Résumé non technique d'un projet d'expérimentation animale publié sur ALURES le 21/09/2023
("EC NTS/RA identifier" : NTS-FR-061661)
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l’issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de néphrectomie des cinq sixièmes, en deux temps, leur induit une insuffisance rénale chronique, suivie de quinze semaines de régime plus ou moins riche en phosphate, de passages en cage métabolique et de prélèvements de sang. Le porteur reconnaît que la chirurgie, le changement de régime et les prélèvements sont sources de douleur, et prévoit une analgésie post-opératoire. Il affirme que « seul un modèle in vivo » permet d’étudier les liens entre os, rein, intestin et aorte dans le métabolisme du phosphate.
Objectifs et bénéfices escomptés du projet
Décrire les objectifs du projet.
La mortalité cardiovasculaire est la principale cause de décès dans l’insuffisance rénale chronique à cause du développement de calcifications vasculaires. En effet, le défaut de fonctionnement des reins entraine des taux élevés de phosphate circulant dans l’organisme. Nous souhaitons évaluer l’impact de la réduction de l’entrée du phosphate (=absorption) dans l’organisme sur le niveau de phosphate circulant lors de la pathologie de l’insuffisance rénale chronique et sur les complications vasculaires. Nous avons récemment découvert que des souris possédant une extinction génique de la sialoprotéine osseuse (BSP) présentent une absorption intestinale de phosphate réduite, ce qui en fait un modèle intéressant pour tester le rôle de ce paramètre dans le développement des complications vasculaires au cours de l’insuffisance rénale chronique. Ce projet implique des souris contrôles et d’autres modifiées pour la BSP qui subiront une chirurgie de néphro-réduction (procédure visant à induire l’insuffisance rénale chronique). Elles recevront une alimentation avec des taux de Pi normaux ou très élevés durant 15 semaines avant mise à mort et prélèvements des tissus pour étudier l’impact du défaut d’absorption intestinale sur le niveau de phosphate circulant des souris malades et le développement des calcifications vasculaires.
Quels sont les bénéfices susceptibles de découler de ce projet?
Les résultats de cette étude nous permettront d’étudier si la réduction de l’absorption intestinale du phosphate via la voie paracellulaire permet de normaliser les taux circulants de phosphate et donc d’empêcher le développement de calcifications vasculaires en condition de maladie rénale chronique.
Nuisances prévues
À quelles procédures les animaux seront-ils soumis en règle générale?
Certains animaux seront soumis à une chirurgie de néphro reduction des 5 /6 (laissant donc 1/6ème de la masse rénale initiale en place), il s’agit de deux procédures chirurgicales à 1 semaine d’intervalle, et chaque chirurgie dure environ 30 minutes. Les animaux sham auront également deux chirurgies de même durée, avec des actes mimant la néphrectomie. Les animaux auront eu une analgésie préalable ainsi qu’une anesthésie locale et gazeuse lors des procédures. La couverture analgésique post-opératoire est également prévue et sera en continue et adaptée en fonction de l’étude des signes cliniques (avec respect du délai d’administration – délai de 4 à 8 heures). Les animaux seront ensuite placés pendant 15 semaines sous régime ± riches en phosphate. Pendant cette période, les animaux seront placés 2 fois pendant 23 heures en cage métabolique pour collecter les urines et les fèces. En cours de protocole, une goutte de sang sera prélevée sur les animaux anesthésiés via la veine caudale. 6 et 2 jours avant la fin du protocole, les animaux recevront une injection de tétracycline (marqueur de formation osseuse). A la fin de l’étude, un acte de prélèvement de sang va être réaliser (sur des animaux anesthésiés), les animaux seront ensuite euthanasiés à l’aide d’une injection d’un produit pharmaceutique, pour ensuite collecter les organes nécessaires aux analyses de l’étude.
Quels sont les effets/effets indésirables prévus sur les animaux et la durée de ces effets?
La chirurgie peut être source de douleur, mais également la modification du régime alimentaire, le passage en cage métabolique, la prise de sang et les injections.
Justifier le sort prévu des animaux à l’issue de la procédure.
A la fin de la procédure expérimentale, les animaux seront mis à mort. L’enjeu du projet est d’étudier le développement des calcifications vasculaires donc l’arche aortique sera prélevée. De plus, d’autres organes comme le cœur, les os et le rein seront prélevés. Le sang sera également collecté en vue d’observer la modification du métabolisme du phosphate et les marqueurs de dysfonctionnement rénal.
Application de la règle des "3R"
1. Remplacement
Nous souhaitons investiguer la relation entre l’os (lieu d’expression de la BSP), le rein (insuffisance rénale chronique) et l’intestin (absorption du phosphate) et l’arche aortique (développement de calcifications vasculaires). La relation entre ces organes va nous permettre d’étudier le métabolisme du phosphate. Seul un modèle in vivo permet de réaliser cette étude.
2. Réduction
Avant cette étude, une étude pilote a été réalisée. Cette dernière nous a permis de déterminer le sexe des animaux utilisés dans cette étude, et ainsi réduire le nombre d’animaux utilisés. L’étude pilote a indiqué que nos animaux supportaient très bien la néphrectomie (2 décès sur 47 souris). Avec un risque d’erreur de type I choisi de 5% et une puissance souhaitée d’environ 60% ; il faut inclure au moins 10 animaux par groupe. Les données de littératures sur des animaux C57Bl6 indiquent un taux de mortalité inférieur à 10% 12 semaines après néphrectomie. De ce fait et prenant en compte les possibles décès des animaux suite à la chirurgie, un nombre de 12 animaux par groupe a été jugé suffisant pour obtenir une puissance statistique jugée robuste. Cela est en accord avec les résultats de notre étude pilote. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de Nx, ce point permettra de réduire le taux de mortalité.
3. Raffinement
Les animaux proviennent de l’élevage du laboratoire, ils sont donc habitués aux expérimentateurs et au personnel de l’animalerie, notamment via le change toutes les semaines. Les animaux sont dans la salle d’hébergement avec de la musique, un passage quotidien, ils ont également de l’enrichissement physique et sociale : cage transparente, 3-4 animaux par cage, bâtons de bois, et copeaux pour les nids. Pour limiter le stress des autres animaux dans la salle d’hébergement, tous les animaux ayant subi l’intervention seront placés dans une autre salle d’isolement. Avant l’expérience, les animaux seront déjà placés dans cette salle pour les habituer. Une grille de scoring sera proposée pour évaluer le bien-être des animaux, et cette évaluation sera effectuée régulièrement. Les actes douloureux comme la chirurgie seront effectués sous anesthésie, et la couverture analgésique sera continue et suffisante durant toute l’étude. De plus, toutes les procédures chirurgicales seront réalisées par un même expérimentateur de façon à réduire la variabilité inter opération. Également, la personne choisie possède de l’expérience dans la réalisation de cette procédure, ce point permettra de réduire le taux de mortalité. Les animaux seront sous surveillance accrue à compter de leur chirurgie. Concernant les injections de tétracycline en fin de protocole, elles seront effectuées par un expérimentateur habilité et formé. Les animaux seront habitués à la contention 48h avant les injections pour diminuer leur stress et également pour vérifier que la contention ne génère pas de douleur au niveau des cicatrices, bien que les cicatrices soient loin de la zone d’injection. Le prélèvement de sang sera réalisé sur animal anesthésié, la mise à mort sera rapide et sans douleur via l’injection d’un produit euthanasiant.
Expliquer le choix des espèces et les stades de développement y afférents.
L’induction de l’insuffisance rénale chronique via une néphrectomie des 5/6ème est connue et maîtrisée chez la souris (plus de 200 animaux opérés, et un taux de mortalité global post opératoire faible). Nous disposons au laboratoire des souris déficientes en BSP. L’étude est menée sur des animaux âgés de 20 semaines. A cet âge, le phénotype des animaux est suffisamment établi pour obtenir des résultats représentatifs d’une population.