Souris

154 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour évaluer une bithérapie contre des cancers dits méthionine-indépendants. Chaque animal reçoit une greffe sous-cutanée de cellules cancéreuses, un régime privé d'un acide aminé et des traitements injectés, avec un suivi de la tumeur au pied à coulisse trois fois par semaine. Le porteur indique une douleur modérée et une perte de poids liées à la tumeur, prévoit du paracétamol puis de la morphine, et tue les animaux atteignant un point limite de douleur sévère. Il affirme qu'une étude sur "organisme entier" est "nécessaire", la tolérance à long terme des molécules n'étant pas connue et le bénéfice restant un transfert possible "chez l'Homme".

Objectifs

Objectif principal : Evaluation de l’efficacité et de la synergie d’une nouvelle bithérapie ciblant les cancers méthionine-indépendants. Objectifs secondaires : Quantification de la synergie entre les 2 composés de la bithérapie, évaluation de la tolérance et toxicité à long terme des composés en monothérapie et en bithérapie, évaluation de la synergie de tolérance (réduction des effets secondaires liée aux diminutions posologiques permises par la synergie d’efficacité), évaluation des mécanismes d’efficacité anti-tumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité et la tolérance d’une association thérapeutique qui pourra être transférée chez l’Homme pour le traitement du cancer.

Procédures

Greffe de cellules cancéreuses : La greffe sera réalisée par une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses (procédure durant 10 min), dans le flanc droit des souris, à une distance suffisante des articulations pour éviter toute limitation des amplitudes articulaires. L’injection sera réalisée après une période d’acclimatation de 7 jours pour diminuer le stress des animaux liée à la minupulation, avec désinfection à la bétadine de la zone d’injection. Cette procédure permettra ensuite de suivre le volume tumoral de manière non invasive. L’étude visant à évaluer l’efficacité antui-tumorale d’une nouvelle association médicamenteuse, tous les animaux de l’étude seront concernés par cette procédure. Administrations des médicaments : L’étude vise à évaluer l’association entre un traitement administré par voie orale, et un traitement administré par voie injectable. Le premier traitement consistera en un régime particulier (croquettes en tout point identiques aux croquettes standards mais dépourvues d’un acide aminé particulier), mis à disposition des animaux. Le second traitement sera administré par voie sous-cutanée, intra-péritonéale (procédure durant 2 min), ou par mini-pompe osmotique SC placée sous anesthésie (procédure durant 10 min), selon ses propriétés de diffusion qui auront fait l’objet d’une étude préalable. Le délai entre deux injections aura été déterminé lors de l’étude préalable, et la fréquence des injections sera réduite au minimum (elle ne dépassera pas 2 injections par jour). Mesure du volume tumoral : Le volume tumoral sera mesuré 3 fois par semaine à l’aide d’un pied à coulisse. Il constituera le critère de jugement principal pour évaluer l’efficacité des traitements. Tous les animaux de l’étude seront concernés. Prélèvements sanguins : Trois prélèvements sanguins sont prévus par animaux (procédure durant 8 min). Ils seront prévelés au niveau mandibulaire, aux temps suivants : J0 (avant la première administrationd de traitement), J7 et J21. Le délai mminimum entre 2 prélèvements correspond au délai nécessaire pour la reconstitution sanguine du volume prélevé qui est réduit au minimum (100 µl).

Impact sur les animaux

Le modèle de greffe tumorale a pour effet attendu une douleur modérée, une perte de poids liée à l’activité métabolique de la tumeur, et un stress modéré lié aux manipulations.

Devenir

Les animaux concernés par les 2 procédures seront mis à mort à la fin de ces procédures. Ceci permettra l’autopsie des souris pour évaluer l’éventuelle toxicité du traitement sur certains organes nobles (coeur, cerveau, foie, reins), et de mieux comprendre les mécanismes d’efficacités du traitement (par l’analyse de la tumeur). La mise à mort préalable avant ces prélèvements, dans le cadre d’une autopsie, permet d’éviter une manipulation chirurgicale sous anesthésie qui comprend des risques d’antalgie ou d’anesthésie insuffisante.

Remplacement

Une étude chez l’annimal est nécessaire pour évaluer l’efficacité d’associations thérapeutiques dont une des deux molécules est un nouveau traitement, jamais testé chez l’animal ou chez l’Homme, et pour vérifier la bonne diffusion de ces nouveaux composés jusqu’à la tumeur lorsqu’ils sont administrés ensemble par voie systémique Les données in vitro sont prometteuses et démontrent l’existence d’une efficacité anti-tumorale des bithérapies à l’étude, le comportement des nouvelles molécules, et a fortiori des associations médicamenteuses impliquant ces nouvelles molécules, n’a jamais été décrit sur un organisme entier. Il est donc nécessaire de vérifier i) que l’administration conjointe des 2 traitements ne modifie pas leur capacité à atteindre la tumeur par des mécanismes de régulations complexes propres aux organismes vivants, et ii) que l’administration systémique des associations thérapeutiques aboutira bien à une efficacité localisée au niveau des cellules tumorales. Aussi, une étude est nécessaire pour évaluer la bonne tolérance des nouvelles molécules et des bithérapies impliquant ces nouvelles molécules, notamment lors d’une administration prolongée et répétée. En effet, une étude in silico (modélisation informatique) et une étude in vivo préliminaire ont permis de sélectionner les composés qui sont bien tolérés à court terme, mais la tolérance à long terme n’est pas connue. La connaissance de la tolérance à long terme de ces nouvelles molécules et nouvelles associations thérapeutiques est nécessaire avant d’envisager leur administration chez l’Homme. Les éventuelles toxicités attendues, de manière hypothétique, étant principalement médullaire et neurologique, une évaluation chez l’animal est d’autant plus pertinente qu’il n’existe pas de modèle cellulaire satisfaisant pour évaluer les effets spécifiques à long terme avec une administration médicamenteuse répétée sur ces systèmes. Nous avons testé la tolérance de notre traitement sur des fibroblastes et des cellules endothéliales, avec des résultats permettant d’envisager une très bonne tolérance in vivo, mais ces modèles ne représentent pas les systèmes les plus susceptibles d’être altérés, et ne permettent pas non plus d’évaluer l’éventuelle toxicité d’une administration répétée. Enfin, la synergie entre les 2 traitements devrait permettre de diminuer les doses nécessaires des nouvelles molécules pour assurer l’absence d’effet indésirable tout en maintenant un effet anti-tumoral.

Réduction

Pour réduire au maximum le nombre d’animaux dans l’étude, nous avons limité le nombre de groupes de traitements, le nombre d’animaux par groupes, tout en nous assurant que nous aurons un nombre d’animaux suffisant qui correspond aux exigences scientifiques et statistiques pour répondre à la question posée. Concernant le nombre de groupes, nous devions tenir compte de plusieurs exigences scientifiques : Inclure l’analyse de 2 nouvelles molécules agissant via deux mécanismes différents et comprenant chacune des avantages et inconvénients, et inclure des dosages différents. Si nous avions limité l’analyse à l’étude de l’un ou l’autre de ces traitements, nous n’aurions pas pu généraliser les résultats au second traitement en raison de leurs caractéristiques différentes, et l’étude aurait dû être renouvelée pour le second traitement. Réaliser d’emblée cette étude avec ces deux traitements permet de réduire le nombre d’animaux utilisés, notamment en permettant de n’avoir qu’un seul groupe contrôle et témoin. Pour limiter le nombre de groupes, nous avons fait le choix de n’inclure dans l’étude qu’un seul traitement de chacune des deux classes thérapeutiques, en considérant que les résultats de chacun de ces traitements seront généralisables aux autres molécules de leur classe thérapeutique. Inclure différentes posologies (dosages) permettra de statuer sur la synergie (potentialisation d’effet) entre les deux traitements. Pour limiter le nombre de groupes, nous n'avons retenu que deux dosages par traitement. Concernant le nombre d’animaux par groupe, le nombre de souris a été réduit au minimum pour obtenir des résultats exploitables sur le plan statistique. Pour déterminer le nombre d’animaux par groupe, nous avons tenu compte des différences attendues entre les groupes et de la variabilité de résultats au sein de chaque groupe Nous avons calculé qu’il est nécessaire d’inclure dans l’analyse statistique au minimum 11 souris par groupe en fin d’analyse. En raison du risque de non prise des greffes tumorales estimé à 10%, et du risque de décès prématuré de cause non tumorale estimé à 10%, nous avons calculé qu’il était nécessaire d’inclure 14 souris par groupe.

Raffinement

Nous prendrons toutes les dispositions nécessaires pour limiter au maximum les nuisances, attendues ou non, liées aux manipulations des animaux et procédures de l’étude. Le bien-être des animaux fera l’objet d’une évaluation biquotidienne, week-end compris. Pour limiter les nuisances et effets indésirables liées à la greffe tumorale, nous reproduirons un protocole d’étude déjà réalisé et décrit dans plusieurs études concernant les cellules cancéreuses d’intérêt chez des souris. Pour réduire le stress des animaux lié aux manipulations, une période d’acclimatation de 7 jours est prévue avant la première procédure, avec des éléments de distractions prévus dans les cages et des moments de préhensions douces pour habituer les animaux aux manipulations et au contact humain. Toute manipulation sera réalisée dans un environnement calme, et par un manipulateur qualifié pour limiter la durée de chaque manipulation. La douleur ou l’inconfort de l’animal sera évalué 2 fois par jour, week-end compris. Pour prévenir un inconfort modéré, du paracétamol sera administré en continu systématiquement dans l’eau de boisson. Par ailleurs, si des signes comportementaux indiquent une douleur modérée, un traitement morphinique sera administré à visée antalgique à une dose plus ou moins importante selon les signes cliniques observés. En cas de signe clinique indiquant une douleur sévère définissant un point limite, la souris sera mise à mort pour éviter toute prolongation de sa souffrance.

Choix des espèces

La greffe de cellules cancéreuses pancréatiques à des souris a déjà été décrite dans plusieurs articles scientifiques. Reproduire ce modèle permettra de s’affranchir de manipulations de mise au point et de risquer le sacrifice inutile de souris en raison d’une mauvaise prise de greffe ou du délai de croissance tumoral. Nous avons privilégié un modèle de souris immunodéprimées à un modèle murin immunocompétent, car notre étude porte exclusivement sur les cancers méthionine-indépendants, or seules une quarantaine de lignées cancéreuses humaines ont été testées vis-à-vis de leur capacité à proliférer avec/sans méthionine, et aucune lignée murine n’a été testée dans ce but. De ce fait, greffer des cellules cancéreuses murines dont on ignore le statut de méthionine-dépendance/indépendance reviendrait à prendre le risque que l’étude menée ne soit finalement pas interprétable, au cas où la lignée choisie aurait été méthionine-dépendante. Les souris seront accueillies au laboratoire à 6 semaines de vie, pour une greffe tumorale et introduction des traitements entre 7 et 8 semaines de vie, comme décrit lors d’études précédentes évaluant des traitements anti-tumoraux sur le même modèle animal que celui décrit ici (même lignée cancéreuse, même lignée murine).

268 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester une immunothérapie cellulaire contre le myélome multiple. Elles reçoivent par voie intraveineuse des cellules tumorales humaines, parfois après une irradiation aux rayons X et une greffe de cellules souches humaines, puis la thérapie à évaluer, avec un suivi par imagerie. Le porteur indique que la maladie induite peut provoquer une perte de mobilité puis une paralysie des pattes et une perte de poids, et qu'un échec de greffe peut tuer environ une souris sur dix. Il affirme que le recours à un "organisme vivant entier" est "indispensable", les bénéfices annoncés d'une thérapie "universelle" restant un "objectif ultime".

Objectifs

Le myélome multiple (MM) est un cancer du sang caractérisé par la prolifération incontrôlée d'un type particulier de cellules sanguines de la famille des globules blancs appelées plasmocytes. Ces plasmocytes sont des cellules productrices d’anticorps et s’accumulent dans la moelle osseuse. Les traitements actuels du MM reposent sur la chimiothérapie et la greffe de moelle osseuse. Bien que ces traitements aient amélioré la survie des malades, certains patients répondent mal aux traitements conventionnels. L’immunothérapie est une nouvelle stratégie thérapeutique utilisée dans le traitement d'autres cancers du sang, qui vise à réorienter les défenses immunitaires de façon spécifique contre les cellules cancéreuses. Ainsi il est possible de modifier génétiquement une population de cellules du système immunitaire (les lymphocytes), afin qu'ils reconnaissent spécifiquement les cellules tumorales et les éliminent. Le but ultime étant d'améliorer la prise en charge des patients résistants aux traitements classiques. La plupart de ces immunothérapies cellulaires sont faites avec des cellules appelées lymphocytes T car elles sont très faciles à réorienter contre la tumeur; mais elles ont le désavantage d’être spécifiques à chaque individu et ne peuvent pas être données à un autre individu. C’est à dire, qu’un patient ne peut bénéficier de cette immunothérapie à base de lymphocytes T que s’il est en suffisamment bon état de santé (malgré son cancer) pour être prélevé de ses lymphocytes T. Une autre alternative est de faire ces immunothérapies cellulaires avec des cellules appelées lymphocytes NK, qui elles ne sont pas spécifiques à un individu et peuvent être obtenus d’un donneur sain. Cependant, ce type de thérapie dite « universelle » (les cellules thérapeutiques issues d’un donneur peuvent être utilisées pour traiter différents patients) reste peu exploité. Dans notre projet, nous testerons une nouvelle thérapie cellulaire « universelle » à base de lymphocytes NK pour le traitement du Myélome Multiple que nous avons développé. Notre objectif ultime est d’améliorer la prise en charge des malades et de proposer des nouvelles thérapies accessibles pour tous.

Bénéfices attendus

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » contre le Myélome multiple. Les immunothérapies cellulaires ont déjà fait leurs preuves dans d’autres types de cancer du sang et donnent une nouvelle chance aux patients qui ont rechuté après un traitement classique. Ainsi, nous cherchons à contribuer à l’amélioration de la prise en charge des malades atteints de Myélome multiple en développant des alternatives thérapeutiques. De plus, nous avons choisi de développer cette thérapie cellulaire avec un type de cellules immunitaire pouvant être accessibles pour tous.

Procédures

Notre projet consiste à développer une nouvelle immunothérapie cellulaire « universelle » contre le Myélome Multiple (MM). Pour évaluer son efficacité sur cette maladie, nous utiliserons trois types de modèles murins de MM humain. Ces modèles consistent en l’injection par voie intraveineuse (veine de la queue) de cellules tumorales de MM humain à des souris éveillées (1 minute). Après 7 jours, notre thérapie cellulaire sera injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute) deux ou trois fois par semaine pendant deux semaines). La progression de la tumeur et donc l’efficacité de notre immunothérapie cellulaire seront suivis par imagerie in vivo sous anesthésie générale (durée de la session : 10 min) et ce une fois par semaine pendant toute la durée de l'étude, soit 3 mois maximum. Une deuxième partie de l’étude consiste à vérifier qu’il n’existe pas de toxicité de la part de notre immunothérapie cellulaire envers des cellules saines. Pour ce faire, nous allons utiliser des souris ayant reçu une greffe de cellules souches humaines: les souris reçoivent un prétraitement au rayon X afin de les préparées à la greffe (2 minutes) et elles sont ensuite injectées par voie intraveineuse (veine de la queue) avec des cellules souches humaines (souris éveillées ; durée 1 minute). Cinq semaines plus tard, une prise de sang (1 à 2 gouttes prélevée de la veine mandibulaire, (veine de la joue), durée 1 minute, souris éveillée) sera effectuée pour vérifier la prise de la greffe. Notre thérapie cellulaire sera alors injectée (par voie intraveineuse dans la veine de la queue sur souris éveillées ; durée 1 minute). Pour vérifier s’il existe une toxicité de notre thérapie sur les cellules du sang, des prises de sang (1 à 2 gouttes prélevées de la veine mandibulaire, durée 1 minute) seront effectuées sur les souris éveillés 4 et 7 jours après l’injection de cellules thérapeutiques.

Impact sur les animaux

Dans le modèle de MM humain, les cellules tumorales se multiplient dans la moelle. Ceci entraine fréquemment, quand le traitement n’est pas efficace, l’apparition d’une perte de mobilité qui dans la plupart des cas est suivi par une paralysie des pattes inférieurs, s’accompagnant d’une perte de poids. Des tumeurs au niveau du crâne sont également des évènements susceptibles d’être attendus sur ce modèle, néanmoins ces tumeurs apparaissent à long terme à environ 2 mois post injection des cellules tumorales. Il est également possible que les cellules tumorales s’accumulent au niveau de la rate, pouvant générer une gêne abdominale. Dans le modèle souris humanisé (souris greffées avec des cellules souches humaines), il existe un risque d’échec de greffe (environ 1 souris sur 10) qui peut entrainer la mort de l’animal environ 15 jours après la greffe. L’irradiation rend aussi la souris fragile aux infections et peut favoriser la présence d’une diarrhée et perte de poids. Dans le cas où notre thérapie soit toxique envers les cellules du sang, une perte de poids et un changement de comportement sera attendu.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure. Nous analyserons à partir de la moelle osseuse et de la rate prélevées en post-mortem, les différentes populations de cellules du système immunitaire.

Remplacement

Nous avons réalisé le maximum d'expériences in vitro afin de valider l'efficacité de nos cellules thérapeutiques. Cependant ces tests ne nous permettent pas d'évaluer à long terme ces cellules thérapeutiques. L’utilisation d’un organisme vivant entier est donc indispensable afin de reproduire les conditions observables chez l’Homme dans le cadre de leur utilisation en thérapie. De plus, il est nécessaire de vérifier ces résultats dans un modèle in vivo, car celui-ci intègre la plupart des caractéristiques de ces pathologies humaines telles que l’hétérogénéité des cellules tumorales, l’existence de tissus sains, la présence de barrières limitant l'efficacité des traitements.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisés au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Plusieurs groupes de souris seront analysés simultanément permettant de n’avoir qu’un seul groupe d’animaux « contrôle ». L’utilisation de l’imagerie in vivo permet également de réduire le nombre d’animaux utilisé grâce à l’analyse d’une même souris sur toute la durée de l’expérience.

Raffinement

Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes procédures. Tout d'abord, les souris sont hébergées dans une animalerie avec un statut sanitaire contrôlé, un enrichissement sera mis en place (papier kraft pour la fabrication de nid, buchette en bois à ronger). Un suivi visuel quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux est réalisé. Nous veillerons, par ailleurs, à réduire au minimum l’intensité et la durée des souffrances ressenties par les animaux, en utilisant une grille d'évaluation hebdomadaire prenant en compte l'apparence physique, le poids et le comportement des animaux. De plus la mesure hebdomadaire par imagerie in vivo, nous permettra d'évaluer la propagation tumorale et euthanasier les animaux si celle-ci devient trop invasive et avant que les signes cliniques n’apparaissent (paralysie par exemple).

Choix des espèces

L’espèce animale choisie dans ce projet est la souris. Cette espèce présente l’avantage d’être un petit mammifère dont le comportement est bien connu et proche de l’humain. Ainsi, l’évaluation du bien-être et de la douleur liée à l’expérimentation peut être effectuée aisément (perte de poids, posture, aspect du poil, comportement agressif, isolement) permettant une prise en charge rapide et adapté. De plus, les modèles de MM humains et murins sont bien décrits dans la littérature scientifique. Les souris utilisées dans ce projet sont des animaux adultes de 2 à 3 mois au début de la procédure (injection des cellules tumorales) qui est l’âge de référence utilisé dans de nombreux modèle expérimentaux sur souris adultes.

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, comme modèles du syndrome de Wolfram. Chaque animal subit un jeûne de 16 h, des injections intrapéritonéales et des incisions caudales répétées sur neuf mois, pour caractériser un diabète et tester cinq composés. Le porteur indique que le modèle Wolfram-like développe progressivement cécité, surdité et troubles vestibulaires, et que les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il affirme que ces modèles murins sont "indispensables", seul "recours mammifère autre que l'humain" à reproduire ces symptômes, alors que les retombées thérapeutiques restent une "preuve de concept" à venir.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. De même, le syndrome de Wolfram-like est caractérisé par un diabète sucré de type 1, une surdité neurosensorielle et une atrophie optique bilatérale. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de ces maladies n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de caractériser l'apparition du diabète dans deux modèles murins de ces maladies et déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur ce diabète.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans les syndromes de Wolfram et Wolfram-like sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, dans un premier temps, de caractériser le diabète des modèles murins de référence pour le syndrome de Wolfram et Wolfram-like. Il permettra ensuite d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur ces deux modèles.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : contrôle alimentaire (durée 16h) -identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale via créme anesthésiante). Chaque animal sera identifié une fois. Les animaux subiront 1 contrôle alimentaire (durée 16h), 2 injections en intrapéritonéal (1 min) à au moins 3 jours d’intervalle, 2 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute) à 1 mois. Ces interventions seront répétées à 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins, pour un total de 5 contrôles alimentaires, 10 injections en intrapéritonéal et 10 incisions caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Le contrôle alimentaire sur un durée de 16h peut également engendrer un stress. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels (cécité, surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins des syndromes de Wolfram et Wolfram-like pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Nous avons basé la taille de notre lot sur les données bibliographiques de souris développant un diabète, non induit par un régime spécifique. Nous avons estimé que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires et suffisants pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle. De plus, des analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe et ce nombre sera révisé au besoin. De même, les animaux utilisés pour la réalisation des tests métaboliques seront ensuite euthanasiés et leurs organes collectés afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Ces tissus seront utilisés pour lors de nombreuses analyses, morphologiques, histologiques, afin de disposer du plus large éventail de données possibles à l’issue d’une procédure expérimentale et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Des points limites ont été établis afin de surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le projet . Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations métaboliques dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests métaboliques seront réalisés sur les animaux à 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins.

66 souris vont être utilisées, chacune passant 48 heures isolée dans une cage de calorimétrie et subissant trois séances de rotarod, de grip test et de marche en équilibre sur une planche à trous, ainsi qu'un open field de 30 minutes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Les prises de sang se font sous anesthésie, et une partie des souris reçoit pendant six mois un régime enrichi en sucres et en lipides, que le porteur dit capable de conduire "à la longue à une obésité". L'équipe a créé une lignée privée d'un gène dont les souris résistent à la prise de poids, et veut comprendre cette résistance en les comparant à des souris témoins. Toutes sont tuées à l'issue pour l'analyse de leurs tissus. Le porteur retient des groupes de 12 souris pour deux génotypes et deux régimes, soit 48 souris, et écrit pourtant que "l'étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire".

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’étudier la locomotion et le métabolisme chez des souris qui semblent résistantes à la prise de poids. En effet, nous avons développé un modèle de souris avec une perte d’expression d’un gène spécifique, et à notre surprise ces animaux sont résistants à la prise de poids. Des analyses complémentaires montrent une masse musculaire normale mais une non-accumulation de la masse graisseuse dans ces animaux à l’âge d’un an. Nous souhaitons donc explorer plus en avant ce phénotype, notamment via des analyses longitudinales de la composition corporelle, du métabolisme, de l’activité locomotrice et de la calorimétrie de ces animaux, complété par des analyses sanguines, et ceci à la fois en diète normale ou enrichie en lipides. Nous espérons que cette approche nous permettra de mieux comprendre la résistance à la prise de poids dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de l’activité locomotrice et du métabolisme.

Procédures

1 – Les prélèvements sanguins requièrent moins d'une minute. 2 – L’analyse de la masse corporelle se fera par qNMR, qui est une analyse non-invasive d’une durée de 1 minute. 3 - L’analyse du métabolisme se fera par des tests de Calorimétrie indirecte, qui se déroulent dans des cages d’hébergement individuelles pendant 48 heures. 4 – L’analyse de la locomotion des animaux se fera par une batterie de tests non invasifs réalisés sur une durée de 3 à 4 semaines selon un protocole classique : pour le rotarod, 3 tests de 5 min sont réalisés par souris ; le grip test et la marche en équilibre sur planche à trou sont aussi réalisés trois fois (environ 5 min) par souris et l’open field est un test de 30 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Nous souhaitons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice chez des souris résistantes à la prise de poids, et ceci via des tests classiques et non invasifs. Nous souhaitons aussi analyser les paramètres biochimiques de ces souris et ceci via un prélèvement d’une faible quantité de sang. Ces analyses peuvent induire des contraintes décrites ci-dessous : -Une partie de l’étude du métabolisme se fait chez des animaux avec une diète enrichie en sucres et en lipides, ce type de régime peut conduire à la longue à une obésité avec ces problèmes associés (difficulté à se déplacer, etc.). Nous allons donc restreindre ce régime enrichi en sucres et en lipides à une période de 6 mois. - Toujours à propose de l’étude du métabolisme, celle-ci nécessite des tests se déroulant dans des cages d’hébergement individuelles, conduisant donc à un isolement des animaux pendant 48 heures. Toutefois ce test est de courte durée et une fois terminé, les animaux sont remis dans leurs cages d’origine avec les mêmes dispositions d’avant le test (les mêmes souris dans la même cage, et les cages sont gardées dans le même état qu’avant le début du test, et ceci afin que les animaux retrouvent leur environnement). - Concernant les prélèvements sanguins, ceux-ci peuvent entrainer un stress et/ou éventuellement à une légère douleur. Les animaux seront donc anesthésiés quelques minutes avant le prélèvement sanguin.

Devenir

Les souris seront euthanasiées à l'issue de la procédure afin d’étudier leurs tissus pour des analyses histopathologiques et moléculaires.

Remplacement

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris d’une maladie humaine génétique. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la locomotion et la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude de la locomotion et du métabolisme. Enfin, nous espérons que l’analyse de ce modèle murin permettra de mieux comprendre la faiblesse musculaire et la perte de poids de noter maladie d’intérêt.

Réduction

L’objectif est de réduire au maximum le nombre de souris pour l’étude tout en s’assurant d’une analyse statistique fiable et reproductible. Des travaux précédents et l’étude de la littérature nous ont permis d’établir que l’étude de groupes de 12 animaux permet d’obtenir des résultats statistiquement significatifs, et compte tenu de notre projet d’analyser deux conditions (souris contrôle ou souris sans notre gène d’intérêt) sous deux types de nourriture (normale ou enrichie en lipide), nous estimons que l’étude de 66 animaux sur 3 ans est nécessaire.

Raffinement

Afin de limiter la prise de poids des animaux, le régime enrichi sera limité à 6 mois. De plus, les prélèvements sanguins à la veine temporale superficielle se feront sous anesthésie. Les point limites seront alors déterminés en fonction des observations faites d'une part pendant l'anesthésie (évaluation du rythme cardiaque, variation de la température de l'animal) et d'autre part pendant et après le prélèvement sanguin (changement du comportement : akinésie, prostration, paralysie, non réponses à des stimuli externes). L'anesthésie et la procédure de prélèvement seront arrêtés si ces points limites sont atteints. Enfin, les animaux seront hébergés dans les meilleures conditions possibles dans un environnement contrôlé permettant une réduction du stress. Néanmoins, si des signes de douleur apparaissaient (réduction de l’appétit, diminution de la mobilité et du comportement exploratoire, tendance à l’isolement, poil terne et hérissé, dos voûté), nous ferons alors un traitement analgésique et anti-inflammatoire. De plus, de la nourriture gélifiée sera de plus mise à disposition de l'animal dans la cage dès les premiers signes de problème moteur pour palier tout risque de réduction de prise de nourriture. Toutefois, en cas de douleur forte (isolement, immobilité, automutilation, cachexie, etc.) et/ou d’échec des traitements précèdent ; les animaux seront euthanasiés rapidement pour éviter toute souffrance et l’expérience sera stoppée.

Choix des espèces

Cette étude a pour but d’étudier l’activité locomotrice et le métabolisme dans un modèle de souris. Pour ce faire, il est indispensable de disposer d'un modèle animal car il n’existe pas de modèle in vitro ou de systèmes cellulaires pour étudier la résistance à la prise de poids à l’échelle d’un organisme complet. De plus, des études précédentes ont démontré que la souris est un modèle animal de choix pour l’étude du métabolisme. Nous allons étudier le métabolisme et l’activité locomotrice par des tests non invasifs sur 66 souris adultes, et ceci sur une période de 6 mois pour l'étude du métabolisme, à 15 mois pour l'étude de la locomotion, Ce protocole a été choisi d’après nos expériences précédentes et par l’étude de la littérature et ceci afin de reproduire l’aspect progressif de la perte de force et de la prise de poids des animaux.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une myopathie centronucléaire, elles reçoivent une injection d'un vecteur viral, subissent des mesures de force musculaire sous anesthésie et la pose d'électrodes pouvant enflammer le muscle, avant le prélèvement de leurs organes. L'objectif est de tester une thérapie génique apportant le gène manquant responsable de la maladie musculaire. Le porteur affirme que ces analyses "ne peuvent pas être effectuées" sur cellules en culture, seul l'animal reproduisant l'évolution des symptômes.

Objectifs

Les myopathies centronucléaires sont une classe de maladies génétiques qui détériorent la fonction des muscles squelettiques et handicapent fortement la qualité de vie des patients qui en sont atteints et aucune thérapie n’est à ce jour disponible. Le principal objectif de ce projet est de mettre au point un traitement curatif en apportant le gène manquant responsable de cette maladie à l'aide d'un vecteur viral. En parallèle nous souhaitons également étudier plus en détail les fonctions des différents domaines de la protéine manquante responsable de la maladie musculaire.

Bénéfices attendus

Dans l’hypothèse où notre stratégie thérapeutique s’avèrerait efficace sur le phénotype de notre animal modèle, cette étude serait une preuve de concept thérapeutique pour traiter les myopathies centronucléaires. Ce projet permettra également de faire avancer les connaissances scientifiques relatives aux fonctions des différentes régions de la protéine étudiée.

Procédures

Les 140 souris de la cohorte « Injection intraveineuse » seront soumises aux procédures suivantes : - Injections systémiques rétro-orbitales sous anesthésie générale, non-invasive, unique à 8 semaines d’âge, 5min par animal. -Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, non-invasive, hebdomadaire de 6 à 12 semaines d’âge, 10min par animal - Mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, acte chirurgical, unique à 13 semaines d’âge

Impact sur les animaux

Les animaux présentent une légère atrophie et faiblesse musculaire mais qui n’affecte pas leur qualité de vie de manière significative aux âges analysés. Les animaux interagissent, se déplacent et s’alimentent normalement. En revanche lors de la soumission à l’effort ou par stimulation électrique, le phénotype des souris devient observable et quantifiable le temps de l’analyse. A notre connaissance il n’y a pas de douleurs associées au phénotype myopathique. La pose sous-cutanée des électrodes et l’injection intra-musculaire peuvent causer une inflammation dans le muscle tibial antérieur.

Devenir

Les animaux sont mis à mort sous anesthésie à la fin des deux procédures car notre projet nécessite la collection d’organes pour compléter l’analyse au niveau histologique et moléculaire.

Remplacement

Ces analyses ne peuvent pas être effectuées sur des cellules en culture car celles-ci ne reproduisent pas la fonction d’un organe et encore moins d’un organisme entier. En effet seul le modèle animal permet d’étudier d’une part la maladie dans sa globalité et d’autre part l’évolution des symptômes, ce qui est essentiel dans le cadre d’une mise au point de thérapie.

Réduction

Le nombre d’animaux a été basé sur les résultats de précédentes études sur ces mêmes animaux. Il nous permet d’assurer la robustesse statistique des différences entre animaux sains et malades et ainsi d’évaluer correctement l’effet de notre traitement. Toutes les souris passeront des tests phénotypiques et leurs tissus seront collectés pour compléter l’analyse histologique et moléculaire, nous permettant ainsi de nous affranchir de la création d’une deuxième cohorte pour la collection de tissus, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la procédure expérimentale.

Raffinement

Si des difficultés de locomotion apparaissent lors de l’hébergement, de la nourriture en gel sera placée dans la cage afin de soulager l’animal dans ses déplacements. Les souris seront hébergées par groupe de 2 à 4 par cage et la qualité de l’air sera assurée par une ventilation. Des nids seront disposés dans chaque cage avec un accès illimité à la boisson et à la nourriture. Lors de l’injection par voie rétro-orbitale, du gel ophtalmique sera appliqué au niveau de l’œil de l’animal afin de s’affranchir de la sécheresse oculaire au réveil. Lors de la procédure de mesure de la force musculaire sous anesthésie générale, les souris seront anesthésiées afin d’immobiliser l’animal et de prémunir toute douleur lors de l’opération chirurgicale. Durant la procédure les souris seront placées sur une plaque chauffante pour maintenir leur homéostasie thermique et elles seront monitorées en permanence.

Choix des espèces

Pour tester l'éventuelle amélioration thérapeutique, nous avons besoin d'effectuer des expériences physiologiques in vivo sur modèle animal. Nous disposons déjà de plusieurs modèles murins de myopathies avec lesquelles nous avons publié plusieurs études sur les myopathies centronucléaires. Conserver la même espèce animale pour ce projet s’inscrit dans un effort de continuité et de reproductibilité de nos études. Nous prévoyons ainsi de réaliser cette étude sur des lignées de souris déjà disponibles dans nos laboratoires, ces modèles présentent des phénotypes comparables aux symptômes observés chez les patients humains. Enfin, le modèle murin présente l’unique avantage d’être génétiquement très proche de l’homme et facile d’élevage en raison de sa taille et de ses capacités de reproduction. L’effet du traitement avant l’apparition des symptômes a déjà prouvé son efficacité lors d’une étude précédente au laboratoire, nous traiterons donc ces animaux au stade adulte (8 semaines) pour étudier l’effet du traitement après l’apparition des symptômes.

210 rats et 24 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur provoque une douleur inflammatoire de la patte par des stimulations thermiques ou mécaniques répétées, ou une douleur post-opératoire par incision et sutures, avec un risque d'automutilation de la plaie. L'objectif est de tester des nanomédicaments à base d'enképhalines contre la douleur, une partie des animaux étant tuée pour doser les substances dans le sang. Le porteur affirme que la complexité de la douleur rend le recours à l'animal "incontournable" et présente le rat comme l'espèce "de référence".

Objectifs

La morphine et les opioïdes synthétiques apparentés sont les analgésiques les plus largement utilisés mais leur utilisation est associée à des effets secondaires graves, tels que la dépression respiratoire, l'accoutumance et la dépendance. Dans ce contexte, les enképhalines, qui sont des opioïdes existant naturellement dans le corps humain, sont une option intéressante car elles jouent le rôle d’une morphine endogène, inhibitrice de la douleur mais sans effets secondaires. Cependant, l'utilisation des enképhalines a toujours été limitée car elles sont rapidement dégradées après leur injection dans la circulation sanguine. Ainsi, la conception de systèmes d'administration les protégeant de la dégradation et leur permettant d'atteindre leur cible pour délivrer leur action est un objectif ambitieux. Notre équipe a développé une nouvelle approche de nanomédecine permettant la protection des enképhalines. La preuve de concept a été faite sur un modèle classique de douleur inflammatoire chez le rat et l’étude a montré que les nanomédicaments contenant les enképhalines ont protégé la substance active qui s’est accumulé au site de la douleur et a montré une action analgésique périphérique. Cette étude préliminaire est très encourageante et une des voies d’amélioration de l’activité analgésique des enképhalines repose sur l’augmentation de leur stabilité par l’utilisation de médicaments qui empêche leur dégradation (appelés inhibiteurs d’enképhalinases) et ainsi prolonger encore leur durée de vie et donc leur action anti-douleur. Notre objectif est de tester cette piste d’amélioration en développant de nouveaux médicaments à base d’inhibiteurs des enképhalinases pour booster la concentration en enképhalines et traiter efficacement et durablement la douleur.

Bénéfices attendus

La douleur représente un important défi sanitaire mondial en raison de l'absence relative de traitement efficace, en particulier pour soulager la douleur neuropathique. Actuellement, les médicaments les plus puissants et les plus fréquemment utilisés pour soulager la douleur sont la morphine et les opioïdes de synthèse. Toutefois, leur utilisation chronique est associée à de graves inconvénients, tels que la dépression respiratoire, la tolérance et la dépendance. Chaque jour, plus de 130 personnes aux États-Unis meurent après une surdose d'opioïdes. Il existe donc un besoin important de médicaments antidouleur efficaces dépourvus d’effets secondaires. L’objectif de ce projet est le développement de nouveaux traitements innovants de la douleur. Les enképhalines qui sont des opioïdes naturellement existants dans le corps humain représentent un moyen prometteur d'atténuer la sensation de douleur, sans les effets secondaires de la morphine. Cependant, leur dégradation rapide une fois administrés limite leur utilisation clinique. Ainsi, la conception de nanosystèmes d'administration de médicaments protégeant les enképhalines de la dégradation et leur permettant d'atteindre les récepteurs opioïdes situés dans le système nerveux périphérique (effet local et non central) est un objectif majeur. Cette nouvelle approche permettrait de lutter contre la crise des opioïdes qui a englouti l'Amérique, et d’autres pays dans une moindre mesure, dans une vague d'addiction et de décès par overdose.

Procédures

Pour le modèle de douleur inflammatoire au niveau de la patte, le rat subira 2 injections, d’une durée de quelques secondes, sous anesthésie générale. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise une douzaine de fois (toutes les 30 minutes environ) à un stimulus thermique ou mécanique, qui va déclencher le retrait spontané de la patte, l’animal n’étant pas contraint. La procédure durera au maximum 24h. Pour le modèle de douleur post-opératoire, le rat ou la souris subira une incision qui sera refermée avec 2 points de suture sous anesthésie générale (durée de l’intervention : 5 minutes). Pour la pharmacocinétique, chaque rat sera soumis à une injection et à 4 ou 5 prélèvements de sang sur 24 ou 48 h. Ces gestes seront réalisés sous anesthésie à l’isoflurane et dureront moins d’une minute. Pour la biodistribution, chaque souris sera soumise à une injection unique de traitement et sera suivi en imagerie à différents temps sur une période de 24h. Les injections et l’imagerie seront réalisées sous anesthésie générale et dureront moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Le modèle d’inflammation de la patte induira une douleur locale modérée pendant 3 à 8 h avec une réduction de la motricité mais sans autres manifestations comportementales notables. La voute plantaire des pattes arrière du rat sera soumise à un stimulus thermique, qui va déclencher le retrait de la patte. La douleur reste modérée car les animaux ont la possibilité d'échapper à la stimulation en retirant leur patte, l’animal n’étant pas contraint. Le modèle de douleur post-opératoire, équivalent à la suture d’une plaie superficielle aux urgences de l’hôpital sous anesthésie locale, induira une douleur locale pendant 2 à 3 jours avec un pic de douleur à 24h. Une éventuelle infection au site d’incision ou une désunion de la cicatrice seront à surveiller ainsi que des comportements d’automutilation au niveau de la plaie.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue des procédures, soit parce que l’étude est terminée et qu’ils ne pourront pas être ré-utulisés dans une autre procédure, soit pour réaliser des prélèvements sanguins pour doser les substances actives dans le plasma.

Remplacement

La douleur est un phénomène très complexe. C’est une expérience sensorielle et émotionnelle désagréable, associée à une lésion tissulaire. Le stimulus générant la douleur va activer les terminaisons nerveuses de neurones spécialisés dans la perception de la douleur. Ce signal se propage ensuite le long des fibres nerveuses jusqu’à la moelle épinière et le cerveau. Il existe dans le cerveau et la moelle un puissant système de contrôle de la douleur qui fait notamment intervenir des endorphines et régule le transfert des informations douloureuses en provenance de la périphérie. Cette complexité est actuellement impossible à modéliser in vitro ou in silico et le recours à l’animal est incontournable pour évaluer nos nanomédicaments sur la douleur. Le rat constitue un bon modèle d’étude de la douleur car il possède une organisation nerveuse comparable à celle de l’homme. Les modèles de douleur inflammatoire sont validés par la communauté internationale (International Association for the Study of Pain, IASP)

Réduction

Le dimensionnement des groupes expérimentaux a été réalisé à l’aide d’un logiciel de statistique qui permet de déterminer le nombre juste et minimal d’animaux qui garantira la validité statistique de l’étude. Un plan d’expérience a été construit afin de réduire au maximum le nombre d’animaux. Les animaux seront répartis dans les groupes expérimentaux de manière aléatoire. L’attribution des traitements se fera en simple aveugle pour éviter les biais expérimentaux. Si les traitements innovants testés ne présentent pas l’effet analgésique escompté l’étude s’arrêtera là. Pour l’étude de pharmacocinétique, afin de réduire le nombre d’animaux, plusieurs prélèvements sanguins seront réalisés sur le même animal dans la limite du volume maximal prélevable en 24h. L’étude de biodistribution se fera en imagerie par fluorescence ce qui permettra un suivi longitudinal des animaux et de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

La semaine précédent la mise en place du modèle, les rats seront manipulés tous les jours et habitués aux gestes de la procédure afin de minimiser le stress le jour de la procédure expérimentale. Les injections, lesprélèvements et la chirurgie se feront sous anesthésie générale associée quand cela est possible à une anesthésie locale (quand pas d’interférence entre le traitement et l’anesthésique). Notre modèle de douleur inflammatoire et post-opératoire induit une douleur modérée dans la patte qui est raisonablement bien supportée par l’animal. Dans les tests utilisés pour évaluer la sensibilité nociceptive, l’animal n’est pas contraint pendant les mesures et l’intensité de la stimulation est progressivement augmentée jusqu’à une valeur minimale seuil pour déclencher la réaction nociceptive et donc le retrait de la patte. La stimulation n’est jamais poursuivie au-delà. Pour des raisons scientifiques évidentes, les anti-douleurs et les anti-inflammatoires ne peuvent pas être utilisés. Toutefois, une grille de score permettra de suivre l’état général des animaux et de définir des points limites qui seront strictement appliqués. Les animaux seront stabulés en groupes sociaux, dans un environnement enrichi afin de favoriser un comportement naturel.

Choix des espèces

Cette étude sera effectuée sur des rats car c’est l’espèce de référence dans la littérature pour les études sur la douleur. Les rats sont calmes, faciles à manipuler et s’acclimatent progressivement à l’expérimentateur. L’étude de biodistribution sera menée sur des souris afin de pouvoir réaliser une étude longitudinale en imagerie de fluorescence, les rats étant trop grands pour être imagés en entier dans l’appareil d’imagerie. Nous utiliserons des rats et des souris adultes car la population cible est adulte.