Souris

458 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le rôle de la protéine ApoE4 dans la dégénérescence des synapses. Elles reçoivent une injection rétro-orbitaire et sept injections sous-cutanées, ainsi qu'un régime déplétant les microglies pendant un mois, avant mise à mort pour prélever le cerveau. Le porteur signale que les injections rétro-orbitaires peuvent provoquer une cécité ou une tumeur locale et qu'environ 15 % des souris du modèle développent une paralysie des membres postérieurs. Les bénéfices thérapeutiques sont renvoyés au 'moyen/long terme'.

Objectifs

La maladie d'Alzheimer (MA) est la principale maladie neurodégénérative dans le monde et pour laquelle il n’existe aucun remède à ce jour. Dans la MA, les synapses (zone de contact entre deux neurones où a lieu la transmission du message nerveux) dégénèrent progressivement, menant aux troubles de mémoire bien connus dans la MA. L'apolipoprotéine E (ApoE) est une protéine essentielle aux fonctions synaptiques. L'isoforme E4 d’ApoE (ApoE4) augmente fortement le risque de développer la MA. Bien que nos études précédentes aient pu montrer qu’ApoE4 exacerbe la perte synaptique, on ne se sait pas exactement comment. Déterminer comment ApoE4 contrôle la dégénérescence des synapses dans la MA est essentiel pour comprendre la maladie, mais nécessite une caractérisation fine des fonctions ApoE4 au niveau des synapses. Ce projet testera l'hypothèse selon laquelle ApoE4 aggrave la perte synaptique dans la MA par l’intermédiaire des astrocytes (cellules nourricières des synapses) et des microglies (cellules immunitaires du cerveau). Le rationnel derrière cet objectif est d'identifier les protéines à l'interface astrocytes/synapses et comment elles sont affectées par ApoE4 et les microglies. Pour cela, nous marquerons et identifierons les protéines à l'interface neurone-astrocyte. Nous utiliserons des souris transgéniques P301S qui reproduit la dégénérescence synaptique comme observée chez les patients MA.

Bénéfices attendus

Nous espérons que ce projet nous apportera : A court/moyen terme : Une meilleure compréhension des mécanismes fondamentaux menant à la dégénérescence synaptique dans la MA et le rôle d’ApoE4, des astrocytes et des microglies dans ce processus pathologique. A moyen/long terme : Le développement de stratégies thérapeutiques originales et innovantes basées sur la régulation des activités d’ApoE4 et des microglies pour préserver l'interaction astrocyte/synapse et qui pourraient apporter des solutions thérapeutiques chez l’homme. La population européenne vieillissant, le nombre d'Européens atteints de la maladie d'Alzheimer doublera presque d'ici 2050, soulignant l'urgence de développer des traitements efficaces pour arrêter ou au moins retarder la maladie d'Alzheimer avant qu'elle n'atteigne des proportions épidémiques. À cet égard, on estime qu'un traitement qui retarde l'apparition de la MA de 5 ans réduirait automatiquement le nombre de cas de 50 %.

Procédures

- Une injection rétro-orbitaire et 7 injections sous-cutanées - Une euthanasie sous anesthésie/analgésie par injections IP et sous-cutanée (unique) - Une diète spéciale permettant la déplétion des microglies (1 mois).

Impact sur les animaux

Il n’y pas d’effets indésirables attendus sur les animaux liés à l’utilisation des traitements proposés (diètes). Les interventions telles que les injections rétro-orbitaires et la perfusion intra-cardiaque seront réalisées sous anesthésie. Suite aux injections RO, les souris pourraient développer de possibles effets indésirables comme un gonflement autour du site d'injection, une exophtalmie, un traumatisme oculaire, une cécité ou encore une croissance tumorale localisée. En ce qui concerne les injections sous-cutanées, elles seront faites sur un temps répété relativement court de 7 jours (une injection par jour) mais pourraient engendrer des plaies ou nécroses. Les souris porteuses du transgène P301S peuvent développer plusieurs phénotypes dommageables. Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par surdosage anesthésique suivi d'une perfusion intracardiaque.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour prélever le cerveau qui doit être analysé.

Remplacement

Bien que des progrès considérables aient été faits dans la modélisation des pathologies à l’aide de systèmes cellulaires et moléculaires innovants (cellules iPS et système CRISPR/Cas9), ces modèles n’offrent que des informations "physiopathologiques" très partielles. Il est encore à ce jour indispensable d’utiliser des animaux pour mieux appréhender la complexité des interactions cellulaires et moléculaires et développer de nouvelles thérapies adéquates pour traiter des maladies neurodégénératives comme la maladie d'Alzheimer. En ce sens, la dégénérescence synaptique est très difficile à obtenir in vitro. Ces souris P301S représentent un modèle de choix pour l’étude de la maladie d’Alzheimer car c’est l’un des rares modèles de la MA qui développent une dégénérescence synaptique et une atrophie cérébrale, comme observées chez les patients MA et responsables des troubles cognitifs. Puisque le but principal est de comprendre et combattre la dégénérescence synaptique dans la MA, nous devons utiliser un modèle qui développe une perte synaptique similaire à celle présente chez les patients atteints de la MA. Les modèles MA in vitro (culture cellulaire ou organoïdes) actuels ne développant pas (ou très peu) de perte synaptique, nous nous tournons donc vers ce modèle murin.

Réduction

Afin de calculer au plus juste l'effectif des lots d'animaux, nous avons effectué un calcul des effectifs nécessaires grâce à plusieurs tests statistiques. Du fait de la variabilité pathologique précédemment rapportée entre mâles et femelles dans le modèle P301S, nous n’utiliserons que les mâles afin de réduire la variabilité au sein des groupes et ainsi le nombre d’animaux utilisés. Nous utiliserons les mâles car ils développent une perte synaptique plus tôt par rapport aux femelles. Les seules femelles utilisées seront celles nécessaires à la création et au maintien des différentes lignées de souris pour la reproduction. Nous avons conscience que l’utilisation des deux sexes serait un atout scientifique mais le nombre d’animaux nécessaires serait bien trop important d’un point de vue éthique. Nous proposons donc de faire cette étude exploratoire chez les mâles. Dans le futur, lorsque les mécanismes liant ApoE4 à la perte synaptique seront établi chez les mâles, nous ferons une nouvelle demande auprès du comité d’éthique afin de confirmer (ou non) les résultats principaux découverts chez les mâles sur une petite cohorte de femelles.

Raffinement

Les souris seront hébergées sous environnement contrôlé, dans des cages avec un environnement enrichi (alternance entre dômes de plexiglass et dômes en papier, accompagné de Nestlets en coton). Les animaux seront sous la responsabilité de personnels animaliers expérimentés. Une observation quotidienne des animaux sera effectuée pour s’assurer de leur bien-être. Les souris peuvent perdre du poids avec le traitement; Au-delà de 20% de perte de poids pendant l'expérience, la souris sera euthanasiée. Les souris P301S développant des phénotypes dommageables, des points limites stricts seront établis afin de réduire les nuisances causées aux animaux. Pour ces points limites, l’animal sera euthanasié. Environ 15% des souris P301S développeront une paralysie des membres postérieurs à partir de l'âge de 7-8 mois.

Choix des espèces

Les souris P301S constituent des modèles de choix pour notre travail car elles sont couramment utilisées comme modèles de la MA, ainsi que comme modèle pré-clinique pour tester des molécules thérapeutiques potentielles puisqu'elles développent de la perte synaptique et des troubles cognitifs. - Toutes les souris du projet seront injectées via injection retro-orbitaire à l’âge de 4 à 5 mois (sous anesthésie) permettant d'identifier les protéines à l'interface synapse-astrocyte. - Une cohorte (cohorte 1) sera utilisée à 7 mois (euthanasie et collecte des tissus) afin d'évaluer les stades précoces de la dégénérescence synaptique dans ce modèle - Une cohorte (cohorte 2) sera utilisée à 10 mois (euthanasie et collecte des tissus) afin d'évaluer les stades tardifs de la dégénérescence synaptique dans ce modèle

216 souris gestantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne de médicament et trois prises de sang sous anesthésie entre le 11e et le 15e jour de gestation, puis sont tuées au 15e jour pour analyser les placentas et les fœtus. Le projet cherche une preuve de concept qu'une classe de médicaments ralentirait la prééclampsie. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable grave et qualifie le modèle d'animal gestant d'"indispensable".

Objectifs

La prééclampsie est une malade spécifique de la grossesse potentiellement mortelle et pour laquelle il n'existe à ce jour aucun traitement curatif. L'objectif de ce projet est de faire la preuve de concept qu'un type de médicament est potentiellement intéressant pour ralentir l'évolution de la prééclampsie, en prouvant qu'il fonctionne sur les marqueurs de la maladie et qu'il n'est pas toxique pour le foetus. C'est une étape indispensable à nos travaux de recherche.

Bénéfices attendus

Il n’existe à ce jour aucun traitement de la prééclampsie en cours de grossesse. Cette maladie est pourtant potentiellement mortelle pour la mère et pourvoyeuse de grande prématurité. Le développement de médicament est une priorité de la recherche en médecine périnatale. C’est le bénéfice attendu de nos recherches : apporter la preuve de concept qu’une classe médicamenteuse permet de ralentir potentiellement l’évolution de la prééclampsie sans effets secondaires indésirables pour la grossesse.

Procédures

Durant le protocole expérimental, les animaux recevront une injection quotidienne de médicament. L’injection est un acte peu douloureux et peu stressant quand il est réalisé par un opérateur entrainé. Cette procédure est réalisée quotidiennement par un très grand nombre d’équipes de recherche. L’injection de médicament sera effectuée entre le 11e et le 15e jour de la gestation. Les prises de sang (réalisées 3 fois dans notre protocole de recherche, 11e, 13e et 15e jour de la gestation) seront systématiquement réalisées sous anesthésie générale pour limiter au maximum à la fois le stress et la douleur des animaux, et seront réalisées par un opérateur expérimenté.

Impact sur les animaux

Aucun effet secondaire, ni indésirable grave n’est attendu des gestes réalisés en cours de gestation (injection de médicament, prise de sang) au cours de notre protocole. De plus, les médicaments utilisés ont déjà été testés chez la souris pour d’autres applications et n’ont pas d’effets indésirables. Aucune procédure chirurgicale ne sera effectuée sur les animaux jusqu’au jour de l’euthanasie. Une grille de suivi quotidien sera mise en place afin d’évaluer le bien-être animal.

Devenir

Chaque animal sera euthanasié en fin de procédure au 5ème jour du protocole expérimental c’est-à-dire au 15e jour de gestation. Cette euthanasie se justifie par la nécessité d’une prise de sang maternel de plus gros volume et pour l’analyse systématique des placentas et des fœtus. Nos procédures d’analyse ne sont pas possibles après la parturition et la mise bas des portées, puisque nous apportons une attention toute particulière au placenta.

Remplacement

A ce jour, il n’existe pas de modèle permettant de remplacer l’interaction entre la mère, le placenta et le fœtus au cours de la gestation. C’est pourquoi en recherche en reproduction le modèle d’animal gestant reste indispensable pour tester l’efficacité de nouveaux médicaments en cours de gestation. De plus, cette étape expérimentale est incontournable pour repérer les éventuels effets malformatifs ou délétères pour la grossesse de classes médicamenteuses.

Réduction

Afin de limiter au maximum l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable testé nos hypothèses de travail et l’ensemble des molécules (leur efficacité et leur toxicité) sur des placentas humains. Le nombre de souris nécessaire dans l’étude, c’est-à-dire le nombre de souris dont nous avons besoin pour montrer une différence significative entre deux groupes est de 8 animaux par groupe. Ce nombre a été réduit à son maximum en tenant compte de la variabilité du nombre de fœtus par portée, de la variabilité des dosages sanguins et du fait que l’établissement éleveur ne nous assure pas de la gestation des animaux lors de la livraison (ce qui peut représenter 1/3 de l’effectif total des animaux qui se trouvent être non gestant). De plus, dans notre projet, nous avons prévu de tester 3 doses croissantes d’un médicament. Nous commencerons par tester la dose la plus faible et si celle-ci est suffisante pour observer des effets nous ne testerons pas les 2 doses plus fortes sur les souris afin de limiter au maximum leur utilisation.

Raffinement

Les animaux seront surveillés quotidiennement et ont à leur disposition des maisons en carton et du coton pour se créer des nids. Les critères objectifs de souffrance et/ou la détresse d’un animal seront quotidiennement évalués à l’aide d’une grille de suivi. Si une souffrance et/ou détresse est observée chez les animaux, des mesures seront mises en place (prise en charge médicamenteuse etc). Si malgré les mesures mises en place, l’animal atteint un point limite, c’est-à-dire que sa souffrance et/ou sa détresse dépasse un certain seuil défini au préalable, l’expérimentation sera interrompue pour cet animal immédiatement.

Choix des espèces

Le modèle murin est choisi pour plusieurs raisons : - Son type de placenta est proche de celui de l’espèce humaine - Les molécules responsables de la maladie humaine sont également retrouvées dans le sang maternel au cours de la gestation chez la souris. Les dosages de ces molécules chez la souris sont fiables et commercialisés. - Le modèle de gestation chez la souris est systématiquement utilisé en toxicologie de la reproduction pour étudier de potentiels effets délétères de classes médicamenteuses sur le developpement embryologique et fœtal.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une greffe de cellules tumorales sous la peau ou par voie intraveineuse, puis des séances d'imagerie sous anesthésie de 20 à 60 minutes, avec administration d'agents de contraste pour certaines. Le projet vise à mettre au point le suivi du développement tumoral par imagerie non invasive pour évaluer des molécules anticancéreuses. Le porteur décrit une mise à mort systématique à l'issue et un point limite fixé à 20 % de perte de poids ou à une tumeur atteignant 10 % du poids du corps.

Objectifs

Le cancer touche 382000 personnes par an et avec 157400 décès annuel, soit environ 40 % du total, il représente la première cause de mortalité en France. C'est surtout la première cause de mortalité prématurée (avant 65 ans). Un homme sur deux et une femme sur trois sont concernés, avec des localisations différentes selon le sexe : le cancer de la prostate est de loin le cancer le plus fréquent chez l'Homme avant le cancer du poumon et le cancer colorectal, et, chez la femme, le cancer du sein est le plus fréquent avant le cancer colorectal et le cancer du poumon. L'incidence globale du cancer augmente chaque année en raison du vieillissement de la population, de la généralisation des techniques d’exploration et de dépistage, et de causes environnementales. Grâce aux progrès de la prévention, du diagnostic précoce et de la prise en charge, le risque de mourir d'un cancer a diminué depuis 25 ans. Cependant, il n'en demeure pas moins un fléau déclaré priorité de santé publique. Les efforts de développement de nouvelles thérapeutiques doivent donc se poursuivre. Les deux premiers critères mis en jeu dans la sélection de nouveaux médicaments antitumoraux sont, d’une part, l’originalité du mécanisme d’action et, d’autre part, l’activité antitumorale expérimentale dans un modèle animal in vivo. En effet, afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques, il est indispensable de tester ces molécules chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer complètement la tumeur dans son microenvironnement et son évolution au sein d'un organisme vivant (prolifération, invasion, dissémination). Il existe cependant des modèles d'étude de clonogénicité, de migration et d'invasion cellulaires in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’homme). Ce projet s'intéresse au suivi du développement tumoral par des approches d'imagerie non-invasive afin d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques chez le petit animal (souris).

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet, en proposant l’exploration du développement tumoral par imagerie non-invasive, est de permettre (i) une détection précoce des tumeurs (avant qu'elles ne soient palpables), (ii) le suivi de la progression tumorale au cours du temps (croissance / invasion / dissémination), et (iii) la quantification 2D et/ou 3D des masses tumorales (tumeurs primaires et métastases). L'approche quantitative de l'évaluation de l'efficacité médicamenteuse dans le modèle animal sera abordée par le développement d'outils logiciels pour l'analyse d'images, visant à établir des biomarqueurs quantitatifs d'imagerie i.e. des signaux anatomiques, physiologiques, biochimiques ou moléculaires détectables en imagerie, afin d'améliorer le développement thérapeutique contre cette pathologie au sombre pronostic.

Procédures

Les animaux subiront une greffe de cellules tumorales par voie sous cutanée ou intraveineuse. Nous serons vigilants à intervenir au moindre signe de douleur ou si la taille de la tumeur devait impliquer le sacrifice des animaux. Les tumeurs sous cutanées, parfaitement accessibles, seront mesurées au pied à coulisse. Les tumeurs profondes (tumeurs pulmonaires) seront mesurées par imagerie non invasive. Certaines procédure d’imagerie (bioluminescence, tomographie de fluorescence moléculaire et tomographie par émission de positons) nécessiteront de leur administrer un agent de contraste par voie intrapéritonéale ou intraveineuse. Les autres procédures sont des procédures d'imagerie non invasive n'entrainant aucune douleur pour les animaux. Nous leur éviterons tout stress en les anesthésiant dès le début des sessions d'expérimentation. La durée de l’anesthésie pourra varier de 20 à 60 minutes en fonction de la modalité d’imagerie mise en œuvre.

Impact sur les animaux

Certaines procédures: transplantation sous cutanée ou intraveineuse de cellules tumorales, administration de traitements par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutanée, prélèvements sanguins (veine mandibulaire ou saphène) sont susceptibles d’induire un stress physique aux animaux. Pour le réduire, ces procédures seront mises en œuvre après anesthésie des animaux. L’apparition des tumeurs induites pourra également induire un stress physique et de la douleur. Ces nuisances potentielles nous conduisent à classer ces procédures en classe modérée.

Devenir

Les animaux utilisés dans ce projet auront tous subi une induction de tumeur par injection sous cutanée de cellules tumorales. Ils seront tous mis à mort à l'issue des différentes procédures d'imagerie mises en œuvre.

Remplacement

Il n’existe pas de modèle in vitro pouvant remplacer complètement la tumeur dans son microenvironnement et son évolution au sein d'un organisme vivant (prolifération, invasion, dissémination). Il existe cependant des modèles d'étude de clonogénicité, de migration et d'invasion cellulaires in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal.

Réduction

Ce projet s'intéresse au suivi du développement tumoral par des approches d'imagerie non-invasive afin d'évaluer l'efficacité de molécules thérapeutiques chez le petit animal (souris). Les mêmes animaux seront mis en œuvre sur les différentes modalités évaluées dans ce projet puisqu'elles sont atraumatiques et non destructrices y compris pour le suivi longitudinal de l'efficacité thérapeutique évitant ainsi de multiplier le nombre de lots d'animaux mis en œuvre pour la totalité du projet.

Raffinement

Tous les animaux sont hébergés selon les conditions de la réglementation en vigueur (directive européenne 2010/63, décret n°2013-118 du 1er février 2013). Tout animal présentant des signes de souffrance, de léthargie, d'hypothermie persistante, des difficultés respiratoires, une perte de poids supérieure à 20% ou une tumeur de volume supérieur ou égal à 10% du poids corporel ou ulcérée/infectée sera exclu de l’étude et sacrifié. Nous veillerons à ce que chaque cage bénéficie d’un enrichissement adapté (igloo, tunnel ou paper wool). Les animaux sont anesthésiés pour chaque procédure d'imagerie et une attention particulière est apportée au maintien de leur température corporelle pendant l'anesthésie.

Choix des espèces

Les petits mammifères, notamment la souris, sont à la base de la compréhension de la pathologie cancéreuse et se sont imposés comme modèles fondamentaux dans la recherche biomédicale. Ils sont d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules car, par la présence de gènes équivalents chez l'homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et apportent de nombreuses connaissances sur les relations entre les cellules tumorales et les tissus normaux, notamment le système immunitaire. Ils permettent également l'étude des phénomènes de vascularisation tumorale et de dissémination métastatique, et aident à la compréhension de la résistance des cellules aux traitements. De plus, ils présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation, et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Il est important de noter que les molécules utilisées actuellement en clinique, notamment en chimio- et immunothérapie, ont été découvertes ou évaluées sur ces modèles. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (~4-8 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. En effet, il est bien établi dans la littérature que l'induction tumorale par transplantation de cellules cancéreuses chez des animaux jeunes adultes est efficace, fiable et reproductible. Au-delà de cet âge, les tumeurs se développent plus lentement. Dans le cas de notre étude, ce stade de développement est en parfaite adéquation avec la pathologie humaine, notamment en lien avec ses similarités physiologiques et moléculaires. De plus, il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

6 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour vérifier l'innocuité d'un peptide destiné à un futur essai sur la maladie de Parkinson. Chaque animal subit 16 pesées, 10 injections quotidiennes et une sédation sous anesthésie. Les 3 souris ayant reçu le peptide seront tuées pour une autopsie des organes, les 3 autres réutilisées. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative pour démontrer l'innocuité et n'a prévu aucune analyse statistique vu le faible effectif.

Objectifs

La maladie de Parkinson fait partie des maladies neurodégénératives progressives qui affectent le système nerveux central entraînant la mort des cellules nerveuses. Elle est la deuxième maladie neurodégénérative en France et sa prévalence augmente fortement avec l'âge. Elle est associée à la perte de neurones dans le cerveau et dans les neurones survivants, on observe la présence d’amas de protéines qui perturbent leurs fonctionnements. La plupart des thérapies actuelles n'atteignent pas leurs cibles car elles sont incapables de traverser la Barrière Hémato-Encéphalique (membrane qui protège le cerveau des infections, des hormones et des toxines circulant dans le sang), elles procurent un soulagement temporaire des symptômes mais elles sont aussi accompagnées d’effets secondaires graves. Par conséquent, il existe un besoin urgent de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet s'inscrit dans la continuité d'une précédente étude qui démontrait la capacité ou non de peptides à passer la barrière hémato-encéphalique. Parmi dix peptides testés, nous avons démontré que trois peptides étaient capables de la passer. Parmi ces trois peptides, nous avons sélectionné un peptide candidat en raison de l'intensité et de la stabilité du signal de fluorescence dans le cerveau des souris à plus de 6 heures post-injection. Nous n'avons pas observé d'effets délétères de ce peptide chez la souris lors des études précédentes. Son efficacité thérapeutique va être prochainement testé dans un modèle de souris parkinsoniennes afin de montrer que son interaction, avec les protéines cibles, permet de stopper les symptômes (tremblements, raideur musculaire et instabilité de la posture). Nous souhaitons, avant de démarrer l'étude d'efficacité chez la souris parkinsonienne, confirmer l'innocuité de ce peptide suite à des injections répétées chez une souris non-parkinsonienne. L'objectif est de se calquer sur le schéma thérapeutique qui sera utilisé pour l'étude d'efficacité, nous utiliserons les mêmes modalités d'injection et de durée afin de démontrer l'innocuité du peptide.

Bénéfices attendus

Cette étude a pour but de démontrer l'innocuité du peptide avant d'initier une étude thérapeutique chez des souris ayant la maladie de Parkinson.

Procédures

Les souris seront soumise à un total de 16 pesées d'une durée de 30 secondes (1 pesée journalière de stress léger), à une injection journalière d'une durée de 30 secondes pour un total de 10 injection (stress et douleur légère) et à une sédation par anesthésie d'une durée de 5 minutes.

Impact sur les animaux

La préhension de l’animal pour les pesées quotidiennes peut induire un stress d'intensité faible d'une durée d'environ 30 secondes, au total les animaux auront 16 pesées. Les injections engendreront un stress et une douleur légère d'environ 30 secondes, au total les animaux auront 10 injections. Nous posons l'hypothèse que des effets indésirables de gravité légère à modérée pourront être observés (modification de l'apparence, perte de poids, inactivité ou une mobilité réduite), ces effets pourront être de durée variable allant de quelques minutes à plusieurs heures.

Devenir

Les 3 souris injectées avec le peptide seront mises à mort pour réaliser une autopsie macroscopique des tissus et organes.

Remplacement

L'objectif étant de démontrer l'innocuité du peptide chez la souris, il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, ceci impose d'avoir recours à des animaux.

Réduction

Nous avons réduit au maximum le nombre d'animaux, 3 souris par groupe. Aucune analyse statistique ne sera réalisée.

Raffinement

Les souris seront acclimatées durant 4-7 jours à l'animalerie avant d'être incluses dans la procédure. Les animaux seront suivis tout au long de la procédure et le registre de soins complété en se rapportant à la grille de soins.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris sauvages d'un fond génétique défini qui correspond à celui des souris développant la maladie de Parkinson. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 7 semaines, adultes et matures sexuellement, dont le poids varie entre 20-30 grammes. C'est l'âge des souris adultes couramment utilisées dans la littérature lors d'étude sur l'innocuité de médicament.

1 488 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau du flanc puis des injections intrapéritonéales de traitements anticancéreux trois fois par semaine pendant jusqu'à 112 jours, une partie recevant en plus des cellules immunitaires par la veine de la queue. Le porteur revendique la validation d'une protéine comme cible thérapeutique, les retombées pour les patients étant renvoyées au 'plus long terme' et à d'éventuels autres cancers. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode alternative ne reproduit des 'interactions physiologiques aussi complexes'.

Objectifs

Le mélanome cutané (15500 nouveaux cas par an en France) est un cancer issu des mélanocytes, cellules responsables de la pigmentation de la peau. Le pronostic de ce cancer diagnostiqué précocement est favorable mais au stade métastatique celui-ci reste très mauvais. Malgré les progrès dans le traitement des patients atteints de mélanome cutané métastatique avec les thérapies ciblées et les immunothérapies, plus de la moitié des patients développe des résistances. Les cellules de mélanome sont capables de s’adapter et d’échapper aux thérapies ciblées. De nouvelles approches thérapeutiques sont alors nécessaires afin de resensibiliser les patients aux traitements. Nous avons étudié le rôle d'une protéine d'intérêt sur les résistances des cellules de mélanome aux thérapies ciblées. L'objectif du projet est de valider, chez la souris, le mécanisme montrant la re-sensibilisation des cellules de mélanome aux thérapies ciblées.

Bénéfices attendus

Ce projet est essentiel pour évaluer l'implication de notre protéine d'intérêt dans la résistance des mélanomes aux traitements. La validation de cette protéine comme nouvelle cible thérapeutique permet de pouvoir proposer, à plus long terme, de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer le traitement des patients atteints de mélanomes métastatiques. La validation de notre protéine candidate dans le mélanome métastatique permettra d’étendre nos résultats à d’autres cancers dont les mécanismes de résistance sont similaires.

Procédures

Les souris seront soumise à une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile (non anesthésiée) puis à une administration par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) des différents traitements anticancéreux 3 fois par semaine jusqu’à 112 jours (16 semaines) maximum après l'injection des cellules. D'autre part, une partie des souris sera soumise à une injection de cellules en sous cutanée au niveau du flanc gauche sur souris vigile (non anesthésiée) ainsi qu’une injection intraveineuse de cellules immunitaires dans la veine caudale (veine située au niveau de la queue) puis à une administration par injection intra-péritonéale (au niveau de l'abdomen) des différents traitements anticancéreux 3 fois par semaine jusqu’à 112 jours maximum après l'injection des cellules.

Impact sur les animaux

Les souris seront soumises à des nuisances et des effets indésirables auxquels nous seront très attentifs. Ces effets indésirables pourraient être causés par la croissance de la tumeur (gêne, mobilité réduite, perte de poids (malnutrition, déshydratation)) ou par les injections répétées (stress physique) des différents traitements anticancéreux.

Devenir

À l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses in vitro.

Remplacement

En termes de remplacement, il n'est pas possible de s'affranchir de l'utilisation de souris car il n'existe pas de méthodes alternatives qui permettent de reproduire des interactions physiologiques aussi complexes.

Réduction

En termes de réduction, le nombre d'animaux nécessaire à cette étude a été déterminé à l'aide d'un test statistique. L'utilisation de ces animaux sera optimisée en prélevant les tumeurs de mélanome et/ou les organes (foie, poumons,...) présentant des métastases afin de réaliser des analyses au laboratoire. Il est fort probable que le nombre d’animaux utilisés soit très inférieur à la fin du projet. En effet, selon les résultats de la procédure 2, la procédure 3 sera lancée ou abandonnée. Dans le meilleur respect du bien-être animal et dans le but de réduire, nous utiliserons des souris NSG (souris de laboratoire qui possède un système immunitaire affaibli) mâles et femelles provenant de notre élevage.

Raffinement

En termes de raffinement, les souris seront hébergées à plusieurs par cage avec un environnement enrichi (igloo) et seront observées deux ou trois fois par semaine selon la procédure par les demandeurs du projet afin de prendre en charge tout signe de douleur, de stress ou d’inconfort. Les manipulateurs ont un niveau qui permet d’avoir une bonne vision et une excellente capacité à détecter les problèmes de santé, stress ou malaise. Le suivi est fait par des méthodes non invasives (mesure des tumeurs sous cutanées avec un pied à coulisse (instrument de mesure), pesée des animaux régulières). Le site d’injection au niveau de l'abdomen sera surveillé et changera de côté pour chaque injection. De plus, nous avons fait en sorte que les traitements utilisés puissent être mélangés afin de les injecter en une seule manipulation (diminution du stress). En ce qui concerne les souris NSG (souris de laboratoire qui possède un système immunitaire affaibli), ces dernières seront manipulées sous hotte de type PSM (Poste de Sécurité Microbiologique, hotte qui offre une zone de travail stérile) dans des conditions d'hébergement stérile (igloo, nourriture, changement de cage en condition stérile). Ces conditions d'hébergement permettent donc le maintien d'un statut sanitaire exempt d'organisme pathogène spécifique (SOPF).

Choix des espèces

La souris est un mammifère ayant des similitudes génétiques avec l’homme. De plus, elle a un cycle de vie court, un cycle de reproduction bien connu, une faible taille ce qui permet d’avoir des conditions d’hébergement plus faciles. Les modèles de souris avec un système immunitaire déficient nécessaires à l'étude sont déjà disponibles commercialement ce qui permet de ne pas avoir à générer de nouveaux modèles génétiquement modifiés. Les souris seront utilisées au stade adulte (7 semaines) afin de garantir une prise tumorale optimale.

1 356 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une neurochirurgie du crâne ou une chirurgie vasculaire, des tests métaboliques avec prélèvements sanguins, un régime gras, des mises à jeun de vingt-quatre heures et une exposition au froid, ainsi que des isolements en cage individuelle, avant mise à mort pour prélever des tissus. Le porteur reconnaît des douleurs postopératoires liées à l'incision du crâne et un stress d'isolement et de contention, l'objectif étant d'étudier le rôle des cellules immunitaires du cerveau dans l'obésité. Sur le remplacement, il affirme que ces interactions entre le cerveau et les organes ne sont pas modélisables in vitro.

Objectifs

Afin d’envisager de nouvelles thérapies pour lutter contre l’obésité et ses comorbidités, il est nécessaire de mieux connaître les phénomènes biologiques qui régulent la prise alimentaire et le poids corporel. Dans le cerveau, on trouve des neurones qui sont sensibles à des signaux (hormones, sucres, graisses…) qui les renseignent sur l’état énergétique global de l’organisme. La consommation d’un régime hypercalorique riche en graisses entraîne une inflammation du cerveau. La microglie, qui forme les cellules immunitaires du cerveau, est impliquée dans la régulation du poids corporel. Elle participe à la mise en place de l’'inflammation cérébrale lors de la consommation d'un régime gras. Son activation est variable en fonction de la longueur de la consommation du régime (entre les premiers jours et plusieurs semaines). Cependant, les mécanismes moléculaires impliqués restent mal connus. Nous allons étudier deux molécules qui agissent sur l'activation de la microglie afin de déterminer si elles sont importantes pour la mise en place de l'inflammation cérébrale.

Bénéfices attendus

Les informations tirées de la réalisation de ce projet permettront de mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires du cerveau (microglies) dans le développement de l'obésité et les dérèglements métaboliques en réponse à un régime gras riche en calories, ainsi que les changements inflammatoires sous-jacents dans le cerveau. Dans une perspective thérapeutique à plus long terme, ces données seront utiles pour des tentatives de modulation de la microglie afin de contrer les troubles métaboliques, dans le cas où nos résultats supporteraient cette hypothèse.

Procédures

Voici la liste des principaux gestes techniques réalisés sur les animaux. 1) Analyse de la composition corporelle : durée maximale de 5 minutes, sans anesthésie. Les souris subiront 1 à 4 analyses de ce type au cours de ce projet, espacées au minimum de 3 semaines (1356 animaux). 2) Neuro-chirurgie : sous anesthésie générale + protocole analgésique. Une seule neuro-chirurgie sera effectuée dans la vie de l’animal (60-75 minutes, 384 animaux). Une partie des 384 animaux subiront une deuxième chirurgie (60-75 minutes, 96 animaux) et une troisième anesthésie (45 minutes, les mêmes 96 animaux). 3) Chirurgie vasculaire : sous anesthésie générale + protocole analgésique. Une seule chirurgie vasculaire sera effectuée dans la vie de l’animal (30 minutes, 204 animaux). 3) Test de tolérance au glucose/insuline/pyruvate et clamp hyperglycémique : réalisé sur souris vigiles. Maximum 10 prélèvements sanguins de 10µl. Un seul test de chaque type sera réalisé durant toute l’étude (120 minutes, 492 animaux). 4) Tests de calorimétrie indirecte (288 animaux concernés au maximum) : isolement de l’animal vigile en cage individuelle enrichies (pendant deux semaines).

Impact sur les animaux

Dans notre étude, les animaux seront parfois isolés à l’âge adulte (suite à une chirurgie ou lors des sessions de cages métaboliques). Cet isolement est nécessaire pour quantifier la consommation de nourriture de chaque animal ou limiter la dégradation des implants. Au-delà du stress d’isolement social, ces animaux subiront un stress de contention lors de l’analyse de composition corporelle, qui se déroule dans un tube en plastique au fond duquel les souris sont bloquées. Ce stress est cependant d’une durée limitée, l’analyse ne prenant que 5 minutes au maximum. Certains animaux subiront un stress métabolique lors de la mise à jeun pendant 24h et les 24h à une température de 4°C. Les prélèvements sanguins (maximum de 44 µl prélevés en une journée) peuvent induire une gêne passagère. Les nuisances les plus importantes sont attendues lors de la neuro-chirurgie. L’incision de la peau du crâne et la déshydration induite par l’anesthésie peuvent provoquer des douleurs post-opératoires.

Devenir

À l’issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés pour récupérer des tissus, afin de réaliser des analyses in vitro supplémentaires, qui nous apporteront des informations cruciales sur les conqéquences des changements moléculaires microgliaux.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle de la microglie hypothalamique sur un ensemble de variables métaboliques intégrées, telles que le poids, la composition corporelle et la régulation de la glycémie. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et interagit avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu adipeux…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de cette communication entre divers réseaux de neurones et la périphérie. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude. A noter, ce projet a d’abord fait l’objet d’études réalisées in vitro (cultures cellulaires) afin de mieux cibler les voies de signalisation impliquées dans notre hypothèse. De plus, les modèles génétiques nécessaires pour répondre à notre question scientifique ont été développés chez la souris.

Réduction

Sur la base de nos études antérieures, nous avons adapté le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons regroupé dans la mesure du possible nos différents tests métaboliques sur les mêmes animaux, de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle (masse grasse vs masse maigre) est réalisée dans un appareil spécifique qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : 1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 3 ou 24 semaines et seront habitués pendant 1 semaine minimum. Cette période d’habituation permettra de diminuer le stress des animaux en réponse à l’expérimentateur. Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois la répartition des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. 3) L’enrichissement des cages se compose de carrés de cellulose pour nidifier, un tunnel en carton pour se cacher et de bâtonnets en bois pour ronger. 4) Environnement sonore : Une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 5) Notre étude nécessite une chirurgie stéréotaxique et une chirurgie vasculaire, qui seront réalisées sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès l’induction, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 6) Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie (le cas échant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera retiré de l’étude et mis à mort, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

LLa régulation du poids corporel, le comportement alimentaire et le métabolisme glucidique sont depuis longtemps étudiés chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à ce type d’études. De très nombreux modèles d’obésités ont été développés chez la souris. De nombreux modèles génétiquement modifiés existent et permettent l’étude de mécanismes moléculaires précis. De plus, la souris est une espèce de prédilection pour la création d’animaux transgéniques, d’autant que son cycle de reproduction court permet d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement. Enfin, la forte proximité biologique entre l’homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire fait de la souris un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de cette étude, l'inflammation hypothalamique et la réactivité microgliale induite par un régime obésogène est retrouvé à la fois chez la souris et chez l’Homme. Toutes les souris de cette étude seront adultes, elles arriveront entre 3 et 24 semaines d’âge dans notre animalerie, mais nous ne commencerons les expériences qu’à partir de l’âge de 8 ou 25 semaines. Cet âge est celui auquel on estime que le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet d’utiliser des atlas de référence pour la réalisation de la neuro-chirurgie.