Souris

352 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par la tuberculose au moyen d'une instillation nasale sous anesthésie et reçoivent entre dix et treize injections, pour étudier l'origine de cellules neuronales pulmonaires apparaissant lors de l'infection. Le porteur indique que l'infection peut altérer l'état corporel, la respiration et le comportement en fin d'étude. Il conclut qu'un "organisme biologique complexe" est nécessaire et que la souris est le "modèle de choix" pour ce travail.

Objectifs

La tuberculose, causée par l’infection respiratoire de la bactérie Mycobacterium tuberculosis, est la deuxième pathologie infectieuse la plus meurtrière après la COVID-19. L’apparition de bactéries résistantes aux traitements antibiotiques existants rend essentiel la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques. Une population de cellules neuronales dans les poumons au cours de l’infection par Mycobacterium tuberculosis a récemment été découverte. Des cellules similaires à celles identifiées dans les poumons ont été décrites dans les tumeurs de prostate. Dans ce contexte, il a été montré que ces cellules neuronales dans les tumeurs dérivent de cellules souches provenant du cerveau ; elles sont associées à une plus grande mortalité des patients. Ces cellules neuronales sont donc de potentielles cibles thérapeutiques dans le cadre du cancer. L'objectif de ce projet est d’identifier l’origine et le rôle des cellules neuronales pulmonaires lors de l’infection par Mycobacterium tuberculosis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de : (i) identifier l’origine et le rôle de cellules neuronales pulmonaires induites par Mycobacterium tuberculosis ; (ii) mieux comprendre les interactions entre le système nerveux et le système immunitaire dans le poumon ; (iii) améliorer notre compréhension de la pathologie liée à la tuberculose ; et (iv) identifier potentiellement une nouvelle cible cellulaire pour une thérapie ciblée sur l'hôte pour traiter la tuberculose.

Procédures

Les souris recevront entre 10 et 13 injections sur animaux vigiles, d’une durée inférieure à 2 minutes par injection. Cela correspond à deux injections quotidiennes sur une période de 5 jours, puis à une injection quotidienne pendant 3 jours. Une pause de 2 jours sera effectuée entre ces deux périodes. Les souris seront également anesthésiées/analgésiées une fois pendant 1h pour être infectées par voie nasale (durée d’environ 30 secondes), et une fois pendant 5 minutes pour recevoir une autre injection d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Un stress modéré éventuel pourra être engendré par la préhension et la contention afin de procéder aux injections (durée de la contention et de l’injection inférieure à 2 minutes par injection). Une sensibilité locale au niveau de la zone des injections pourrait être observée. Les principaux effets indésirables causés aux animaux résideront dans l'inflammation causée par les bactéries et la pathologie résultant de l'infection (aux points les plus tardifs). De légères altérations de l’aspect (état corporel, pelage) peuvent être observés en fin d’étude ainsi que des légères altérations de la respiration et du comportement (posture et mobilité).

Devenir

Toutes les souris de ce projet seront mises à mort à la fin des procédures pour effectuer des prélèvements.

Remplacement

Afin de mieux comprendre l’interaction entre le système nerveux et le système immunitaire, un organisme biologique complexe doit être utilisé. Des échantillons de patients infectés et de primates non-humains ont d'abord été utilisé mais pour mieux comprendre les mécanismes impliqués, le projet nécessite l’utilisation de souris vivantes.

Réduction

L'expertise dans l’utilisation de modèles animaux d’infection par Mycobacterium tuberculosis et l’expérience des années précédentes ont fourni des indications sur la taille des lots d’animaux à respecter pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Les approches expérimentales permettent d’analyser sur un même lot d’animaux, des paramètres qui étaient avant mesurés sur des lots d’animaux séparés.

Raffinement

Dans ce projet, il existe différentes étapes susceptibles de générer de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse chez les animaux. Pour chaque étape, des mesures adéquates ont été mises en place pour suivre et réduire au maximum ces nuisances. Les infections et les injections pouvant être douloureuses seront réalisées sous anesthésie et analgésie. Les souris infectées par Mycobacterium tuberculosis seront monitorées quotidiennement par des personnes compétentes. L’aspect, les fonctions corporelles et le comportement des animaux seront pris en compte à chaque observation et les animaux présentant des signes de souffrance seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Pour notre projet visant à déterminer l’origine et le rôle de cellules neuronales pulmonaires dans l'infection tuberculose, la souris constitue le modèle de choix en raison i) de l'excellente caractérisation des fonds génétiques et de la variabilité de résistance à la pathologie, et ii) du fort degré de convergence des paramètres de l'immunité chez l'homme par rapport aux autres espèces envisageables. Nous n’utiliserons pour ce projet que des souris adultes et, si possible, par soucis d’homogénéité, âgées entre 6 et 10 semaines. A ce stade de développement, les souris ont un système immunitaire suffisamment mature pour étudier la réponse immunitaire à l’infection par Mycobacterium tuberculosis.

358 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Celles destinées aux analyses sont tuées pour prélever la rate, la moelle osseuse et les reins, tandis que les souris gardées pour l'entretien de la lignée restent en vie. Porteuses d'une mutation reproduisant un lupus humain, elles reçoivent des prélèvements sanguins mensuels sous anesthésie et peuvent développer une insuffisance rénale, des plaies cutanées et des douleurs articulaires. Le porteur affirme devoir recourir à un "modèle entier" pour étudier la production d'auto-anticorps dans les organes lymphoïdes.

Objectifs

Ce projet repose sur l'étude d'une mutation décrite chez une patiente atteinte d'un lupus érythémateux systémique. Un modèle murin reproduisant cette mutation a été récemment créé sur fond C57BL/6J, et décrit dans la littérature. Cette souris présente une survie réduite, une autoimmunité avec une augmentation des lymphocytes B et une production d’auto-anticorps (notamment des anticorps anti-nucléaires). Nous souhaitons étudier en détail le phénotype des lymphocytes B à l’origine de la production des autoanticorps pathogènes. Ce projet n'a pas fait l’objet d'une évaluation par d'autres instances mais repose sur une question scientifique non résolue à ce jour et dont les réponses pourraient bénéficier aux patients.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de mieux comprendre comment cette mutation génétique peut conduire à une perte de contrôle de la production d’autoanticorps dans une maladie autoimmune sévère telle que le lupus. Les TLR sont des récepteurs de l’immunité qui ont été impliqués dans la maladie lupique dans la littérature, mais les mécanismes de leur implication sont encore mal connus. Ainsi ces résultats pourraient apporter de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients, à moyen/long terme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins mensuels, sous anesthésie. Des prélèvements (rate, moelle osseuse, reins) seront effectués sur les animaux en fin de procédure après mise à mort. La protéinurie sera mesurée sur un prélèvement d'urine toutes les semaines, pour l'évaluation des points limites.

Impact sur les animaux

Les souris étudiées dans ce projet développent une maladie proche du lupus humain, qui peut causer une perte d'appétit et donc une perte de poids, une insuffissance rénale matérialisée par une augmentation de la protéinurie mesurable à l'aide de bandelettes urinaire. De plus, les animaux peuvent développer une adénopathie associée à une dermite, entrainant une dépilation et le développement de plaies. Le lupus peut également se matérialiser par des douleurs articulaires induisant des difficultés de déplacement et une mise à l'écart du/des individus, un dos voussé. Les prélèvements sanguins peuvent potentiellement générer une anémie (paleur des muqueuses), une respiration plus rapide ainsi qu'une plaie éventuelle au site de prélèvement. Les nuisances liées aux anesthésies répétées sont inhérentes à toute anesthésie (l'anesthésie est cependant ici de courte durée pour un prélèvement sanguin). L'utilisation de l'isoflurane pour l'anesthésie présente un aspect aversif pour la souris, cependant l'anesthésie génère un stress moins important que de réaliser le prélèvement sur un animal vigile.

Devenir

Les animaux ayant atteint les points limites définis seront mis à mort. Les animaux prévus pour expérimentation seront mis à mort pour pouvoir prélever les organes et analyser les cellules immunitaires. Les animaux gardés pour le maintien des lignées et les croisements seront gardés en vie.

Remplacement

La règle du remplacement n'est pas applicable ici : en effet, nous devons avoir recours à un modèle entier afin d'étudier les réponses immunes et la production d'autoanticorps qui mettent en jeu des coopérations cellulaires multiples dans les organes lymphoïdes tels que la rate et les ganglions.

Réduction

Afin de respecter la règle des 3R, une réduction du nombre d'animaux utilisés a été décidée. La pertinence des résultats sera évaluée à l'aide de tests statistiques multiparamétriques de type Anova nécessitant l'analyse de groupes de 10 souris minimum pour chaque question posée. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d'optimiser l'utilisation des différentes portées, nous utiliserons les mâles et les femelles de chaque portée générée.

Raffinement

Pour répondre à l'objectif de raffinement, les souris seront hébergées en groupes sociaux, et dans des cages à couvercle filtrants comportant des enrichissements (nids, tunnels), sur des portoirs ventilés. Les animaux seront hébergés dans une animalerie à statut sanitaire propre permettant déviter une infection. Le phénotype des animaux sera examiné de façon hebdomadaire à l'aide d'une grille de score définissant des points limites, décrite pour chaque procédure, afin de soustraire les animaux à la souffrance. Après chaque prélèvement sanguin, les animaux seront également surveillés pendant 24h en utilisant des points limites spécifiques.

Choix des espèces

En ce qui concerne l’espèce choisie, la souris est le modèle approprié afin d'étudier les fonctions du système immunitaire impliquant la coopération cellulaire dans un organisme entier. Les connaissances chez la souris étant très développées, en particulier dans le domaine de l'autoimmunité, pour lequel de nombreuses techniques d'analyse et de nombreux réactifs (anticorps, notamment) sont disponibles, en font un modèle approprié pour mener à bien nos différentes analyses et études. Adulte, en âge de procréer pour maintenir l’élevage. Les animaux utilisés pour expérimentations auront un âge de 3 mois (âge moyen d’atteinte d’un système immunitaire mature chez les souris contrôles) et maximum de 8 mois (âge moyen pour lequel les points limites apparaissent).

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de néphrectomie des cinq sixièmes, en deux temps, leur induit une insuffisance rénale chronique, suivie de quinze semaines de régime plus ou moins riche en phosphate, de passages en cage métabolique et de prélèvements de sang. Le porteur reconnaît que la chirurgie, le changement de régime et les prélèvements sont sources de douleur, et prévoit une analgésie post-opératoire. Il affirme que "seul un modèle in vivo" permet d'étudier les liens entre os, rein, intestin et aorte dans le métabolisme du phosphate.

Objectifs

La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l'insuffisance rénale chronique à cause du développement de calcifications vasculaires. En effet, le défaut de fonctionnement des reins entraine des taux élevés de phosphate circulant dans l’organisme. Nous souhaitons évaluer l’impact de la réduction de l’entrée du phosphate (=absorption) dans l’organisme sur le niveau de phosphate circulant lors de la pathologie de l’insuffisance rénale chronique et sur les complications vasculaires. Nous avons récemment découvert que des souris possédant une extinction génique de la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de phosphate réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce paramètre dans le développement des complications vasculaires au cours de l’insuffisance rénale chronique. Ce projet implique des souris contrôles et d’autres modifiées pour la BSP qui subiront une chirurgie de néphro-réduction (procédure visant à induire l’insuffisance rénale chronique). Elles recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 15 semaines avant mise à mort et prélèvements des tissus pour étudier l'impact du défaut d'absorption intestinale sur le niveau de phosphate circulant des souris malades et le développement des calcifications vasculaires.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront d’étudier si la réduction de l’absorption intestinale du phosphate via la voie paracellulaire permet de normaliser les taux circulants de phosphate et donc d’empêcher le développement de calcifications vasculaires en condition de maladie rénale chronique.

Procédures

Certains animaux seront soumis à une chirurgie de néphro reduction des 5 /6 (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux sham auront également deux chirurgies de même durée, avec des actes mimant la néphrectomie. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures. La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (avec respect du délai d'administration - délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 15 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 23 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. En cours de protocole, une goutte de sang sera prélevée sur les animaux anesthésiés via la veine caudale. 6 et 2 jours avant la fin du protocole, les animaux recevront une injection de tétracycline (marqueur de formation osseuse). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang va être réaliser (sur des animaux anesthésiés), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique, pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.

Impact sur les animaux

La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, le passage en cage métabolique, la prise de sang et les injections.

Devenir

A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort. L’enjeu du projet est d’étudier le développement des calcifications vasculaires donc l’arche aortique sera prélevée. De plus, d’autres organes comme le cœur, les os et le rein seront prélevés. Le sang sera également collecté en vue d’observer la modification du métabolisme du phosphate et les marqueurs de dysfonctionnement rénal.

Remplacement

Nous souhaitons investiguer la relation entre l’os (lieu d’expression de la BSP), le rein (insuffisance rénale chronique) et l’intestin (absorption du phosphate) et l’arche aortique (développement de calcifications vasculaires). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.

Réduction

Avant cette étude, une étude pilote a été réalisée. Cette dernière nous a permis de déterminer le sexe des animaux utilisés dans cette étude, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés. L’étude pilote a indiqué que nos animaux supportaient très bien la néphrectomie (2 décès sur 47 souris). Avec un risque d’erreur de type I choisi de 5% et une puissance souhaitée d’environ 60% ; il faut inclure au moins 10 animaux par groupe. Les données de littératures sur des animaux C57Bl6 indiquent un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie. De ce fait et prenant en compte les possibles décès des animaux suite à la chirurgie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique jugée robuste. Cela est en accord avec les résultats de notre étude pilote. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité.

Raffinement

Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de cette procédure, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections de tétracycline en fin de protocole, elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. Le prélèvement de sang sera réalisé sur animal anesthésié, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.

Choix des espèces

L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). Nous disposons au laboratoire des souris déficientes en BSP. L’étude est menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.

Jusqu'à quarante-quatre instillations d'allergène dans le nez sous anesthésie gazeuse, plus deux injections d'allergène dans l'abdomen : des souris femelles sont ainsi rendues asthmatiques, parmi 144 utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit un fragment d'anticorps censé bloquer le métabolisme des acides gras et réduire le remodelage des bronches, puis, sous anesthésie, une trachéotomie permet de mesurer la respiration des souris avant leur mise à mort sans réveil et le prélèvement de leurs organes. Le porteur choisit des femelles parce que l'asthme sévère est plus fréquent chez la femme, et prévoit de traiter par bronchodilatateur l'essoufflement qui peut suivre les instillations. Les points limites se résument à des "critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire", sans aucun seuil chiffré.

Objectifs

L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires qui touche 300 millions de personnes dans le monde. Le terme « d’asthme sévère » s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couvert dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Ces exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes d'essoufflement, de toux, de respiration sifflante ou d'oppression thoracique et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est caractérisé par une hyperréactivité, une inflammation et un remodelage bronchique. Le remodelage bronchique est un changement structurel qui comprend entre autres l’augmentation de la taille du muscle lisse bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est une valeur très importante, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’objectif de ce travail est d’étudier si le blocage du métabolisme des acides gras par un fragment d’anticorps contre une des molécules de cette chaine métabolique au moment d’installation des caractéristiques de l’asthme est capable de diminuer les symptômes de la maladie dans le modèle murin de l’asthme chronique allergique.

Bénéfices attendus

Ce projet montrera si le blocage d’une des molécules qui jouent le rôle important de régulation du métabolisme énergétique dans les muscles lisses bronchiques permet de diminuer les symptômes d’asthme et notamment de remodelage du muscle lisse bronchique chez les animaux de laboratoire. Les données ainsi obtenues ouvriront la voie pour la nouvelle thérapie de cette pathologie respiratoire.

Procédures

Les animaux seront soumis à quarante-quatre (maximum) instillations intranasales sous anesthésie gazeuse (durée jusqu’à 2 minutes) et les deux injections intra-péritonéales de l’allergène (2 injections). Les mesures de paramètres respiratoires d’une durée de 10 minutes seront faites par la méthode de trachéotomie sur les animaux anesthésiés dans la procédure sans réveil.

Impact sur les animaux

Les animaux vont subir un léger stress suite aux contentions pour l’injection/l’instillation des allergènes et un bref placement dans une boîte en plexiglass. Les souris ressentiront une légère douleur des piqûres pendant l’injection. L’anesthésie sous isoflurane induit également un léger stress. La sensibilisation aux allergènes induit des symptômes asthmatiques chez l’animal : l’inflammation des voies respiratoires et éventuel remodelage bronchique. Ces symptômes peuvent survenir après l’instillation de l’allergène et éventuellement provoquer une dyspnée (un essoufflement). Après l’anesthésie, l’opérateur observera les animaux et toute dyspnée sera corrigée par l'utilisation d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Devenir

L’objectif de ce projet est d’estimer l’efficacité de traitement contre le remodelage bronchique dans l’asthme. Suite au développement des symptômes d’asthme, les animaux recevront le traitement et les paramètres respiratoires seront réalisés. Puis les animaux seront mis à mort et les organes seront prélevés et analysés au laboratoire.

Remplacement

En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. Grace au modèle animale, nous testerons les hypothèses apparues après nos résultats in-vitro sur les lignées cellulaires. L’utilisation du modèle murin d’asthme chronique allergique dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes et à terme de proposer des traitements plus efficaces pour la prise en charge des personnes asthmatiques.

Réduction

Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. Nos expériences ne seront pas répétées. Nous allons comparer les organes des groupes de souris asthmatiques avec ceux des animaux témoins qui recevront ou non le traitement pouvant diminuer les symptômes d’asthme. Comme il a été déjà démontré par nos travaux précédents, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum afin de mettre en évidence une différence significative sur les différents paramètres analysés grâce aux pléthysmographie invasive notamment la résistance bronchique dont la variabilité est importante. Afin d’analyser l’inflammation broncho-alvéolaire nous utilisons les 6 animaux par groupe.

Raffinement

Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle induite par les instillations intranasales peut être traitée par la nébulisation pendant 15 s d’un broncho-dilatateur d’action rapide.

Choix des espèces

La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc dans cette espèce, de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux utilisés sont des femelles. La majorité des études sur l’asthme est menée sur les souris femelles. L’utilisation des femelles permet de rapprocher le modèle murin de la maladie humaine car la sévérité de l’asthme est plus fréquente chez la femme que chez l’homme. Les animaux utilisés pour commencer le protocole sont des jeunes adultes âgés de 5 à 10 semaines. La plupart des études scientifiques dans le domaine pneumologique sont réalisées sur les animaux de cet âge.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Spontanément diabétiques, elles reçoivent chaque semaine pendant quatorze semaines une injection de protéines à tester, subissent un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang répétés, avant une ponction aortique terminale. Le porteur signale le stress lié aux manipulations, au gavage et aux mesures de glycémie, et rappelle que ces souris résistent tardivement à l'acidocétose. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'efficacité des composés dans un modèle proche de la maladie humaine avant tout essai clinique.

Objectifs

En 2021, le nombre de diabétiques de type 1 (DT1) dans le monde était de 8,4 millions dont 20% ont moins de 20 ans. Plus de 500 000 nouveaux cas apparaissent chaque année et ce chiffre est en constante augmentation. A ce jour, le seul traitement des DT1 approuvé à ce jour est l’insuline. Néanmoins, des complications sévères peuvent se développer et l’espérance de vie des DT1 est réduite de 10 à 15 ans comparé à un individu non diabétique. Le DT1 survient suite à la destruction auto-immune de la plupart des cellules bêta β. Néanmoins, il persiste un petit nombre de cellules bêta fonctionnelles même 50 ans après le diagnostic. Il a par ailleurs été montré, en particulier dans un modèle de DT1 présentant des caractéristiques proches du DT1 humain, la souris diabétique, qu’activer la prolifération des cellules bêta prévenait l’apparition du DT1 dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de sélectionner une nouvelle molécule présentant un effet antidiabétique grâce à l’augmentation de la masse des cellules bêta pancréatiques, seul ou en combinaison avec les traitements existants et ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques chez le patient diabétique de type 1.

Procédures

Chaque animal recevra une fois par semaine pendant 14 semaines une injection des protéines à tester ou du véhicule (14 injections) plus une administration de glucose le jour du test de tolérance au glucose, test qui dure 120 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal vigile : - 1 goutte de sang une fois par semaine pendant 14 semaines pour la mesure de la glycémie (durée de prélèvement 2-5 secondes) - 6 prélèvements de sang le jour du test de tolérance au glucose (durée de prélèvements 2-5 secondes, ou de 30 à 60 secondes pour les 4 temps où l'insuline sera dosée dans le plasma). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié : ponction aortique immédiatement avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux avec un diabète de type 1 (DT1), qui apparaît spontanément dans le modèle utilisé. La principale complication du DT1 est l’acidocétose diabétique, résultant de l’accumulation de corps cétonique dans le sang. Cependant, les souris utilisées ont la particularité d’être résistante à l’acidocétose, ou du moins son apparition est tardive (souris de plus d’un an); et leur utilisation dans ce projet est à 6 mois d’âge au maximum. Les nuisances attendues liées aux expérimentations sont: le stress dû aux multiples manipulations et mesures de glycémie, au gavage et éventuellement au point d'injection pour l'administration d'insuline. Les techniques employées dans ce projet pour suivre la glycémie sont des techniques utilisées également chez l’homme, comme le test de tolérance au glucose.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt, tels que le pancréas pour mesurer la masse des cellules bêta et évaluer l’infiltration par les cellules immunitaires et le thymus et la rate pour réaliser un profil immunologique.

Remplacement

L’objectif final du projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de composés sélectionnés au préalable sur des tests in vitro pour le traitement du diabète de type 1. Cependant, avant tout essai clinique, il est nécessaire de démontrer l’efficacité de ces composés dans des modèles physiopathologiques dont les caractéristiques sont proches de la pathologie humaine.

Réduction

Les produits testés dans le projet sont des produits qui auront montré un effet positif significatif dans des tests in vitro (lignées de cellules bêta pancréatiques et îlots de Langerhans). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie, sachant que l’incidence du diabète est de 60 à 80% chez la souris femelle spontanément diabétique que nous allons utiliser. Pour limiter le nombre d‘animaux utilisés, 3 protéines seront testées par étude, évitant ainsi de multiplier le nombre de groupes contrôles. Par la suite, la protéine d’intérêt sélectionnée sera testée en combinaison avec une seule dose de produit commercial (dose usuelle dans la littérature) afin de limiter le nombre d’animaux par étude.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés à au moins 3 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels, de matériaux de nidification et de bûchettes de peuplier à ronger. Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les points limites sont les suivants : troubles du comportement; signes d'absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale); perte de poids supérieure à 20%. L’ensemble des procédures de ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie et sont souvent utilisées comme modèles de pathologie humaine comme le diabète. Nous utiliserons une lignée de souris spontanément diabétique comme le modèle de choix du DT1, de par leur susceptibilité au développement spontané d’un diabète auto-immun avec des caractéristiques similaires au diabète humain de type 1. Il s'agit de jeunes adultes, âgés de 6 à 9 semaines à la livraison, qui seront traités pendant 14 semaines par les molécules à tester ou le placebo. Après acclimatation au sein de notre animalerie pendant au minimum une semaine, les traitements commenceront à l’âge de 9 – 10 semaines. A cet âge les souris sont déjà diabétiques mais sans que la maladie ne soit trop grave et provoque une acidocétose. Chez l'Homme, le diabète de type 1 apparait majoritairement chez les adolescents et jeunes adultes.

739 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une greffe de tumeur du pancréas par chirurgie, puis des injections de chimiothérapie et un traitement par ultrasons de puissance pendant cinq semaines, avec un suivi par imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que la croissance tumorale peut causer une perte de poids et des signes de souffrance, pris en charge par analgésie, et qu'une soixantaine d'animaux subissent une chirurgie supplémentaire pour l'implantation de sondes. Il affirme que les cultures cellulaires en 3D ne représentent pas la physiologie tumorale et juge le modèle animal seul capable de la reproduire.

Objectifs

Le cancer du pancréas est une maladie grave avec près de 100% de décès dans les 5 années suivant le diagnostic. La raison principale de ce mauvais pronostic est que l’environnement de la tumeur (appelé stroma) est très dense et empêche la chimiothérapie d’atteindre sa cible. Ainsi modifier cet environnement tumoral pour le rendre moins dense permettrait à la chimiothérapie d’être plus efficace. Les ultrasons de puissance, focalisés, permettent de modifier cet environnement tumoral dans des zones précises, sans impacter les tissus sains. En l’appliquant aux tumeurs du pancréas nous souhaitons savoir si ces ultrasons de puissance permettet d'améliorer l'efficacité de la chimiothérapie. Le projet se déroulera en deux phases : une première phase déterminera les paramètres ultrasonores optimaux augmentant l'efficacité de la chimiothérapie dans des tumeurs greffées. La deuxième phase utilisera ces réglages pour les appliquer dans un modèle génétique de tumeurs du pancréas, plus proche de la maladie humaine, mais pour lequel il est compliqué d’avoir suffisamment de tumeurs comparables en même temps pour réaliser une étude et nécessitant un nombre important d'animaux à élever. Ce projet de recherche translationnelle d’une durée de 3 ans mettra en œuvre un maximum de 739 souris.

Bénéfices attendus

Ce projet doit permettre de valider le système de traitement ultrasonore ainsi que les conditions de son utilisation pour envisager des essais chez les patients pour traiter le cancer du pancréas par endoscopie.

Procédures

Pour la première phase de l'étude, des souris dépourvues de système immunitaire seront utilisées. Parmi ces souris, certaines se verront injecter des cellules tumorales par injection sous-cutanée (210 animaux). La croissance de ces tumeurs peut prendre jusqu'à 6 semaines . Les autres seront opérées sous anesthésie générale et analgésie pour greffer dans le pancréas des fragments tumoraux issus de ces tumeurs sous cutanées (489 animaux). Ces tumeurs mettent 3 semaines à se développer. Ces souris recevront ensuite des injections intra-péritonéales de chimiothérapie ainsi qu'un traitement par ultrasons de puissance pendant 5 semaines. Pour suivre la croissance des tumeurs dans le pancréas et leur réponse au traitement, les souris seront examinées par imagerie non-invasive sous anesthésie générale. Pour mesurer de manière précise les effets des ultrasons de puissance, certains animaux greffés (60) subiront une opération chirurgicale sous anesthésie générale pour appliquer des sondes de mesure directement dans la tumeur, les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérience. Pour la deuxième phase de l'étude, des souris génétiquement modifiées seront croisées pour obtenir une mutation conduisant au développement de tumeurs du pancréas. Ces 40 souris voient appraître des tumeurs entre 10 et 20 semaines et seront ensuite traitées 5 semaines par injection intra-péritonéale de chimiothérapie et par ultrasons de puissance sous anesthésie générale. Tous ces animaux seront suivis par imagerie non-invasive pour suivre la croissance des tumeurs, et caractériser l'effet du traitement.

Impact sur les animaux

La croissance des tumeurs dans le pancréas peut entrainer des pertes de poids et des signes de souffrance si celles-ci sont trop importantes, d'où un suivi précis par imagerie non-invasive et une prise en charge de la douleur par analgésiques. La chirurgie du pancréas induit une douleur liée au geste chirurgical, prise en charge par une analgésie adaptée.

Devenir

Tous les animaux de la procédure 1 sont mis à mort et les tumeurs prélevées seront utilisés pour les procédures 2 à 7. Tous les animaux des procédures 2 à 8 sont mis à mort en fin d'étude pour analyser les tumeurs qu'ils portent et caractériser les effets du traitement.

Remplacement

Des études in vitro ont été réalisées pour déterminer la plage de fonctionnement à utiliser pour les ultrasons de puissance et documenter leur impact couplé à la chimiothérapie dans des modèles de culture cellulaire 3D. Toutefois ces techniques ne peuvent représenter correctement la physiologie du développement tumoral (vascularisation, potentiel métastatique, réponse immune), seul un modèle animal le permet.

Réduction

Le nombre de souris suivies est réduit à ce qui est nécessaire pour être significatif à l'aide de test statistiques adaptés. Des outils d’imagerie non invasive seront utilisés pour suivre le développement tumoral, évitant des mises à mort séquentiels et limitant le degré de souffrance des animaux, les tumeurs étant détectées très tôt. Les résultats de cette étude permettront de réduire par la suite le nombre d’animaux sur le modèle de référence.

Raffinement

Le suivi de la douleur et du stress sera réalisé un à deux fois par semaine et des points limites clairs ont été définis, entrainant la mise à mort si nécessaire. Un suivi plus fréquent est prévu en suite opératoire et après injection des traitements. Les procédures d’imagerie et de chirurgie seront réalisées sous anesthésie avec une analgésie adaptée. Dans ce projet de mise au point, les principaux organes seront prélevés afin de déceler d’éventuelles métastases. Les animaux seront hébergés dans des cages disposant d’enrichissement (tubes en carton et cotons compactés).

Choix des espèces

La souris est un bon modèle de tumeurs du pancréas et nous avons besoin de lignées spécifiques n'existant pour certaines que chez la souris. Les animaux utilisés pour les greffes de tumeur du pancréas seront utilisés à l’âge adulte (8 à 10 semaines), les animaux transgéniques développant des tumeurs à partir de l'âge adulte (au delà de 10 semaines).