Souris
Etude des interactions entre la signalisation oestrogénique et circadienne pour l’amélioration du traitement de la ménopause
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 248 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections de tamoxifène pendant cinq jours, une partie subissant l'ablation des ovaires pour reproduire la ménopause et la pose d'une capsule hormonale sous la peau, avec isolement en cage individuelle pour mesurer l'activité sur roue. Le porteur indique un stress comportemental lié à la modification des rythmes et à l'isolement, sans douleur selon lui, avant mise à mort pour prélever foie, utérus, aorte et cerveau. Sur le remplacement, il affirme que les effets multiples des oestrogènes ne sont pas modélisables in vitro et qu'aucune stratégie de remplacement ne répond au projet.
Objectifs
De nombreuses études ont montré un lien potentiel entre la signalisation oestrogéniques et les rythmes circadiens mais les mécanismes moléculaires sont inconnus, ce qui pourrait pourtant avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit. Afin de déterminer les liens moléculaires et physiologiques entre la signalisation oestrogénique et la signalisation circadienne, les objectifs de ce projet sont de : 1) Evaluer l'impact d'un traitement oestrogénique sur les rythmes circadiens ; 2) Evaluer le rôle de la régulation circadienne sur la signalisation des oestrogènes
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de déterminer les liens moléculaires et physiologiques entre la signalisation oestrogénique et la signalisation circadienne, ce qui pourrait avoir un impact thérapeutique significatif dans le traitement de la ménopause et chez les personnes travaillant de nuit. En effet, l'interaction entre la signalisation oestrogénique et les rythmes circadiens représente un levier thérapeutique relevant pour limiter, prévenir et/ou traiter les dysfonctions cardiovasculaires et métaboliques ainsi que les symptomes climatériques et le développement de certains cancers hormono-dépendants chez les femmes menopausées et les travailleurs de nuit.
Procédures
Tous les animaux sont soumis à la procédure d'injection de tamoxifène (5 jours d'injection par IP). De plus, certains animaux seront soumis à deux procédures chirurgicales dont une de classe légère (pose de capsule à libération prolongée sous la peau mimant les traitements hormonaux de la femme) et une de classe modérée (ablation des ovaires mimant la ménopause). Ces deux procédures durent entre 10-20min sous anesthésie générale. Au total, 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène seule ; 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène et l'ovariectomie et 416 animaux seront soumis à l'injection de tamoxifène, l'ovariectomie et la pose de pellets.
Impact sur les animaux
La modifications des rythmes circadiens ainsi que l'induction d'un syndrome métabolique par une régime hypercalorique va challenger la physiologie des souris et peut donc induire un stress comportemental chez les souris mais pas de douleurs. De plus, l'étude des rythmes circadiens nécessite l'isolement en cage individuelle des souris afin d'avaluer leur activité locomotrice sur roues. En effet, cet appareillage est présent dans l'établissement utilisateur et il n'existe pas d'alternative dans l'établissement utilisateur, sachant que le statut sanitaire des animaux (hébergés en animalerie conventionelle) ne permet pas de les transférer dans un autre établissement.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes (foie, utérus, aorte, cerveaux) et réaliser des analyses moléculaires.
Remplacement
Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques des oestrogènes. De même, les rythmes circadiens font intervenir de nombreux tissus dont l'horloge centrale dans l'hypothalamus intégrant le signal jour/nuit régulant les rythmes circadiens. Alors qu'une approche in vitro est utilisée pour définir les mécanismes moléculaires de ces signalisations, l'étude des effets physio(patho)logiques circadiens des oestrogènes ne peut pas être modéliser in vitro. Ainsi il n'y a donc aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons uniquement les femelles car ce projet rentre dans le cadre de la mise au point d’un traitement de la ménopause et s’applique donc uniquement au sexe féminin. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs. Les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 12 animaux étaient requis pour obtenir une distribution normale des mesures sur des paramètres physiologiques (procédures 1 à 6) alors que pour les études d'expression génique uniquement (procédures 7 à 12), les études statistiques antérieures ont montré que des groupes de 5 animaux étaient requis.
Raffinement
Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. L'étude des rythmes circadiens nécessite également de raffiner les conditions d'hébergement des animaux afin de respecter leur rythme circadien car les souris sont des animaux nocturnes. Ainsi, l'ensemble des animaux utilisés dans ce projet seront hebergés dans une pièce spécifique en cycle inversé afin de manipuler les animaux pendant leur phase d'éveil quand la lumière est éteinte. Cette inversion du cycle jour/nuit plus adapté à l'expérimentation sur les animaux nocturnes participera au bien-être animal. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie sont adaptées. Tout au long des procédures, les points limites adaptés et précis (décrits dans chaque procédure) sont quotidiennement surveillés permettant de mettre en application l'arbre décissionnel pouvant aboutir aux critères d'arrêt des souffrances. Cette décision sera prise par la personne en charge de la mise en oeuvre générale du projet dans l’EU et de sa conformité à l’autorisation de projet, en concertation avec la personne en charge du bien-être animal dans l’EU. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel a été générée l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes et des gènes REVERBs. De plus, afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée après 8 semaines.
Impact de l’administration de l’acide-tout-trans-rétinoïque par voie orale sur l’expression tissulaire de MAdCAM-1, sur la croissance et l’immunité tumorale.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des administrations orales de bactéries et d'acide rétinoïque, une injection dans un ganglion et un prélèvement de sang, avant mise à mort pour prélever tumeur, foie, intestins, ganglions et rate. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et un inconfort lors des administrations, l'objectif étant de restaurer l'efficacité des immunothérapies en cas de déséquilibre du microbiote. Sur le remplacement, il affirme que seul un animal vivant et "entier" permet d'étudier l'immunité antitumorale, impossible à reproduire in vitro.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal (MI) sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements en créant un déséquilibre de la flore intestinale ou dysbiose. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin (MAdCAM-1). L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules néfastes dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. De plus, il a été montré que l’acide tout trans rétinoïque (ATRA, all tran retinoic acid) (dérivé de la vitamine A utilisé pour traiter des leucémies) augmente l’expression du ligand de MAdCAM-1 sur les lymphocytes et réprime l’induction de certaines cellules néfastes. Cette surexpression de ce ligand permettrait une meilleure captation des cellules immunitaires intestinales vers l’intestin en cas de dysbiose. Pour comprendre ce lien entre l’ATRA et la réponse anti-tumorale, nous souhaitons dans un contexte de dysbiose supplémenter nos souris en ATRA pour comprendre son effet sur le MI, sur l’effet des immunothérapies, sur l’expression de MAdCAM-1 et de son ligand et sur la migration des cellules immunitaires entre l’intestin et la tumeur. Pour cela, nous voulons administrer l’ATRA par voie orale. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet bénéfique de la supplémentation en ATRA sur la réponse anti-tumorale aux immunothérapies en cas de dysbiose en capturant les cellules néfastes au niveau de l’intestin permettant ainsi la recirculation des cellules immunitaire bénéfiques vers la tumeur.
Bénéfices attendus
Nous voulons ainsi montrer la restauration de l’efficacité des immunothérapies post traitement par l’ATRA (all trans retinoic acid) malgré le contexte de dysbiose intestinale. (dérégulation de la flore) Le but ultime de nos investigations est de proposer une solution thérapeutique pour réduire la recirculation des cellules immunitaires néfastes de l'intestin vers la tumeur chez les patients souffrant d’une dysbiose et donc d’améliorer significativement l’efficacité des immunothérapies chez ces derniers. Selon nous, l’ATRA, déjà disponible dans la pharmacopée humaine semble être une bonne molécule pour atteindre cet objectif.
Procédures
Les interventions seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (une fois, durée 1 minute) sous anesthésie locale, l’administration orale de bactéries (maximum 8 fois, durée 1 min) et d’ATRA (maximum 4 fois, durée 1 minute), l’utilisation de traceur cellulaire nécessitant une injection intra-ganglionnaire (1 fois, 5min) sous anesthésie locale, et prélèvement de sang (une fois en fin de procédure, durée 1min) sous anesthésie locale ou générale suivant les prélvèement..
Impact sur les animaux
Les contraintes pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs (douleur potentielle au point d'injection de courte durée, après l'effet de l'anesthésique local), l’administration orale de bactéries ou d'acide tout-trans-rétinoïque (inconfort pendant l'administration) ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossible à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique d'animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Ce résultat statistique sera basé sur l'expression tissulaire de MAdCAM-1 ou sur la différence de taille tumorale entre les groupes. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifique. - Génétique et immunologies proches de celle de l’Homme et bien connues - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 7 et 12 semaines. Les souris seront donc adultes ce qui permettra un passage plus aisé à l'Homme dans la suite de l'étude.
Etude de l’effet antalgique de l’oligodésoxynucléotide IMT504 sur l’hypersensibilité viscérale d’origine colique dans un modèle d’inflammation intestinale
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent du dextran sulfate de sodium qui détruit la barrière intestinale et provoque une colite, subissent des injections quotidiennes pendant cinq jours et un test de distension du côlon au moyen d'un ballonnet, avant mise à mort pour prélèvement de tissus. Le porteur indique évaluer la sévérité de la colite par la consistance des selles, la perte de poids et la présence de sang, et teste une molécule antalgique, l'IMT504. Il affirme que l'étude du comportement douloureux ne peut se faire que sur l'animal vigile, la caractérisation du mécanisme étant ensuite renvoyée à des modèles cellulaires.
Objectifs
La prise en charge des douleurs viscérales reste, à ce jour, limitée en raison de la faible efficacité des thérapies antalgiques actuellement disponibles, de leurs effets indésirables, notamment sur la physiologie intestinale, et de l’origine de ces douleurs souvent multifactorielle et hétérogène selon les pathologies considérées. Le besoin d’innovation thérapeutique demeure ainsi pressant dans ce domaine de recherche puisque ces douleurs présentent généralement une forte composante cognitivo-émotionnelle pouvant affecter durablement la qualité de vie des patients. L’IMT504 est une molécule agissant sur le système immunitaire initialement développée en tant qu’adjuvant vaccinal permettant de promouvoir la production d’anticorps afin d'accroître l'efficacité des vaccins. Depuis ces premières études, un rôle nouveau de cette molécule a été mis en évidence dans le traitement des douleurs chroniques au niveau cutané en agissant notamment sur le recrutement et l’activation de cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l’inflammation. Le côlon est un organe soumis à une surveillance immunitaire permanente du fait de sa proximité avec la lumière intestinale contenant une multitude de corps étrangers alimentaires et microbiens. La rupture de la barrière intestinale est un évènement fréquemment associé aux pathologies intestinales entrainant, de fait, un passage accru de ces corps étrangers à travers la paroi intestinale aboutissant à une réaction immunitaire et inflammatoire et, consécutivement, à la sensibilisation des neurones innervant l'intestin transmettant l'information douloureuse intestinale. Ce phénomène peut être modélisé chez l’animal par administration de Dextran Sulfate Sodium (DSS) chez l’animal. Cette molécule, en détruisant les cellules intestinales séparant le contenu du tube digestif du reste de l'organisme, va rompre l’intégrité de la barrière intestinale et, par le biais des mécanismes cités précédemment, provoque une hypersensibilité viscérale. Le but de ce projet est donc, dans un premier temps, d’étudier la cinétique de recrutements de populations de cellules immunitaires dans le modèle d'inflammation colique au DSS et, par la suite, d’évaluer les effets de l’administation d’IMT504 sur la sensibilité viscérale dans ce modèle en lien avec la modulation des populations de cellules immunitaires.
Bénéfices attendus
Ce projet a un objectif double. Tout d'abord évaluer l'effet de l'IMT 504 sur la douleur viscérale dans un contexte inflammatoire. Actuellement, un projet d'étude clinique réalisé par nos collaborateurs argentins expérimentant l'effet de cette molécule sur des douleurs d'origine somatique va bientôt être mis en oeuvre. Ainsi, cette molécule pourrait constituer une alternative aux molécules antalgiques actuellement disponibles dans le traitement des douleurs viscérales avec un transfert potentiellement rapide chez l'homme. Dans un second temps, l'IMT504 constitue un outil de recherche fondamentale nous permettant de caractériser les interactions entre les cellules neuronales et immunitaires dans un modèle de douleur intestinale. En effet, la capacité de l'IMT504 à recruter des cellules immunitaires impliquées dans la résolution de l'inflammation nous permettra d'étudier la capacité de ces cellules à réduire l'activité neuronale, et par là-même, le contrôle du message douloureux par les cellules immunitaires. Ainsi, outre le caractère pharmacologique de ce projet, de nouveaux aspects sur la physiopathologie des douleurs viscérales inflammatoires seront étudiés.
Procédures
Chaque animal sera soumis à une injection sous-cutanée quotidienne durant 5 jours consécutifs d'IMT504 ou de la molécule contrôle (Chlorure de sodium). Pour l'evaluation de la sensibilité colique, les animaux seront soumis à un test de distension colorectale qui consiste à appliquer des pressions de distensions croissantes à l'aide d'un ballonnet préalablement inséré dans le côlon distal des animaux. Chaque distension dure 20s et un intervalle d'au moins 4min est respecté entre chaque épisode de distension. Au total le test de sensibilité colique dure donc 30 minutes.
Impact sur les animaux
L'administration de DSS induit une colite dont la sévérité sera évaluée quotidiennement par l'expérimentateur par la mesure du score DAI (Disease Activity Index) en prenant en compte les 3 critères suivants: consistance des selles, perte de poids, et présence de sang dans les selles.
Devenir
A l'issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour la collection de tissus et des analyses mécanistiques réalisées in vitro.
Remplacement
Les études sur le comportement douloureux des animaux ne peuvent être effectués uniquement sur l'animal vigile. Les expérimentations visant à caractériser le mécanisme d'action de l'IMT504 seront ensuite réalisées in vitro sur des modèles cellulaires.
Réduction
Les expérimentations sont organisées de façon à obtenir des résultats statistiquement exploitables avec le plus petit nombre d’animaux possible.
Raffinement
Afin de réduire une éventuelle souffrance, les animaux seront surveillés quotidiennement (Week-end et jours fériés compris) par l'expérimentateur mais aussi par le personnel de l'animalerie. Les animaux seront au maximum 5 par cage (5 mâles ou 5 femelles) et ceci en respect de la réglementation en vigueur concernant la superficie au sol par souris. De plus, ces cages contiendront des milieux d'enrichissements de type maisonnette de chez Genobio ainsi que du coton.
Choix des espèces
Les souris seront utilisées au stade de jeune adulte (10 semaines). En effet, l’utilisation des animaux à ce stade de développement permet de limiter les biais liés à des différences pouvant se développer au cours de la vie de l’animal. La réduction de la variabilité inter-individus permet ainsi de réduire le nombre d’animaux à expérimenter.
Evaluation préliminaire de la marge de sécurité en vue de l’utilisation clinique d’un candidat médicament pour lutter contre la maladie de Huntington
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Réparties en six groupes de doses, elles reçoivent un candidat médicament par voie orale puis subissent des prélèvements de sang à la queue, avant mise à mort pour examiner leurs organes et doser l'accumulation du produit. Le porteur indique qu'une toxicité peut apparaître aux fortes doses, avec des signes d'inconfort, l'objectif étant de fixer la dose maximale tolérée avant des essais réglementaires puis cliniques contre la maladie de Huntington. Sur le remplacement, il affirme que les études de toxicité sont obligatoirement menées sur l'animal et "indispensables" avant le passage en clinique.
Objectifs
La maladie de Huntington est une maladie neurodégénérative rare d’origine génétique (18000 personnes atteintes en France et environ 300 000 personnes dans le monde) pour laquelle il n’existe à ce jour aucun traitement curatif. Il a été identifié une molécule capable de restaurer le transport neuronal, défaut primaire associé à la maladie de Huntington, dans les neurones humains et murins. Il a ensuite été démontré qu’un traitement sous cutané d’un mois avec ce candidat médicament permettait d’améliorer les défauts moteurs et psychiatriques dans un modèle souris de la maladie de Huntington. Afin de développer le candidat médicament pour des patients atteints de la maladie de Huntington, l’équipe de recherche suit les directives de l’agence européenne du médicament parmi lesquelles figurent l’obligation de réaliser des études de sécurité non-clinique (nommées « études réglementaires ») en amont des études cliniques (voir la guideline européenne ICH M3(R2). Le projet a donc pour objectif de préparer ces études réglementaires pour 1/ aider à identifier la dose maximale tolérée et 2/ réaliser une première évaluation de la marge de sécurité du candidat médicament. Le candidat médicament cible une voie thérapeutique jamais évaluée auparavant, et n’a jamais été utilisé chez l’homme, cette étude préliminaire permet donc d’orienter la conception des études réglementaires notamment en termes de choix des doses.
Bénéfices attendus
Il a été démontré avec des premiers résultats preuve de concept l’intérêt thérapeutique de la molécule dans un modèle souris de la maladie. Il est nécessaire maintenant d’identifier la dose maximale tolérée afin de borner le choix des doses à utiliser pour les études de toxicité réglementaire en dose répétée, études préconisées par l’agence européenne du médicament avant le passage en clinique. L’identification d’une dose maximale tolérée élevée et éloignée de la dose efficace connue permettra également de rassurer quant au profil de sécurité du candidat médicament pour les études cliniques
Procédures
Le traitement sera administré par voir orale. Le geste permettant l’administration orale dure 10 secondes. Un prélèvement sanguin sera réalisé à l'extrémité de la queue de l'animal à trois temps différents après administration du traitement. 30 secondes seront nécessaires au prélèvement sanguin. Ces actes expérimentaux n'impliqueront que des nuisances mineures chez l'animal.
Impact sur les animaux
Les animaux utilisés dans cette étude sont des souris d’âge adulte. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation. Une toxicité d’une dose unique et rapide induite par le traitement est possible aux fortes doses, se traduisant par des signes d’inconfort chez l’animal.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'observer visuellement l'aspect des différents organes après administration du traitement ainsi que de doser l’éventuelle accumulation du produit dans les organes cibles.
Remplacement
Les études de toxicité sont obligatoirement réalisées chez l’animal. Elles sont indispensables à la validation du profil de sécurité du médicament avant d’envisager le passage en clinique. Notre étude permet de documenter le profil de sécurité du médicament in vivo et les résultats seront utilisés pour concevoir les études de toxicités réglementaires.
Réduction
Pour cette procédure, nous limitons au maximum le nombre d’animaux afin de pouvoir réaliser des analyses quantifiables et reproductibles. Au final, les animaux seront répartis dans 6 groupes différents (différentes doses). Ces effectifs seront suffisants pour calculer les valeurs de concentrations du médicament dans le plasma ainsi que pour écarter le risque de conclure à une toxicité macro ou micro qui serait due au hasard.
Raffinement
Ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Comme expliqué plus haut, aucun effet indésirable majeur n’est attendu chez l’animal. Les animaux seront surveillés pendant toute la durée de l’étude, de façon à prévenir toute survenue de points limites, et leur poids sera évalué de façon quotidienne. Le traitement oral et les prélèvements de plasma seront réalisés par le personnel compétent, permettant ainsi de limiter au maximum le stress associé à ces deux gestes. Les prélèvements de plasma peuvent aboutir à une légère déshydratation palliée par une injection de liquide physiologique en sous cutané.
Choix des espèces
Les études preuves de concept et pharmacocinétique précédemment réalisées avec notre candidat médicament ont été faites chez la souris. Dans un souci de cohérence et afin de pouvoir compléter notre corpus de données, la présente étude sera également réalisée chez la souris. Puisque l’étude vise à définir la dose maximale tolérée et donc à préparer les études de toxicité réglementaire qui seront réalisées sur animaux adultes, notre étude sera également réalisée sur des animaux adultes.
Etude des conséquences sur le métabolisme et le vieillissement de mutations dans les canaux ioniques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Quatre souris sont recensées dans le tableau des dommages attendus, une sans réveil et trois en souffrance sévère, alors que le résumé annonce par ailleurs 480 animaux. Le porteur décrit l'induction d'une migraine chronique par injections répétées, une douleur qui ne sera soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées, les animaux étant tués en fin de procédure pour prélèvement des tissus. Il indique surveiller des points limites et euthanasier tout animal atteignant un score de douleur élevé ou perdant du poids. Sur le remplacement, il affirme que les effets métaboliques à long terme et le vieillissement exigent un "organisme vivant" impossible à modéliser in vitro.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'incidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.
Bénéfices attendus
La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.
Procédures
Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (4 tests dans la vie de l'animal) et thermique (4 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (4 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 4 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons. Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, pelage non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur en annexe.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chacune des procédures. Dans le cadre des procédures 1 et 2, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Dans le cadre des procédures 3 et 4, les animaux seront anesthésiés (procédure sans réveil) et une perfusion intracardiaque sera réalisée afin de prélever des tissus de qualité optimale pour les analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles génétiques des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.
Effet de deux mutations dans un gène impliqué dans le développement cérébral chez la souris EU1/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris de ce projet sont génétiquement modifiées pour étudier deux mutations d'un gène du développement cérébral, LKB1, et certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies du développement. 288 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie d'électroporation in utero, puis leurs souriceaux, triés dès la naissance par la fluorescence visible à travers le crâne, sont étudiés au sevrage ou à 90 jours. Après les accouplements, la majorité des mâles se battent et sont alors hébergés seuls. Le porteur présente les tests de comportement social comme "bien établis chez la souris", sans dire si ce projet en fait passer ni lesquels. Toutes les souris sont tuées : les souriceaux pour des prélèvements, les reproducteurs âgés "réformés" faute de replacement, et les femelles opérées, que le porteur dit ne pas soumettre à une nouvelle procédure "pour raison éthique".
Objectifs
Ce projet a pour but d’étudier le rôle d’un gène comme relai intracellulaire pour les signaux émis par les cellules du cerveau au cours de la formation des réseaux de neurones du cortex cérébral. Les connaissances antérieures ont démontré l’importance de ce gène pour le développement cérébral. Des domaines de régulation de ce gène ont été identifiés dans des lignées de cellules, et ont conduit à l’identification de deux mutations qui perturbent la régulation du gène d’intérêt. Lorsque ces mutations sont introduites chez la souris, elles entrainent des défauts du comportement social rappelant les troubles du spectre autistique. Ce projet a pour objectif d’identifier les défauts de connectivité qui expliquent les défauts de comportement, lors de la mutation de ce gène, chez la souris.
Bénéfices attendus
Ce projet répond à une problématique fondamentale qui permettra de mieux comprendre comment se forment les réseaux neuronaux dans le développement normal du cerveau. A terme cette étude permettra de mieux comprendre les causes de troubles du neurodéveloppement tels que les troubles du spectre autistique.
Procédures
Des femelles gestantes seront soumises une fois, à une procédure de chirurgie sous anesthésie et avec analgésie (1 injection avant l’opération, et jusqu’à 2 injections après opération), appelée électroporation in utero, d’une durée de 30 minutes. Pendant cette procédure, le temps total de l’anesthésie est estimé à 5 minutes.
Impact sur les animaux
La manipulation répétée des animaux et leur contention peut entraîner un stress modéré qui néanmoins s’atténue à mesure que les animaux s’habituent à l’expérimentateur. Suite aux accouplements, il est observé chez la majorité des mâles un comportement de bagarre nécessitant leur hébergement en cage individuelle. Certaines lignées peuvent présenter un retard de croissance ou des anomalies développementales. Des animaux subissent une procédure chirurgicale sous anesthésie, pouvant entrainer du stress et de la douleur pendant la phase de réveil et la phase post-opératoire, malgré l’utilisation d’antalgiques.
Devenir
Les animaux utilisés dans ce projet sont des organismes génétiquement modifiés qui ne peuvent être replacés ou relâchés. Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour prélèvement des tissus désirés. Les animaux reproducteurs âgés seront réformés et mis à mort, en l’absence de possibilité de replacement. Les femelles ayant subi une procédure chirurgicale ne seront pas soumises à une nouvelle procédure pour raison éthique et seront donc mises à mort en fin de procédure. Les souriceaux doivent être mis à mort pour la réalisation de prélèvements postmortem.
Remplacement
Les études préliminaires à ce projet ont été conduites in vitro, ce qui permet de ne tester chez l’animal que les approches qui ont montré un potentiel résultat . Il est à présent nécessaire d’observer le développement cérébral in vivo pour aller plus loin dans l'analyse des conséquences de la mutation du gène d'intérêt et le lien avec les perturbations du comportement social retrouvées chez les animaux mutants. Ces projections dépendent de l’architecture cérébrale et des interactions cellule-cellule, qui sont reproduites de façon imparfaite in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux inclus dans l’étude a été calculé sur la base d'expériences similaires pour tenir compte d'aléas non contrôlables tels que la variabilité entre les expériences, ou le génotype des portées. Certains animaux devront être exclus de l’analyse a posteriori pour des raisons techniques, ce qui est compris dans le calcul du nombre d'animaux. Les groupes expérimentaux seront faits séquentiellement, afin de pouvoir arrêter l'étude en cours si le résultat est négatif. Les souriceaux entrant dans la procédure seront sélectionnés par l’observation transcranienne de la fluorescence au moyen d’une lampe LED. Ceci permettra de détecter dès la naissance un éventuel problème expérimental (échec de l’électroporation) et de ne continuer inutilement la procédure sur un animal qui ne sera pas exploitable pour les résultats de l’étude.
Raffinement
Ce projet repose sur des procédures maitrisées par les chercheurs impliqués. L’approche chirurgicale sera réalisée selon les standards de la médecine vétérinaire (asepsie, anesthésie et analgésie). Un soin particulier sera porté à la récupération postopératoire, et à la limitation du stress autour de la période de la naissance. L’enrichissement sera contrôlé et strictement identique entre tous les animaux (nidation, cache, objet en boit pour jouer/mâcher…). Un suivi journalier des souriceaux sera effectué afin de détecter immédiatement tout signe d’inconfort. Afin de prévenir toute souffrance inutile, des points limites spécifiques adaptés aux différentes procédures réalisées ont été définis. Un arbre décisionnel, à la disposition des expérimentateurs et des zootechniciens, permettra le cas échéant de décider de l’arrêt des souffrances au moyen de critères prédéfinis, sous le contrôle de la SBEA de l’établissement. Pour limiter la perte de données et tirer plus d’informations par animal, nous utilisons dans l’équipe des outils d’imagerie et d’analyse qui ont été optimisés afin d’obtenir un maximum d’information. Ce projet se déroule sur deux établissements utilisateurs. Le transport des animaux est rapide et sera réalisé dans des conditions minimisant le stress lié au transport et à l'arrivée dans un nouvel environnement.
Choix des espèces
Le choix d'un modèle rongeur (souris) est justifié par le fait que la souris a un cerveau dont la structure est proche du cerveau humain. Le développement embryonnaire est rapide et le développement postnatal est court, ce qui permet d''obtenir rapidement les résultats de l'étude. Enfin, les tests de comportement social pertinents pour l'étude des troubles autistiques sont bien établis chez la souris, ce qui nous assure que le projet permettra de répondre à la problématique scientifique de ce projet et de projets ultérieurs. Les reproducteurs (mâles et femelles) seront des adultes entre 8 et 30 semaines, au pic de leur fertilité. Les souriceaux seront utilisés soit au moment du sevrage (J21), correspondant à l’âge où la connectivité corticale est établie, pour déterminer un effet sur la formation des projections axonales, soit à J90, âge où les connexions sont matures, pour déterminer un effet des mutations de LKB1 sur la sélection des contacts synaptiques liés à la plasticité cérébrale. Cet âge correspond également à l’âge où nous observons des anomalies du comportement social.
Etude et vectorisation de nouvelles molécules à visée anti-fibrotique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
Toute souris qui perd 20 % de son poids est sortie de l'étude et tuée par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse. 220 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, modéré ou sévère, toutes mises à mort à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Une administration par la trachée, sous anesthésie, déclenche chez une partie d'entre elles une fibrose pulmonaire suivie par cinq séances de microscanner, et les souris traitées reçoivent sept injections intrapéritonéales et une ou trois administrations des composés, par la veine ou par la trachée, avec une gêne respiratoire et des douleurs attendues. Le porteur affirme que la fibrose "ne peut se concevoir que sur organisme entier" et que "le recours à l'animal reste une étape indispensable", et prévoit aussi d'évaluer les composés sur des cellules pulmonaires de patients "pour valider ce médicament dans un contexte humain".
Objectifs
La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique fibrosante associée à un déclin progressif de la fonction pulmonaire et a une durée médiane de survie inférieure à 5 ans après le diagnostic. Il n'existe pas de traitement curatif et les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de la fibrose pulmonaire sont encore peu connus. Dans ce projet, nous proposons d’optimiser l'administration de nouveaux composés anti-fibrose et de tester leur efficacité dans des modèles murins de fibrose pulmonaire. Le développement de la fibrose sera suivi de manière non invasive par imagerie. Seuls les composés validés sur cellules seront évaluées chez l'animal. Les composés porteront un marqueur fluorescent afin de suivre leur comportement dans l’organisme en temps réel et de façon non-invasive par imagerie de fluorescence. L’efficacité des composés sera evaluée pour le traitement de la fibrose. De plus, l'efficacité, la spécificité et le mécanisme d'action des composés dans les différentes populations cellulaires du poumon atteint de fibrose seront évalués sur les poumons. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel traitement anti-fibrose d’un candidat médicament. Ces composés seront également évalués dans des cellules pulmonaires primaires provenant de patients atteints de fibrose pulmonaire idiopathique pour valider ce médicament dans un contexte humain.
Bénéfices attendus
La fibrose est un processus complexe mettant en jeu de nombreux types cellulaires. Les options de traitement pour la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) sont limitées avec seulement deux médicaments approuvés, le nintedanib et la pirfénidone, qui ralentissent la progression de la fibrose pulmonaire mais sont incapables d'inverser ou même d'arrêter la maladie. Ce projet permettra d'optimiser l'administration de composés anti-fibrose pour augmenter l'efficacité de traitement. Il pourra également ouvrir de nouvelles perspectives de traitement pour d'autres types de fibrose, comme la fibrose rénale, hépatique ou musculaire.
Procédures
Dans le cadre de l'administration des composés, les animaux subiront soit une injection intraveineuse (1 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la cinétique sanguine, les animaux auront des prélèvements sanguins répétés dans la veine caudale (5 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse). Dans le cadre de la détermination de la biodistribution des composés, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (1 à 2 fois, 1 minute) et une anesthésie gazeuse le temps de l'imagerie de bioluminescence (1 à 2 fois, 5 minutes). Dans le cadre des procédures d’imagerie de fluorescence, les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie (6 fois, 5 minutes). Dans le cadre du développement de la fibrose, les animaux subiront une administration par voie intratrachéale (1 fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse), puis les animaux seront simplement anesthésiés au gaz pendant l'imagerie µCT (5 fois, 10 minutes). Dans le cadre des procédures d'efficacité thérapeutiques, les animaux avec fibrose subiront des injections intrapéritonéales (7 fois, 1 minute), et soit des injections intraveineuses (1 ou 3 fois, 2 min, sous anesthésie gazeuse), soit des administrations par voie intratrachéale (1 ou fois, 10 min, sous anesthésie gazeuse).
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les nuisances ou effets indésirables attendus sont : douleurs et conséquences de l'administration intratrachéale pour déclencher la fibrose, des injections intrapéritonéales et intraveineuses, stress de la contention et des anesthésies répétées (pour l'imagerie et les traitements), gène respiratoire et/ou douleurs induites par la présence de fibrose.
Devenir
Les animaux issus des procédures seront mis à mort, afin de prélever leurs organes, les imager et les conserver pour des analyses ultérieures.
Remplacement
Les paramètres de biodistribution sont obtenus uniquement par l’emploi d’animaux. Ces études précliniques sont nécessaires avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Il n’existe pas de modèle non biologique ou in vitro permettant de réaliser ces travaux sans perte d’informations scientifiques. De plus, les processus biologiques à l’origine du développement de la fibrose sont mal connus. La fibrose étant un processus dynamique mettant en jeu de nombreux types cellulaires, son étude ne peut se concevoir que sur organisme entier. Les modèles cellulaires ne permettent pas de refléter de manière satisfaisante le processus de fibrose, et le recours à l’animal reste une étape indispensable pour démontrer le potentiel anti-fibrose d’un candidat médicament. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose, on retrouve de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine et nous disposons d’une grande variété d’outils moléculaires pour mener à bien nos expérimentations. Le consensus actuel est que l'utilisation du modèle murin de fibrose par instillation de bléomycine par voie oropharyngée représente le modèle animal le mieux caractérisé disponible pour les tests précliniques.
Réduction
Les tests in vitro permettront de réduire le nombre de composés à tester in vivo. Les modèles utilisés dans ce projet utilisent des procédures couramment décrites, et qui ont été élaborées afin d’utiliser le moins d’animaux possible tout en permettant d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et valides. Les nombres de souris indiqués par condition sont nécessaires pour une analyse statistique fiable, évitant de refaire l’expérience. Le nombre des groupes sera ajusté en fonction des premiers résultats de biodistribution. La mise en place du modèle murin de référence pour la fibrose sera effectuée dans une étude pilote qui permettra de déterminer les doses optimales de bléomycine (dépendante de chaque lot de bléomycine) à administrer pour l’induction de la fibrose pulmonaire et la durée du suivi par imagerie non invasive afin d’observer une résolution totale. Cette étude nous permettra ainsi de réduire le nombre d’animaux dans les procédures suivantes. De plus, seuls le meilleur composé et la meilleure voie d’administration seront testés dans des modèles de fibrose, ce qui permettra aussi de réduire le nombre d'animaux.
Raffinement
Le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques en expérimentation animale. Les animaux seront maintenus dans des cages ventilées. Les animaux seront hébergés par fratries afin de limiter les bagarres. Les conditions standards de luminosité, hygrométrie et température seront appliquées. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, enrichi avec des tunnels en carton et morceaux de papier pour y faire un nid. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La gravité des procédures est légère pour les biodistributions, cinétiques sanguines et traitements. La plus grande vigilance sera apportée aux animaux afin de prévenir, minimiser et/ou abroger la souffrance et le stress. Des points limites pertinents seront déterminés et nous permettront d’intervenir immédiatement de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. La mise à mort sera faite sous anesthésie générale. Nous réaliserons une étude pilote afin d’optimiser et calibrer finement le modèle de fibrose et permettre un suivi non-invasif par imagerie. Les animaux seront anesthésiés afin de réduire le stress et la douleur. Un suivi quotidien accru des animaux sera effectué au cours de l’établissement de la fibrose. Les paramètres observés seront la prostration, la diminution de la mobilité, la forte baisse de température et la perte de poids. Tout animal présentant une perte de poids de 20% par rapport aux pesées précédentes sera sorti de l’étude et euthanasié par dislocation cervicale après anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Les modèles animaux permettent d’avancer dans la mise au point de nouvelles thérapies et procéder à leur évaluation préclinique avant de réaliser des essais cliniques chez l’homme. Les rongeurs constituent un modèle de choix pour l’étude de la fibrose tissulaire, on retrouve en effet de nombreuses similitudes avec la pathologie humaine. Plus particulièrement, nous utiliserons des souris de 8 semaines mâles en raison de leur sensibilité notamment aux atteintes pulmonaires induites par la bléomycine. Ce stade de développement permet d’avoir des souris adultes, de taille et de poids suffisants pour être facilement manipulables.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 1/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Greffées de cellules tumorales du foie sous la peau ou, après une incision de l'abdomen, directement dans le foie, 882 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leurs organes. Certaines passent ensuite sept anesthésies en six semaines pour des échographies ou de l'imagerie par bioluminescence, et une partie des lots reçoit trois injections d'un vaccin à ARNm dans le péritoine, trois injections d'un virus oncolytique dans la tumeur ou le foie, ou les deux. Le projet doit établir une preuve de concept pour cette association contre le carcinome hépatocellulaire. Sur la douleur des souris, le porteur invoque des "données cliniques chez l'homme" selon lesquelles les tumeurs intrahépatiques "ne sont pas douloureuses", et écrit aussi que le niveau de nuisance "dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur".
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis une injection (30 secondes) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe. Les animaux traités avec le virus oncolytique subiront 3 anesthésies gazeuses rapides (inférieures à 5 minutes) suivies à chaque fois d’une injection intrahépatique/tumorale per cutanée.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 3/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
882 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes. Elles reçoivent sous anesthésie une greffe de cellules de tumeur du foie, sous la peau ou directement dans le foie après une incision de l'abdomen, puis, selon les lots, des injections de traitement, et pour certaines sept anesthésies en six semaines pour suivre la tumeur par imagerie. Mené dans trois établissements, le projet teste l'association d'un vaccin à ARNm contre l'alpha-fœtoprotéine et de virus censés éliminer de préférence les cellules cancéreuses. Pour décrire la douleur des souris greffées dans le foie, le porteur invoque des "données cliniques chez l'homme" selon lesquelles les tumeurs intrahépatiques "ne sont pas douloureuses", tout en écrivant que la nuisance "peut augmenter avec la taille de la tumeur".
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis 3 injections successives (30 secondes chacune) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Immuno-virothérapie du cancer du foie 2/3
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
Anesthésie gazeuse, puis greffe de tumeur du foie sous la peau du flanc pour la moitié des lots, ou incision de l'abdomen et trois injections dans le foie pour l'autre moitié : ainsi commence le protocole pour les 882 souris de ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Entre J+3 et J+17, certains lots reçoivent trois injections intrapéritonéales ou intratumorales d'un vaccin à ARNm contre l'alpha-fœtoprotéine ou de virus oncolytiques, et certaines souris subissent sept anesthésies sur six semaines pour des échographies ou de l'imagerie par bioluminescence. Les tumeurs sous la peau sont mesurées au pied à coulisse tous les deux ou trois jours. Toutes les souris sont tuées à l'issue de chaque procédure, et leurs organes prélevés pour des analyses biochimiques et moléculaires.
Objectifs
Le projet concerne un nouveau traitement du cancer du foie, une des causes les plus courantes de décès liés au cancer avec une incidence en constante augmentation (830 000 décès dans le monde en 2020). L’absence de traitement efficace et les difficultés de diagnostic précoce en font un cancer de mauvais pronostic par le plan stratégique national décennal de lutte contre le cancer (survie à 5 ans de seulement 18%). Le carcinome hépatocellulaire représente plus de 80% des cancers primitifs du foie et se développe fréquemment sur un fond de maladie hépatique chronique causée par l'alcool, l'hépatite virale B ou C chronique ou le syndrome métabolique associé à un excès de poids et au diabète. Le carcinome hépatocellulaire est souvent diagnostiqué tardivement et se prête mal à un traitement curatif. L'objectif du projet est d’apporter la preuve de concept du bénéfice de l’association d’une vaccination antitumorale ciblant un antigène associé aux tumeurs hépatiques : l’alpha-fœtoprotéine, avec l’action de virus oncolytiques (virus capable d’éliminer préférentiellement les cellules cancéreuses) dans un contexte de cancer du foie. Pour la formule de vaccin, nous utiliserons de l’ARNm codant l’alpha-fœtoprotéine, qui est l’antigène candidat reconnu le plus prometteur pour les vaccins cancer du foie. L’ARNm utilisé comportera les modifications moléculaires qui ont démontré leur valeur dans les vaccins ARNm actuellement très utilisés dans la pandémie COVID. L’ARNm sera associé à des NanoParticules Lipidiques pour servir de vaccin à des groupes de souris, porteuses de tumeurs du foie. L’effet protecteur et curatif de la vaccination ainsi que l’apport d’un traitement combinant le vaccin et le virus oncolytique seront évalués. Ce projet est réparti sur 3 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Les traitements du carcinome hépatocellulaire restent insatisfaisants. Ils reposent essentiellement sur des interventions lourdes ou des thérapies peu efficaces. L’immunothérapie est basée sur la stimulation du système immunitaire du patient et reste une option thérapeutique de choix, mais en l’état elle doit être améliorée pour atteindre un niveau d’efficacité satisfaisant. Les essais de vaccination contre les antigènes associés aux tumeurs du carcinome hépatocellulaire reposent essentiellement sur l’utilisation de peptides ou de protéines recombinantes. Des avancées récentes dans l’utilisation d’ARNm modifié dans la composition de vaccins, notamment par le développement de vecteurs de nano particules lipidiques, ouvrent de nouvelles perspectives vaccinales. La récente démonstration pour les mélanomes de l’efficacité de l’association de l’immunothérapie des points de contrôle immunitaire avec la vaccination par des nanoparticules lipidiques chargées avec des ARNm codant des antigènes associés aux tumeurs des mélanomes ouvre la voie à de nouvelles thérapies pour d’autres cancers. L’originalité du projet repose sur la combinaison de l’action de virus oncolytiques provoquant la destruction de la tumeur ouvrant ainsi l’accès aux cellules tumorales pour les réponses immunitaires spécifiques induites par le vaccin ARN. La combinaison de thérapies impliquant différents mécanismes d’action anti-tumoraux apportera 1) la spécificité antigénique initiale grâce à la vaccination favorisant l’infiltration lymphocytaire intra-tumorale, et 2) la lyse tumorale amplifiée grâce aux virus oncolytiques favorisant ultérieurement la réponse immunitaire.
Procédures
La moitié des lots de souris subira une anesthésie gazeuse d'environ 5 minutes puis une injection sous-cutanée de 30 secondes. L'autre moitié des lots subira une anesthésie gazeuse d'environ 20 minutes, pour effectuer une incision de l'abdomen d'un centimètre., puis 3 injections successives (30 secondes chacune) dans le foie. Certains animaux subiront ensuite 7 anesthésies gazeuses d'environ 5 à 20 minutes chacune afin d'effectuer à chaque fois une échographie et/ou une imagerie par bioluminescence, sur une durée totale de 6 semaines. Parmi les lots décrits précédemment, certains lots subiront en plus trois injections intrapéritonéales et/ou 3 injections intratumorales ou intrahépatiques (30 secondes pour chaque injection) entre J+3 et J+17 post greffe.
Impact sur les animaux
La greffe de tumeur en sous-cutané est un geste rapide et peu douloureux pour l'animal (piqure d’aiguille dans le flanc) et sera réalisé sous anesthésie générale. Pour cette procédure, un stress peut intervenir lors de la préhension de l'animal et une douleur légère au point d'injection. La taille des tumeurs sera mesurée tous les deux ou trois jours à l’aide d’un pied à coulisse digital. Un stress lors de la préhension de l'animal pourrait survenir. La greffe de tumeur en intrahépatique implique une anesthésie générale de l’animal. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. Ensuite, l’animal endormi subira une laparotomie mineure. Une douleur au niveau de la suture pourrait apparaître et sera prise en charge par une analgésie adaptée. Les données cliniques chez l’homme montrent que les tumeurs intrahépatiques ne sont pas douloureuses. Les effets indésirables particuliers en réponse aux traitements seront quasiment absents. En effet, la stratégie vaccinale par nanoparticules lipidique (NPL) et l’utilisation de virus oncolytiques (VO) ont déjà été validées dans des protocoles précédents et ces traitements n'ont pas engendré d'effets indésirables notoires lors de leur mise en œuvre. L’administration des traitements engendrera une douleur légère au point d’injection (intrapéritonéal pour les NPL, ou intra-tumoral pour les VO). Le niveau de nuisance dû à la croissance tumorale peut augmenter avec la taille de la tumeur. Les compétences des manipulateurs et des points limites adaptés permettent de limiter et prendre en charge efficacement douleur et stress. Enfin, le suivi longitudinal de la taille des tumeurs en greffes orthotopiques sera réalisé sur animal anesthésié sur une courte période (quelques minutes) par échographie et bioluminescence. Un stress lors de la préhension de l'animal et de l'induction de l'anesthésie pourrait survenir. La suite de la procédure est non invasive, non douloureuse. Pour la bioluminescence, une injection IP est réalisée pourra engendrer une douleur légère au point d’injection.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de chacune des procédures et leurs organes prélevés en post-mortem pour des analyses biochimiques et moléculaires ultérieures.
Remplacement
Le foie est un organe très complexe du point de vue tissulaire et comporte une haute diversité cellulaire. En effet, les hépatocytes, principale composante cellulaire du foie, sont des cellules épithéliales donc polarisées. Les cultures in vitro en 2D ne peuvent reproduire cette polarisation, limitant ainsi les modèles de remplacement à des cultures d'organoïdes ou d'organe sur puce. Ces modèles reproduisent bien les fonctions métaboliques des hépatocytes et permettent des études de toxicité des molécules à visée thérapeutique (ils seront d'ailleurs utilisés en amont de ce projet dans ce but). De nombreuses autres cellules participent à l'homéostasie du tissu hépatique, notamment les cellules immunitaires (macrophages, lymphocytes...). A ce jour, quelques modèles in vitro proposent de reproduire une partie cette complexité cellulaire. Notre projet étant une investigation thérapeutique reposant sur l'immunité de l'organisme et impliquant la communication entre différents compartiments tissulaires (cellules tumorales, microenvironnement tissulaire, système immunitaire de la souris), nous ne pouvons remplacer ce modèle animal par aucune méthode alternative actuelle, même les plus complexes.
Réduction
Les formules moléculaires des nanoparticules lipidiques et des virus oncolytiques seront analysées et présélectionnées par une série d’essais in vitro sur cellules immunitaires et hépatiques en culture. Cette sélection in vitro des meilleures formules moléculaires contribuera à réduire le nombre d’individus inclus dans l’expérimentation animale et permettra d’affiner les protocoles en fonction du type de réponses immunitaires désiré. Seules les formules présentant un intérêt entreront dans les traitements chez la souris. Un suivi longitudinal de la taille des tumeurs de chaque animal sera réalisé et permettra de réduire drastiquement le nombre d'animaux qui aurait été utilisé pour obtenir des courbes de croissance tumorale par sacrifice des animaux à chaque temps étudié. Enfin, un calcul des effectifs nécessaires basé sur une variable biologique simple (taille de la tumeur) nous permettra d'atteindre une significativité des résultats avec un minimum d'animaux.
Raffinement
Le raffinement du protocole prendra en compte le suivi de la taille des tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse (greffe ectopique) ou d'une imagerie non invasive (échographie, bioluminescence, pour les greffes orthotopiques) afin de s'assurer qu'elles restent inférieures à la taille classiquement utilisée comme point limite en cancérologie chez la souris. Afin de raffiner notre approche in vivo, nous nous basons sur des études précédentes qui montrent une excellente tolérance des complexes Lipidots-ARNm et sur une étude qui montre que la prise de greffe est influencée par le moment de la journée où elle est pratiquée. Nous choisirons donc le moment de la journée le plus favorable à la greffe. De plus, les animaux seront toujours hébergés en groupes avec un enrichissement du milieu. Un suivi quotidien des animaux sera effectué. L’utilisation d’analgésique sera réalisée si nécessaire et suivant les procédures décrites dans ce projet afin de réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal. Les animaux seront transportés par un expérimentateur comptétant suivant la réglementation, dans des cages occultées, contenant de l'enrichissement et des croquettes mouillées.
Choix des espèces
Le développement de tumeur par greffe syngénique chez la souris est facilement réalisable, reproductible et est un modèle de référence dans le domaine de l’immuno-oncologie. Les lignées de souris présentent l'intérêt d'être génétiquement homogènes, réduisant ainsi la variabilité des réponses immunitaires. Nous emploierons des souris de deux souches différentes qui présentent l'avantage d'être bien connues dans leur capacité de réponse immunitaire. Nous disposons de différentes cellules issues de tumeurs du foie chez ces souris, qui pourront donc être greffées dans des souris immunocompétentes (modèle syngénique) et présentant des différences de réponses inflammatoires intéressantes pour ce projet. Les souris utilisées seront âgées de 8 semaines pour les greffes, ainsi que décrit dans la littérature. C’est aussi le stade de développement auquel leur immunité est effective.
Thérapie génique des tumeurs solides : CRISPR/Cas9 et photothérapie dynamique
- Recherche fondamentale
- Oncologie
88 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de cellules tumorales humaines sous la peau puis des séances d'imagerie deux fois par semaine pendant quatre semaines, avant mise à mort pour analyse des tumeurs. Le porteur décrit des brûlures cutanées légères liées à l'éclairage, une gêne ou une ulcération de la tumeur et une douleur à l'injection, pour une preuve de concept d'une photothérapie anticancéreuse. Sur le remplacement, il affirme que le test chez l'animal est "nécessaire" et que le rôle du microenvironnement tumoral impose le "modèle animal".
Objectifs
L'objectif est de montrer l'efficacité de la photothérapie dynamique dans le carde du traitemen de tumeurs solide.
Bénéfices attendus
Preuve de concept de l'efficacité de la thérapie par la lumière dans le traitement anti cancéreux.
Procédures
Injection des cellules en sous cutané : sur animal anesthésié, une seule fois, durée 1 minute. Imagerie optique : nécessite une injection IP sur souris vigile au préalable, puis imagerie sur souris anesthésiée (5 minutes), 2 fois par semaine pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Légères brulures cutanées liées à l'éclairage. Gêne et/ou ulcération de la tumeur. Douleur au moment de l'injection dans le péritoine. Stress.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de l'étude afin de réaliser une étude histologique des tumeurs.
Remplacement
L'objectif étant de développer des thérapies applicables chez l'homme, le test de faisabilité chez l'animal en amont est nécessaire. De plus dans ce projet nous souhaitons tester notre approche thérapeutique dans un contexte tumoral sachant que le microenvironnement joue un rôle primordial, le modèle animal est nécessaire.
Réduction
L'imagerie optique permet de faire un suivi au cours du temps sur un même animal. Cette méthode permet donc de diminuer le nombre d'animaux au final.
Raffinement
Les lieux d'hébergement et d'expérimentation sont différents. Le transfert des animaux d'un lieu à l'autre se fera dans une cage de transport dédiée munie d'un couvercle filtrant. La cage contient litière, nourriture, eau et est transportée dans un sac à l'abri des regards extérieurs. Le trajet dure quelques minutes. Les souris sont hébergées en groupes avec un enrichissement du milieu (maison en carton, coton). Toutes les procédures sont réalisées sur animal anesthésié et lors de l'anesthésie les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour éviter l'hyporthermie. Les animaux sont quotidiennement suivis par l’expérimentateur et en cas de signes de souffrance un analgésique sera administré. Si la souffrance persiste, l’expérience sera stoppée.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car la taille de l'animal est adaptée à l'imagerie optique. Nous utiliserons des souris immunodéprimées NSG car nous injecterons des cellules d'origine humaine. Les souris seront utilisées à un âge adulte compris entre 8 et 12 semaines car à cet âge là les animaux sont facilement manipulables rendant la contention aisée.
Carbamylation et stockage tissulaire du Sodium chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
26 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie reçoit du cyanate de sodium dans l'eau de boisson et subit des séances d'IRM une à deux fois par semaine de la dixième à la vingt-et-unième semaine, huit autres subissant une ablation partielle du rein pour reproduire une insuffisance rénale chronique, avant mise à mort pour prélever les tissus. Le porteur affirme étudier le lien entre le stockage du sel sous la peau et une modification des protéines de ce tissu, au bénéfice d'une meilleure compréhension de l'insuffisance rénale chronique renvoyée à un horizon lointain. Sur le remplacement, il indique que l'IRM humaine ne serait pas assez sensible et que le phénomène ne peut pas s'analyser in vitro, concluant à la contrainte d'utiliser la souris.
Objectifs
Le corps humain est composé de 60% de liquide. Classiquement on considère que c’est la différence entre les entrées de sel (alimentation, boisson) et les sorties de sodium (urines, sueur, selles) qui permet de maintenir à l’équilibre les différents compartiments liquidiens. Cette vision classique fait donc un lien simple entre le stock en sodium et le stock en liquide, où un bilan positif en sodium s’accompagne d’une augmentation du volume liquidien en dehors des cellules. Cependant, différentes études ont mis en évidence que l’augmentation du stock en sel n’entraine pas systématiquement d’augmenation du stock de liquide. Ces constations ont conduit à la mise en évidence de zones de stockage de sel au niveau cutané et musculaire . Les voies de régulation de ces stocks sont semblent être modifiés dans différentes maladies. Les objectifs de notre projet visent à étudier le lien entre le stockage du sel sous la peau et la carbamylation des protéines de ce tissu . Nous faisons l’hypothèse que la carbamylation de ces protéines modifie le stockage du sodium dans ce tissu. . Le CDP le plus caractéristique est l'homocitrulline. Les protéines carbamylées s’accumulent dans la peau et les muscles avec l’âge, cette accumulation s’intensifie dans certaines conditions pathologiques comme la maladie rénale chronique.
Bénéfices attendus
En analysant l’effet de la carbamylation des tissus sur le stockage du sel sous la peau, notre projet permettra de poursuivre la caractérisation de ce compartiment de réserve en sel de l’organisme. La carbamylation étant amplifiée au cours de l’insuffisance rénale chronique nous pourrons envisager l’impact de cette modification biochimique sur l’accumulation cutané de sel dans cette pathologique et sa répartition entre peau et muscle, ce qui permettra de mieux comprendre cette maladie au cours de laquelle la gestion du sel de l’organisme est d’une grande importance (problème d’oedèmes, d’oedème aigu du poumon, d’hypertension artérielle).
Procédures
Pour les animaux avec le régine cyanate de sodium, les 6 animaux alimentés en cyanate de Na (0,5 mM) via l’eau de boisson et les 6 animaux alimentés en NaCl (0,5 mM) via l’eau de boisson seront eront imagés une à deux fois par semaine à partir de la 10ème semaine jusque l'euthanasie (semaine 21) Si les résultats obtenus avec le cyanate démontrent une modification des concentrations sodiques tissulaires par IRM (imagerie par resonance magnétique), un protocole d'IRC (insuffisance rénale chronique) sera alors envisagé. Pour cela, 8 animaux seront opérés (néphrectomie subtotale), et 6 animaux seront nécessaires pour les animaux contrôles IRC, donc au total : Les 12 animaux seront imagés une à deux fois par semaine à partir de la 10ème semaine jusque l'euthanasie (semaine 21)
Impact sur les animaux
Les animaux seront sous anesthésie générale (Isoflurane) durant les manipulations, puis euthanasiés en fin de protocole, nous ne pensons pas qu'il y aura des complications ou d'effets secondaires suite au régime sous cyanate de sodium. Par ailleurs, le modèle basé sur l'ajout de cyanate de sodium dans l'eau de boisson des souris a déjà été validé et utilisé précédemment dans d'autres projets de l'équipe. Les souris recevant ce traitement n'ont jamais montré quelconque signe de souffrance ou effet secondaire
Devenir
Les animaux seront euthanasié en fin de procédure afin de recupérer les tissus nous permettant de réaliser des expériences d'immunohistochimie.
Remplacement
Ce projet ne peut pas être remplacé par une étude clinque basée sur l'utilisation de patients insuffisants chroniques car la sensibilité des IRM pour l'imagerie humaines n'est pas assez sensible. Nous étudions un système complexe qui ne permet pas d’analyser le phénomène in vitro également. En effet l’accumulation de sodium tissulaire est régulée par les systèmes immunitaire et lymphatique. Un régime riche en sodium augmente la synthèse, la polymérisation et la sulfatation des glycosaminoglycanes et stimule la croissance des vaisseaux lymphatiques ce qui favorise la clairance du sodium stocké en sous-cutané. L’impact de la carbamylation des protéines de la matrice extra cellulaire sur ce phénomène n’est pas connu.
Réduction
Un calcul de puissance statistique a été effectué pour utiliser le nombre minimal mais suffisant pour observer une une différence significative entre les différents groupes. Nous prévoyons d'utiliser pour cela, au maximum, un nombre de 26 animaux.
Raffinement
Préalablement à la mise en place des expérimentations, les animaux seront hébergés dans des cages à raison de 3 souris par cage au maximum. En cas d'affrontement entre les animaux, le nombre de souris par cage sera réduit en conséquence. L'eau et la nourriture seront mis à disposition ad libitum et la litière changée régulièrement. Afin de limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies de divers équipements d'activité (igloos, tubes en carton, papier...). À leur arrivée dans l’animalerie et avant toute manipulation, les souris subiront une phase d’acclimatation aux conditions d’hébergement du laboratoire durant une période de 10 jours. Le suivi du protocole et de sa réalisation sera effectué par les responsables du projet en concertation avec la structure en charge du bien-être animal et les animaux seront anesthésiés durant toute la durée de l'expérience , de manière à n'induire aucune souffrance. Durant la phase d’anesthésie, si une détérioration irréversible de l'état de l'animal est observée (accélération anormale du rythme cardiaque ou suffocation ou hypothermie importante), alors l'animal sera immédiatement euthanasié. L'utilisation de l’IRM est également à la base de ce projet . Il s'agit d' une technique d’imagerie préclinique non invasive permettant de réaliser un suivi longitudinal du même animal. Concernant les animaux IRC, une injection d'analgesique sera réalisée avant le début de l’intervention pour la néphrectomie et sera répétée après 12h (2x/jours) et appliquée sur une durée de 3 jours).
Choix des espèces
Le modèle de nephrectomie a été développé chez la souris et l'antenne Na de l'IRM également ce qui nous contraint a utilisé uniquement cette espèce. En référence à nos résultats antérieurs, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines pour réaliser la néphrectomie.