Souris

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par chirurgie stéréotaxique une greffe intracérébrale de cellules de gliome pédiatrique du tronc cérébral, tumeur incurable, pour tester l'effet de l'inhibition du gène VRK3 sur sa progression. Le porteur indique que les animaux développeront des troubles neurologiques et une ataxie liés à la tumeur. Il décrit ces modèles, suivis par bioluminescence, comme un "outil indispensable" faute de pouvoir reproduire l'infiltration tumorale hors de l'animal.

Objectifs

Les tumeurs cérébrales constituent la première cause de mortalité et de morbidité par cancer chez l'enfant et l'adulte jeune. Les gliomes malins infiltrants du tronc cérébral (ou DIPG), qui représentent 10 à 15% des tumeurs cérébrales pédiatriques, sont les formes les plus graves et les plus mal connues sur le plan biologique. Ces tumeurs sont universellement incurables et constituent le plus grand défi thérapeutique de l'oncologie pédiatrique à ce jour. Nous avons initié un programme de recherche pour caractériser ces tumeurs et montrer qu’elles sont très différentes des gliomes de l’adulte et des tumeurs corticales de l’enfant. Des mutations originales de l’histone H3, quasi-constantes dans les DIPG et jamais décrites dans aucun autre type de cancer, ont été découvertes. Il s’agit donc d’un mécanisme oncogénique complètement inédit et intimement lié au développement de cette partie du cerveau. Par ailleurs, les DIPG ne forment jamais de masse tumorale, mais infiltrent les structures cérébrales normales puis se disséminent dans la totalité du cerveau. Nous avons récemment réussi à développer des modèles expérimentaux de tumeurs cérébrales issus de tumeurs de patients atteints de DIPG. Ces modèles que l'on peut suivre par bioluminescence, développent des signes cliniques neurologiques entre deux et quatre mois post-greffe, et histologiquement la tumeur se développe en infiltrant le tronc cérébral. Ces modèles sont encore très rares et sont un outil indispensable pour l'exploration de thérapies prometteuses. Afin d’identifier les gènes nécessaires à la survie cellulaire du DIPG, une étude de screening par shARN ciblant l’ensemble des kinases humaines a été réalisé sur quatre lignées in vitro. Plusieurs gènes ont été identifiés dont VRK3. Les résultats de ce crible ont été confirmés in vitro par shARN et Crispr/Cas9 sur un plus grand nombre de lignée cellulaire de DIPG. Pour les études vivo, des constructions spécifiques de shRNA et Crispr/Cas9, dirigées vers le gène VRK3, inductibles par la doxycyline ont été réalisés afin d’éteindre le gène dans les cellules tumorales après la greffe.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont la réduction ou le ralentissement du volume ou de la croissance tumorale dans le cerveau de souris, comme modèle de la maladie humaine, après inhibition du gène VRK3 par induction de 845mg/kg de doxycycline dans l'alimentation. En effet, in vitro, nous avons pu voir que l'inhibition du gène VRK3 était létal sur les cellules. Nous nous attendons à cette létalité sur les cellules tumorales in vitro ou bien un ralentissement de leur croissance.

Procédures

Chirurgie stéréotaxique sous anesthésie générale (durée 30 minutes). Injection de luciférase en IP 10ml/kg sous anesthésie locale à raison d'une injection tous les 15 jours pour observer la bioluminescence (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

L’inhibition de VRK3 sera spécifique aux cellules tumorales, car les constructions seront intégrées uniquement dans ces dernières en amont de la greffe, nous ne nous attendons donc pas à observer des signes de toxicité systémique chez la souris. Les nuisances attendues chez les animaux sont celles liés aux symptômes tumoraux (trouble neurologiques perceptibles; ataxie).

Devenir

Mise à mort de tous les animaux pour prélèvements des cerveaux et analyses ex-vivo.

Remplacement

Une singularité des gliomes du tronc cérébral résulte dans leur phénotype systématique d’infiltration des structures normales, l’absence de masse tumorale et l’importante capacité d’invasion du tronc cérébral dans un premier temps, puis plus largement du cerveau au décours de la maladie. Ces particularités résultent des interactions des cellules tumorales avec leur stroma qui ne peuvent être appréhendées que dans des modèles vivo, où la variété et complexité du microenvironnement tumoral peut être reproduite.

Réduction

Nos xénogreffes intracérébrales de DIPG que nous pouvons suivre par bioluminescence, développent des tumeurs avec un temps de survie des animaux de façon reproductible. Le nombre minimal nécessaire et suffisant a été calculé au plus juste par calcul de puissance (GPower). Les contrôles ont tous été vérifiés et validés ou supprimés.

Raffinement

Toutes les procédures sont réalisées sous anesthésie générale ou locale (injections). Les animaux seront pesés deux fois par semaine et examinés trois fois par semaine au début de la maladie, puis quotidiennement avec des tumeurs au stade avancé. Ils seront hébergés au minimum par 2 avec un enrichissement de la cage type sizzlenest et recevront des anti-douleurs dès l’arrivée des premiers symptômes neurologiques ou de douleur. L'eau et la nourriture seront donnés ad libitum. La nourriture sera adaptée en cas de symptômes (DietGel).

Choix des espèces

L'utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Swiss/Nude) permet la greffe de tumeurs humaines. Les animaux utilisés auront entre 4 et 6 semaines correspondant à l’âge du jeune adulte. Nos études préalables nous ont montrées qu'il n'y avait pas de différences de prise de greffe chez des animaux juste sevrés (3 semaines) et des animaux adultes (plus de 6 semaines). Cependant, le développement de la tumeur étant lent (entre 2 mois et 1 an selon les modèles), nous utiliserons des animaux jeunes afin de ne pas avoir un état général dégradé qui pourrait être dû à la dégénérescence du modèle en fin de protocole.

460 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des plaies cutanées par découpe à l'emporte-pièce ou par compression à l'aimant, pour étudier le rôle d'une "protéine X" dans la cicatrisation et la fonction vasculaire. Le porteur indique qu'aucun anti-inflammatoire ne sera administré pendant la cicatrisation "car cela pourrait modifier les résultats", une douleur modérée pouvant persister plusieurs jours. Il décrit le passage par l'animal comme "indispensable" pour observer ces mécanismes dans un "organisme entier".

Objectifs

Des candidats médicaments sont en cours de développement pour traiter certains défauts de cicatrisation tels que les plaies des grands brûlés, les opacités cornéennes ou les conséquences déletères d'un infarctus au niveau cardiaque ou d'une infection au niveau hépatique ou pulmonaire. Toutes ces pathologies peuvent s'avérer mortelles ou très invalidantes et représentent un coût sociétal très important. Pour le moment, les candidats médicaments se fixent principalement sur la Protéine Y bien caractérisée mais aussi sur une protéine très semblable, appelée Protéine X, dont les fonctions sont mal connues. Pour mieux anticiper les effets secondaires des candidats médicaments et déterminer s'il faut les améliorer pour qu'ils ne reconnaissent que la Protéine X ou la Protéine Y, il est crucial de mieux comprendre les rôles précis de la Protéine X chez les mammifères. La peau et les vaisseaux sanguins seront investigués en analysant particulièrement le rôle de la Protéine X dans la cicatrisation de la peau ainsi que dans la capacité des vaisseaux sanguins à répondre aux agents qui régulent la pression artérielle ou à laisser passer des molécules dans les tissus.

Bénéfices attendus

Les expériences ne nécessitant pas de recours aux animaux ont déjà été réalisées. Ceci a permis d'identifier des mécanismes d'action possibles pour la Protéine X. L'étape suivante consiste à vérifier ce qui se passe dans un organisme entier et à confirmer les données préliminaires déjà obtenues concernant l’effet de l’absence de la Protéine X sur l’organisation de la peau normale et cicatricielle ainsi que sur la fonction des vaisseaux sanguins. Ces éléments seront étudiés indépendamment puis conjointement dans un modèle de plaie où l’apport en oxygène et nutriments est déficient (type escarre). A plus long terme, les informations collectées lors de ces expériences serviront à mieux comprendre les fonctions de la Protéine X dans la peau et à évaluer s’il est plutôt bénéfique ou délétère que les candidats médicaments reconnaissent à la fois la Protéine X et la Protéine Y. Par exemple, s'il s'avère que la Protéine X est nécessaire à la fonction vasculaire, il faudra développer des candidats médicaments qui n'affectent que la Protéine Y. Les résultats obtenus seront ainsi très importants pour optimiser leurs propriétés.

Procédures

Il n'est pas prévu de prélèvements sur animaux vigiles. Cependant, une injection de colorant (Bleu EVANS) est programmée sur certains animaux pour identifier des "fuites" éventuelles au niveau des vaisseaux sanguins. Une série d'animaux sera également soumise à des plaies réalisées soit à l'aide de "punchs" et ciseaux fins (6 mm de diamètre; 1 seule induction de plaies) soit par application de 2 aimants de 8 mm de diamètre pendant 3 fois 3h à 24h d'intervalle (plaies de compression). Les autres interventions auxquelles seront soumis les animaux sont non invasives et indolores.

Impact sur les animaux

Les souris déficientes en Protéine X sont viables, fertiles et ne semblent pas présenter de phénotype dommageable, en conditions normales, susceptible d’induire de la souffrance ou d’affecter leur comportement. La procédure visant à évaluer la fonctionnalité vasculaire utilise des techniques non invasives et indolores (laser doppler) réalisées sous anesthésie générale pour diminuer le stress des animaux. L’injection de bleu EVANS dans la veine caudale en fin de procédure peut cependant induire un stress momentané. L’induction des plaies d’excision et de compression peut aussi causer douleur et stress chez l’animal. Elles sont réalisées sous isoflurane pour diminuer ces effets et un produit analgésique sera administré avant l'induction des plaies d'excision. Une douleur modérée peut persister après l'induction de la plaie pendant quelques jours. Il n’est pas prévu d’administrer de produit anti-inflammatoire pendant l’induction des plaies ou pendant la cicatrisation car cela pourrait modifier les résultats de notre étude. L’apparition d’autres effets indésirables (perte de poids, mobilité réduite, comportement anormal etc) sera surveillée tous les 2 jours.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures car des prélèvements seront réalisés pour étudier la peau et ses différents composants cellulaires.

Remplacement

Les modèles in vitro (protéines recombinantes) et cellulaires ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées qui nécessitent des systèmes intégrés multi-cellulaires et multi-organes. Il n’existe par exemple pas de modèle de peau reconstruite intégrant toutes les composantes cellulaires nécessaires aux études de physiologie vasculaire ou de cicatrisation. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures de fonctionnalité vasculaire, il est possible de tester deux agents vaso-dilatateurs différents sur les mêmes animaux à 7 jours d’intervalle minimum. Les mêmes animaux peuvent donc être utilisés pour ces deux mesures qui sont également couplées à chaque fois à au moins une autre mesure non invasive (réponse à la pression ou perfusion cutanée). Avant la mise à mort des animaux en fin de procédure, il est également prévu de faire une injection de bleu EVANS qui permettra de mettre en évidence une augmentation éventuelle de perméabilité vasculaire au niveau de la peau. Dans les études de cicatrisation, deux plaies sont réalisées sur le même animal pour diminuer le nombre d’animaux nécessaires. Les 5 temps de mise à mort ont été soigneusement sélectionnés en fonction de la connaissance actuelle des modèles pour couvrir toutes les phases de la cicatrisation et évaluer précisément le rôle de la Protéine X dans chacune de ces phases.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée (au moins trois fois par semaine). Des points limites (perte de poids supérieure à 20% du poids maximal atteint par la souris, état de prostration de l’animal, plaies infectées) ont été définis qui conduiront à la mise à mort immédiate de l’animal. Les animaux utilisés pour l’étude de fonctionnalité vasculaire ne subiront pas plus de deux anesthésies générales chacun. Le nombre de souris par cage sera compris entre 3 et 5, suivant la taille de la cage et en accord avec la réglementation en vigueur. Après induction des plaies ou en cas de comportement agressif d’un animal, les animaux seront isolés dans des cages individuelles pour éviter le risque de sur-blessure. Ces cages possèdent des séparations transparentes pour permettre aux animaux de continuer à communiquer et diminuer le stress lié à l’isolement. Les cages seront également enrichies avec des boules d’ouate, des bâtonnets de bois, du carton etc. Les plaies seront protégées par des pansements pour éviter les risques d'infection. Tous les changements de pansements (et les photographies permettant de suivre la fermeture des plaies) seront réalisés sous anesthésie gazeuse sur table chauffante.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du tissu d'intérêt (peau) très semblable au tissu humain et les étapes clés du processus de cicatrisation sont conservées (phase inflammatoire et vasculaire, phase de réparation, phase de remodelage). Les souris utilisées dans ce projet seront âgées de 8-16 semaines pour rester cohérent avec les expériences préliminaires qui ont été réalisées.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées comme donneuses de moelle osseuse et 720 transférées vers un autre protocole de tests comportementaux. Rendues obèses par un régime gras pendant 18 semaines, elles reçoivent du busulfan induisant une myélodysplasie, une greffe de moelle et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle de la protéine DNase1L3 dans le syndrome métabolique et la dépression liés à l'obésité. Le porteur décrit la perte de poids et l'anémie post-busulfan comme "transitoires". Les 720 survivantes prolongeront l'expérimentation dans une animalerie dédiée aux tests d'anxiété et de dépression, sous une autre autorisation.

Objectifs

Nous avons observé que la déficience en DNase1L3 rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité. Un de nos objectif courant est de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la DNase1L3 dans le contexte de l’obésité. De plus, l’obésité induit des troubles neuropsychiatriques comme la dépression. Un deuxième objectif de notre travail est d’évaluer l’impact de la déficience en DNase1L3 sur la survenue des syndromes neuropsychiatrique induits pas l’obésité. Tous les concepts, incluant l’état de l’art, le rationnel de notre étude ainsi que sa méthodologie sont décrits dans la section suivante.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence le rôle de la DNase1L3 dans la régulation de l’inflammation chronique induite par l’obésité ainsi que ces mécanismes d’actions. De plus, il nous permettra de déterminer si une dérégulation de la DNase1L3 peut contribuer aux troubles neuropsychiatriques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité qui est à l’origine du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Les souris sont soumises à un régime riche normal et riche en graisse durant 18 semaines. Une myélodysplasie est induite par le Busulfan durant 4 jours. Une reconstitution des souris myélodysplasique est faite par transfer de cellules de moelle osseuses . La reconstitution se fait par une seule injection et a lieu en 1 mois. Des prises de sang retroorbitaires sont effectué toutes les six semaines. Un test de tolérance au glucose par injection i.p de glucose et prise de sang a la base de la queue est effectué toutes les 6 semaines aussi.

Impact sur les animaux

1. Placer les animaux sur un régime riche dans le temps imparti pour l’expérimentation augmente leur poids d’une manière considérable sans causer une altération significative de l’état général de l’animal. 2. La génération de souris chimérique nécessite l’induction d’une myélodysplasie par un traitement aux Busulfan. Ce traitement induit une perte de poids

Devenir

Procédure 1 : 288 animaux sont inclus dans cette procédure. 48 animaux sont utilisés en tant que donneur de moelle osseuse et sont euthanasiés par dislocation cervicale a l’issue de cette procédure. Le prélèvement de la moelle osseuse ne peut être effectue que sur des animaux morts. Le reste des animaux (240), constituent les animaux chimériques receveur de moelle osseuse qui seront gardés en vie et donc inclus dans les procédures qui suivent. Procédure 2. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un régime normal (360) et un régime riche en graisse (360). Tous les animaux de cette procédure sont gardés en vie en passent dans la procédure 3. Procédure 3. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à des prises de sang. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie en passent dans la procédure 4. Procédure 4. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un test de tolérance au glucose. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie et transférés dans l’animalerie NutriNeuro ou ils seront soumis à des tests comportementaux. Une autre DAP a été soumise pour cela.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologiques observés chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de la DNase1L3 dans le développements d’un syndrome métabolique et dans la régulation des troubles neuropsychiatriques qui découlent de l’inflammation induite par l’obésité. De plus les études comportementales afin d’évaluer le développent de l’anxiété et des états dépressifs ne peuvent être réalisé que sur des animaux vivants. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité de la régulation des états mentaux par les processus inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons également optimisé leur utilisation. En effet sur les mêmes animaux nous allons à la fois évaluer la survenue du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques. Cela nous permet de réduire l’utilisation des animaux d’un facteur deux.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang retro-orbitaires sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort de cette procédure. De plus, les prises de sang réalisées à l’extrémité de la queue incluent une anesthésie locale pour réduire la douleur qui peut être induite par cette procédure.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris déficientes pour la DNase1L3, DNase1, TLR9 et IFNAR sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont très sensibles aux régimes alimentaires pour l'induction de l’obésité (Surwit et al., Diabetes, 1988). Comme l’Homme, elles développent une obésité, un diabète de type II, une stéatose hépatique et des troubles neuropsychiatriques (dépression et anxiété) un fois exposées à un régime riche en graisse, alors qu’avec une alimentation standard, elles restent minces et ne développent pas de problèmes métaboliques ni de troubles neuropsychiatriques. En plus des souris congénique B6/SJL (pep boy, CD45.1) seront utilisées pour réaliser des chimères de moelle osseuse. Leur utilisation est necessaire afin d'évaluer l'efficacité de nos greffes qui est rendu possible par l'analyse de l'expression du variant de la molécule CD45. Les souris seront nourries dès l’âge de 12 semaines par HFD. L’exposition des souris C57BL/6 de cet age à un régime HFD ad libidum conduit à une obésité et au développent du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques assez proche de ceux se développant chez l’homme. Les premières manifestations apparaissent environ 6 semaines après l’introduction du régime HFD mais l’hyperglycémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique ainsi que les troubles neuropsychiatriques sont observées vers 18 semaines post régime HFD (Surwit et al. ; Diabetes, 1988).

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit jusqu'à huit prélèvements sanguins sur une journée, aux veines mandibulaire, saphène et fémorale, pour mettre au point une technique de micro-prélèvement. Le porteur admet que des sites de prélèvement seront "abîmés" puisqu'il s'agit d'une mise au point, et fixe la validation à 90% d'animaux aux sites corrects. Il justifie le projet par la réduction du nombre d'animaux dans de futures études, tout en qualifiant le recours à l'animal d'"indispensable".

Objectifs

Ce projet consiste à effectuer huit prélèvements sanguins par animal en vigile via la technique du micosampling. Les prélèvements sanguins seront réalisés sur animal vigile par microsampling c'est à dire prélèvement à la veine mandibulaire, à la veine saphène et/ou à la veine fémorale (2 prélèvements maximum par site de 40 μl maximum). Nombre maximal de prélèvement par animal: 8

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour ce projet sont de développer une nouvelle technique de prélèvement, via le microsampling, qui permettra de faire 8 prélèvements de 40 µL maximum et donc de réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés pour les prochaines études

Procédures

La veille des prélèvements de sang, les animaux seront anesthésiés (anesthésie gazeuse: Isoflurane) pour pouvoir raser les pattes arrières des animaux. Avant de commencer les prélèvements, les cages hébergeant les animaux seront placées sous lampes chauffantes pendant environ 15 minutes pour faciliter les prélèvements et dilater les veines. Cette opération peut être renouvellée autant que nécessaire si besoin. Les sites de prélèvement sanguin ( veine mandibulaire, saphène ou fémorale droite ou gauche) seront alternés au maximum. 4 prélèvements seront fait au niveau des mandibules droites et gauche et 4 autres prélèvements seront réalisés au niveau des saphènes droite et gauche et fémorales droite et gauche (1 prélèvement par site) Les temps de prélèvement seront: T5min, T15min, T30 min, T1h, T2h, T4h, T6h, T8h. Volume de sang prélevé: 40 µL par temps de prélèvement

Impact sur les animaux

Il est probable d'avoir des sites de prélèvement abimés car c'est une mise au point de technique... Un suivi quotidien (voire plusieurs fois par jour, à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin. Cette technique sera validée si 90 % des animaux présentent des sites de prélèvements convenables, non abîmés avec un bon aspect général des animaux.

Devenir

A la fin de cette procédure , les animaux seront anesthésiés et euthanasiés par dislocation cervicale (possibilité d'exsanguination précédant la dislocation).

Remplacement

Le but de ce projet est de mettre en place une nouvelle technique de prélèvement sanguins ( le microsampling) chez la souris. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de valider cette technique sur un autre support , il est indispensable de recourir à l'animal de laboratoire.

Réduction

Dans ce projet, 40 animaux seront inclus pour une durée de 1 an. C'est le nombre d'animaux nécessaire et minimal requis pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Les animaux seront divisés en 2 groupes de 6, et les essais seront fait sur trois souches de souris différentes (souris SWISS, C57Bl6 et les souris SCID). Douze animaux seront utilisés pour chaque souche.

Raffinement

Durant toute la phase expérimentale, les animaux seront hébergés par groupe de 6 maximum dans une même cage comprenant de la litière et du matériel d'enrichissement (ex: nid, bois à ronger). Un suivi quotidien (à chaque temps de prélèvement) sera mis en place pour l'observation générale des animaux et pour une prise en charge rapide si besoin.

Choix des espèces

La souris est l'espèce utilisée dans ce projet. Les souches SWISS, C57BL6 seront particulièrement utilisées . La souche SCID, pourra aussi être utilisée. Majoritairement adultes. Souris d'environ 20-40g

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un traumatisme crânien est provoqué chez des souriceaux de 17 jours, suivi pendant six mois d'une batterie de tests comportementaux (open field, poutre, échelle, test de Von Frey, labyrinthe en croix surélevé, labyrinthe de Barnes) et d'IRM sous anesthésie, pour étudier le rôle du facteur HIF1. Le porteur qualifie le traumatisme de "léger" et affirme que l'animal "ne montre aucun signe de douleur" une fois réveillé, alors que la procédure est classée en gravité modérée. Le bénéfice annoncé, cerner les conditions de séquelles après un traumatisme crânien pédiatrique, reste une perspective de recherche.

Objectifs

Chaque année 1,5 millions d'européens sont victimes d'un traumatisme crânien (TC) le plus souvent subit lors d'un accident de la route, d'une chute ou au cours de pratiques sportives. 70 000 personnes perdent la vie des suites du traumatisme et environ 100 000 ne présentent pas de récupération totale et demeurent handicapées, notamment chez les enfants et les jeunes adultes qui représentent une population particulièrement vulnérable en regard de ce type de traumatisme. Bien qu'au cours des dernières années un raffinement des procédures de prise en charge par les urgences et les hôpitaux a permis de réduire la mortalité des traumatisés crâniens, il est apparu qu'un grand nombre de patients souffrent par la suite de désordres chroniques invalidants tels que : épilepsie, dépression, démence progressive, etc. À ce jour, aucun traitement ne permet d'empêcher la mise en place de tels désordres à la suite d'un traumatisme crânien. Après un TC, les atteintes des vaisseaux ont pour conséquence de diminuer l’apport en oxygène aux cellules du cerveau. Cette baisse en oxygène (hypoxie) peut aller jusqu’à provoquer la mort de certaines cellules du cerveau. La réponse de l’organisme face à l’hypoxie est régulée par le facteur HIF1 (Hypoxia Inducible Factor). Nous voulons tester si ce facteur joue un rôle délétère dans les évènements cellulaires après un TC. Si tel est le cas, ce facteur représenterait une cible potentielle de traitement innovante et à fort intérêt thérapeutique.

Bénéfices attendus

Les mécanismes physiopathologiques découlant d’un traumatisme survenant pendant l’enfance sont encore assez peu connus. Ainsi on ne sait pas pourquoi seule une partie des enfants souffrant d’un traumatisme crânien léger vont développer à plus ou moins long terme des symptômes tels que des maux de tête, pertes d’équilibre, problèmes de concentration ou retards d’apprentissage… De plus il n’existe à ce jour aucun traitement efficace pour prévenir les conséquences d’un traumatisme crânien survenant chez l’enfant. Notre étude permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à ces traumatismes et devrait permettre de mieux cerner les conditions propices au développement de symptômes post-trauma (notamment l’influence du sexe de l’individu). D’autre part ce projet déterminera si la protéine HIF1 représente une cible thérapeutique intéressante dans le cadre du développement de traitements post-trauma chez l’enfant.

Procédures

Les 640 animaux subiront tous les procédures non-terminales suivantes : 1. traumatisme crânien léger unique sous anesthésie générale courte (5 minutes) pour moitié des animaux et anesthésie générale courte seule pour l’autre moitié (animaux contrôles dits « sham ») à 17 jours après la naissance. 2. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 et 7 jours après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field) et un test de coordination motrice sur échelle (Foot Fault) réalisés la même journée. 3. Exploration comportementale sur animal vigile répétée à 1 mois, 3 mois et 6 mois après le trauma. Chaque série comportementale comprendra 1 test d’exploration de 5 minutes (Open Field), 2 tests de coordination motrice sur poutre et échelle (Beam walk et Foot Fault) d’environ 5 minutes chacun, 1 test de sensibilité tactile (Von Frey test) d’environ 5 minutes, 2 tests d’évaluation de l’état anxieux (Elevated Plus Maze et White/Black box) de 5 minutes et un test d’apprentissage spatial (Barnes Maze) qui nécessite des sessions quotidiennes de 5 minutes sur 5 jours. Chaque test sera effectué à un jour différent, ainsi chaque série comportementale comprendra 11 tests quotidiens d’environ 5 minutes répartis sur 2 semaines. 4. Exploration d’imagerie fonctionnelle par IRM réalisée sous anesthésie générale d’environ 1 heure répétée à 1, 3 et 6 mois après le trauma, un jour après le dernier test comportemental.

Impact sur les animaux

Notre projet repose sur l’utilisation d’un modèle léger de traumatisme crânien chez l’animal juvénile. Le traumatisme est réalisé chez l’animal anesthésié, et une fois réveillé l’animal ne montre aucun signe de douleur, il reprend immédiatement un comportement normal. Comme il s’agit d’un traumatisme léger, les conséquences à long terme ne sont pas anxiogènes ou douloureuses pour l’animal. Ces conséquences sont principalement des retards/défauts d’apprentissage et une légère altération de la coordination motrice, sans altération de la mobilité de l’animal. De plus, le modèle murin utilisé n’engendre pas de phénotype dommageable.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de la procédure, soit 640 animaux.

Remplacement

Le projet vise à caractériser les atteintes du tissu cérébral suite à un TC ainsi qu’à évaluer l’intérêt d’une cible thérapeutique sur la récupération post TC. À ce jour, aucun modèle in vitro ou informatique ne permet de simuler la complexité des interactions cellulaires mise en jeu, tant nos connaissances demeurent encore superficielles en la matière. Notre recherche sur des bases de données (PubMed, Web of science, …) permet d’affirmer qu’à notre connaissance, il n’existe pas d’autre modèle expérimental que l’animal afin d’étudier ces réactions tissulaires dans leur ensemble. Par conséquent, notre projet ne peut pas se passer de l’expérimentation animale.

Réduction

Le projet concerne 640 souris mais permet de réduire le nombre d'animaux utilisés sans compromettre les objectifs du projet en effectuant un suivi longitudinal non invasif par imagerie. Nous planifions des groupes expérimentaux correspondant au nombre minimal permettant l'utilisation de tests statistiques visant à comparer les différents groupes : analyses multi-ANOVA avec répétition / analyses de régression entre les différents paramètres mesurés pour des tests comportementaux / IRM (voir annexes pour le plan expérimental).

Raffinement

Le projet permet de raffiner l'expérimentation animale en utilisant un modèle pertinent par rapport à la situation chez l'homme, en s'appuyant sur la mise en place d'une démarche de suivi des animaux permettant de limiter et traiter la souffrance éventuelle des animaux, et en employant les méthodes d'imagerie les plus sensibles disponibles actuellement. L'ensemble des procédures mises en place dans le projet sera assuré par des personnes qualifiées en expérimentation animale. Le stress des animaux sera limité à son maximum, avec un sevrage mis en place à 25 jours post-natal, et des conditions d'hébergement enrichies (matériels de nidification) et permettant les interactions sociales en adéquation avec les directives européennes. La réalisation du projet repose sur l'établissement de points-limites et de pratiques permettant de minimiser au maximum le stress, la détresse et la souffrance des animaux. Les traumatismes crâniens seront réalisés sur animal anesthésié en utilisant des impacts calibrés. De plus, la cage de réveil est placée sur un tapis chauffant afin de prévenir toute hypothermie. Lors de la réalisation des tests comportementaux, les animaux ne se retrouveront isolés que peu de temps : 5mn pour la plupart des tests et 1h au maximum. Les protocoles expérimentaux s'appuient notamment sur l'utilisation d'un agoniste opioïde, la Buprénorphine, afin de prévenir ou traiter la manifestation de douleurs.

Choix des espèces

Le système nerveux central de la souris est parmi les mieux connus et les plus étudiés. Son organisation est aussi très proche de celle du cerveau humain. Les résultats obtenus permettent ainsi de proposer des hypothèses de dysfonctionnement du cerveau humain suite à un traumatisme crânien et de proposer des pistes thérapeutiques pour leur traitement. De plus, le modèle murin permet l’utilisation de souches génétiquement modifiées. Notre projet s'appuie sur l'utilisation d’une de ces souches : des souris pour lesquelles le gène codant pour le facteur HIF1-alpha a été inactivé dans les astrocytes. Cette invalidation de gène n'induit pas d'effet sur le développement, la survie, la croissance et les fonctions neuromusculaires. Dans ce projet, les traumatismes crâniens seront réalisés sur des souris juvéniles à 17 jours post natal, ce qui nous permet de modéliser les effets d’un TC en pédiatrie chez des enfants de 4 à 6 ans. Nous conserverons les animaux jusqu’à 6 mois après le TC afin d’évaluer les conséquences à long-terme.

630 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ovariectomie puis une greffe de cellules tumorales dans l'utérus, suivie de plusieurs semaines d'imagerie sous anesthésie, pour tester un anticorps anti-Netrin-1 contre le cancer de l'endomètre. Le porteur indique que la croissance tumorale peut provoquer des douleurs abdominales et que les métastases pulmonaires peuvent entraîner des difficultés respiratoires, les animaux étant alors mis à mort. Le bénéfice annoncé, "améliorer la prise en charge" des patientes, reste général, et il affirme que le recours à l'animal est "nécessaire".

Objectifs

Le cancer de l'endomètre est le cancer gynécologique le plus diagnostiqué dans les pays développés, et son incidence ne cesse d'augmenter. L'objectif de ce projet est de créer un modèle de greffe de cellules tumorales dans l’endomètre des souris pour mimer au mieux les conditions micro-environnementales dans le but de caractériser l’action de l’anticorps anti-Netrin-1 sur la croissance tumorale. il permettra également par la suite d’utiliser ce modèle pour tester l’efficacité de l’anticorps anti-Netrin-1 en le combinant avec des traitements anti-cancéreux connus.

Bénéfices attendus

Améliorer la prise en charge et le traitement du cancer de l’endomètre chez les patientes atteintes de tumeurs avancées et/ou métastatiques.

Procédures

Ovariectomie et xénogreffes de cellules tumorales en orthotopique (1à à 15 minutes, une fois). Imagerie par ultrason (10 à 20 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines). Imagerie de la luminescence (10 à 15 minutes, 1 à 2 fois par semaine pendant 7-8 semaines).

Impact sur les animaux

Bien que la publication dans laquelle cette procédure est décrite ne fasse pas état d’effets indésirables particuliers, la croissance tumorale des tumeurs de l’endomètre peut générer des douleurs abdominales qui seront atténuées par traitement analgésique si l’animal montre des signes de souffrance. Si les signes de douleurs se poursuivent et sont accompagnés d’une baisse d’appétit et une perte de poids > 20%, l’animal sera mis à mort. Suivant la taille des tumeurs, il est possible que la mobilité des animaux soit réduite du fait de la localisation des tumeurs. La présence de métastases pulmonaires peut générer des difficultés respiratoires chez l’animal. Le comportement et la respiration de l’animal seront monitorés régulièrement et l’animal sera mis à mort si l’atteinte respiratoire devient trop grave.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, ou si un point limite est atteint en cours de procédure, par dislocation cervicale après anesthésie à l’isoflurane. Cela est nécessaire afin d'une part de limiter la souffrance de l'animal en cas d'atteinte de point limite et d'autre part de valoriser l'expérience par des analyses immuno-histochimiques et biochimiques sur différents tissus (sains et tumoraux) récoltés après la mise à mort de l'animal et d'ainsi identifer les mécanismes moléculaires impliqués.

Remplacement

Une attention particulière sera accordée à la règle des 3R afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires tout en s’assurant de la reproductibilité des résultats. Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire pour valider l’observation clinique et analyser les effets de la thérapie ciblée. Ces méthodes sont complémentaires d’expérimentations sur des cellules en culture qui sont largement utilisées en parallèle pour cette étude.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, l’abrasion puis l’injection de cellules tumorales seront réalisées au niveau des cornes utérines droite et gauche de l’animal, afin de générer 2 tumeurs par animal et ainsi réduire le nombre total d’animaux par deux. De plus, les procédures se feront de façon séquentielle et donc en fonction des premiers résultats, les expérimentateurs pourront réduire le nombre d'animaux nécessaires au total.

Raffinement

Toute manipulation susceptible d’entraîner du stress sera réalisée par un expérimentateur formé aux techniques de contention et de manipulation des animaux. L’ovariectomie et l’injection de cellules tumorales seront réalisées par un expérimentateur habitué et formé aux techniques de chirurgie expérimentale et l’animal sera anesthésié à l’isoflurane. Il est important de noter qu'en cas d’atteinte d’un point limite, les animaux seront euthanasiés dans le respect de la réglementation en fonction des signes de souffrance. Le suivi de la croissance tumorale sera réalisé, de manière non-invasive, soit par échographie soit par imagerie de fluorescence non-invasive, sous anesthésie, une fois par semaine tant que la taille de la tumeur est inférieure à 2 mm, puis tous les 3 jours jusqu'à ce que la tumeur atteigne le point limite de 50mm3. Ces techniques d'imagerie non-invasive permettent de réduire les manipulation et le stress de l'animal. Pour le traitement de la douleur, de la buprenorphine sera administrée avant le début de la procédure chirurgicale afin de prévenir toute douleur opératoire. Pour le traitement des douleurs post-opératoires, l'eau de boisson sera additionnée de paracétamol.

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est le modèle le plus approprié pour greffer des cellules cancéreuses humaines afin qu’il n’y ait pas de rejet des cellules. De plus, la souris immunocompétente permettra d’analyser la contribution du système immunitaire dans les effets observés après xénogreffes de lignées tumorales murines. Par ailleurs, les schémas d’administration des chimiothérapies (voie, doses, posologies) sont bien standardisés chez la souris, contrairement à d’autres modèles tels que le Zebrafish. L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles d’au moins 8 semaines, possédant un utérus mature et fonctionnel.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de l'oreille interne puis une bio-impression assistée par laser via la fenêtre ronde de la cochlée, sous deux anesthésies générales, pour mettre au point une technique d'injection intra-cochléaire. Le porteur décrit la bio-impression et les mesures auditives comme ne générant "aucune douleur ou traumatisme", alors que la chirurgie reste classée en gravité modérée. Sur le remplacement, il affirme que ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères, au système auditif jugé "trop éloigné" de celui de l'homme.

Objectifs

L'oreille interne représente l'un des organes cibles les plus difficiles pour l'administration de médicaments. Les voies conventionnelles, telles que l'administration orale et les injections, ont une efficacité limitée, principalement en raison de la barrière hémato-cochléaire qui bloque la plupart des molécules provenant de la circulation sanguine. L’une des voies d’accès la plus étudiée et la plus prometteuse comme « porte d’entrée » de l’oreille interne repose sur la fenêtre ronde à la base de la cochlée (1.5 mm de diamètre environ). Elle constitue une membrane souple, relativement perméable, de 40 à 60 µm d'épaisseur et est composée de 3 couches cellulaires. Son rôle est de vibrer de manière opposée aux vibrations acoustiques qui entrent dans l’oreille interne, jouant ainsi le rôle de soupape de pression et permettant aux ondes sonores de se propager dans la cochlée. Cette membrane permet d’avoir un accès privilégié aux fluides internes de la cochlée. L’objectif du projet est donc de développer un nouveau dispositif permettant de délivrer un agent thérapeutique en intra-cochléaire, via la fenêtre ronde, de manière atraumatique et contrôlée. Pour cela, l’équipe s’est orientée vers la bio-impression assistée par laser, déjà utilisée au laboratoire dans des protocoles de régénération osseuse in situ chez l’animal, qui ne produit pas de souffrance apparente des animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de développer une technique pour réaliser des injections de substances thérapeutiques dans l’oreille interne, avec une grande précision et sans risque de lésions des structures sensorielles cochléo-vestibulaires contrairement aux stratégies développées à ce jour.

Procédures

Les 4 groupes d’animaux (soit 100 souris) seront soumis à une procédure chirurgicale et aux mesures de PEAs. La bio-impression assistée par laser ne concernera que les groupes 2 à 4 (soit 90 souris sur les 100 prévues). Ces procédures seront réalisées sous anesthésie générale (mélange Kétamine-Xylazine) accompagnée d’une analgésie dans le cas de la chirurgie (Carprofène). Les procédures de mesure de PEAs pré-opératoire, de chirurgie et de bio-impression seront réalisées en continuité directe lors de la première anesthésie (10 min pour les mesures de PEAs, 15 min pour la chirurgie et 10 min pour la bio-impression, soit 35 min de procédure sur souris anesthésiées). Une seconde anesthésie sera réalisée, 48h à 7 jours après l’intervention (post-opératoire), pour mesurer les PEAs. A la fin de la seconde mesure de PEAs post-opératoire, les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Ainsi, sur les 100 souris qui subiront la procédure chirurgicale et les mesures de PEAs (pré- et post-opératoire), 90 souris subiront également la bio-impression assistée par laser. Les 4 groupes d’animaux seront donc soumis à 2 anesthésies générales au total, pour une durée maximale de 35-40 min par anesthésie (cf. frise chronologique en annexe). Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies.

Impact sur les animaux

La durée des procédures n’excède pas 40 minutes maximum permettant de limiter la durée de l’anesthésie. Un délai de 48h minimum sera respecté entre les anesthésies. Les procédures de bio-impression et de mesure des PEAs ne génèrent aucune douleur ou traumatisme chez l’animal, et seront réalisées sous anesthésie générale car elles nécessitent une immobilisation complète de l’animal. Lors de la chirurgie (niveau de sévérité modéré), un analgésique sera également utilisé pour limiter le niveau de douleur de l’animal.

Devenir

Tous les animaux seront gardés en vie après les différentes procédures excepté après la seconde mesure de PEAs (post-op) où les animaux seront mis à mort selon la procédure prévue. Les tissus de l’oreille interne seront prélevés pour analyse.

Remplacement

L'application de substances thérapeutiques sur la fenêtre ronde s'insère dans un projet d'application clinique future. Il faut dans un premier temps démontrer son efficacité et son innocuité sur un modèle animal. Par ailleurs, ces mesures ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. Toutes les manipulations préalables de calibration par exemple seront effectuées dès que possible sur matériel inerte (gélose).

Réduction

Chaque souris sera utilisée pour toute la série de procédures (chirurgie, bio-impression assistée par laser et mesures de PEAs) afin d'en limiter leur nombre. Les souris seront donc soumises à 2 anesthésies au total : une première anesthésie pour la mesure pré-opératoire des PEAs, la chirurgie et la bio-impression puis une seconde anesthésie pour la mesure post-opératoire des PEAs (cf. frise chronologique en annexe). Nous utiliserons le plus petit nombre possible de souris par conditions de bio-impression, conformément aux limites biostatistiques nous permettant une fiabilité des résultats. Pour les tests statistiques, nous utiliserons essentiellement des tests non paramétriques (type Wilcoxon-Mann-Whitney) puisque les échantillons seront petits et que les pré-requis des tests paramétriques (distributions normales, variances égales) ne seront pas satisfaits. Le nombre total de 100 souris utilisées sur l’ensemble du projet permet un traitement statistique significatif des données obtenues en se laissant une marge de manœuvre en cas d’échecs. Une phase de mise au point de bio-impression in vivo sera nécessaire, nécessitant des animaux surnuméraires (pris en compte dans nos lots). Un nombre minimum de 15 souris/groupe de bio-impression sera nécessaire pour assurer la fiabilité des tests statistiques. Ainsi, en fonction des résultats obtenus, un nombre plus faible d'animaux pourrait permettre d’avoir des résultats statistiquement fiables.

Raffinement

Une analgésie adaptée sera appliquée en pré- et post-opératoire ainsi que des conditions de stabulation appropriées. Pour soulager l’inconfort et le stress des souris, nous hébergerons les souris dans une cage à milieu enrichi (tunnel carton, aspen bois, fibres de papier et abri) dans un local à ventilation, température et éclairage contrôlés. Pendant les différentes procédures, l’animal sera profondément anesthésié avec une surveillance des points vitaux (fréquence cardiaque et respiration, couleur des muqueuses, température corporelle). Des points limites seront définis afin de respecter le bien-être animal et pourront entraîner l’arrêt immédiat des manipulations. Trois expérimentateurs impliqués dans le projet possèdent l’expérimentation animale niveau concepteur (un expérimentateur supplémentaire fera la formation en mars 2022). Concernant les 2 expérimentateurs principaux (possédant l’EA concepteur), l’un a également suivi la formation chirurgie (octobre 2021) et l’autre suivra la prochaine formation chirurgie prévue en mars 2022. Concernant la formation continue, ces 2 expérimentateurs ont accumulé respectivement 26h sur 6 ans et 18h sur 4 ans (notamment sur le bien-être animal, la règle des 3R, les points limites, la gestion de la douleur…).

Choix des espèces

Les mesures de PEA ne peuvent se faire sur des animaux non-mammifères car leur système auditif est trop éloigné de celui de l'homme. L’anatomie cochléaire est également similaire, et la fenêtre ronde est bien accessible. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 semaines, c’est-à-dire à un stade de développement postnatal où l’appareil auditif a atteint sa maturité.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent l'ablation chirurgicale de la quasi-totalité des reins en deux opérations pour induire une maladie rénale chronique, puis des tests de tolérance au glucose et à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, pour évaluer un probiotique. Le porteur indique une mortalité chirurgicale de moins de 5% et prévoit la mise à mort en cas de glycémie hors seuil. Les retombées cliniques, un éventuel "essai thérapeutique chez l'homme", restent conditionnées à des résultats positifs.

Objectifs

La maladie rénale chronique est un enjeu de santé publique majeur compte tenu de sa fréquence en constante augmentation et de ses conséquences en termes de décès. Elle est caractérisée par une diminution du fonctionnement des reins responsable de l’accumulation de déchets que le rein ne peut plus éliminer. Ces déchets sont appelés toxines urémiques et sont responsable d’une perturbation de la glycémie et de la progression de la maladie rénale. Le microbiote intestinal (bactéries de l’intestin) est responsable de la production de ces toxines urémiques issues de la dégradation des protéines de l’alimentation. Ainsi, la modulation du microbiote intestinal semble être une nouvelle stratégie thérapeutique pour réduire la production des toxines urémiques en plus des régimes pauvre en protéines proposés aux patients ayant une maladie rénale. Cependant réduire les protéines peut exposer les patients à un risque de dénutrition sévère et à des retards de croissance chez l’enfant. Les probiotiques qui sont des bactéries vivantes peuvent avoir un intérêt dans la maladie rénale en améliorant la composition du microbiote. Certains probiotiques semblent particulièrement intéressant. Par exemple, le probiotique Lactobacillus plantarum peut stimuler la croissance de souris juvéniles en condition de dénutrition. L’objectif de cette étude est d’étudier l’effet du probiotique Lactoplantibacille plantarum chez des souris ayant une maladie rénale chronique induite par chirurgie (ablation des 5/6èmes de reins, provoquant une maladie rénale chronique modérée) sous une alimentation pauvre en protéines chez des souris en croissance (souris jeunes) et chez des souris âgées. Nous cherchons à étudier l’impact de ce probiotique en particulier sur la croissance, la régulation de la glycémie, la fonction rénale et l’accumulation des toxines urémiques.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de mieux comprendre le rôle du microbiote intestinal dans la progression de la maladie rénale chronique, la production des déchets urémiques et leurs conséquences néfastes. Cela nous permettra de mieux définir si l’ajout d’un probiotique qui stimule la croissance et l’hormone de croissance, pourrait en plus de la modulation du microbiote lutter contre les effets délétères des régimes pauvre en protéines chez l’enfant et l’adulte. Si les résultats sont positifs, ce projet pourra faire l’objet d’un essai thérapeutique chez l’homme ayant une maladie rénale chronique.

Procédures

Le modèle de maladie rénale chronique sera induit par ablation chirurgicale des 2/3 du rein droit puis de la totalité du rein gauche 1 semaine plus tard. Chacune de ces opérations sera réalisée sous anesthésie générale et antalgie efficace. Le traitement antalgique sera poursuivi de façon systématique pendant 48 heures. Les chirurgies seront réalisées en conditions stérile et les souris seront installés sur des tapis chauffant afin d’éviter un refroidissement. Les souris contrôles auront une chirurgie factice au cours de laquelle le rein sera exposé selon la même procédure chirurgicale mais sans réaliser d’intervention au niveau du rein. Au cours de la chirurgie, l’opérateur vérifiera l’absence de saignement anormal. Les probiotiques seront administrés à la pipette dans la bouche des souris. Au cours de la procédure les animaux auront plusieurs prélèvements. Les prélèvements réalisés en condition vigile se feront par le biais d’une micro-incision à l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Un premier prélèvement sera réalisé avant la 1ère chirurgie et réitéré 3 semaines après la 2ème chirurgie. A 4 semaines, nous réaliserons un test de tolérance au glucose après 6 heures de jeûne. Le glucose sera injecté en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. A 5 semaines nous réaliserons un test de tolérance à l’insuline après 6 heures de jeûne. L’insuline sera injectée en intra-péritonéale et nous mesurerons la glycémie par une goutte de sang à l’extrémité de la queue à l’injection puis à 15, 30, 60, 90 et 120 min. La survenue d’une glycémie trop haute ou trop basse (malgré une injection intra-péritonéal de glucose) constitue un point limite et les animaux seront mis à mort selon la procédure (injection d’un anesthésiant à forte dose et dislocation cervicale). A 6 semaines, les souris seront placées 2 par 2, pendant 24 h en cage avec un fond contenant de trous millimétrique afin de récolter l’urine. A la fin de la procédure les souris seront mises à mort. Le dernier prélèvement sera réalisé à cœur battant, sous anesthésie générale afin de permettre le prélèvement d’un volume le plus grand possible pour permettre le dosage des toxines urémiques. La mise à mise sera réalisée sans réveil par dislocation cervicale.

Impact sur les animaux

Dans de précédentes études, la mortalité chirurgicale était de moins de 5%. La mortalité est généralement liée à l'induction d'une maladie rénale chronique trop sévère et arrive généralement dans les 24-48h après la 2° chirurgie. De plus, il n’a pas été noté de comportements anormaux dénotant une souffrance ou une anxiété des animaux. Il n'a pas été noté de perte d'appétit en condition de régime pauvre en protéine dans nos précédentes études. L’appétence pour les probiotiques est bonne. L’utilisation de régimes pauvre en protéines peut cependant induire une agressivité chez les animaux. Au cours de cette étude l’administration du probiotique se fera en intrabuccale grâce à l’utilisation d’une simple pipette et d’un cône. Par ailleurs les souris seront amenées à subir des test métaboliques nécessitant un prélèvement d'un micro-goutte de sang par incision de la portion terminale de la queue. Les souris seront mises à mort par dislocation cervicale sous anesthésie générale.

Devenir

A la fin de la procédure, toutes les souris sont mises à mort sous anesthésie générale selon le protocole soit animaux.

Remplacement

La production des déchets urémiques résulte à la fois de la diminution du fonctionnement du rein et de la composition modifiée du microbiote. Ces éléments ne sont pas modélisables sur un modèle cellulaire. De plus nous voulons étudier en autre les modifications de la structure l’intestin et de la régulation de la glycémie qui nécessite des examens trop invasifs pour être réalisé chez l’homme. Enfin l’étude de l’impact du probiotique sur la croissance dans une population d’enfant ayant une maladie rénale n’est pas possible à ce stade de développement du fait du risque potentiel infectieux de ce traitement. Ainsi toute expérimentation dans des modèles cellulaire ou chez l’homme est impossible à ce stade.

Réduction

Nous avons pris les dispositions nécessaires pour éviter le double emploi de notre procédure expérimentale. En effet, à notre connaissance, la question scientifique que nous posons ici n’a encore jamais été adressée. Il s’agit donc d’un projet totalement original et nous avons veillé, lors de l’élaboration de notre procédure, à éviter toute redondance dans les expérimentations. Le nombre de souris a été calculé au plus juste pour offrir la puissance statistique maximum. Le nombre de souris du groupe contrôle a été réduit au minimum car des données obtenues d’expérience précédente seront réutilisées. Nous utiliserons au maximum 260 souris.

Raffinement

Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale. Des antidouleurs seront délivrés systématiquement au moment de la chirurgie et 48 après. Les interventions seront réalisées sur tapis chauffant. Une surveillance 2 fois par jour sera effectuée pendant les 48 premières heures après les chirurgies. Dans les suites, les souris seront surveillées 1 fois par jour 5 jours par semaine afin de repérer toutes situation d’inconfort, de stress, douleurs ou agressivité. Pour limiter l’anxiété, les animaux seront placés 5 par cage. L’agressivité sera en particulier évaluée chez les animaux sous régimes pauvre en protéines. Tout au long de notre expérimentation nous resterons également vigilants à la survenue des points limites. Si une atteinte des points limites définis est constatée, les animaux seront sortis du protocole et mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale. Les prélèvements réalisés sur souris vigiles seront réalisés par incision de l’extrémité de la queue préalablement anesthésiée par crème anesthésiante locale. Au cours des tests de tolérance au glucose et à l’insuline, en cas de glycémie trop haute ou trop basse à la fin du test, cela constitue un point limite et les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie générale L’administration des probiotiques sera réalisée directement dans la bouche par le même opérateur durant toute la procédure pour éviter tout traumatisme des animaux. Nous évitons ainsi le gavage directement dans l’estomac qui pourrait causer des lésions internes.

Choix des espèces

Le présent protocole sera conduit sur des souris, car le modèle de maladie rénale chronique, est facilement réalisable et permet l'induction d'une maladie rénale chronique de stade modéré. De plus, l'altération de la fonction rénale chez la souris reproduit les modifications systémiques que l'on peut observer chez l'homme (accumulation de toxines urémiques, hyperglycémie, modification du microbiote intestinale). Des souris âgées de 4 semaines ont été choisi car les souris sont dans une phase de croissance et d’étudier plus spécifiquement l’intérêt de ce probiotique sur la croissance. Des souris âgées de 12 mois seront utilisées afin d’évaluer l’impact du probiotique sur la dénutrition en particulier, reproduisant une situation retrouvée chez l’homme adulte.