Souris

35 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de glioblastome dans le cerveau puis des nanoparticules par voie intraveineuse et des irradiations, une partie étant tuée précocement pour l'analyse des tissus, afin de tester une thérapie photodynamique activée par rayons X. Le porteur relie le passage en gravité modérée aux anesthésies et transports répétés vers le site d'imagerie. Il conclut que le remplacement n'est "clairement pas possible" pour reproduire une tumeur cérébrale.

Objectifs

ll s'agit de valider le bénéfice d'une thérapie photodynamique activée par des rayons X sur un modèle de tumeurs cérébrales orthotopiques implantées chez la souris. Ce projet permettra de renforcer les effectifs et les résultats issus d'une étude préliminaire afin d'avoir une meilleure robustesse statisitique. L'utilisation de souris satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) permettra de caractériser par histologie les effets du traitement X-PDT régulièrement après l'adminitration du traitement.

Bénéfices attendus

Ce projet mené en recherche préclinique permettra d'estimer si cette approche expérimentale est applicable par la suite chez l'Homme. Il permettra à long terme de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement de ce type de tumeurs cérébrales très aggressives (glioblastome) en médecine humaine.

Procédures

Procédure 1 : Xénogreffe intracérébrale : implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral (35 souris au total pour une durée d'1h environ par animal, répété une seule fois en début d'étude) Procédure 2 : Administration intra-veineuse des nanoparticules sur souris vigiles 1h avant les irradiations : cette procédure ne nécessite pas d'anesthésie, la technique étant parfaitement maitrisée par les membres du laboratoire (durée 1min, 19 souris concernées avec 2 réitérations)

Impact sur les animaux

Anésthésie chimique ainsi que transport sur site d'imagerie répétés d'où passage de la saisine en classe modérée.

Devenir

Procédure 1 "xénogreffe intracérébrale" (implantation de cellules tumorales dans le tissu cérébral) : tous les animaux sont gardés en vie (implantation tumorale étant l'étape clé indispensable du projet) Procédure 2 "administration des traitements" : tous les animaux sont gardés en vie (pour permettre par la suite d'évaluer l'efficacité des traitements) Procédure 3 "suivi par imagerie" : tous les animaux sont gardés en vie sauf si un animal a atteint un des points limites décrit précédemment, il sera dans ce cas mis à mort à l'issue de la procédure. En outre, les animaux satellites (souris mises à mort précocémment pour l'observation des tissus au microscope pour observer l'effet précoce du traitement) pour lesquels le temps cinétique prévu est atteint (Jn+4, Jn+11, Jn+18) seront mis à mort à l'issue de la procédure en vue d'analyses histologiques.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est dans ce contexte clairement pas possible puisque le développement et la réponse au traitement in vivo de tumeurs cérébrales dépend de phénomènes biologiques complexes (intravasation, extravasation, envahissement du parenchyme cérébral, angiogénèse...). De plus, la mise en place d’une tumeur est un phénomène multifactoriel impliquant différents types cellulaires (cellules tumorales, cellules endothéliales, stroma...). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal. L’évolution de l’intensité de bioluminescence sera un indicateur d’efficacité des traitements. De plus, chaque groupe sera caractérisé par une courbe de survie. Les survies moyennes seront comparées par test de Kruskal-Wallis suivi d’un test post-hoc si la différence entre tous les groupes est significative.

Réduction

Les données issues d'une étude antérieure nous ont permis de réaliser un premier suivi en imagerie de la croissance des cellules U251 -Luc implantées en stéréotaxie (procédure chirrugicale permettant d'implanter les cellules tumorales directement dans une région bien précise du cerveau), en traitant par la voie X-PDT. Les résultats étant prometteurs, il est cependant nécessaire de compléter les effectifs pour avoir une meilleure fiabilité statistique mais les données générées par cette première étude seront exploitées permettant ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés dans cette étude complémentaire. L'estimation de l'efficacité de la thérapie par imagerie par Bioluminescence nécessite un suivi longitudinal des souris. Chaque animal sera son propre témoin ce qui constitue une stratégie permettant une utilisation judicieuse des animaux et assure une rigueur scientifique

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux d'une part après l'implantation de la tumeur (pesée quotidienne, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, désinfection et vérification de la bonne cicatrisation de la plaie) . L'atteinte d'un point limite décrit précédemment dans le descriptif des procédures conduira à la mise à mort de l'animal. Une attention toute particulière sera également portée lors du transport des animaux sur le site d’imagerie à NancycloTEP, notamment par le maintien d'une température optimale (par l'intermédiaire de bouillottes chauffantes placées sous les cages). Ce transport se fera toujours sous conditions éveillées. Les animaux bénéficieront en permanence d'un enrichissement sous forme de feuilles de sopalins et de bâtonnets en bois à ronger. De plus, une analgésie sera administrée lors des procédures invasives (chirurgie d'induction tumorale)

Choix des espèces

Souris : pour nos expérimentations, nous travaillerons sur des modèles de tumeurs humaines implantées chez des rongeurs immunodéprimés. Ces modèles sont très largement décrits dans la littérature et sont très pertinents dès lors qu'il s'agit d'évaluer de nouveaux agent diagnostiques ou thérapeutiques Des souris âgées de 6 semaines sont utilisées, à un stade où leur conformation crâniale correspond à celle de l’atlas de stéréotaxie de Paxinos et Franklin.

30 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des psychostimulants ou des opiacés par gavage ou injection pour induire une sensibilisation comportementale, puis subissent un test comportemental avant un prélèvement de sang et de cerveau, afin d'évaluer des candidats médicaments contre l'addiction. Le porteur signale des effets indésirables possibles comme des crampes abdominales ou une sédation. Il affirme qu'aucun test in vitro ni modèle informatique ne peut rendre compte du comportement et conclut à l'absence d'alternative.

Objectifs

Les psychostimulants, tels que la D- amphétamine et la cocaïne, et les opiacés, tels que la morphine et l'héroïne, ont en commun la capacité de provoquer une dépendance chez l'homme et d'augmenter la libération de dopamine (DA) dans le noyau accumbens. Les mêmes médicaments induisent également une hyperactivité locomotrice chez les rongeurs et déclenchent une sensibilisation comportementale après des injections répétées. L'objectif de cette étude sera : 1) de mettre en place, chez la souris, un modèle de sensibilisation comportementale induite par une drogue et 2) de tester l’efficacité de médicament candidat dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour tester de nouvelles molécules candidates pour améliorer la prise en charge des patients pour une addiction et leur procurer une meilleure qualité de vie.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration d’un nouvel agent thérapeutique, certains effets indésirables tels que les crampes abdominales ou la sédation, peuvent apparaitre. Les administrations sont réalisées avant le test. Le mode et le nombre d’administrations des solutions sont déterminés en fonction des caractéristiques pharmacologiques des produits. La voie orale (gavage) est généralement privilégiée pour administrer le ou les produits étudiés parce que c’est celle qui sera prescrite chez l’homme. Le cas échéant, par exemple si le produit administré est destiné à être administré par d’autres voies chez l’homme, ou si sa biodisponibilité nécessite un autre mode d’administration, les voies intrapéritonéale, sous cutanée, intraveineuse ou intranasale peuvent être choisies.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

L’étude du comportement animal est une étape essentielle dans le développement des médicaments actifs sur le système nerveux. L’effet de molécules sur le comportement est la conséquence de leur action au niveau de l’ensemble de l’organisme et en particulier sur le système nerveux. La mise en évidence de ces effets est réalisée sur un organisme vivant entier. Pour être valide, un modèle alternatif devrait prendre en compte l’ensemble des phénomènes pharmacologiques, biochimiques et physiologiques qui ont lieu chez l’animal. A ce jour, aucun test in vitro ou modèle informatique ne permet de rendre compte de l’ensemble de ces phénomènes et en particulier ceux qui conditionnent le comportement. Les tests utilisés pour les études comportementales ne peuvent pas donc être remplacés par des méthodes alternatives. Pour le présent projet : il n’existe aucun modèle de sensibilisation comportementale induit par une drogue ou un médicament induisant une dépendance alternatif à l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés pour chaque étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables. Il correspond généralement à ce qui est classiquement utilisé en expérimentation animale. Les données sont présentées en moyenne et d’erreurs standard de la moyenne (SEM). La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p ≤ 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. La lignée de souris utilisée est : C57Bl/6 5-20 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections virales et une fibre optique implantée dans le cerveau sous anesthésie, subissent une stimulation magnétique répétée puis une inhibition optogénétique, avant une perfusion intracardiaque, pour étudier les effets de la stimulation transcrânienne sur la dépression. Le porteur qualifie les effets indésirables de "faibles" et décrit une chirurgie à "impact léger", alors que la procédure est classée en gravité modérée. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ne peut répondre à la question posée.

Objectifs

Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. La stimulation cérébrale magnétique transcrânienne répétée (rTMS) permet de modifier durablement l’activité cérébrale d’une région corticale ciblée via l’application d’une série d’impulsions magnétiques. Ses mécanismes d’action restent peu connus. L’objectif du projet est dans un premier temps de caractériser les effets de la rTMS par photométrie de fibre dans le cerveau de la souris (technique expliquée dans le déroulé du projet). Cette technique permet de suivre en direct l’activité d’une population neuronale à l’échelle d’une région cérébrale. La région d’intérêt à stimuler est le cortex préfrontal médian (mPFC), car il a été montré dans notre équipe que la rTMS du mPFC permet l’amélioration de certains phénotypes dépressifs dans un modèle murin de dépression. Cependant, le rayon d’action de la sonde que nous utilisons pour la rTMS n’a pas été décrit systématiquement in vivo, d’où la nécessité de caractériser la rTMS avec une technique permettant de suivre en direct les modifications de l’activité neuronale. Dans un second temps, l’objectif sera de caractériser plus en détail l’effet thérapeutique des stimulations. Une fois que nous aurons mieux caractérisé la stimulation et ciblé avec plus de précision le mPFC par rTMS, nous allons investiguer quelle projection du mPFC est impliquée dans l’amélioration des phénotypes dépressifs après rTMS. En particulier, le mPFC projette directement vers l’amygdale et le striatum ventral, et indirectement vers l’hippocampe. Ces trois régions et le mPFC étant dérégulées dans la dépression, il est important de déterminer le rôle de chacune de ces projections dans la réponse thérapeutique à la rTMS. Pour cela, nous allons d’abord caractériser la connectivité fonctionnelle au repos 3 jours après la fin d’un traitement de 5 jours consécutifs de rTMS du mPFC. En s’appuyant sur ces résultats, nous allons ensuite étudier l’impact d’une inhibition optogénétique des projections du mPFC vers l’amygdale, l’hippocampe, et le striatum ventral. L’inhibition de ces projections une à une pendant le traitement par rTMS nous permettra d’identifier quelle(s) projection(s) est impliquée dans la réponse thérapeutique.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation de la stimulation magnétique dans les modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de la seule sonde disponible pour les rongeurs (initialement mise au point pour le modèle rat). En se basant sur ce meilleur contrôle de la stimulation, cette étude pourra permettre d’identifier la (ou les) projection du mPFC ayant un effet dans le rétablissement des phénotypes anxieux et/ou dépressifs. Cela est important pour mieux comprendre les effets de la rTMS chez l’homme et l’animal, mais aussi pour développer de potentielles approches thérapeutiques plus spécifiques dans une approche translationnelle.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à des injections virales et à l’implantation de fibre optique sous anesthésie générale (isoflurane), l’intervention durant environ 90 min. Une seconde intevention sous anesthésie générale est la rTMS, qui n’est pas invasive et consiste à placer la sonde magnétique à proximité du crâne de l’animal. 640 animaux au total suivront cette procédure, qui dure environ 10 min et est répétée sur 5 jours consécutifs. Une dernièree intervention sous anesthésie générale également est l’inhibition de l’activité neuronale par optogénétique, qui se fera pendant la rTMS (sur la même durée, 10min) via la fibre optique préalablement implantée et connetée à générateur délivrant des pulses de lumière (10Hz, 10ms) sur une durée de 500ms pendant 20s.

Impact sur les animaux

Peu d’effets indésirables sont à prévoir dans le projet. Le modèle de dépression que nous envisageons d’utiliser a un impact faible sur le bienêtre des animaux. La rTMS n’a pas d’impact sur le bien-être. La chirurgie permettant l’injection du vecteur viral puis l’implantation de la fibre optique pour la photométrie et l’optogénétique a un impact léger sur le bienêtre animal, les animaux récupérant rapidement de ce type de chirurgie, et l’encombrement et le poids de l’implant (canule, et fibre pendant les enregistrements) étant faibles : de nombreux laboratoires ont déjà utilisé ce type d’approche sans encombre sur l’animal mobile et éveillé sans gêne majeure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à morts lors de la perfusion intracardiaque . Cette procédure est nécessaire pour la caractérisation histologique de l’expression des vecteurs viraux et du placement des fibres optiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale à la rTMS nécessite également l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les effectifs sont optimisés, les analyses tissulaires nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle (n=20 sujets par groupe expérimental en tenant compte du taux de succès des chirurgies évalué à ~70%). De plus, la rationalisation des procédures permet d’optimiser l’utilisation des échantillons cérébraux prélevés. Les phases de mise au point des chirurgies (étapes 1) et 2) dans la description du projet) font partie de cette optimisation afin de réduire le nombre d’animaux dans les étapes ultérieures, et seront arrêtées une fois la technique mise au point.

Raffinement

Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu (cabanes plexiglass et cartons, tubes). Les animaux recevront un traitement analgésique avant, juste après et 24 à 48h suivant l’intervention, puis si nécessaire un traitement antibiotique. Chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Les cornées sont protégées de la déshydratation. L’anesthésie gazeuse est ici privilégiée pour mieux contrôler la profondeur d’anesthésie et pour une meilleure récupération post-opératoire. Une surveillance post-opératoire d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris et intervenir si nécessaire.

Choix des espèces

Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des vecteurs viraux permettant l’utilisation de l’optogénétique font de la souris le modèle le plus pertinent. Les animaux seront adultes (âgés d’environ 8 semaines ou plus) au début de l’étude. Justification : il s’agit de comprendre ces phénomènes dans un cerveau adulte (8 semaines correspondant au début de l’âge adulte chez la souris.

4 995 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des bactéries, greffées de cellules tumorales ou exposées à des substances cancérigènes, puis traitées par antibiotiques, immunothérapies ou phages, pour étudier la réponse immunitaire de la vessie. Le porteur reconnaît que l'infection peut causer des douleurs et qu'une tumeur à croissance rapide peut obstruer l'urètre. Il décrit ces travaux comme visant une "meilleure compréhension" des mécanismes immunitaires et affirme le recours à l'animal "absolument nécessaire", faute d'alternative.

Objectifs

Notre objectif est de comprendre la réponse immunitaire à l'infection, au cancer et aux immunothérapies dans la vessie. Cette compréhension nous permettra d'identifier des cibles pour les futures imunothérapies afin d'améliorer le traitement des infections, des cancers et d'autres maladies de la vessie.

Bénéfices attendus

Nous espérons avoir une meilleure compréhension du fonctionnement de la réponse immunitaire dans la vessie et comprendre les mécanismes par lesquels les approches thérapeutiques, telles que la vacciantion ou la phagothérapie, améliorent l'immunité contre la maladie.

Procédures

les animaux seront infectés par des bactéries, ou implantés avec des cellules tumorales, ou recevront des substances cancérigènes pour développer des tumeurs. Ensuite, les animaux seront traités avec des médicaments, tels que des antibiotiques, des immunothérapies ou des phages.

Impact sur les animaux

Bien que nous ayons mis en place un plan pour éviter les effets néfastes, il est possible que les animaux ressentent des douleurs dues à une infection, comme c'est le cas chez l'homme, ou que des tumeurs à croissance rapide provoquent une obstruction urétrale. Nous pouvons surveiller ce scénario pour éviter cette possibilité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de toutes les procédures.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est absolument nécessaire pour ce projet puisqu’il n’existe aucune autre alternative pertinente pour ce genre de projet. En outre, ces études doivent être effectuées in vivo, parce qu’il est nécessaire que les organes et les systèmes impliqués soient intacts afin de bien comprendre la migration cellulaire et la réponse immunitaire (innée et adaptative).

Réduction

Réduction : Le nombre de souris a été calculé pour utiliser le nombre minimum d'animaux nécessaires à l'analyse statistique, sur la base d'expériences antérieures. Dans la mesure du possible, un seul groupe témoin sera utilisé pour plusieurs groupes expérimentaux afin de réduire le nombre total de souris nécessaires, sans compromettre l'intégrité de l'expérience.

Raffinement

Raffinement : Tout sera mis en œuvre pour minimiser le stress, l'inconfort et la douleur des animaux. Cela comprend une surveillance régulière, l'administration de médicaments antidouleur approuvés si les souris souffrent (aspect voûté, piloérection) et la détermination de points limites avant de commencer l'expérimentation (perte d'un pourcentage prédéterminé de poids, par exemple) (le tout conformément à la réglementation européenne).

Choix des espèces

Les souris sont un bon modèle pour étudier les réponses immunitaires contre les bactéries. Il a été démontré empiriquement que les infections des voies urinaires chez la souris reflètent, dans de nombreux aspects essentiels, l'état de la maladie observée chez l'homme. Il a été démontré que la voie utilisée par les pathogènes identifiés comme uropathogènes chez la souris est également utilisée chez l'homme, ce qui justifie l'utilisation de la souris comme un modèle approprié pour l’infection des voies urinaires. Des travaux précédents de notre laboratoire ont démontré que la réponse des souris traitées par BCG-thérapie pour le cancer de la vessie est très similaire à celle observée chez l'homme, justifiant à nouveau la souris comme un modèle utile pour l'étude de l'immunothérapie dans la vessie. On va utiliser les souris de 6 à 24 semaines. Cet âge chez la souris équivaut à l’âge adulte chez l’homme. Dans un très petit nombre d'observations, nous analyserons la vessie de souris néonatales non manipulées qui n'ont pas encore été sevrées, âgées de 0 à 28 jours, afin d'identifier spécifiquement le moment où les populations de macrophages résidents dans la vessie divergent en deux populations distinctes et si cela dépend du passage de l'allaitement à l'alimentation solide. Nous pensons avoir besoin de 8 à 10 souris par point temporel, 4 points temporels étant prévus. Donc, 40 souriceaux femelles et 40 souriceaux mâles

520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique chronique, suivie de tests du seuil mécanique aux filaments de von Frey, de préférence de place conditionnée et d'observation en IntelliCage, pour étudier l'anxiété et la dépression liées à la douleur chez les femelles. Le porteur précise qu'aucun anti-inflammatoire ni opiacé ne peut être administré, ces molécules interférant avec la douleur qu'il cherche à maintenir. Il affirme qu'il lui est "impossible" de remplacer ce modèle par une approche in vitro ou in silico.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7% dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles de l’humeur. En effet, environ 50% des patients présentent cette co-morbidité. Ceci constitue un enjeu important de santé publique. Malgré les données cliniques, les mécanismes sous-jacents de cette co-morbidité restent encore inconnus et nécessitent des études précliniques. Une modélasation chez la souris mâle des conséquences affectives à long terme d’une douleur neuropathique existe. De plus, les données d’imagerie neuroanatomique et fonctionnelle chez l’homme, ainsi des résultats obtenus par des approches lésionnelle, ,d’optogénétique et imagerie, chez la souris montrent que la dépression majeure mais aussi les situations douloureuses s’accompagnent de changements dans des structures limbiques comme le cortex cingulaire antérieur (CCA), l’Habénula laterale (HBl), le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) et l’aire tegmentale ventrale (VTA). Le but de ce projet est de caractériser les comportements anxio-dépressifs dans un modèle de douleur neuropathique chez les femelles et comparer les changements moléculaire et physiologique entre mâles et femelles.

Bénéfices attendus

Le but de ce projet est double : 1) caractériser pour la première fois chez la femelle l’établissement de la douleur chronique neuropathique et le développement progressif des comportements de type anxieux et dépressif et 2) en étudier les changements moléculaires au cours du développement de cette comorbidité dans 4 structures cérébrales d’intérêt, le cortex cingulaire antérieur (CCA), l’Habénula laterale (HBl), le noyau basolatéral de l’amygdale (BLA) et l’aire tegmentale ventrale (VTA). A l’issue de ce projet, nous serons en mesure de détailler pour la première fois l’apparition de cette comorbidité chez la femelle, en comparaison avec les données déjà connues chez le mâle, et pourront de plus décrire les adaptations moléculaires liées au développement des comportements de type anxieux et dépressif chez les deux sexes. Cette avancée pourrait permettre de révéler de nouvelles cibles thérapeutiques, potentiellement différentes chez le mâle et la femelle.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique avec développement de troubles anxio-dépressifs. Chirugie patte droite de l'animal et pose de puce d’identification.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie "cuff" et / ou à la chirurgie stéréotaxique, toute perte de poids qui atteindrait 15 % sans récupération, ou une plaie ouverte seront considérées comme point limite. Tout animal montrant un de ces points limites et dont l'état ne s'améliore pas sur une période raisonnable (48 h pour une blessure et 5 jours pour la perte de poids) sera mis à mort par inhalation de dioxyde de carbone. Après chaque chirurgie, des croquettes ainsi que de l'eau gélifiée sont disposés dans les cages. Une fiche individuelle de suivi est utilisée afin de suivre le bon rétablissement de chaque animal. Cette fiche présente en annexe 3 est basée sur une évaluation numérique (scoring). Pour la chirurgie « cuff », chaque animal est scoré le lendemain de la chirurgie, puis deux fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. Pour la chirurgie stéréotaxique, chaque animal est scoré quotidiennement pendant les 3 jours suivants la chirurgie puis deux fois par semaine jusqu'à la fin du protocole expérimental. » Points limites : - si le poids est inférieur à 80 % du poids initial (avant chirurgie) pendant 48 h - si, après anesthésie, l’animal présente des signes d'abdomen gonflé pendant 48 h - si l'animal présente une vocalisation spontanée ou une automutilation - si l’animal présente deux scores de 2 ou un score supérieur à 6 sur la grille de suivi-post-chirurgical (annexe 2). - Pour la procédure 1: problèmes moteurs, difficulté à se déplacer ou paraplégie - Pour les procédures 8 et 9 : rougeurs ou signes d’infection autour de l’implant crânien Remarque : l'utilisation d'antidouleur de type anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) et opiacés n'est pas possible en post-chirurgie dans notre cas. Les AINS tout comme les opiacés bloqueraient (ou interfèreraient avec) les processus inflammatoires nécessaires au développement et au maintien de la douleur neuropathique.

Devenir

• P1 : Modèle de douleur neuropathique (TOUS les animaux sont gardés en vie pour les procédures suivantes soit 520 animaux) • P2 : Evaluation du seuil de sensibilité mécaniques filaments de von Frey (TOUS les animaux sont gardés en vie pour les procédures suivantes soit 520 animaux) • P3 : Evaluation de l’état anxieux/dépressif (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 160 animaux) P4: Evaluation de la douleur spontanée par le test de préférence de place conditionnée (CPP) (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 120 animaux) • P5 : Pose de puce pour analyse du comportement spontané dans une IntelliCage (TOUS les animaux sont mis à mort par CO2 soit 80 animaux) • P6 : Evaluation de l'état anxieu/dépressif des animaux pour analyses moléculaires (TOUS les animaux sont mis à mort par dislocation cervicale soit 160 animaux)

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur et de sa composante émotionnelle et affective nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Afin de réduire l’angoisse des animaux, les souris seront hébergées à 4-5 par cage. Chaque cage sera enrichie avec de la frisure et du coton pour favoriser les comportements de nidation et un barreau bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Au regard de la littérature et de la variabilité phénotypique inter-individuelle, les groupes expérimentaux explorant les comportements de type anxio-dépressif liés aux douleurs chroniques seront constitués d’au moins 20 souris. Les animaux étant consanguins, la variabilité phénotypique est considérablement diminuée, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux tout en mettant en évidence un effet statistiquement significatif. Un calcul statistique « power analysis » a également été réalisé pour s’assurer que les résultats obtenus sont valides au plan statistique (multiple ANOVA).

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Nous travaillerons en cycle jour/nuit inversé (lumière allumée de 21h à 9h), pour éviter les manipulations durant le temps de sommeil des animaux et ainsi diminuer le stress. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Les signes de mal-être suivants seront recherchés : perte de poids, blessure ou plaie ouverte, dégradation de l'état du pelage, dos arqué. Un exemplaire du « mouse grimace scale » sera disponible (annexe 1) pour aider à la détection des signes de douleurs aiguës. En cas de signes de souffrance de l’animal, des soins (désinfection, suture de plaie), une administration d’antalgique ou d’anti-inflammatoire, une séparation (blessures entre congénères) seront réalisés après concertation avec le vétérinaire, la Structure chargée du Bien-Etre des Animaux (SBEA) et/ou le personnel zootechnique de l’institut. Enfin, des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la SBEA de l’institut pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.

Choix des espèces

Le modèle de douleur neuropathique utilisé dans cette étude a été caractérisé et validé pharmacologiquement chez la souris et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. De plus, de nombreuses lignées de souris transgéniques existent et sont disponibles ce qui nous permettra de répondre de façon précise aux questions scientifique posées. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).

4 770 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de lipopolysaccharide bactérien pour induire un état de type dépressif, puis passent le test de la nage forcée avant un prélèvement de sang et de cerveau, afin d'évaluer des candidats médicaments. Le porteur indique que le produit provoque une hypoactivité et une perte de poids, et retire du bécher toute souris qui met la tête sous l'eau. Il affirme qu'il "n'existe pas de méthodes alternatives" pour modéliser la dépression et conclut au caractère "nécessaire" du recours à l'animal.

Objectifs

De plus en plus d’études démontrent que l’inflammation joue un rôle dans la physiopathologie du trouble dépressif majeur (MDD). En effet, il a été montré que les patients déprimés présentaient un taux plus élevé de cytokines pro-inflammatoires par rapport à des témoins sains. Des symptômes dépressifs ont également été détectés chez des patients traités par immunothérapie pour des cancers ou des maladies virales. L’administration périphérique de l'endotoxine bactérienne lipopolysaccharide (LPS) induit des symptômes de type dépressif chez les rongeurs dans le modèle de la nage forcée (ou forced swimming test, FST). L’objectif de ce projet sera dans un premier temps la mise en place de ce modèle puis l’étude, chez la souris ayant reçu du LPS, d’une potentielle efficacité de plusieurs candidats médicaments dans le test de la nage forcée.

Bénéfices attendus

Les études animales précliniques reposent sur des modèles de rongeurs bien validés pour faciliter la compréhension des mécanismes et ainsi améliorer sa prise en charge. Ainsi, ce modèle animal peut être utile pour identifier le lien entre l’inflammation et l’état dépressif afin de tester de nouveaux candidats médicaments.

Procédures

La collecte de sang et le prélèvement de cerveau sont des demandes fréquentes dans les études de recherche préclinique. Ils permettent de réaliser des mesures de paramètres biochimiques. Les différents prélèvements (sang + cerveau) sont effectués à la fin du test comportemental ; juste avant la mise à mort de l’animal.

Impact sur les animaux

L’administration de LPS induit chez la souris une hypoactivité et une baisse de masse corporelle durant les heures qui suivent l’injection et l’administration de nouveaux candidats médicaments peut également entraîner des effets indésirables. Les animaux sont donc suivis après administration. L’état général des animaux est évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort. Des paramètres supplémentaires ont été rajoutés, il concerne les effets indésirables potentiels qu’un traitement pourrait provoquer. L’expérimentateur doit alors noter l’intensité de chacun de ces paramètres. Durant le test de nage forcée, si la souris met la tête sous l’eau, elle est immédiatement retirée du bécher et placée dans une cage contenant un linge pendant 10 minutes pour retourner ensuite dans sa cage d’origine.

Devenir

Pour des mesures de paramètres biochimiques, les animaux seront soumis à la fin de l’étude à un prélèvement sanguin et de cerveau.

Remplacement

A ce jour, il n'existe pas de méthodes alternatives pour modéliser la dépression. Le recours à l’animal de laboratoire s’avère donc nécessaire pour l’étude de la physiopathologie et l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le nombre total d'animaux utilisés pour une étude est fonction du nombre de groupes et du nombre d'animaux par groupe nécessaire pour l'obtention de résultats statistiquement interprétables. Compte tenu de la variabilité interindividuelle des variables mesurées dans ce test, ce nombre a été fixé à 15 animaux par groupe. L'utilisation d'un nombre inférieur d'animaux a une probabilité importante d'entraîner la non-validité de l'étude, conduisant à la refaire, et par conséquent à utiliser un nombre d'animaux plus élevé. Les données sont présentées en moyenne ± SEM. La différence entre les groupes est évaluée à l'aide de tests paramétriques : t de Student et de l'analyse de la variance (ANOVA). Une valeur de p < 0,05 est considérée comme statistiquement significative. NB : Les tests paramétriques sont utilisés en première intention car présentant une puissance statistique supérieure aux tests non paramétriques c’est-à-dire permettant la mise en évidence d’une différence avec des effectifs plus faibles.

Raffinement

Nous portons une attention particulière au raffinement des conditions d’hébergement (enrichissement du milieu, soin aux animaux) et d’expérimentation (méthode de manipulation, durée du test), afin d’assurer à nos animaux des conditions de vie les meilleures possibles. Les animaux seront pesés et leur état général quotidiennement évalué selon notre grille de surveillance pour détecter des signes éventuels de douleurs. De ce fait, si un animal atteint à un moment donné de l'expérience, un de ces points limites définis, il sera immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

Le répertoire comportemental des souris correspond aux domaines de recherche abordés, contrairement à des espèces présentant un système nerveux central moins développé. De plus, les rongeurs sont des modèles simples à élever et leur reproduction est relativement bien contrôlée. Dans le cas de ce projet, la proximité clinique entre le modèle de souris et la maladie humaine fait de celui-ci le modèle le plus fiable pour étudier l’effet des traitements sur cette maladie dans toute sa complexité. Les lignées utilisées sont : la souris Swiss et la C57Bl/6 13 semaines au moment du test. Les molécules développées sont destinées à des adultes.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de peau humaine ou bio-imprimée sous six à onze anesthésies, avec un suivi par pansements et imagerie, pour évaluer la cicatrisation. Le porteur liste parmi les effets attendus saignements, hématomes, infections et nécrose du greffon, et fixe la mise à mort à 15% de perte de poids. Il met en avant une innovation "made in France" et des publications à "haut facteur d'impact" autant que le bénéfice pour les grands brûlés.

Objectifs

L’objectif principal de cette étude vise à évaluer l’efficacité, chez un modèle murin immunodéprimé, d’une greffe de peau (dermo-epidermique) fabriquée à partir de cellules humaines par un procédé de culture cellulaire et d’impression 3D : apprécier la cicatrisation post greffe quantitativement (en surface et en épaisseur) et qualitativement (en terme d’intégrité cellulaire, d’inflammation et de vascularisation).

Bénéfices attendus

Les résultats feront l’objet de communications scientifiques et de publications dans des revues scientifiques internationales à haut facteur d’impact. Ce projet étant proposé par des chercheurs, industriels et des cliniciens, il a été élaboré de manière à ce qu’il soit transposable à l’Homme. La peau bio-imprimée préparée à partir d’un prélèvement peu invasif de cellules du patient permettrait de simplifier la procédure chirurgicale et d’éviter les larges prélèvements de peau, leur rançon cicatricielle et les procédures chirurgicales sous anesthésie générale qu’ils engendrent. Cette innovation thérapeutique « made in France » pourra être une avancée technique significative en termes de diminution de la morbidité pour la prise en charge des patients nécessitant une greffe de peau, comme les grands brulés, les exérèses de cancers cutanés et les victimes de traumatisme avec délabrement cutané.

Procédures

Toutes les interventions décrite ci-après sont faite sous anesthésie générale hallogéné : soit entre 6 et 11 anesthésie pour l'ensemble des animaux. (1) Procédure chirurgicale : Greffe de peau humaine ou de peau bio-imprimée 1 fois à J0 -- Nombre de souris =72 -- Durée= 20min/souris ; (2) Pansements et analyse photonumérique : 6 fois au total à J2, J5, J8, J12, J15, J21, pour tous les animaux vivants à date -- Durée=5min ; (3) Analyse macroscopique : étude de l’épaisseur de la greffe par pinch test de chaque animal -- maximum 3 fois, pour tous les animaux vivants à date -- Durée=5min ; (4) Laser Doppler : maximum 3 fois J2, J5, J12 -- Pour tous les animaux vivants à date -- Durée :10 minutes ; (5) Imagerie nucléaire : maximum 4 fois J5-8, J15-16 -- pour tous les animaux vivant à date -- Durée : 30 minutes

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont ceux communs aux greffes de peau chez l’Homme : - Saignements per et post opératoires - Hématome post-opératoire - Infection post-opératoire - Nécrose du greffon cutanée

Devenir

Une partie importante de notre projet se base sur l’étude microscopique des tissus à différents temps de la cicatrisation : J8, J15 et J21. Les prélèvements se feront en post-mortem, nous avons prévu d’effectuer ces prélèvements sur 4 souris pour chaque temps, soit un effectif de n=12 (4 souris x 3 temps) pour chaque lot.

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L'usage de biothérapie nécessite une évaluation de l'efficacité et des risques sur un modèle biologique vivant avant transposition à l'homme.

Réduction

L’objectif principal de cette étude vise à évaluer la greffe de peau fabriquée par impression 3D chez un modèle murin. Nous avons déterminé à partir d’études préalablement réalisées que 24 souris immunodéficientes par série - pour 3 séries étalées sur 3 ans - seront nécessaires et suffisantes pour mener à bien ce projet. L’utilisation de l’imagerie isotopique permettra de faire un suivi longitudinal, multiparamétrique et quantitatif non invasif du processus de cicatrisation et ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Le nombre de souris prévues est minimum mais suffisant pour chaque étape pour obtenir des résultats significatifs. Nous avons retenu le nombre de 12 animaux maximum par groupe analysés et par temps ; ce nombre a été choisi à partir d’études précédentes s’approchant de notre protocole.

Raffinement

Les souris seront hébergées par 5 en portoirs ventilés durant la période d’acclimatation pour diminuer leur stress et permettre les interactions sociales. Chaque cage sera agrémentée de tunnel rouge afin d'amener un enrichissement aux souris et de les stimuler. Elles auront à disposition de la nourriture et de l’eau à volonté, le cycle jour/nuit (12h/12h) sera respecté et la température et l’hygrométrie ambiante seront contrôlées. Toutes les manipulations seront réalisées par du personnel formé afin d’optimiser le bien-être des souris et l’obtention de résultats positifs. La chirurgie se fera sous anesthésie générale avec une analgésie pré et post-opératoire. Après la chirurgie, les souris seront hébergées dans des cages individuelles pour éviter que les pansements soient arrachés par les congénères. Pour limité aux maximum le stress de l'animal toutes les gestes de suivi post-opératoire (pansements, imageries, ...) seront réalisés sous anesthésie. Et les différents gestes seront regroupés au maximum pour limiter le nombre d'anesthésie par animal. De plus, la douleur et le bien-être des souris seront évalués quotidiennement tout au long de l’expérimentation afin d’adapter leur prise en charge en fonction. Si l’atteinte du point limite défini par une souffrance sévère irréversible (En cas de perte de poids supérieure à 15 % ; troubles du comportement : arrêt du toilettage, faciès douloureux, signe d’apathie, difficulté à se déplacer et à se nourrir ; invalidité ou de signe d'infection cutanée) était objectivée, une mise à mort de l’animal sera réalisée sans délai.

Choix des espèces

La souris présente un modèle de cicatrisation cutanée proche de l'homme et le plus documenté actuellement. Ce modèle de plaie reproductible et comparable est validé pour l'étude objective des biothérapies dans la cicatrisation. Il s’agira de souris nude femelles compatibles avec l’utilisation d’un greffon de peau (bioimprimée ou non) humaine. Utilisation des souris à 8 semaines de vie, au moment où leur potentiel de cicatrisation est le plus important.