’ELOVL5 est similaire entre l’homme et la souris. Cela est également vrai pour d’autres enzymes essentielles impliquées dans le métabolisme des PUFAs. Cela nous permettra donc d’extrapoler plus aisément les conclusions de nos études métaboliques à la situation humaine pour étudier l’effet de l’inactivation de ELOVL5.
Réduction
Le nombre d’animaux prévu est calculé sur la base d’études antérieures. Compte tenu de la variabilité interindividuelle et des effets biologiques observés après l’inactivation de gènes clés, des groupes de 10 animaux seront utilisés pour établir des différences significatives dans la formation de lésions hépatiques. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles afin de tenir compte du dimorphisme sexuel.
Raffinement
Les régimes alimentaires utilisés mènent au développement de la stéatose, qui est indolore et asymptomatique (hors prise de poids). L’injection des cellules souches hématopoïétiques sera réalisée dans la veine de la queue par une personne expérimentée. Durant la période de prise de la greffe, les animaux recevront des antibiotiques afin de limiter le risque infectieux (4 semaines). Les animaux seront surveillés quotidiennement. Si une perte de poids supérieure à 20% du poids corporel est observée sur une période de 2 jours, les animaux seront euthanasiés après anesthésie. Ce type d’évènements est extrêmement rare. Nous ne pourrons pas administrer de traitement antalgique afin de ne pas interférer avec notre expérience qui repose sur l’étude de l’inflammation. Le volume de sang prélevé n’excédera pas 10% du poids corporel. Le milieu d’hébergement sera enrichi avec des feuilles de papier. Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10 animaux.
Choix des espèces
Il existe de fortes similarités génétiques, développementales, physiologiques et biochimiques entre les souris et l’homme concernant le rôle d’ELOVL5. Notamment, l’activité des différentes élongases (dont ELOVL5) et d’autres enzymes intervenant dans le métabolisme des PUFAs dans le foie est similaire entre souris et humains (contrairement à d’autres modèles animaux). Les voies de production et l’élongation des acides gras polyinsaturés restent donc très similaires. De plus, les élongases ont un profil d’expression similaire dans le foie entre la souris et l’humains. Tous ces éléments permettront ainsi d’extrapoler plus facilement et de manière plus fondée les conclusions de nos études à l’homme. Des animaux adultes (8 semaines) seront utilisés, la stéatose hépatique touchant principalement une population adulte.