Souris

498 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souris de deux, trois et quatre semaines reçoivent une greffe de cellules d'ostéosarcome dans l'os du tibia, puis une immunothérapie et un inhibiteur du métabolisme tumoral par injections répétées. Le porteur indique que la tumeur peut provoquer un boitement et, en cas de métastases, une gêne respiratoire entraînant une mise à mort anticipée. Il présente ce modèle pédiatrique comme le plus proche de l'ostéosarcome de l'enfant et affirme qu'un essai clinique impose de justifier l'efficacité des molécules chez l'animal.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente chez les enfants, les adolescents et jeunes adultes. Le traitement reste inchangé de plus de 50 ans avec un taux de survie plafonné à 70% en cas des tumeurs locales et 30% en cas des métastases. La base du traitement consiste en chirurgie combinée à la chimiothérapie pré- et post-opératoire. Ce traitement étant très agressifs avec des séquelles qui peuvent être très conséquentes pour des enfants, il y a un réel besoin de traitements mieux adaptés. Le but de ce projet est de valider de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l’ostéosarcome. Les deux approches seront testées, un stimulant du système immunitaire et un agissant sur le métabolisme de la tumeur. Pour pouvoir réaliser un essai clinique de ces médicaments, il y a une exigence de justifier à la fois de leur efficacité et de leur sécurité d’emploi chez des animaux. Il est alors essentiel d’étudier ces candidats médicaments sur un modèle animal adapté tenant compte de la spécificité liée à l’âge de survenue parce qu’aucun autre modèle in vitro existant n’est aussi proche de la complexité d’un organisme humain.

Bénéfices attendus

Nous avons un modèle d’ostéosarcome inter-âge implanté dans l’os de la jambe postérieure chez des souris immunocompétentes âgées de 2, 3 et 4 semaines. Il existe des différences dans l’environnement proche de la tumeur correspondant au développement osseux au cours de la croissance. Ces données nous rendent confiants que l’efficacité de la réponse antitumorale à des âges différents sera modifiée. Ce projet montrera alors l’efficacité des thérapies innovantes par rapport à l’âge de survenue et permettra de mieux adapter des essais cliniques chez des enfants, adolescents et jeunes adultes.

Procédures

1 : implantation orthotopique des cellules tumorales en intratibiale dans toutes les procédures sous anesthésie de durée 5 min par animal 2 : administration des traitements par les voies intrapéritonéale (1x/jour) et intraveineuse (2x/semaine) sur animaux vigiles pendant 28 jours au maximum

Impact sur les animaux

Les animaux de 2 semaines étant plus sensibles à l’anesthésie par une baisse rapide de la température corporelle ils seront surveillés jusqu’au réveil sur le tapis chauffant et visités également à la fin de la journée. En cas d’apparition des métastases, une gêne respiratoire peut subvenir (fréquence respiratoire irrégulière ou accélérée) ainsi que la diminution du poids. Cette gêne est rapidement repérée grâce aux observations cliniques régulières d'un personnel expérimenté et l’animal sera mis à mort immédiatement pour éviter sa souffrance. On peut observer également le boîtement de l'animal dû au développement tumoral, pour cet effet les volumes tumoraux sont bien précisés en tant que les points limites. Utilisant que des doses non toxiques des traitements, on ne s’attend pas à des effets indésirables particuliers. On observera les sites d’injections et on change le côté d’injection à chaque administration. On fera également attention à la diminution du poids des animaux, le signe visible plus précoce d’un potentiel effet indésirable des traitements administrés ainsi qu'à d'autres potentiels effets indésirables (e.g. convulsions, cachexie, vomissement, diarrhée, apparition des plaques rouges sur la peau au site d'injection). Le stress de l'animal dû à la contention et l'injection des traitements sur animaux vigiles sera diminué par l'habituation des animaux avant le début des traitements par le personnel expérimenté.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par l’inhalation de CO2 à la fin des procédures afin de récolter les tumeurs et tissus avec des métastases pour les analyses approfondies ainsi que pour la création d'une banque des tissus sains en cas de la non prise tumorale.

Remplacement

L'environnement de l’ostéosarcome étant très complexe, il n’existe pas un autre moyen i.e. in vitro, pour reproduire sa complexité avec tous ses composants, notamment immunitaires afin d’étudier l’efficacité des médicaments agissant sur ce dernier. La première efficacité des traitements administrés a été évaluée au cours des études in vitro sur des cellules de l'ostéosarcome avant de passer chez l'animal. Leur toxicité chez la souris a été également évalué dans des études de toxicité in vivo par des entreprises développant ces molécules.

Réduction

Les procédures seront réalisées de façon séquentielle afin de réduire le nombre d'animaux. A la fin des procédures les animaux seront mis à mort et les tissus collectés afin de construire une banque tissulaire pour d’autres analyses histologiques et moléculaires. Pour toutes les procédures des tests paramétriques ou non-paramétriques, selon les règles de leur application, seront utilisés pour connaître l’efficacité des traitements au sein du même âge des souris ainsi que voir la différence de l’efficacité des traitements entre les âges différents. Le nombre des animaux a été calculé en se basant sur la proportion des animaux répondeurs au traitement vs des animaux contrôle.

Raffinement

Toute intervention d’injection dans l'os de la patte postérieur sera faite sous anesthésie générale administrée au maximum pendant 5 min. Les animaux seront manipulés sans stress par des personnes compétentes en expérimentation animale. Une définition précise des points limites conduisant à l'arrêt du protocole et à la mise à mort immédiate des animaux, une surveillance adaptée des animaux, au minimum une pesée et une observation bi-hebdomadaire permettront d’éviter toute douleur ou souffrance de l’animal. Dans le cas de la douleur de l'animal lié au développement tumoral, le plus souvent observée par le boitement de l'animal qui ne pose pas sa patte au sol, on administrera du paracétamol dans la boisson qui n'influence pas sur le système immunitaire. L'aménagment standard des cages par des cocons et papier craft peut être enrichi par des tunnels ou bouchettes pupliers en cas de l'observation du mal être des animau, notamment dû au stress post-injection des traitemens sur des animaux vigiles. Dans le cas des injections intrapéritonéales, le quadrant et le côté du ventre seront changés pour chaque injection. Dans le cas des injections intraveineuses, la même veine caudale latérale ne sera pas utilisée deux fois par la suite.

Choix des espèces

Nous disposons d’un modèle d’ostéosarcome établi par l’injection dans l'os dans les souris à des âges différents correspondant à des âges prépubère, pubère et post-pubère chez l'homme. Ce modèle est à notre connaissance le plus proche de l’ostéosarcome des enfants à différent âge de survenue (agressivité, pouvoir métastatique, environnement immunitaire) et un pic d'incidence à 15 ans hormis les cancers spontanés. Les cellules utilisées sont une lignée cellulaire d’ostéosarcome d’origine des souris de la même souche ; ce modèle peut donc être établi sur un animal avec un système immunitaire propre à souris, condition nécessaire pour étudier notamment l’environnement immunitaire de cette tumeur. A noter que l’âge plus jeunedes animaux n’influe pas le taux de prise tumorale.

4 576 rongeurs, 2 288 souris et 2 288 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour induire une infertilité, une partie des animaux subit une hyperthermie du scrotum par immersion de l'arrière-train dans une eau à 43 °C pendant vingt minutes, jusqu'à quinze fois, sous anesthésies répétées, tandis que d'autres reçoivent de l'acyline, puis tous des candidats médicaments et des prises de sang. Le porteur reconnaît tester des molécules de clients dont il ignore la nature et les effets secondaires, et signale des bagarres entre mâles pouvant les blesser. Il conclut que ces modèles d'infertilité rendent le recours à l'animal "incontournable", aucune méthode in vitro ne reproduisant la production de sperme et son contrôle hormonal.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet de nouveaux candidats médicaments sur des modèles d’infertilité masculine chez le rongeur. L’infertilité masculine joue un rôle très important dans le couple infertile, car environ 30% des problèmes liés à la grossesse correspondent à un facteur masculin. La plupart du temps, l'homme infertile présente une faible qualité séminale, ce qui signifie que son sperme n'a pas la capacité suffisante pour féconder l'ovule. L’azoospermie, caractérisée par une absence totale de spermatozoïdes dans l’éjaculat ou l’oligospermie, caractérisée, quant à elle, par une concentration en spermatozoïdes insuffisante dans le sperme conduisent à une infertilité masculine. Pour mimer une infertilité masculine en jouant sur la spermatogénèse, le modèle d’hyperthermie scrotale est décrit dans la littérature chez la souris. Ce modèle consiste à tremper dans le l’eau chaude la partie basse de l’animal (pattes arrières, queue, scrotum) pour créer une hyperthermie scrotale et ainsi altérer la spermatogénèse. Une administration hormonale sera réalisée afin de réverser l’infertilité et induire une réactivation de la spermatogénèse. L'hypogonadisme, autre pathologie provoquant une infertilité masculine, est défini par une synthèse insuffisante des hormones sexuelles (d'origine testiculaire telle que la testostérone). Pour mimer cette pathologie, l’administration d’acyline est décrite dans la littérature chez le rat.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de tester de nouveaux candidats médicaments pour trouver de nouvelles molécules plus efficaces et avec moins d’effets secondaires que les molécules utilisées actuellement pour traiter les patients atteints d’infertilité.

Procédures

Les animaux du modèle hyperthermie seront anesthésiés et la partie basse de leur corps (pattes arrière, queue et scrotum) sera trempée dans le l’eau chaude à 43°C pendant 20 min, et ce plusieurs fois par semaine (15 fois au maximum en tout). Ils recevront également des traitements de candidats médicaments et d’hormones pour restimuler la spermatogénèse (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Les animaux du modèle acyline recevront uniquement des traitements de candidats médicaments et d’hormones (voie d’administration et fréquence dépendantes de chaque protocole). Tous ces animaux pourront également avoir des prélèvements sanguins (en terminal ou prélèvements intermédiaires). De plus, des animaux utilisés uniquement pour des études de pharmacocinétique recevront des administrations de candidats médicament, d’hormones et auront des prélèvements sanguins à des temps précis dépendants du protocole expérimental.

Impact sur les animaux

Nous testons des molécules clients dont nous ne connaissons ni la nature ni les effets secondaires possible, il nous ait, pour cette raison, difficile d’anticiper les nuisances pour les animaux liées à ces produits. Toutefois, des manipulations, administrations répétées sur les animaux peuvent provoquer du stress, une légère douleur (douleur de l’aiguille), un hématome possible selon la voie d’administration. De plus, les animaux vont subir plusieurs anesthésies répétitives pour le modèle d’hyperthermie scrotale (procédure 1) et être en partie immergés dans de l’eau à 43°C. Toutes ces séries successives peuvent provoquer un stress à l’animal, une nuisance physiologique respiratoire ou cardiaque dues aux successions d’anesthésies. De ce fait, une attention particulière des animaux sera observée lors des sessions d’hyperthermie scrotale et pendant les phases d’endormissement et de réveil. Les animaux étant des mâles, des bagarres peuvent facilement intervenir selon la hiérarchie dans les cages, pouvant stresser, voire blesser certains d’entre eux. Les plaies possibles seront désinfectées avec de la vétédine et les animaux seront séparés si nécessaire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin du projet.

Remplacement

Aujourd’hui il n’existe pas de thérapie pharmacologique efficace pour le traitement de l’infertilité masculine. Actuellement, aucun modèle in silico, in vitro ou ex vivo ne peuvent mimer la pathologie dans son ensemble et dans sa complexité. En effet, aucun de ces modèles ne peuvent mimer la fertilité masculine (production de sperme, viabilité des spermatozoïdes) en tenant compte des différents organes intervenants et des différentes hormones pouvant intervenir sur les différents paramètres observés, sachant que le paramètre hormonal est primordial pour cette pathologie. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouveaux candidats médicaments.

Réduction

Le modèle d’infertilité par hyperthermie scrotale se faisant sous anesthésie, cela permet de réduire la douleur et le stress chez l’animal. D’après notre expérience sur les modèles in vivo, un nombre minimum de 8 animaux par groupe est le minimum nécessaire pour avoir des résultats statistiquement différents. Un premier test sur quelques animaux (8 maximum) pourra être réalisé comme « étude pilote » afin d’évaluer la faisabilité technique du modèle (surtout pour l’hyperthermie scrotale et le prélèvement de sperme). De plus, ce premier test pourrait être fait sur des animaux issus d’autres projets et non euthanasiés à la fin, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Ce projet étant nouveau, il nous semble que 3 études par an soit une estimation raisonnable par rapport à nos autres modèles et aux demandes de nos clients.

Raffinement

Dès leur arrivée dans la zone d’exploration fonctionnelle, les animaux seront hébergés dans des conditions définies par la directive européenne 2010/63/UE et un enrichissement sera introduit dans l’hébergement des animaux. L’état des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel compétent afin de s’assurer de leur bien-être et de l’absence de point limite à savoir prostration, perte de poids, difficulté à se mouvoir, s’alimenter, boire, piloérection, présence de blessure, … Après chaque anesthésie, une attention particulière sera apportée lors du réveil de l’animal. Un contrôle de la température de l’eau (utilisation de matériel type bain-marie thermostaté) sera effectué lors de chaque expérimentation. Si un animal présentait un point limite, il serait isolé dans un premier temps et hydraté et mis en présence de nourriture dans la litière si besoin. Si son état ne s’améliorait pas dans les 48h, les expérimentateurs compétents excluraient l’animal de l’étude et l’euthanasieraient.

Choix des espèces

L’utilisation de la souris ou du rat dans les modèles d’infertilité sont très bien décrits dans la littérature. Chaque modèle peut être extrapolé aux deux espèces. Les animaux utilisés seront au moins âgés de 7-8 semaines afin d’avoir des animaux sexuellement matures permettant de mimer au mieux les conditions cliniques humaines.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris SAMP8 modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une supplémentation en butyrate, des gavages, des prélèvements de sang à la queue et des mesures du transit digestif, puis des tests comportementaux de mémoire visuelle et de motricité. Le porteur signale une perte de poids propre à cette lignée et indique que gavages, prises de sang et tests peuvent générer stress et douleur. Il affirme que l'étude du lien intestin-cerveau au cours du vieillissement ne peut aujourd'hui se faire que sur un modèle animal, faute de reproduire cette complexité in vitro.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde. Il n’existe aucun traitement efficace pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et mortelle, entraînant une perte progressive des neurones au niveau du cerveau, notamment des régions impliquées dans la mémoire. Un des signes majeurs de la maladie d'Alzheimer est l’accumulation dans le cerveau d’un bout de protéine appelé Abeta qui à la longue empêche une bonne communication entre les neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives (eg. constipation) pouvant se manifester de façon très précoce, longtemps avant qu’apparaissent les premiers signes affectant le cerveau. Ces défauts de transit gastro-intestinal suggèrent que la MA toucherait aussi bien le cerveau que l’intestin. L’intestin est composé de neurones régulant les fonctions digestives. Par ailleurs, il a également été montré que les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Il a aussi été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du tapis microbien tapissant l’intestin et d’une baisse associée de métabolites provenant de ces microbes tel que le butyrate. De plus, le butyrate a été montré comme étant bénéfique au bon fonctionnement des neurones de l’intestin et du cerveau. Dans ce contexte, améliorer le fonctionnement des neurones de l’intestin pourrait améliorer la fonction de transit intestinal et ainsi prévenir des formes graves de MA. De nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans les processus de mémoire. Au vu de tous ces éléments, améliorer le tapis microbien de l’intestin ou des métabolites qu’il produit, tel que le butyrate, peux avoir un impact positif sur les fonctions de l’intestin et la mémoire dans la MA.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Favoriser la communication des neurones du cerveau par l’alimentation peut avoir des effets bénéfiques sur le vieillissement normal ou pathologique (Maladie d’Alzheimer) du cerveau. D’autre part, le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale dans le cerveau pourrait aussi impacter ceux de l’intestin et vice-versa. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans la régulation des performances cognitives (AGCCs : acides gras à courte chaine, acides aminés, vitamines). De manière intéressante, la flore intestinale et ses métabolites peuvent eux aussi impacter ces fonctions. Les AGCC sont naturellement synthétisés par le microbiote, principalement dans le colon et leur rôle central non seulement dans le métabolisme neuronal mais aussi la modulation de gènes impliqués dans la connectivité neuronale. De plus, d’autres études ont mis en évidence les effets bénéfiques du butyrate sur la communication des neurones du cerveau avec amélioration de la mémoire. Néanmoins, leur capacité à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.

Procédures

Après 4 mois et 6 mois de traitement, pour tous les animaux, nous effectuerons des études des fonctions digestives en évaluant le temps de transit colique (durée max 30 min) et total jusqu’à 6 heures avec addition d’eau (temps de transit total) , ainsi que la perméabilité intestinale in vivo et le nombre de fèces émises. L’objectif est de mesurer le temps de transit oro-anal et de calculer le nombre de fèces émises sur 2 heures. Ainsi les fèces émises seront collectées toutes les 15 minutes sur deux premières heures pour le temps de transit colique. Deux heures après gavage, un prélèvement d’un échantillon de sang à la queue (sur animal vigile) est réalisé (durée 30 sec). Après 6 mois, tous les animaux réaliseront des tests comportementaux (mémoire visuelle et motricité d’une durée de 10 à 30 min individuellement).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant la supplémentation alimentaire en butyrate ou l’Inuline. Il est cependant important de noter une perte de poids des souris SAMP8 par rapport aux contrôles qui est indépendant de la supplémentation envisagée. Cette perte serait liée à une altération du métabolisme chez ces souris et qui est observable dès la naissance. Stress et douleur peuvent être générés par différentes expérimentations (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux).

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des études sur des protéines, des ARN et des marquages sur des tissus.

Remplacement

L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de vieillissement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier le butyrate comme métabolite d’intérêt et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement bénéfiques de plusieurs métabolites bactériens. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Les animaux seront hébergés collectivement dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. Ils seront observés quotidiennement. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine si le score reste inférieur à 1 Si, selon les tables des points limites, le score venait à augmenter, la surveillance du poids et de l’hydratation seraient quotidienne voir 2 fois par jour pour des scores de 1 à 2. Si le score devait être de 3, les souris recevraient un analgésique par voie sous-cutanée, 1 fois par jour. Pour un score de 4 les souris seraient mises à mort

Choix des espèces

Les souris SAMP8 sont un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car ne présentant aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, étant un modèle naturel/spontané sans surexpression de gènes, il se prête mieux à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec du butyrate et/Inuline envisagé dans le projet. Les travaux menés au sein du laboratoire ont également montré qu’il est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la MA. Les souris SAMP8 et leur modèles contrôles (SAMR1) seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon quotidienne avec de l’eau sans supplémentation ou de l’eau contenant du butyrate (supplémentée ou non avec de l’Inuline) jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les souris SAMP8 et SAMR1 seront utilisées à l’âge de 3 semaines et hydratées de façon journalière avec de l’eau sans supplément (contrôle) ou de l’eau contenant du butyrate jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus pour nos expériences car des études montrent que les symptômes intestinaux commencent vers 1-2 mois et les symptômes cérébraux vers l’âge de 6 mois. Etant donné que le projet vise à évaluer l’effet préventif du butyrate, les âges retenus permettent de baliser l’apparition de ces symptômes.

100 souris transgéniques vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des approches anti-inflammatoires sur le cerveau par microscopie à deux photons. Chaque animal subit une chirurgie crânienne de deux heures puis trois séances d'imagerie sous anesthésie, certaines recevant une lésion inflammatoire au cortex, un implant délivrant du dihydrogène ou une stimulation magnétique transcrânienne. Le porteur indique que la stimulation peut causer de petites hémorragies cérébrales, que les chirurgies présentent un risque infectieux et que les souris peuvent aggraver leurs plaies, avant d'être tuées pour les analyses. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro d'un "cerveau complexe vivant" pour ces mécanismes.

Objectifs

Objectif 1 : Analyser les effets anti-inflammatoires du dihydrogène sur la neuro-inflammation. Objectif 2 : Valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3 : Analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus des projets sont multiples : objectif 1, valider ou pas l'effet du dihydrogène sur la diminution de la neuro-inflammation. La neuro-inflammation est associée a beaucoup de neuropatologies neurodégénératives comme Alzheimer et Parkinson. Pour cette derniere , il a déjà été observé une ameliorations de symptomes chez les rats Parkinsoniens. Objectif 2 ,valider un ciblage spécifique sur les sites de neuro-inflammation. Objectif 3: analyser les effets de la stimulation magnétique transcrânienne sur le cerveau. Ces effets sont à eviter chez l'homme, sauf dans le cas ou nous avons besoin transitoirement du passage d'un médicament.

Procédures

Toutes les souris subiront une chirurgie cérébrale sous anesthésie générale pendant 2 heures. Et, également sous anesthésie générale, 3 séances d'imagerie cérébrale sous microscope précédées d'une injection intra-veineuse d'agent de contraste, durant un maximum de 3 heures. Lors de leur chirurgie, pendant quelques secondes, certaines souris subiront une induction inflammatoire à l'aide d'une aiguille de biopsie à la surface du cortex cérébral. Certaines souris se verront implanter en sous-cutané dans le dos d'un électrolyseur délivrant du dihydrogène (chirurgie implantatoire de quelques minutes sous anesthésie générale). Enfin, quelques souris seront soumises pendant 30 minutes à un champ magnétique en disposant une bobine électrique au-dessus de leur tête.

Impact sur les animaux

Nous pouvons causer des petites hemoragies cérébrales lors de la stimulation magnétique transcrânienne. Les chirurgies présentent un risque infectieux. Les souris peuvent agraver leurs plaies en se blessant.

Devenir

La mise à mort des animaux est necessaire pour faire les analyses immunohistochimiques quantitatives de la neuroinflammation.

Remplacement

Il n'y a pas de remplacement possible avec des modèles in vitro ou in silico. La complexité des reactions neuro-inflammatoires in vivo ne permet pas de les étudier in vitro . Il n'existe pas de modèle in vitro d'un cerveau complexe avec les interactions intercellulaires et cellulaires-vasculaires en place. De ce fait, les mécanismes étudiés dans un cerveau vivant ne peuvent être analysés que dans un organisme complexe vivant.

Réduction

Les animaux sont suivis dans le temps par imagerie pour reduire leur nombre par groupe expérimental. Les nombres d’animaux par groupe ont été fixés en tenant compte d'une part de la complexité de la chirurgie et des implantations et d'autre part de la variabilité inter-individuelle. On utilisera les tests statistiques pour le calcul du nombre d'animaux minimum permettant l'obtention de résultats significatifs.

Raffinement

Le projet est mis en oeuvre en suivant toutes les règlementations en vigueur : animalerie agréée, personnel formé et autorisation de projet validée. Les animaux seront hébergés individuellement dans un environnement enrichi et contrôlé et observés régulièrement afin d'anticiper l'apparition des points limites fixés. La fréquence de surveillance des animaux sera adaptée à la temporalité de l'expérience, impliquant si nécessaire l'arrêt des expérimentations. Si les points limites sont atteints : 1) Perte de poids , Perte de poids 5% > 10%> 20%, score 1/2/3 2) Etat du pelage, de la peau et des yeux, manque de soins / lesions, score 1/2, Grattage/ infection/ Ulcération / inflammation chronique, score 1/2/3/, adminstration d'une crême apaisante. 3) Mobilité anormale: claudication/ inactivité/ prostration , score 1/2/3. 4) Fèces liquides, score 1 5) respiration , anomalies, score 2. Score limit = 3, adminstration d'un antalgique dans le biberon systématique en post-chirurgie. S'il n'y a pas d'amélioration de l'état de la souris en 24h , elle sera sacrifiée sans demande d'autorisation au responsable scientifique du projet. Les différents gestes chirurgicaux et toutes les séances d'imagerie sont réalisés sous anesthésie et analgésie générale et locale. La méthode chirurgicale la moins invasive sera retenue pour le bien-être animal, comprenant la sévérité des suites opératoires. Il y a un traitement antalgique (Carprofène) suite aux chirurgies dans toutes les procédures expérimentales selon les conseils de notre vétérinaire référent. Les animaux pourront être vidéosurveillés en continue si nécessaire (surtout en post-opératoire) grâce à la mise au point d'une caméra infra-rouge. Bien que génétiquement modifiée, le transgène étant transmis de façon systématique et stable, les souris seront identifiées par tatouage sans geste plus invasif.

Choix des espèces

L'espèce animale retenue correspond au modèle le plus pertinent pour la modalité d'imagerie utilisée : la microscopie intra-vitale. De plus, nous avons besoin d'un modèle in vivo qui exprime des cellules immunitaires rendues fluorescentes telles que chez une souris transgénique existante. Nous utilisons les souris adultes (> 6 mois ) pour faire une chirurgie osseuse sur la boîte cranienne. Ces operations ne sont pas possibles sur une souris en croissance pour laquelle la bôite cranienne n'est pas à sa taille definitive.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les réponses immunitaires contre les tumeurs. Chaque animal est irradié, reçoit une greffe de moelle osseuse puis des cellules tumorales, et une partie ingère un irritant intestinal par cycles de cinq jours. Le porteur indique que l'irradiation peut faire souffrir en cas de mauvaise reconstitution, que l'irritant colique provoque une perte de poids et une souffrance, et que tous les animaux sont tués pour prélever organes et tumeur. Il affirme que la complexité du micro-environnement tumoral "oblige" à recourir à l'expérimentation animale, les bénéfices restant formulés au conditionnel.

Objectifs

Chez l’homme, les réponses immunitaires anti-tumorales sont souvent inefficaces. Cela est notamment dû au développement d’un épuisement des réponses immunitaires (aussi appelé exhaustion). Il a été montré que certaines protéines sécrétées en contexte inflammatoire contribuaient au développement d’une exhaustion des globules blancs au cours du vieillissement. Au regard de ces résultats, nous souhaiterions déterminer le rôle de ces protéines sur l'exhaustion des réponses immunitaires dans le cadre du cancer.

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de préciser le rôle de ces protéines inflammatoires sur les acteurs de la réponses anti-tumorale, notamment sur leur fonction. In fine, ce projet pourrait aboutir à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques permettant d'améliorer les réponses anti-tumorales et le traitement de certains cancers.

Procédures

Irradiation (4 minutes par souris), une injection intraveineuse rétro-orbitaire de cellules de moelle osseuse sous anesthésie générale (15 sec/souris). Pour certaines souris, une injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale (15 sec/souris) ou alternativement une injection intrapéritonéale d'une substance favorisant le développement de tumeurs (15 sec/souris) suivi de l'ingestion d'un irritant de l'intestin via l'eau de boisson pendant 3 cycles de 5 jours toutes les 2 semaines. Mesure de la croissance tumorale à l'aide d'un pied à coulisse trois fois par semaine (30 sec/souris) jusqu'à fin de l'expérimentation ou mesure de la croissance tumorale par échographie sous anesthésie générale toutes les deux semaines pendant 2 mois (5 minutes par souris).

Impact sur les animaux

L'irradiation peut occasionner une souffrance en cas de mauvaise reconstitution des cellules de la moelle osseuse. L'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée de tumeurs peut entraîner un stress ou une douleur de courte durée chez les animaux. La croissance tumorale peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs aux animaux. L'irritant colique peut entraîner une perte de poids et une souffrance des animaux. Enfin la manipulation des souris pour mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse ou les échographies peuvent également induire un stress chez les animaux.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort afin de prélever les organes et la tumeur pour analyser les cellules immunitaires et l'expression de plusieurs protéines d'intérêt.

Remplacement

La complexité inhérente au microenvironnement tumoral ne permet pas de récapituler les évènements immunologiques impliqués dans des systèmes in vitro, obligeant à utiliser l’expérimentation animale. Les hypothèses testées chez l'animal ont préalablement été testées dans des systèmes in vitro et en se basant sur des données publiées de la littérature.

Réduction

Les effectifs ont été déterminés et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques adaptés. L'utilisation de l'imagerie permet une surveillance non invasive de la croissance tumorale au niveau du tube digestif en évitant la mise à mort séquentielle d'animaux. Chaque animal chimère permet d'analyser les cellules de deux génotypes différents au sein d'un même animal.

Raffinement

Les conditions d’élevage, d’hébergement et de soins sont contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Tous les gestes invasifs réalisés sur les animaux seront faits sous anesthésie générale. Des points-limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. L’état général des animaux sera suivi de manière quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie et très régulièrement par le responsable du projet (pesée et surveillance deux fois par semaine après l'irradiation, mesure de la croissance tumorale trois fois par semaine après l'injection de cellules tumorales, suivi régulier par échographie pour certains animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier le développement tumoral. En effet, de nombreuses voies de régulation sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, la disponibilité de modèles de souris transgéniques nous permet d'étudier le rôle de certaines voies de signalisation dans le développement tumoral. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Souris adultes de 8 à 14 semaines car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral.

6 950 souris immunodéprimées vont être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer des immunothérapies cellulaires associées à d'autres traitements contre le cancer. Chaque animal reçoit une greffe de cellules tumorales humaines, la thérapie à tester et des injections répétées, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse et par bioluminescence. Le porteur indique que la tumeur peut rendre les souris cachectiques et douloureuses, applique un point limite au volume tumoral, et tue les animaux en fin d'étude, une partie des surnuméraires étant réutilisée pour entraîner les expérimentateurs à leurs gestes. Il affirme que l'étude dans un "organisme vivant complet" reste "indispensable" après les tests in vitro.

Objectifs

L’immunothérapie est une avancée scientifique majeure dans la lutte contre le cancer. Elle utilise les caractéristiques du système immunitaire et de ses lymphocytes T, qui détectent et éliminent les attaques extérieures (microbes, virus, bactérie) ainsi que les cellules tumorales de l’organisme. Or, ces dernières envoient des signaux qui modulent l’activité de ces lymphocytes T les rendant moins efficaces. Les traitements d'immunothérapie visent à favoriser l’infiltration de cellules immunitaires dans les tumeurs afin de lutter contre, et de les aider à contourner les mécanismes de protection pour les détruire. Plusieurs stratégies existent : L’immunothérapie active basée sur le principe de la vaccination stimule les défenses immunitaires du patient pour prévenir les récidives ou traiter les cancers métastatiques. De petites molécules sont utilisées pour cibler directement les voies de signalisation impliquées dans l’activation et la prolifération des cellules immunitaires. L’immunothérapie adoptive consiste à injecter au patient des cellules "éduquées" qui agissent contre les cellules cancéreuses. Des cellules immunitaires sur lesquelles a été ajouté un attribut (type anticorps) ou dont le récepteur a été modifié, vont reconnaitre spécifiquement la cellule tumorale et enclencher sa destruction. L’administration de molécules agissant sur des points de contrôle immunologique : des protéines présentes à la surface des cellules saines de l’organisme qui régulent la réponse immunitaire en freinant ou boostant la stimulation des lymphocytes T. Les tumeurs peuvent exprimer certaines de ces protéines, leur permettant de passer inaperçues vis-à-vis du système immunitaire. Ces approches représentent des succès en clinique, mais certains cancers présentent malgré tout des résistances aux traitement et imposent de poursuivre la recherche et le développement de nouvelles thérapies. L’objectif de ce projet est de sélectionner les modifications des cellules immunitaires permettant de les rendre plus efficaces face à une croissance tumorale puis leur associer un traitement type petite molécule et/ou biologique afin de permettre une régression tumorale. Ces modèles sont développés sur souris immunodéprimées porteuses de tumeurs humaines. Ce projet vise également à identifier des biomarqueurs montrant l’engagement de la cible et de grande importance dans le diagnostic en clinique.

Bénéfices attendus

Ce projet comporte plusieurs phases, destinées à déterminer les conditions expérimentales optimales puis à effectuer l’évaluation de l’efficacité de nouvelles thérapies combinant des entités chimiques et biologiques ciblant des cellules tumorales injectées soit en sous-cutanée soit en intraveineuse à la souris. Dans un premier temps, il est nécessaire de déterminer la concentration suboptimale de cellules immunitaires modifiées à injecter induisant une régression tumorale. Si besoin, le suivi des biomarqueurs d’activité soit au niveau de la tumeur, soit dans la circulation sanguine soit dans des organes d’intérêts peut être fait. Dans un second temps, nous évaluerons l’activité des cellules immunitaires modifiées sur la régression tumorale en combinaison avec des traitements d’entités biologiques et/ou chimiques. Ces traitements permettent de lever l’inhibition que portent les cellules tumorales sur les cellules immunitaires modifiées et de stimuler ces dernières. Ce projet s’inscrit dans le cadre de la recherche en immunothérapie ciblée et personnalisée. En effet, connaissant les caractéristiques des tumeurs, la modification des cellules immunitaires du patient ou d’un sujet sain permet une reconnaissance ciblée de la tumeur et donc de s’affranchir des effets indésirables dus à la non-spécificité des traitements. L’association de ces cellules avec des entités chimiques ou biologiques permet de lever l’inhibition de la tumeur et de booster les cellules immunitaires.

Procédures

Injection en sous cutané ou en intraveineuse des cellules tumorales sur animal vigile (moins de 30 secondes) Injection en intraveineuse des cellules immunitaires modifiées sur animal vigile (moins de 30 secondes) Traitement intra-péritonéal ou per-os d’entité biologique ou chimique (moins de 30 secondes par administration) mesures du volume tumoral par pied à coulisse sur souris vigile (2 à 3 fois par semaine) (moins d’une minute à chaque mesure). Injection en intra-péritonéal de la luciférine, 2 à 3 fois par semaine (moins de 30 secondes par geste) Un maximum de 6 prélèvements de sang sur 24 h peut être envisagé sur animal vigile (moins de 30 secondes par prélèvement).

Impact sur les animaux

La potentielle souffrance peut être liée à la tumeur inoculée (qui peut rendre cachectique) ou à la croissance tumorale, voire à la convergence des deux. Mais compte tenu de la localisation de la greffe en sous-cutanée et des points limites prédéfinis, cette souffrance semble plutôt de nature modérée. Une potentielle source de stress peut également provenir : De la greffe de cellules immunitaire en intraveineuse. La contention d’une durée maximale de 30s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’injection en intra-péritonéale de la luciférine pour les mesures d’imagerie par bioluminescence : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress ainsi que l’injection (moins de 10s). De l’administration d’entité biologique ou chimique en intra-péritonéal ou Per-os : la contention d’une durée maximale de 15s peut générer du stress Pour les prélèvements de sang, il est nécessaire de raser les pattes arrière de l’animal. La contention ainsi que le rasage de la patte d’une durée maximale de 30s peut générer du stress. Du prélèvement de sang au niveau de la veine marginale de la patte. La contention d’une durée maximale de 2min ainsi que le prélèvement (moins de 30s) peuvent générer du stress De l’induction de l’anesthésie pour la mesure d’imagerie : l’induction qui est rapide peut générer du stress

Devenir

Les souris greffées en sous cutanée et non incluses surnuméraires ou dont la tumeur n’a pas suffisamment poussé peuvent être réutilisées pour l’entrainement des expérimentateurs à différentes techniques en lien avec ce projet ou d’autres projets (administration sous-cutanée, intra-veineuse, intra-péritonéale, per os, prélèvements de sang, apprentissage des mesures, puçage, etc…). Elles peuvent également être réutilisées dans d’autres études de pharmacologie (pharmacodynamie, pharmacocinétique) ou servir à l’évaluation de la tolérance d’un produit provenant d’une série chimique connue. En revanche, en cas de non-réutilisation possible, elles seront automatiquement euthanasiées. Pour cela le volume tumoral doit respecter les consignes de l'autorisation de projet dédiée à l'entrainement. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude Pour les souris ayant reçu des greffes de cellules tumorales en intraveineuse : les souris non incluses surnuméraires sont euthanasiées. Les souris incluses dans les études sont euthanasiées si des points limites sont atteints ou en fin d’étude.

Remplacement

Aujourd’hui, de plus en plus de tests in silico et in vitro sont mis en place pour caractériser autant que possible les candidats médicaments, de façon à n’investiguer in vivo que les meilleurs candidats issus de ces sélections. Ce projet est mis en œuvre après la validation in vitro des différentes nouvelles entités biologiques et chimiques. L’absence d’efficacité in vitro ne permet pas de justifier l’utilisation d’un modèle animal par conséquent ce projet s’inscrit en dernier lieu dans le processus de recherche d’un candidat médicament. C’est seulement sur la base de ces données que les études d’efficacité antitumorale sont ensuite réalisées : uniquement les candidats les plus prometteurs vont être testés, limitant ainsi le nombre d’animaux utilisés. Cependant, cette étape chez l’animal reste aujourd’hui encore indispensable : en effet, même avec les limitations inévitablement liées à n’importe quel modèle, c’est dans un organisme vivant complet que l’on peut vraiment étudier les effets pharmacologiques d’une molécule anti-cancéreuse. Son comportement dans un système complexe est plus relevant d’un point de vue physiologique.

Réduction

Les conditions et taux de croissance tumorale pour chaque lignée à tester ont été déterminés au préalable dans un projet dédié et permettent de sélectionner les conditions optimales de greffe et le nombre d’animaux nécessaires avant le début de l’expérimentation. Les cellules immunitaires issues de donneurs sains sont modifiées puis évaluées sur des tests in vitro dit de « killing ». Les cellules immunitaires modifiées sont mises en présence de cellules tumorales selon des ratios définis. Le choix du donneur pour une étude in vivo sera donc fait en fonction des résultats de ce test. Le design expérimental a été revu avec le biostatisticien/pharmacocinéticien afin d’identifier notamment le nombre de groupes et de souris dans chaque groupe et par étude au cas par cas, de façon à tirer des conclusions significatives tout en utilisant le nombre minimal d’animaux nécessaires. En cas d’animaux greffés en sous-cutané surnuméraires après randomisation, une ré-utilisation dans un autre projet peut être envisagé après l’aval de la SBEA (structure chargée du bien-être animal). Les tumeurs sont mesurées au moyen d’un pied à coulisse ou par imagerie optique : 2 techniques non invasives pour l’animal qui permettent un suivi de la tumeur dans le temps et une réduction du nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, nous réaliserons au cours d’une même étude : •Un suivi de la croissance tumorale (étude d’efficacité) •L’évaluation de biomarqueur (étude de pharmacodynamie) •L’évaluation de la biodisponibilité des produits testés (pharmacocinétique) Ainsi nous contribuons à diminuer le nombre d’animaux car 3 études peuvent être réalisées en une seule étude.

Raffinement

La progression des tumeurs est mesurée via le pied à coulisse (sous cutanée) ou par bioluminescence (intraveineuse) : 2 techniques non invasives pour l’animal. Dans le cas d’un protocole avec traitement chronique, les tumeurs sont mesurées au moins 2 fois par semaine, à la fois pour l’objectif de l’étude mais également pour limiter la souffrance et appliquer les points limites si nécessaire. Au-delà de 1500 mm3 (pour les tumeurs greffées en sous-cutanée), une surveillance accrue et une réduction de l’intervalle de temps entre les mesures sont mises en place afin d’anticiper efficacement l’atteinte du point limite attaché au volume tumoral. Pour les études de suivi par imagerie de bioluminescence, la surveillance se fait sur la perte de poids des animaux. Une surveillance accrue sera réalisée si les souris présentent un fort signal de bioluminescence. les doses de produits à administrer à l’animal sont sélectionnées préalablement in vivo grâce à des études de Dose Maximale Administrable (DMA) et Dose Maximale Tolérée (DMT) (faisant l’objet d’un autre projet) afin de limiter les risques d’une potentielle toxicité des composés testés. Les souris immunodéprimées seront hébergées et manipulées dans un secteur à confinement spécifique avec des procédures d’accès, des conditions d’hébergement et de manipulations strictes appliquées par tout le personnel et intervenants, et ce afin de prévenir tout risque d’infection et/ou contamination. des prélèvements de sang à la veine saphène latérale peuvent être mis en œuvre afin d’obtenir des informations sur des possibles biomarqueurs ou sur le profil d’exposition du composé (évitant ainsi des études de pharmacocinétique dédiées) et pour exploiter au mieux les données d’activité antitumorale. Si des prélèvements répétés sont prévus, le volume maximal prélevé n’excède pas 15% de volume de sang total sur 28 jours. Cette technique de prélèvement, peu invasive et rapide, permet de prélever plusieurs fois sur un même individu, contribuant ainsi à la réduction du nombre d’animaux, tout en respectant les limites de volémie physiologiques. Les souris sont hébergées en groupes sociaux. Un enrichissement de milieu adapté va également permettre de surveiller leur état général par l’observation de leur comportement vis-à-vis de celui-ci.

Choix des espèces

En oncologie, l’utilisation de souris est largement décrite dans les publications en recherche pré-clinique: ces modèles sont davantage déployés chez la souris que chez le rat. Le modèle murin est à l’heure actuelle le modèle le plus couramment utilisé pour ce type de recherche en immuno-oncologie Les souris sont utilisées à partir de 6 semaines soit un poids corporel d’environ 18-20g en début d’expérimentation. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments. Afin de ne pas avoir d’interférence avec les signes de vieillissement nous essayerons dans la mesure du possible de ne pas excéder 6 mois d’âge à la fin des études.