Souris

510 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle d'un transporteur dans la formation de la myéline. Une partie reçoit cinq injections de tamoxifène puis subit une lésion chirurgicale de la moelle épinière sous anesthésie, l'autre, âgée de cinq jours, reçoit les injections avant d'être tuée à divers stades du développement. Le porteur signale des douleurs post-opératoires, un risque d'hémorragie et d'hypothermie et des hématomes liés aux injections répétées, avant prélèvement des tissus. Il présente les modèles murins comme "indispensables" au motif que les cultures et les invertébrés ne reproduisent pas la myélinisation.

Objectifs

Notre projet vise à mieux comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués dans le contrôle de la formation de la gaine de myéline qui protège les neurones dans le système nerveux central. Dans des conditions pathologiques, la formation d’une nouvelle myéline, processus appelé remyélinisation, est importante pour protéger les fibres nerveuses d’une dégénérescence et pour restaurer la conduction rapide de l’influx nerveux. La myélinisation et la remyélinisation sont des processus contrôlés par de nombreux facteurs et signaux, qui sont souvent altérés dans plusieurs maladies comme la sclérose en plaques. Notre hypothèse est que le lactate, via son transporteur, est une source énergétique importante pour la myélinisation et de la remyélinisation. L’objectif de notre projet est de déchiffrer le rôle de ce transporteur dans le processus de la myélinisation dans des conditions physiologiques et pathologiques afin de développer de nouvelles stratégies de thérapie régénérative pour les pathologies de la myéline. L’étude sera menée sur des souris portant des modifications génétiques qui perturbent le fonctionnement de ce transporteur ainsi que sur des souris contrôles. L’étude nous permettra de mieux comprendre l’implication de ce transporteur ainsi que son rôle dans la réparation des lésions de la myéline.

Bénéfices attendus

Il est nécessaire afin de mieux comprendre les mécanismes pathologiques dans les maladies demyélinisantes du système nerveux central, telle que la sclérose en plaques pour laquelle les thérapies régénératives sont encore limitées. Nos recherches pourraient ainsi contribuer au développement des nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Nous utiliserons des souris afin de déterminer le rôle d’une protéine qui semble impliquée dans le processus de myélinisation du système nerveux central. Pour cela nous réaliserons une étude du processus de réparation des lésions de la myéline ainsi qu’une étude au cours du développement du système nerveux central de la souris. Nous allons (objectif 1) réaliser 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; volume injecté déterminé par pesée quotidienne de l’animal), puis 48h après la dernière injection, nous induirons une lésion de la moelle épinière, sous anesthésie générale et analgésie (une lésion par animal). Cette opération dure 20-30 minutes par souris. Nous utiliserons 210 animaux pour cette étude. La durée totale de la procédure sera au maximum de 30 jours. Après euthanasie des animaux, on procèdera à la récupération des tissus d’intérêt en vue de leurs analyses. Pour l’étude de cette protéine au cours du développement (objectif 2), nous utiliserons 300 animaux. Les animaux, âgés de 5 jours, recevront 5 injections de tamoxifène (une injection par jour durant 5 jours ; chaque injection durant environ 15 secondes). Ils seront ensuite euthanasiés à différents temps expérimentaux afin d’analyser l’impact de la délétion de cette protéine sur la myélinisation.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sur les animaux sont majoritairement liées à la chirurgie (lésions démyélinisantes): hypothermie, hémorragie, risque anesthésique, douleurs post-opératoires. Un stress peut aussi être observé chez l’animal à cause de la contention quotidienne et de l’injection d’un produit. Il est notamment possible d’observer l’apparition d’hématomes dus à l’injection répétée de ce produit.

Devenir

Les prélévements et analyses seront réalisés en post-mortem ; cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.

Remplacement

Les études in vitro et sur animaux invertébrés ne permettent pas l’étude de processus biologiques complexes comme le processus de myélinisation au cours du développement ou la réparation des lésions de la myéline. Le rongeur est donc l’une des espèces les plus appropriées pour ce type d’étude car il présente un système nerveux myélinisé comme chez l’Homme.

Réduction

Le nombre d’animaux est limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement significatives. Nous prévoyons l’utilisation de 210 animaux pour la procédure de démyélinisation focale afin d’évaluer la remyélinisation et 180 animaux pour réaliser l’étude développementale. Lors de l’étude étude développementale le génotypage des animaux ne pouvant être réalisé avant leur utilisation ; la génération des lots expérimentaux nécessitera l’utilisation de 300 animaux. Soit un total de 510 animaux sur ce projet.

Raffinement

Les conditions d’hébergement (température, hygrométrie, éclairage, bruit et espace) et les conditions d’enrichissements de l’environnement (maison et matériel papier-coton, animaux hébergés en groupe), d’alimentation et de soins quand nécessaire (directive européenne 2010/63/UE) seront contrôlées. Pour éviter toute souffrance aux animaux durant les procédures, ils seront sous analgésie pendant toutes les interventions quand cela s’avérera nécessaire. Durant la procédure de chirurgie, les animaux seront placés sous anesthésie. Les points limites sont ceux définis en amont. Les animaux seront suivis régulièrement par les utilisateurs ainsi que par notre vétérinaire désigné. L’euthanasie de l’animal sera réalisée si l’on observe l’un de ces critères absolus.

Choix des espèces

Pour comprendre le rôle d’une protéine d’intérêt dans la réparation de lésions de la myéline, il est nécessaire de réaliser des études in vivo en condition physiologique. L’utilisation de modèles murins, reproduisant certains aspects des pathologies de la myéline chez l’homme, est donc indispensable pour évaluer la fonction de notre protéine en contexte pathologique et pour identifier de nouvelles cibles d’intérêt thérapeutique. Les animaux utilisés seront âgés de 12 semaines, afin d’avoir atteint une maturité suffisante du système nerveux central (jeunes adultes). De plus, à cet âge, la chirurgie est facilitée par la relative faible masse musculaire des animaux.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le pouvoir pathogène de bactéries E. coli productrices de shigatoxines. Après un jeûne hydrique, elles reçoivent une à deux inoculations orales de bactéries puis subissent prélèvements de fèces, prises de sang et injections, le groupe infecté par des bactéries pathogènes développant faiblesse, diarrhée et déshydratation. Le porteur décrit des points limites et une mise à mort pour prélever les organes, et indique que le projet est financé par l'Argentine, où le syndrome hémolytique et urémique est le plus fréquent. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'est "suffisamment sophistiquée" pour simuler un organisme à plusieurs organes.

Objectifs

Certaines bactéries, appelées STEC, produisent des toxines particulières, qui leur confèrent la capacité à provoquer des infections chez l’homme. Les symptômes liés à ces infections vont de la diarrhée bénigne à des symptômes très graves : hémorragie intestinale, syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3-5% et plus d’un tiers des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La toxine produite par les STEC est une protéine formée non par la bactérie mais par un virus qui infecte cette bactérie (phage). Expérimentalement, chez la souris, une STEC infectée par le phage est pathogène. A l’inverse, les STEC chez lesquelles le phage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Lorsque les bactéries infectées par le phage se trouvent dans un organisme de mammifère et qu’un stress est induit, les phages sont libérés par la bactérie, peuvent atteindre les organes-cibles (ex : le rein), et produire la toxine qui induit des dommages. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans les infections causées par les bactéries STEC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans la production de la toxine dans l’organisme. L’utilisation de souris dépourvues de microbiote intestinal (axéniques) permettra de s’affranchir des interférences avec les bactéries de ce microbiote à deux niveaux : en évitant la transmission possible du phage à des bactéries du microbiote intestinal ; en évitant un « effet barrière » du microbiote intestinal à l’égard des STEC, qui affaiblirait leur pouvoir pathogène. Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certains symptômes. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5%) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique, en particulier lors d’infection par des denrées alimentaires contaminées. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant, ce qui explique que le présent projet soit financé par ce pays.

Procédures

En début de procédure, les souris sont soumises à un jeûne hydrique de 4 heures, suivi d’une inoculation par voie orale. Les souris ont au maximum 2 inoculations orales à 30 min ou 24 heures d’intervalle. Puis des prélèvements de fèces sont effectués quotidiennement pendant 7 jours. Les animaux auront un prélèvement de sang qui dure 30 secondes environ. Les animaux recevront deux injections qui dureront moins de 30 secondes. Des organes et du sang seront prélevés après analgésie et anesthésie profonde (sans réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant les bactéries sans phage sont réduites. L’inoculation par voie orale sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les injections seront également réalisées par du personnel très expérimenté. Les nuisances attendues dans le groupe recevant les bactéries avec phage, donc pathogènes, sont : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures seront mises en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition de symptômes. Des points limites ont été identifiés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Ceci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus sur lesquels seront pratiquées différentes analyses.

Remplacement

L’analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience argentine dans le domaine étudié permet de considérer que 10 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe dans tous les groupes. Dans les groupes inoculés avec la bactérie pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si l’euthanasie est trop précoce, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 30 souris supplémentaires, qui seront utilisées si nécessaires. Au total, nous prévoyons d’utiliser 110+30=140 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus par cages, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, buchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher et hamac dans lequel se percher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement bénéficié les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue. De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté aux souris si elles montrent des signes de déshydratation. Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite de possibles symptômes et décider d’une euthanasie anticipée si les points limites sont atteints. Les bactéries seront administrées par voie orale à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Toutes les injections seront effectuées par du personnel expérimenté. Préalablement à l’euthanasie des souris, de puissants antalgiques et analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris de 3 semaines (semaine suivant le sevrage). Chez l’être humain, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants. Nous utilisons en part égale des souris mâles et femelles car la maladie touche indifféremment les deux sexes.

190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une à quatre immunisations par injection sous anesthésie et autant de prélèvements de sang, pour recréer des expositions successives à des pathogènes et étudier la maturation du système immunitaire. Le porteur annonce peu de douleur, avec une perte de poids transitoire et parfois du sang dans les fèces, puis une mise à mort pour prélever les organes. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode ne reproduit ce qui se passe dans un "organisme entier" et conclut au caractère "obligatoire" du recours à la souris.

Objectifs

Au cours de sa vie, l’Homme est infecté par une quantité d'agents pathogènes (bactéries, virus, etc…). Cette exposition aux microbes de l’environnement, façonne notre système immunitaire au cours du temps et modifie probablement ces propriétés. Cependant, de façon surprenante, la majorité des études sur le système immunitaire sont basés sur des souris élevées dans des conditions d’hygiène très strictes et très contrôlées. Ces animaux exemptes de pathogènes sont actuellement la référence pour les études scientifiques et pour les tests précliniques. Récemment, plusieurs travaux suggèrent que l'élevage de souris dans un environnement sans agents pathogènes a des effets importants sur l’état de maturation du système immunitaire. En effet, il a été montré que le système immunitaire des souris de laboratoire est proche de celui d’un nouveau-né, alors que le système immunitaire de souris vivants dans la nature est lui, proche et représentatif d’un humain adulte. Dans ce contexte, les différences observées entre souris de laboratoire et souris issues de milieu sauvage, font des souris de laboratoire un modèle inadapté pour les études précliniques et soulignent la nécessité de nouveaux modèles murins qui intègrent des variables environnementales. Ainsi, ce projet vise à tout d’abord à comprendre l’impact, sur le système immunitaire, d’une exposition successive à différents pathogènes qui mimerait ce que l’Homme subit au cours de sa vie. Puis, dans un second temps, ce projet permettra également mieux comprendre les maladies liées à un dérèglement du système immunitaire comme les maladies auto-immunes et le lupus en particulier.

Bénéfices attendus

Cette étude originale permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires anti-infectieuses et d’améliorer les modèles murins actuels de maladie humaine. En effet, ce projet permettra de développer un modèle murin reflétant plus justement le système immunitaire humain adulte et qui intègre des variables environnementales. De plus, les résultats obtenus permettront de mieux caractériser les dysfonctionnements du système immunitaire liés aux pathologies auto-immunes comme le lupus.

Procédures

Les animaux seront soumis à des immunisations (injections, 10 secondes) 1seule fois/animal, ou 4 fois/animal et seront réalisées sur animaux anesthésiés . Des prélèvements de sang seront réalisés sur animaux anesthésiés (10 secondes - 1 seule fois/animal , ou 4 fois/animal avec un mimimum de 14 jours d'intervalle entre les 2 prélevements).

Impact sur les animaux

Peu de douleur est attendue au cours des procédures réalisées. Peu de douleur également attendue au cours des prélèvements de sang. Cependant, une legere perte de poids transitoire peut etre observé après immunisation. De facon rare, des féces molles ou du sang dans les feces peuvent également être observé au cours de la procédure.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort afin de prélèver les organes et d'étudier plusieurs paramètres immunologiques.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre comment une exposition antérieur à des pathogenes peut génerer des cellules spécifiques protectrices qui vont infiltrer les tissus et y résider de facon permanente. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour comprendre ce mécanisme.

Réduction

Un nombre minimum de souris nécessaire à une analyse statistique sera utilisé en prenant en compte la variabilité inter-individuelle. Ainsi, 5 animaux par groupe seront néccessaire. Un test statistique sera réalisé permettant la comparaison de 2 groupes avec un faible nombre d’échantillons, et aucune hypothèse n'est présupposée.

Raffinement

Une semaine d'acclimatation sera réalisée avant la mise en place de chaque expérience. A la réception, des groupes seront réalisés et maintenus tout au long de la procédure pour créer des groupes sociaux et éviter le stress dû à l'isolement. Des enrichissements de l’environnement (composants de nidification et igloo) seront apportées. Précautions particulières : - Immunisation par les différents pathogenes : Les immunisations sont réalisées sous brève anesthésie. Aucun signe clinique, n’est attendu suite à l’immunisation. Néanmoins, afin de s’assurer qu’aucun signe de souffrance ne soit observé, les animaux seront pesés quotidiennement les 7 jours suivant l'immunisation et feront l’objet d’une surveillance dans les minutes qui suivent l’injection, le lendemain, puis chaque semaine.

Choix des espèces

Parmi les différentes espèces animales utilisées en expérimentation, la souris est l’animal le mieux adapté pour le développement de modèles immunologiques. En effet, bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Les souris seront âgées de 6-10 semaines au démarrage de l’expérience car le système immunitaire de ces animaux doit être complètement mature et non vieillissant.

3 425 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier les protéines des synapses dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Une partie sert à créer et maintenir les lignées et reste vivante à l'animalerie, l'autre est tuée après biopsie de l'oreille, gavages et prélèvement du cerveau. Le porteur signale qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs vers 7 à 8 mois. Les bénéfices thérapeutiques annoncés sont renvoyés au 'moyen/long terme'.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Nous voulons identifier comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses mais également qui produit ces protéines : le neurone lui-même, ou l’astrocyte, connu pour son interaction étroite avec les synapses. Nous utiliserons des souris P301S, l’un des rares modèles de MA à reproduire la perte synaptique comme observée dans la MA. J'analyserai les protéines synaptiques spécifiquement produites par des neurones ou par des astrocytes chez ces souris. Cette étude nous permettra d'identifier précisément comment ApoE4 et les microglies modifient les protéines dans les synapses endommagées par la MA, ainsi que l'origine cellulaire de ces protéines (neurone ou astrocyte).

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver un échange astrocyte/synapse physiologique et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.

Procédures

- Une biopsie rapide de l'oreille (2 secondes) - Des traitements par gavage oral 1 fois/24 h pendant 5 jours continus, et dans une diète purifiée pendant un mois et dans l'eau de boisson pendant 2 semaines) - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injection (unique).

Impact sur les animaux

Le gavage oral ne se fait pas sous anesthésie mais sera fait par des experts animalier afin de réduire le stress des souris lors de la procédure et seront faites sur un temps répété relativement court de 5 jours (un gavage par jour). Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables qui seront discutés dans la procédure et pour lesquels des points limites stricts seront établis. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement ANL.

Devenir

Pour la partie du projet permettant la création et maintien de lignées de souris à phénotype dommageable, une partie des souris sera gardée afin de maintenir les lignées à l'animalerie, l'autre partie sera utilisée pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus. Pour la partie du projet avec les traitements, perfusion et prélèvements des tissus, tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analyser.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants, ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.

Réduction

Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.

Choix des espèces

Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles. De plus, la dégénérescence synaptique responsable des troubles cognitifs dans la MA est très difficilement modélisable in vitro et nécessite des modèles transgéniques exprimant des protéines humaines mutées. Pour étudier l’impact d’ApoE4 sur la dégénérescence synaptique, nous utiliserons des souris sauvages et des souris génétiquement modifiées (P301S) exprimant la protéine tau humaine mutée. Ces souris développent une perte synaptique et des troubles cognitifs comme chez les patients MA. Les souris P301S croisées avec des souris transgéniques exprimant les isoformes humaines ApoE2, ApoE3 ou ApoE4 dans un précédent projet, seront utilisées pour l'étude. Pour la procédure 1, les souris seront utilisées pour la reproduction dès 8 semaines. Pour la procédure 2: - Toutes les souris de la procédure 2 seront traitées par gavage à l’âge de 4 mois permettant ainsi l’expression d'une molécule par les neurones ou par les astrocytes. - Une cohorte sera utilisée à 7 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte sera utilisée à 10 mois (avec traitements 1 mois et 2 semaines avant) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle

2 400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour optimiser des combinaisons de radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et immunothérapie. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau et des prises de sang sous anesthésie, les tumeurs pouvant former des nécroses et ulcérations douloureuses. Le porteur indique qu'environ 75 % des souris seront tuées après un point limite ou une progression tumorale dès la première procédure, le reste à l'issue de la seconde. Le modèle de souris immunocompétente est présenté comme 'indispensable' pour reproduire un 'organisme entier'.

Objectifs

Nous proposons d’optimiser les combinaisons à base de Radiothérapie avec des Nanoparticules et/ou des immunothérapies et/ou des chimiothérapies. L’efficacité de ces traitements sera évaluée par suivi du volume des tumeurs traitées et par étude de la réponse immunitaire à partir d’échantillons sanguins. L’objectif de ces expérimentations est de constituer des bases solides nécessaires aux développements d’essais cliniques en évaluant l’efficacité des combinaisons présentant les meilleurs efficacités en préclinique.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont cliniques avec l’optimisation et la sélection des meilleurs schémas de combinaison à base de radiothérapie, nanoparticules et ou immunothérapies pour traiter des cancers localisés ou métastatiques.

Procédures

- Injection sous cutanée de cellules tumorales - Prélèvement sanguin sous maxillaire - Ces deux types d’interventions seront réalisés sous AG gazeuse (Isoflurane 2.5%)

Impact sur les animaux

Les tumeurs formées par certains types de cellules peuvent former fréquemment des nécroses/ulcération en surface qui peuvent entrainer une douleur évaluable par palpation de la tumeur Aucun effet secondaire ou nuisance dû aux prélèvements sanguins en sous maxillaire n’est attendu. Ce geste est couramment réalisé par les membres de notre équipe.

Devenir

A l’issue de la procédure N°1 : environ 75% des animaux auront été mis à mort après atteinte d’un point limite ou parce que leur tumeur est en progression. Les 25 autres pourcents des animaux seront pris en charge dans la procédure N°2 A l’issue de la procédure N°2 : tous les animaux seront mis à mort.

Remplacement

Etant donné que nous allons évaluer l’effet de la radiothérapie sur l’activation de cellules immunitaires, il nous est nécessaire de réaliser notre étude sur des modèles animaux présentant un système immunitaire actif. Le REMPLACEMENT des animaux est donc impossible pour cette étude. Toutefois l’étude préalable des molécules d’intérêts sur des cellules en culture nous a permis de nous affranchir de l’utilisation d’animaux non justifiée (REMPLACEMENT)

Réduction

La formation de tumeur par les types de souris qui seront utilisés dans ce projet, se fait de façon homogène, permettant l’utilisation d’un nombre d’animaux relativement réduit pour répondre aux questions scientifiques posées. Afin de pouvoir traiter dans un même groupe des tumeurs de tailles comparables, il faut prévoir seulement 20% d’animaux supplémentaires au moment du greffage des tumeurs. L’utilisation de cellules de cancer de souris permet de pouvoir travailler avec des souris au système immunitaire actif sans entrainer de rejet des tumeurs. Ainsi, nous pouvons étudier les effets de nos traitements à la fois sur la croissance des tumeurs mais aussi sur les cellules immunitaires. Afin de garantir la fiabilité de nos résultats il est nécessaire de réaliser les expérimentations 3 fois.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe dans des cages de taille adaptées et en présence d’enrichissement (matériel leur permettant de constituer un « nid »). Les combinaisons des traitements par radiothérapie, nanoparticules, chimiothérapie et/ou immunothérapie ont déjà été réalisées dans ces conditions dans notre équipe sans entrainer de toxicités particulières. Cependant si des signes de douleur sont observés (animal prostré, perte d’orientation, perte de poids …), les animaux seront mis à mort par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. Toutes les manipulations susceptibles de générer de l’inconfort ou de la douleur aux animaux seront réalisées sous anesthésie générale. Des études préalables nous ont permis de définir les points limites les plus précoces afin d’éviter toute souffrance des animaux.

Choix des espèces

La petite taille des souris, leur grande fécondité, leur coût de production et d’entretien relativement peu élevé en font un animal de choix pour les laboratoires. De plus, le modèle de souris est indispensable car les expérimentations sur cellules en culture ne permettent pas de simuler la complexité d’un organisme entier, notamment dans les études impliquant l’activation du système immunitaire. La formation de tumeur par les souris qui seront utilisées dans ce projet est homogène et maitrisé par notre équipe. Ceci permet de limiter la quantité de souris injectées par des cellules tumorales pour constituer des groupes de traitement avec un volume de tumeur comparable. Les souris utilisées seront de 8 semaines minimum, âge adulte de manière à avoir un système immunitaire mature et un poids corporel plutôt stable > 20 g, ainsi qu’une bonne tolérance aux anesthésies, d’après les données de la littérature.

700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier l'épuisement des cellules immunitaires NK en contexte tumoral. Elles reçoivent des injections rétro-orbitaires et intraveineuses de cellules de lymphome, certaines lignées formant des tumeurs dans la rate, la moelle osseuse et le foie et provoquant des troubles locomoteurs des membres postérieurs dès le 14e jour. La rate est prélevée après mise à mort. Le porteur indique anticiper ces signes pour tuer les animaux avant leur apparition et évaluer leur état par un test d'agrippement aux barreaux de la cage.

Objectifs

Les cellules Natural Killer (NK) sont des cellules de l’immunité spécialisées dans la lutte contre les pathogènes intracellulaires (virus et bactéries) et contre les cellules tumorales. Au cours de la progression tumorale, les cellules NK perdent leurs fonctions de contrôle des cellules tumorales. Ainsi, ces dernières échappent alors au contrôle immunitaire et prolifèrent. Il a été mis en évidence que ce phénomène est induit lors d'une stimulation chronique des cellules NK par les cellules tumorales. Cette stimulation chronique mène à l'activation chronique d'un flux calcique . Ce flux calcique chronique conduit alors à la perte des fonctions des cellules NK (elles s'épuisent). Cependant, le calcium entre en jeux dans de nombreux mécanismes intracellulaires et les mécanismes sous-jacents menant à l'épuisement des cellules NK restent inconnus. L'objectif de ce projet est d'étudier le rôle dans l'épuisement des cellules NK de différents acteurs du flux calcique afin de générer des cellules NK résistante à cet état dans le but de concerver des fonctions de contrôle des cellules tumorales. Pour cela, un modèle établi d'épuisement des cellules NK chez la souris sera utilisé. Celui-ci est basé sur 4 lignées de lymphomes (appelées RMA) stimulant plus ou moins fort les cellules NK (RMA : peu stimulante ; RMA-Rae-1b : plus stimulante que les RMA ; RMA-KO : plus stimulantes que les RMA-Rae-1b et RMA-KR : très fortement stimulantes). Ces 4 lignées tumorales permettent la génération de cellules NK avec un profil d'épuisement plus ou moins prononcé permettant ainsi d'étudier le rôle de différents acteurs à la fois dans l'établissement ainsi que le maintien de l'épuisement des cellules NK. Pour cela, les gènes testés seront inactivés dans des cellules NK primaires. Ces cellules modifiées seront re-transférées dans des souris receveuses de souche Rag2-/-yc-/- ne possédant pas de cellules NK. Ces souris recevront alors les différentes lignées tumorales et la fonction des cellules NK sera évaluée.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d'étudier et de trouver des cibles permettant de bloquer l'épuisement des cellules NK en contexte tumoral. Des résultats satisfaisant pourraient ouvrir des profits scientifiques en santé humaine notamment dans le cadre de thérapies cellulaires utilisées dans le traitement des cancers. Ces résultats pourraient ainsi avoir une portée à moyen-long terme au vu des nombreuses étapes nécessaires avant l'élaboration d'un traitement applicable en santé humaine.

Procédures

Les injections rétro-orbitales seront réalisées sous anesthésie à l'isofluorane et de la Tétracaïne sera appliquée. L'anesthésie dure 2 minutes alors que la réalisation de l'injection rétro-orbitale dure moins d'une minute. Les injections intra-veineuse seront réalisée sur des souris mises sous lampes chauffantes durant 20 minutes, dans la veine caudale sur souris vigile, geste durant moins d'une minute.

Impact sur les animaux

Ce modèle d'étude a été mis au point et est finement caractérisé . Cette connaissance approfondie permet de prédire les jours auxquels les cellules NK sont épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. Les complications éventuelles peuvent être liée à l’injection des cellules tumorales si celle-ci se passe mal (injection intra-dermique ou veine caudale transpercée empêchant l'injectionen intra-veineuse). En effet, lors d'une injections IV, les cellules de type RMA forment des tumeurs de façon concommitante dans la rate et la moelle osseuse puis dans d’autres organes tels que le foie, ce qui est source de souffrance pour l'animal. D’après les connaissances de ce modèle, les souris injectées avec les lignées tumorales RMA-KR présentent des troubles locomoteurs des membres postérieurs à partir du Jour 14 post-injection (premier signe visible). Ceci, ainsi que la validation du test d'aggrippement aux barreaux de la cage permet l'évaluation de leur état de santé. Cependant, cette connaissance approfondie du modèle permet d'anticiper ces signes précoces et ainsi de réaliser l'expérience avant même l'apparition des ces signes tout en ayant des cellules NK épuisées.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude ou avant si un point limite est atteint. Nous prélevons la rate des souris, organe riche en cellules NK, afin de réaliser nos analyses, il est donc impossible de ne pas sacrifier les animaux.

Remplacement

Les gènes candidats sélectionnés l'ont été sur la base d'expériences in vitro sur des modèles d'épuisement très simplifiés (ne comportant pas de cellules tumorales). Afin de tester la relevance physiologique réelle de ces candidats il est nécessaire de passer par un modèle d'étude chez l'animal afin de prendre en compte les multiples interaction cellulaires ainsi que l'environnementales mises en jeux lors d'une réponse anti-tumorale.

Réduction

La réalisation de la première procédure permettra d'obtenir des résultats interprétables sur les animaux inclus dans les procédures 2 et 3. La procédure 3 étant conditionnée aux résultats obtenus au cours de la procédure 2, cela permet de réduire potentiellement le nombre d'animaux utilisés. Un test statistique permet de limiter le nombre d'animaux à 10 par groupe. Les expériences n'auront ainsi pas besoin d'être répétées en suivant cette approche statistique, dans un but de réduction. Les groupes étant homogènes cela participe à un effort de réduction car les expériences ne seront pas répétées. Enfin l'utilisation de souris d'un large éventail d'âge et indépendamment de leur sexe supporte le but de réduction.

Raffinement

Ce modèle d'étude a été mis au point finement caractérisé. Cette connaissance approfondie permet de prédire les jours auxquels les cellules NK sont épuisées tout en limitant la souffrance des animaux. Les souris développent une gène des fonctions locomotrices postérieures due à la pousse tumorale dans la moelle osseuse. Ce signe précoce précède la dégradation de l'état général de l'animal. D’après les connaissances de ce modèle, les souris présentant ce signe précoce possèdent des cellules NK épuisées. En cas d'apparition de ce signe sur un animal avant le jour prévu de mise à mort, tout le groupe sera mis à mort. Les groupes étant très homogènes, un tel mode opératoire permet d'obtenir des données interprétables et donc de réduire la variation intra-expérience. Enfin, afin de parer à toute éventualité, les expérimentateurs se tiedront prêt à réaliser l'expérience les jours précédant la mise à mort. Une anesthésie à l'Isofluorane sera effectuée lors de l'injection des cellules NK génétiquement modifiées par voie rétro-orbitale dans le but de réduire le stress des souris. De plus, des visites seront effectuées tous les trois jours au début du protocole puis une surveillance accrue, visite matin et soir, sera réalisée les 3 jours précédents la date de mise à mort des animaux dans le but d'anticiper le moindre signe de souffrance. Enfin, des croquettes humidifiées seront placées dans la cage afin d'en facilité l'accès par les animaux. Des points limites prédictifs de la pousse tumorales ont été établis. Si une souris présente un des ces points limites, l’ensemble du groupe sera mis à mort.

Choix des espèces

Les cellules NK ne sont présentes que chez les mammifères. Parmi ceux-ci, la souris est un modèle de choix. D'une part, et bien qu'il existe certaines différences entre l'immunologie murine et humaine, d'innombrables découvertes chez la souris sont transposables chez l'homme. D'autre part, la richesse des souches murines génétiquement modifiées et des réactifs disponibles permet une compréhension très approfondie des phénomènes mis en jeu du niveau moléculaire au niveau de l'organisme, un atout déterminant dans ce projet. Des souris âgées de 8 à 28 semaines seront utilisées pour les expérimentations. Lors de l'établissement du modèle d'épuisement des cellules NK in vivo aucune différences n'a été observée dans cette tranche d'âge. De plus, c'est à partir de l'âge de 8 semaine que les souris ont un système immunitaire mature (ici elles n'en ont pas mais cela permet de comparer directement avec les résultats préliminaires).

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans un modèle de cancer du pancréas. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, cinq séances d'ultrasons sous anesthésie et cinq injections intrapéritonéales d'immunothérapie, les ultrasons pouvant provoquer une brûlure au niveau de la tumeur. Le porteur décrit des points limites liés aux brûlures, ulcérations et nécroses tumorales, traités par crème ou antidouleur puis par mise à mort si la douleur persiste. Les bénéfices annoncés pour les patients sont renvoyés au 'long terme'.

Objectifs

Alors que l’immunothérapie s’avère être un traitement efficace pour certains cancers, elle ne l’est pas pour le cancer du pancréas. Ce dernier est la deuxième cause de décès liée aux cancers en France. La chirurgie curative, à un stade précoce, est actuellement le seul traitement qui permet une survie à long terme, à environ 20% à 5 ans. L’environnement de la tumeur semble être responsable de cet échec. Il est proposé ici d’utiliser les ultrasons pour désorganiser cet environnement tumoral et permettre à l’immunothérapie de pouvoir atteindre la tumeur.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à long terme. Ce projet permettra par la suite que la stratégie ultrasons + traitement anti cancéreux soit testée en clinique. En cas de succès, ce serait une réelle avancée en termes de prise en charge des patients atteints de cancer du pancréas pour qui le taux de survie à 5 ans est très faible

Procédures

- une injection sous cutanée au niveau du flanc gauche, 30 secondes maximum - 5 traitements par ultrasons maximum 15 minutes sous anesthésie à raison d’un par semaine, - 5 injections intrapéritonéales d'immunothérapie à raison d’un par semaine dans l’abdomen, 30 secondes - 1 injection sous cutanée d’antidouleur dans l’abdomen (30 secondes) - Au maximum 14 pesées et mesures de la taille de la tumeur (1 min) à raison de deux par semaine.

Impact sur les animaux

Une perte de poids peut être envisagée (cumul de la pousse tumorale et des traitements). Une injection de cellules en sous cutané entrainant une croissance de tumeur peut rarement entrainer une gêne à la locomotion. Les injections intrapéritonéales hebdomadaires vont entrainer du stress (contention) et une douleur à l’injection. Le suivi tumoral au pied à coulisse sera réalisé sur les animaux en contention et donc générera du stress et éventuellement une douleur au niveau de la tumeur. Les animaux seront soumis à une anesthésie générale gazeuse et un traitement aux ultrasons une fois par semaine, les ultrasons pouvant induire une brûlure au niveau de la tumeur. Le traitement par anti PD-1 n’a pas montré jusqu’à présent d’effets indésirables chez la souris (pas de réaction auto immune).

Devenir

Suite à la procédure les animaux en études seront mis à mort pour les prélèvements de tumeurs soit 48h après le deuxième traitement soit en fin d’étude.

Remplacement

Plusieurs informations ont été données via des études de culture de cellules : les effets des ultrasons sur l’élasticité de la tumeur, amélioration de la diffusion de drogue après traitement aux ultrasons. Les paramètres de traitement aux ultrasons ont été évalués par simulations informatiques. Cependant, les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes (la rate, les ganglions), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité). L’étude de l’efficacité de la combinaison ultrasons et immunothérapie ne peut se faire qu’au niveau de la tumeur dans son micro-environnement et avec ses interactions avec l’organisme entier.

Réduction

Le calcul du nombre d’animaux a été déterminé par un outil statistique et les résultats seront interprétés grâce à des tests statistiques.

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Des points limites détectés via une grille de score permettront, en fonction des observations, la mises en place de mesures : -Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. -En prévision d’éventuelles brûlures cutanées à cause de la cavitation, les souris recevront une injection d’antalgique au préalable du traitement aux ultrasons. - Les animaux seront placés sur litière en cellulose pour éviter toute uclération, irritation ou nécrose des tumeurs des animaux, si malgré la litière suite au traitement une irritation est observée on appliquera en transcutané sur 7 jours de la crème Dermaflon pour soulager la brûlure. - En cas de douleur observée via les critères de la grille de scoring et via la palpation on administrera à nouveau selon la sévérité soit de la buprénorphine soit du paracétamol sur 48h. Si malgré le traitement antidouleur la douleur est toujours présente alors on euthanasiera les animaux. Si les tumeurs deviennent nécrotiques les animaux sont euthanasiés. Des prélèvements en cours d’étude et en point final (tumeurs) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés. Tous les animaux présentant une prise tumorale à la randomisation seront intégrés dans l'étude pour pallier d'éventuelles pertes lors des anésthésies ou à cause de l'atteinte de points limites. Nous possédons l’expertise en termes de technicité quant à la mise en place et le suivi du modèle de cancer du pancréas ainsi que pour l’administration de traitements

Choix des espèces

La souris est la plus petite espèce qui développe des tumeurs suffisamment grosses pour être traitées par ultrasons. La C57Bl/6 est choisie car nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et de modèles tumoraux murins. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs murines représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Nous avons choisi des souris âgées de 6 semaines au moment de l’implantation du modèle, car d’une part la prise tumorale est meilleure sur les individus jeunes, ce qui permet de diminuer le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part, le traitement débutera entre 7-8 semaines, 7 semaines étant l’âge auquel leur système immunitaire est mature, et donc en action.