Souris
Effet du stress sur un modèle murin de maladie auto-inflammatoire monogénique
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
324 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris génétiquement modifiées pour porter une mutation de la fièvre méditerranéenne familiale présentent un poids inférieur de 30 à 40 % et une perte de poils, et subissent des prises de température rectales répétées, des prélèvements sanguins et des injections quotidiennes pendant deux semaines. Le porteur ajoute des situations de stress pour amplifier la réponse inflammatoire et prévoit la mise à mort pour analyses immunologiques et histologiques. Il affirme que la réponse au stress n'est pas modélisable hors d'un "organisme entier" et présente les retombées thérapeutiques au conditionnel.
Objectifs
La fièvre méditerranéenne familiale (FMF) est une maladie auto-immunitaire héréditaire, assez fréquente dans certaines régions. Elle est caractérisée par des épisodes récurrents et imprévisibles d’inflammation (réaction de défense immunitaire), qui à long terme peuvent entraîner de graves complications et éventuellement la mort. La solution thérapeutique actuelle est basée sur une administration quotidienne et à vie d'un médicament (qui désassemble certains composants intracellulaires), mais 5 à 10% des patients FMF y sont intolérants ou résistants, d’où l’importance de développer de nouveaux traitements. À ce jour, les mécanismes précis responsables de telles crises inflammatoires chez ces patients demeurent inconnus. Néanmoins plusieurs hypothèses, découlant directement d’observations cliniques (dont le rôle de certaines hormones sexuelles et de molécules du stress), sont maintenant validées en culture cellulaire. En particulier, le stress serait capable d’amplifier l’activation de la réponse inflammatoire impliquée dans la FMF. Reste à comprendre comment ce dialogue a lieu, et montrer en quoi il représente une piste thérapeutique prometteuse. La FMF est due dans la plupart des cas à des modifications génétiques touchant une protéine "récepteur" de l'immunité (la pyrine), dérégulée chez les patients. La majorité de ces mutations affectent un domaine particulier de la pyrine. Il existe des modèles cellulaires pour étudier ces modifications pathologiques dans des cellules en culture, mais leur indispensable analyse à l'échelle de l'organisme est rendue difficile par l’absence de ce domaine particulier chez la Souris. Ceci explique l’intérêt de travailler sur un modèle de Souris génétiquement modifiées pour exprimer ce domaine humain portant des modifications typiques de la FMF. L’objectif de ce projet est d’étudier la modulation des symptômes inflammatoires chez ces souris, par des actions stimulatrices ou inhibitrices sur les signaux de stress, afin de mieux comprendre la régulation des crises inflammatoires et d’en proposer d’éventuels leviers de contrôle.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus sont à la fois scientifiques (progrès des connaissances sur certaines maladies immunitaires génétiques) et cliniques : 1) À court terme : mise en évidence du rôle des signaux de stress dans la FMF, et de nouvelles voies à cibler pour moduler les symptômes. 2) A plus long terme : mieux comprendre l’origine des crises inflammatoires (dont les facteurs environnementaux par exemple certains stress), et possiblement tester des traitements innovants (plus ciblés et moins toxiques, utilisables à des moments précis de l’évolution de la maladie, potentiellement préventifs aussi).
Procédures
Interventions effectuées: 1) Prise de température rectale (durée
Impact sur les animaux
Les gestes techniques prévus dans les procédures sont de potentielles sources de stress transitoire et/ou de douleur locale. D'autre part les souris "modèles" de la maladie présentent un phénotype susceptible d’affecter leur bien-être (poids final 30 à 40% plus faible que les souris "sauvages", perte locale de poils, organes immunitaires plus volumineux); nous prévoyons donc un contrôle continu de leur élevage (croisement entre parents hétérozygotes, non malades) en fonction du déroulé et des résultats des expériences. Enfin certains traitements sont susceptibles d’entrainer des effets secondaires, notamment gastriques. D'où les mesures de raffinement, de suivi et de dosage approprié.
Devenir
Mise à mort de tous les animaux participant aux procédures d'expérimentation, pour analyses immunologiques et histologiques post-mortem en lien avec les objectifs du projet.
Remplacement
L’analyse in vivo est indispensable pour remplir les objectifs du projet (suite aux tests préliminaires déjà réalisés in vitro), et pour s’assurer d’une potentielle relevance clinique. En particulier la réponse au stress n’est pas modélisable en dehors d’un organisme entier, d’où l’intérêt d’y d’étudier la réponse inflammatoire dans différents contextes.
Réduction
De nombreux paramètres seront étudiés sur chaque animal inclus dans le projet (mesures corporelles et exploitations post-mortem). De plus l’effectif annoncé est le maximal (révisable à la baisse en fonction des premiers résultats), avec un premier "essai pilote" déterminant. Les nombres d’animaux sont calculés pour permettre des analyses statistiques robustes, en accord avec les objectifs scientifiques et en limitant autant que possible la taille des effectifs.
Raffinement
Nous prévoyons les points de raffinement suivants : 1) Entrainement à la contention (une fois par jour, une semaine avant le début de l'expérience) pour minimiser angoisse et biais secondaire. 2) Anesthésie gazeuse et application locale de collyre lors des prélèvements sanguins rétro-orbitaux. 3) Utilisation de lubrifiant pour les prises de température rectales, et adaptation de la taille de la sonde au gabarit des souris. 4) Minimisation de la fréquence de manipulation (observation et privilège aux mesures les moins intrusives). 5) Mise à disposition de moyens d’hydratation supplémentaires si diarrhées observées en réaction aux inhibiteurs. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux et les expériences menées avec des précautions sur l’âge des souris (
Choix des espèces
Il est ici nécessaire d’étudier un système intégré (in vivo, Vertébré Mammifère), avec un fonctionnement immunitaire reposant sur les mêmes types d’acteurs cellulaires et moléculaires que l’humain. La souris en est un modèle idéal, permettant aussi un accès aux lignées génétiquement modifiées et phénotypes issus de mutations, indispensables pour l’analyse de maladies génétiques comme ici. Les animaux transgéniques envisagés pour ce projet permettent une bonne modélisation des réponses observées chez les patients. L’âge des animaux sera de 6 semaines en fin de procédure expérimentale, dont les expériences de stress (durée maximale après l’injection du traitement : 9h). Les expériences d’injection des inhibiteurs débuteront à l’âge de 4 semaines (pour avoir maximum 2 semaines de suivi), car le phénotype est précoce chez les souris modèles de la FMF et l’espérance de vie est plus courte. Cette chronologie permettra aussi d’inclure le délai de génotypage des petits.
Evaluation de l’efficacité de candidats médicaments dans le domaine de la douleur chez la souris, à l’aide d’un outil de screening basé sur une batterie de modèles et tests.
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
3000 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Chaque animal subit un des sept modèles de douleur, aiguë, inflammatoire, neuropathique ou postopératoire, avec chirurgies, injections et prélèvements sanguins, le porteur décrivant des brûlures des pattes ou de la queue, des crampes abdominales et une possible automutilation de la patte opérée. Il précise que les animaux restent douloureux et ne peuvent être replacés, d'où leur mise à mort en fin d'étude. Il s'agit d'une "prestation de service" commerciale d'évaluation de candidats médicaments pour des "clients", la douleur étant délibérément provoquée sur des souris de cinq semaines.
Objectifs
Le développement de médicament passe par de nombreuses étapes. Un médicament peut avoir plusieurs activités. Il est intéressant dès les premiers stades de développement de tester le principe actif dans différentes douleurs afin d’évaluer son efficacité. Ceci va permettre d’orienter le candidat-médicament vers un domaine d’application. Dans le cadre de ce projet, nous souhaitons proposer un service d'évaluation de la douleur chez la souris. Le but est de tester sur un minimum d’animaux des composés actifs sur des modèles/tests prédictifs de différentes aires de douleurs. Cette offre s’appuie sur une sélection de 7 modèles dans différents types de douleur (douleur aigue, inflammatoire, neuropathique et post-opératoire) et tests comportementaux permettant d’appréhender les multiples composantes de la douleur. Ces études d’efficacité antalgique sont exclusivement réalisées chez la souris offrant des mesures robustes et reproductibles sur la base de modèles parfaitement décrits, calibrés et admis par la communauté scientifique. Compte-tenu de la problématique traitée par le laboratoire et du fait que la caractérisation d’une molécule d’intérêt ne permet pas actuellement de remplacer l’étude de son efficacité chez l’animal vigile, la Direction de l'entreprise expose clairement son engagement de qualité scientifique, de professionnalisme et d’intégrité dans le respect de la Directive Européenne 2010/63/UE, la loi française et le comité régional d'éthique sur l'expérimentation animale. Dans le cadre de ses activités expérimentales de prestation de service, elle est amenée à administrer des candidats médicaments chez la souris. De ce fait, l'entreprise s’engage à respecter les points limites présentés pour chaque procédure et à informer le comité d'éthique a posteriori de tout effet majeur induit par l’administration du candidat médicament portant préjudice au bien-être de l’animal. Le projet est découpé en 6 procédures décrivant les 7 modèles et tests.
Bénéfices attendus
Ce service permettra aux clients, d’évaluer rapidement des candidats médicaments efficaces dans différents types de douleur.
Procédures
Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané (s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m). Ces administrations se réalisent sur animal vigil. Des traitements en co-adminsitration peuvent également se réaliser. Ces injections durent entre 30 secondes et 1minute. Pour certaines procédures les souris subissent une chirurgie. La chirurgie du modèle post-opératoire dure entre 5 et 7 minutes. La chirurgie du modèle de neuropathie dure environ 15minutes. Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie. Ces prélèvements sont rapides et durent quelques minutes. Il peut également y avoir des prélèvements répétés, limités à 6 sur une cinétique.
Impact sur les animaux
Dans le domaine de la pharmacologie préclinique de la douleur, l’induction des modèles entraîne inévitablement l’apparition de symptômes douloureux. Les effets attendus sont différentes tyesde douleurs en fonction des modèles : douleur locale, crameps abdominables, brulures au niveau des pattes, de la queue. Pour les chirurgies, les effets indésirables peuvent être un non-réveil suite à l’anesthésie ou une mauvaise cicatrisation de la plaie. Les effets indésirables peuvent être une automutilation de la patte opérée ou une mauvaise cicatrisation. Les animaux peuvent recevoir un traitement par voie orale (p.o), intrapéritonéale (i.p), sous cutané(s.c) intraveineuse (i.v), sous-cutané plantaire (s.c.pl), Intramusculaire (i.m). Pour l’ensemble des tests, des points limites/nuisances associés à la pharmacologie peuvent aussi apparaitre (tremblement, sédation …). Dans le cadre de certaines études, des prélèvements de sang peuvent être réalisés sous anesthésie (IC, jugulaire, retro-orbital). Le volume de sang total estimé est de 0.7ml/10g pour une souris. En prélèvement unique, 1.2mL de sang peut être prélevé sans réveil de l'animal. Les prélèvements répétés sont limités à 1% de volume de sang total de la souris sur 24h.
Devenir
Une grande partie des modèles utilisés ici sont des modèles stables dans le temps. Les animaux restent donc douloureux. Il n’est donc pas concevable de les replacer. Les autres modèles font mettre en place des processus inflammatoires et donc une réaction immunitaire qui peut interférer avec les autres modèles présents au sein du laboratoire. Il n’est donc pas cohérent de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité de la société.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement de modèles permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésique. Selon sa définition par le IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle ». L’étude de potentiels traitements anti-douleur doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=8 en se basant sur les tests de puissance réalisés lors du développement du modèle et confirmé lors des études subséquentes réalisées par l'entreprise. Cet effectif par groupe a été confirmé lors des stades initiaux de développement du modèle par la réalisation d’un calcul de puissance via BiostaTGV. De plus, cet outil vise à fournir une évaluation rapide des composés testés dans des conditions très calibrées, il est donc réalisé sans les groupes contrôles usuels (groupe recevant le véhicule des composés, groupe recevant une molécule de référence), ce qui permet une réduction du nombre d’animaux et une démarche 3R.
Raffinement
Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude, habituation une semaine à la salle de stabulation, habituation des animaux aux compartiments de tests). Les tests possèdent des valeurs de maximales afin de limiter le temps d’exposition d’un animal à un stimulus douloureux. De l’enrichissement est présent dans les cages afin de limiter le stress et d’améliorer la qualité de vie des animaux (Tunnel en plastique, sizzle nest et briquettes en bois à ronger). L’anesthésie et un suivi post-opératoire sont appliqués pour les chirurgies. Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein du laboratoire. Chez ces espèces la démonstration la capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore développés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) efficacité dans cette espèce des médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente suggérant l’existence de mécanismes biologiques communs. Les animaux utilisés sont âgés d’environ 5 semaines pour toutes les procédures. Ces âges et gamme de poids correspondent à ceux d’animaux jeunes adultes couramment utilisés dans les différents modèles de douleur sur lesquels les procédures ont été validées dans l’entreprise. De plus, des souris plus âgées pourraient présenter des pathologies supplémentaires et interférer avec le screening de molécules.
Nouvelles stratégies thérapeutiques dans L’accident vasculaire cérébral chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
1390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 120 d'entre elles étant maintenues sous anesthésie sans réveil pour une imagerie de six heures. Chaque animal subit une occlusion d'une artère cérébrale pour provoquer un accident vasculaire cérébral, souvent doublée d'une hyperglycémie induite par injection de glucose, avec administration d'agents thérapeutiques et prélèvements sanguins. Le porteur indique que l'ischémie cérébrale provoque une douleur et une perte de mobilité, et prévoit la mise à mort pour prélever les tissus cérébraux. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte de l'efficacité d'un traitement à la phase aiguë d'un AVC associé à une hyperglycémie.
Objectifs
En France, l’accident vasculaire cérébral reste une cause majeure de handicap, de troubles cognitifs et de mortalité. Les seuls traitements disponibles sont soit l’administration d’un médicament permettant de dissoudre le caillot de sang responsable de l’accident vasculaire cérébral, soit un dispositif médical permettant de le retirer chirurgicalement. Ces 2 traitements présentent des limites qui font que seule une minorité de patients peut en bénéficier. Il est donc essentiel de développer de nouveaux traitements qui permettraient de traiter un plus grand nombre de patients. Par ailleurs, l’une des principales complications des accidents vasculaires cérébraux et de leurs traitements actuels est la survenue d’une hémorragie cérébrale qui peut aggraver le pronostic des patients. Pour cette raison, lors de l’évaluation de nouveaux traitements des accidents vasculaires cérébraux, il est donc important de s’assurer qu’ils n’entrainent pas de risque hémorragique. Les objectifs de ce projet sont donc d’évaluer l’efficacité mais aussi la sûreté de nouveaux agents thérapeutiques visant à protéger le cerveau au cours des accidents vasculaires cérébraux.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet donnera des résultats concernant l'efficacité thérapeutique et la sûreté de différents candidats médicaments pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux. Il permettra ainsi d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints d’un accident vasculaire cérébral et ainsi une amélioration de la fonction neurologique et de l’état de santé chez ces patients.
Procédures
Pour cette étude, nous utiliserons un modèle d’accident vasculaire cérébral induit par une occlusion transitoire, réalisée sous anesthésie et analgésie, d’une artère cérébrale moyenne chez la souris. La procédure chirurgicale dure environ 20 minutes. Ce modèle sera combiné à une injection de glucose par voie intrapéritonéale pour provoquer une hyperglycémie aiguë 20 min avant le début de la procédure chirurgicale. Les différents agents thérapeutiques testés seront administrés 30 min après l’occlusion de l’artère cérébrale moyenne. La durée d’injection chez la souris est d’environ 10 secondes. Au total, 1390 souris seront utilisées. 1270 souris dont 1040 seront soumises à une occlusion de l’artère cérébrale pendant une heure avec ou sans hyperglycémie aiguë et 230 souris contrôles sans occlusion de l’artère cérébrale subiront différents examens (dosages biologiques et suivi neurologique) visant à déterminer la sévérité de l’accident vasculaire cérébral. 120 souris subiront également un accident vasculaire cérébral pour étudier les différents acteurs cellulaires impliqués dans la formation du caillot sanguin par imagerie intravitale (au maximum 6 heures). Sur la totalité des souris, des prélèvements sanguins seront réalisés à différents temps (jour 7 avant la chirurgie, 6 heures et 24 heures après l’accident vasculaire cérébral). La durée maximale pour effectuer les prélèvements chez la souris est d’environ de 2 minutes. Toute procédure invasive sera faite sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront mis à mort en fin d'étude et les tissus seront prélevés et stockés pour les analyses biologiques.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront un stress lié aux injections de différents agents thérapeutiques et anesthésiques ainsi qu’aux prélèvements sanguins effectués avant et après ischémie cérébrale. L’induction de l’ischémie cérébrale provoque aussi une douleur chez l’animal et un comportement anormal (perte de mobilité). L’hyperglycémie aiguë peut également entraîner une déshydratation chez l’animal.
Devenir
Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.
Remplacement
Aucun modèle in vitro ne permet de rendre compte de l’efficacité d’un traitement thérapeutique à la phase aiguë d’un accident vasculaire cérébral associé à une hyperglycémie. L'effet biologique des molécules utilisées sur leur cible a été démontré in vitro. La démonstration de leur effet bénéfique thérapeutique avant transposition chez l'homme ne peut se faire que dans un modèle animal proche de la physiopathologie humaine. Les modèles murins d'accident vasculaire cérébral permettent de reproduire la physiopathologie de l'occlusion de l’artère cérébrale chez l'homme.
Réduction
Les modèles d’accident vasculaire cérébral développés chez la souris, sont parfaitement connus et maîtrisés par les expérimentateurs. Les groupes ont été conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux est calculé au plus juste de manière à avoir une puissance suffisante pour l’analyse statistique pour toutes les évaluations réalisées dans les différents groupes au cours du temps. Ces calculs ont été possibles grâce aux résultats antérieurs obtenus avec ces modèles animaux.
Raffinement
Le soin et le suivi des animaux seront faits par des personnes compétentes et expérimentés, journalière par l’animalier et bi-hebdomadaire par l’expérimentateur. La douleur sera évaluée par la mise en place de points limites bien définis à l’aide d’une grille de score. le déficit neurologique sera également évalué à l’aide d’une grille de score bien définis.
Choix des espèces
L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés
Imagerie de la neuroinflammation par ultrasons, chez la souris nouveau-né et la jeune souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des souriceaux reçoivent une injection de molécule pro-inflammatoire dans le péritoine ou directement dans le cerveau à cinq puis trente jours de vie, avec ouverture de la boîte crânienne par craniotomie et imagerie par ultrasons sous anesthésie. Le porteur décrit un retard de croissance, des troubles comportementaux et moteurs, et un risque de mort par surdosage anesthésique, la mise à mort étant justifiée par les injections et la craniotomie subies. Il présente ce modèle comme applicable à terme au nouveau-né prématuré humain et affirme que ces caractéristiques du cerveau en activité sont impossibles à reproduire hors de l'organisme.
Objectifs
La neuroinflammation est une réaction inflammatoire (réaction de l'organisme aux lésions et infections) qui se produit dans le cerveau. Lorsqu’elle survient peu avant ou après la naissance, la neuroinflammation peut impacter des phases critiques du développement du système nerveux central et avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu (handicaps moteurs, troubles comportementaux, déficits cognitifs…). Cette étude vise à mieux comprendre l’impact de l’inflammation sur le développement cérébral. Nous nous intéressons ici à trois caractéristiques du cerveau : la connectivité entre différentes régions cérébrales lorsqu'elles sont activées, l’architecture vasculaire et la rigidité. La connectivité analyse l’activation simultanée de plusieurs aires cérébrales structurellement différentes. La neuroinflammation engendre des défaillances de cette connectivité fonctionnelle. L’inflammation modifie également les vaisseaux sanguins de la zone touchée, puisqu’elle se traduit par un afflux important de sang à cet endroit. L’architecture vasculaire à l’échelle des microvaisseaux fera l’objet d’une partie de cette étude. Enfin, la neuroinflammation, de par ses conséquences au niveau vasculaire notamment, pourrait modifier la rigidité du cerveau, et nous chercherons à quantifier cette modification. Les ultrasons biomédicaux, utilisés à des fins d’imagerie diagnostique, sont un moyen parfaitement adapté à l’étude de ces trois caractéristiques. L’essor considérable qu’ils ont connu au cours des dernières années a permis d’augmenter le niveau de détail des images, spatialement et temporellement, et leur sensibilité. Dans notre étude, trois techniques d’imagerie ultrasonore seront utilisées : les ultrasons fonctionnels pour étudier la connectivité fonctionnelle, l’imagerie superrésolution pour cartographier l’architecture cérébrale à l’échelle des microvaisseaux, et l’élastographie pour mesurer la rigidité du cerveau inflammé.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue à enrichir les recherches faites sur la neuroinflammation chez le souriceau, en utilisant une méthode jusque-là peu utilisée pour étudier ce sujet : l’imagerie par ultrasons. En particulier, l’étude de l’impact possible de l’inflammation sur la rigidité du cerveau constitue la principale avancée de ce projet. A plus long terme, les données collectées serviront à la recherche sur le nouveau-né humain prématuré. La neuroinflammation est en effet une conséquence de la prématurité des enfants, dans 20 à 40% des cas. Elle est à l’origine de la plupart des lésions dans le cerveau du nourrisson, regroupées sous le terme d’encéphalopathie du prématuré. Mieux comprendre les modifications de vascularisation, de connectivité et de rigidité induites par la neuroinflammation contribuera à élargir les outils pronostiques de la prématurité, afin de pouvoir mettre en place des interventions plus précoces et ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Procédures
- Les animaux recevront une injection (à travers le péritoine, sans anesthésie, 1 min ; ou directement dans le cerveau, avec anesthésie, environ 30 min) d’une molécule pro-inflammatoire, à deux stades de croissance différents (5 jours et 30 jours après la naissance). - Les animaux au 30ème jour après la naissance nécessitent une opération chirurgicale d'ouverture de la boîte crânienne, au cours de laquelle ils seront placés sous anesthésie générale (environ 1h). - Toutes les mesures d’imagerie ultrasonore (imagerie fonctionnelle, élastographie, imagerie superrésolution) sont réalisées sous anesthésie générale (durée variable en fonction des mesures à effectuer : entre 15 min et 1h30). - L'imagerie superrésolution nécessite en plus l'injection de microbulles dans la circulation sanguine, réalisée sous anesthésie, à l'aide d'une seringue très fine, adaptée à la taille de l'animal (environ 2 min).
Impact sur les animaux
- L’administration intra-péritonéale (i.e., dans le péritoine) ou intra-cérébroventriculaire (i.e., directement dans le cerveau) peut créer une infection locale dans la zone d’injection. - L’injection de molécule inflammatoire engendre un retard de croissance chez les animaux concernés, qui se traduit morphologiquement par une taille et un poids inférieurs à la normale. De plus, les animaux injectés sont susceptibles de développer des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible…) et moteurs. - Une dose mal estimée d’anesthésie au cours des acquisitions en imagerie peut engendrer le réveil des animaux si trop faible, ou leur mort si overdose, ce qui justifie une étape préalable d'ajustement des doses. - La manipulation des animaux au cours des injections, ainsi que l’injection elle-même, sont sources de stress pour les animaux.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés. Ils auront en effet reçu des injections et/ou subi une craniotomie donc ne pourront pas être maintenus en vie.
Remplacement
Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).
Réduction
Au total, notre projet nécessitera au maximum 1140 animaux. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique.
Raffinement
- Des grilles de scoring en fonction de l’âge des animaux seront proposées pour s’assurer du bien être des animaux et déterminer les points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus des animaux. Suite à l’inflammation, on surveillera régulièrement la prise de poids et l’apparition éventuelle de troubles comportementaux (isolement, agressivité) : la molécule inflammatoire sera injectée le matin, puis les animaux seront surveillés 1h, 6h, 10h, 22h et 24h après l’injection (deux personnes se relaieront pour la surveillance). Si l’un de ces points limites est atteint, et/ou à la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés. - Les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. - Pendant les chirurgies nécessaires pour la mise en place des appareils d’imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l’animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure de chirurgie sera interrompue et l’animal euthanasié. - Au cours des acquisitions en imagerie, sous anesthésie générale, les constantes physiologiques suivantes seront mesurées en continu : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de la neuroinflammation, la littérature montre que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; il pourra donc, à plus long terme, être appliqué au cas du nouveau-né humain. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la neuroinflammation sur certaines caractéristiques du cerveau, à différents stades de croissance : les animaux seront utilisés au cours du développement, à un stade encore immature du cerveau (5 jours après la naissance), et à plus long terme, lorsque le cerveau a atteint sa maturité (30 jours après la naissance).
Déterminer si l’autophagie, un mécanisme cellulaire de dégradation, est impliqué dans la résistance aux traitements anti-cancéreux dans les leucémies.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
672 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit un préconditionnement, une greffe de cellules leucémiques par voie intraveineuse et des traitements répétés par gavage ou injections, une partie étant euthanasiée pour prélèvement et les autres gardées en vie jusqu'à un point limite terminal. Le porteur indique que l'installation de la leucémie provoque un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs, une prostration et une hypothermie. Il affirme l'absence de corrélation entre la réponse aux chimiothérapies in vitro et in vivo pour conclure au caractère "indispensable" du modèle murin, tout en ne justifiant le nombre d'animaux que par des "tests statistiques appropriés".
Objectifs
Malgré un taux élevé de rémission après un traitement conventionnel par chimiothérapie, les rechutes reflet d’un mauvais pronostic, sont fréquentes chez les patients atteints du cancer du sang le plus commum, les leucémies. La principale raison est que certaines cellules ont résisté à ce traitement et ont pu proliférer et ainsi reconstituer la maladie. Comme cela a été montré dans d'autres types de cancer, les cellules cancéreuses résistantes sont les cellules qui ont la capacité d’adapter leur métabolisme. L’autophagie, processus impliqué dans la dégradation et le recyclage de composés cellulaires endommagés est un régulateur du métabolisme. Nous émettons maintenant l’hypothèse que cette adaptation soit contrôlée par l’autophagie, un mécanisme également impliquée dans de nombreuses maladies telles que le cancer. En effet, l’autophagie favorise la croissance de nombreuses cellules cancéreuses en leur fournissant tout ce dont elles ont besoin pour se multiplier. Elle participe aussi à la résistance aux traitements. Ainsi, ce projet s’intéresse à l’étude de l'implication de l’autophagie dans les mécanismes de résistance aux traitements anti cancéreux dans les leucémies.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera une meilleure compréhension du rôle de l'autophagie dans le développement et la résistance des leucémies. Cette connaissance précise permettra l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques et conduira au développement de médicaments ciblant directement l'autophagie ou bien ses régulateurs. De nouvelles combinaisons thérapeutiques avec des chimiothérapies ou thérapies ciblées existantes pourront alors émerger dans le but d'améliorer la prise en charge et le traitement des patients atteints de leucémie.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis une fois par jour pendant 3 jours à une injection dans la cavité abdominale (intrapéritonéal) de quelques secondes, d'un composé permettant de supprimer le mécanisme d'autophagie dans l'ensemble des organes de la souris. Les animaux seront tout d’abord préconditionnés avec un agent qui va éliminer les cellules de moelle osseuse afin de pouvoir par la suite injecter en une seule fois les cellules leucémiques par voie intraveineuse de quelques secondes dans la veine de la queue (caudale) sur animal vigile c’est-à-dire non endormi, puis à des prélèvements de sang au niveau de la mâchoire (en mandibulaire) de moins de 1 minute espacés d’au moins 1 semaine (4 au maximum) afin d'évaluer la prise tumorale et de récolter du matériel biologique pour des analyses ultérieures. En cas de non-diffusion des cellules leucémiques, nous ferons une ponction osseuse d’environ 5 min en intra-fémoral de cellules sous anesthésie et analgésie adaptée. Une fois l'invasion des cellules établie, les animaux vigiles recevront un traitement journalier de durée variable selon le type de thérapie par voie orale en gavage (pendant 7 jours consécutifs) ou bien par une injection dans la cavité abdominale en intra-péritonéal (pendant 5 jours consécutifs) ou en intra-veineuse (pendant 3 jours non consécutifs). Dans le cas de combinaisons thérapeutiques, il pourra y avoir deux administrations par jour, par exemple gavage + injection intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Les animaux lorsqu’ils sont traités avec les différentes molécules, lors de la greffe ou lors du suivi de prise de greffe (gavage, intra-péritonéal, intra-veineux) pourraient être confrontés à des effets indésirables tels que du stress et/ou une perte de poids. Une gêne physique en cas d'administration orale quotidienne peut également survenir. De plus, la greffe de cellules leucémiques va, comme attendu, permettre l’établissement de la maladie et donc entrainer au bout de plusieurs semaines (variable selon le type de cellules leucémiques injectées) un amaigrissement, une paralysie des membres postérieurs empêchant l’animal d’être mobile et de s’alimenter, une perte d’activité, une prostration, une déshydratation et/ou une hypothermie. De manière plus exceptionnelle, en cas de ponction osseuse, les animaux peuvent ressentir une gêne temporaire au niveau de la mobilité. Très rarement, il peut y avoir également apparition de masses tumorales solides, d’origines leucémiques, dans diverses localisations (organes, tête).
Devenir
Une partie des animaux sera euthanasiée afin de prélever la moelle osseuse, la rate et le foie (et potentiellement le tissu adipeux) afin de caractériser les cellules leucémiques résistantes aux traitements, 3 jours après la fin du traitement. Pour les autres souris, l'objectif sera de savoir si le traitement améliore leur survie. Dans ce cas les animaux post-traitements seront gardés en vie et ils ne seront euthanasiés que lorsqu'ils présenteront un point limite terminal.
Remplacement
Dans le but d’évaluer la contribution de l’autophagie dans le développement leucémique et la résistance aux traitements anti-cancéreux, des tests chez l’animal sont nécessaires car il n’existe pas de modèle in vitro permettant de récapituler de façon fidèle l’évolution du cancer au sein d’un organisme vivant. Bien que certains modèles in vitro permettent d’obtenir un premier niveau de compréhension, ils ne sont pas suffisants car ils ne tiennent pas en compte de l’environnement des cellules cancéreuses comme lorsque celles-ci sont au sein d’un organisme en entier car ce dernier peut modifier leur comportement. Par exemple, nous avons montré une absence de corrélation entre la réponse aux chimiothérapies in vitro et celle in vivo, rendant nécessaire l’utilisation de modèle in vivo. Afin d’appliquer nos résultats au stade clinique chez l’homme, il est indispensable d’avoir des preuves d’efficacité in vivo dans des modèles murins.
Réduction
Le nombre minimum de souris nécessaires par groupe a été établit grâce aux études antérieures du laboratoire et notamment à l’utilisation de tests statistiques appropriés.
Raffinement
L'expérimentation fait l'objet d'une procédure de suivi du bien-être des animaux adaptée au modèle et aux potentiels effets indésirables des procédures : les animaux seront observés quotidiennement et le milieu sera enrichi avec du papier et des frisottis pour améliorer le bien-être. Les études antérieures ont permis de mieux appréhender les points limites et ont permis l’établissement d’une liste de différents points limites qui seuls ou cumulés vont nécessiter l’euthanasie de l’animal. Un suivi de la présence de cellules cancéreuses dans le sang ou dans la moelle sera réalisée (toutes les une à deux semaines à partir de 4 semaines après la greffe), une pesée et une évaluation hebdomadaires du comportement et de l'aspect physique permettra de mettre en place des actions précoces et adaptées.
Choix des espèces
Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à comprendre pourquoi les cellules cancéreuses résistent aux traitements. Ils présentent des avantages pratiques tels que la croissance rapide, un cycle de reproduction court, la facilité de transport, de manipulation et d’adaptation aux différentes conditions expérimentales. Dans cette étude, nous utilisons des souris âgées d’environ 6 à 11 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.
Etude de l’effet de faibles doses de rayonnements ionisants externes de type gamma et d’un régime riche en lipides sur la microvascularisation cérébrale et cardiaque chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies animales
736 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque animal est irradié aux rayons gamma sur le corps entier pendant une contention d'un quart d'heure, une partie recevant un régime riche en lipides, avec des échographies sous anesthésie et un prélèvement d'organes terminal. Le porteur affirme que l'irradiation à faible dose n'entraîne ni douleur ni brûlure et se limite à un stress de contention. Il présente l'étude comme une contribution aux normes de radioprotection, en complément d'études épidémiologiques jugées insuffisantes.
Objectifs
L’objectif de notre étude est d’identifier la réponse de la microvascularisation cardiaque et cérébrale à une exposition aigüe à des doses faibles à modérées de RI, associée ou non à un facteur de risque tel qu’un régime riche en graisse. Pour cela, l’évaluation de potentielles conséquences sur les troubles moléculaires, physiopathologiques, phénotypiques et fonctionnels cardiaque et cérébral sera réalisée. L’objectif de ce projet sera d’évaluer cette hypothèse par un modèle expérimental d’exposition externe unique aux rayonnements gamma corps entier. Les effets des doses faibles à modérées de rayonnements ionisants gamma à long terme sur le les vaisseaux du cœur et du cerveau seront évalués afin d’apporter des réponses très attendues quant aux questions des effets biologiques pouvant induire des pathologies non-cancéreuses comme les pathologies cardiovasculaires pour permettre d’alimenter le système de radioprotection. En mimant une exposition à des doses faibles à modérées, ce projet sera complémentaire aux études épidémiologiques et permettra d’apporter des réponses notamment dans les gammes de doses où les études épidémiologiques manquent de puissance statistique
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir de nouvelles connaissances sur les effets à long terme d’une exposition de doses faibles à modérées sur la microvascularisation (cardiaque et cérébrale), afin de participer à la détermination des normes en radioprotection pour des institutions du domaine de la radioprotection.
Procédures
Pour les animaux exposés aux rayonnements gamma, l’irradiation durera maximum 10 minutes. Ainsi la durée de contention des souris en boîte d’irradiation sera maximum de 15 (10 min d’irradiation + 5 minutes de préparation). Certains lots recevront un régime alimentaire riche en lipides pendant toute la durée de l’étude. Pour tous les animaux, les échographies sont non invasives et effectuées sous anesthésie. L’ensemble des prélèvements sera réalisé en terminal.
Impact sur les animaux
L’irradiation à de faibles doses n’entraine pas de douleur ni de brulure aux animaux, seules des modulations d’expression protéique et une légère diminution de la fonction cardiaque a été observée à long terme. Néanmoins un stress des animaux est possible lors de la mise en boite d’irradiation même s’il y a habituation au tube à contention. L’ajout d’un régime riche en graisse n’impact pas le bien-être des animaux. Cela peut pour les temps longs les faire prendre du poids.
Devenir
A la fin de la procédure, toutes les souris seront euthanasiées pour prélever des organes (cœur et poumons) qui permettront une analyse histologique complétant les analyses fonctionnelles réalisées sur tous les animaux de ce projet.
Remplacement
Pour mimer l’exposition corps entier de résidents vivants en zone contaminée ou les travailleurs (après un accident nucléaire par exemple celui de Tchernobyl ou Fukushima), il est nécessaire d’avoir recours à une exposition externe à des doses faibles de rayonnements ionisants gamma (imitant les rayonnements ionisants du CS137) sur un modèle intégré (microvascularisation cardiaque et cérébrale). De plus, les études in vitro présentent des limites pour l’évaluation des mécanismes au niveau cellulaire après une exposition à des doses faibles à modérées et ne permettent pas d’identifier des processus physiologique et/ou physiopathologique, il est de plus très difficile de maintenir des cultures cellulaires au-delà de 3 semaines dû au vieillissement cellulaire et aux cycles limités des cellules.
Réduction
Au total, 736 animaux seront utilisés dans ce projet. Le nombre de 20 à 26 animaux par groupe a été établi avec l’utilisation d’outils statistiques permettant d’optimiser la puissance de l’étude et avec notre expérience concernant ce type d'analyses et ces modèles murins pour être au minimum. Il n’y aura pas 20% de mortalité mais la puissance statistique sera supérieure à celle attendue avec 20 souris. Si nous n’observons pas de mortalité tous les animaux seront pris en compte pour nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe, mais en cas de bagarres, les animaux pourront être isolés. Les souris seront suivies quotidiennement. Elles seront pesées régulièrement une fois par mois. Tout signe de prostration de l’animal, de blessures importantes dues aux bagarres entrainera l’euthanasie anticipée. Les infections ou blessures éventuelles seront traitées localement par application de Vétédine, crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.
Choix des espèces
Ce projet vise à déterminer un seuil dose pour lequel on observe le développement de pathologies microvasculaire (raréfaction au niveau cardiaque ou cérébrale) et également des troubles du rythme cardiaque chez des souris irradiées en corps entier avec des rayonnements gamma à faible dose et ce afin de mimer des effets secondaires à long terme de l’exposition des personnes en territoire contaminé post accident nucléaire. Les souris seront âgées de 2 mois (8 semaines) au moment de l’irradiation car à cet âge leur système nerveux sympathique cardiaque est mature. Des souris C57BL/6 males seront utilisées pour notre projet afin de pallier les effets cardioprotecteurs des hormones comme les œstrogènes. Néanmoins lorsque nous aurons des résultats sur les mâles et si ceux-ci sont significatifs, nous pourront prévoir la réalisation de ces mêmes expériences sur des souris femelles.
Etude de la fonction de différents variants de gènes durant le développement du cerveau dans des modèles murins
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
2850 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie pour injecter et modifier génétiquement les embryons par électroporation in utero, avec un risque d'avortement, puis les femelles et les souriceaux de 7 à 21 jours sont euthanasiés pour prélever les cerveaux. Le porteur décrit une recherche fondamentale sur les gènes du développement cérébral, menée en parallèle sur la drosophile et des cellules humaines, mais affirme qu'une approche in vivo chez le mammifère est "indispensable". Les bénéfices cliniques éventuels sont présentés comme un "socle pour de futures découvertes", sans application directe.
Objectifs
Le développement du cerveau se produit par une succession d’étapes de prolifération et de différenciation cellulaire très contrôlées dans le temps par différents facteurs. Nous nous intéressons aux mécanismes cellulaires et moléculaires qui contrôlent la façon dont les cellules sont générées au cours du temps. Notre objectif est de comprendre le rôle de certaines protéines et donc les gènes dont elles sont issues, dans ces processus et de les étudier dans un contexte in vivo, au cours du développement d’un cerveau de Mammifère. Certaines de ces protéines présentent des modifications qui peuvent modifier son mode de fonctionnement. De plus, certains gènes vont pouvoir compenser la perte d’autres gènes. Ce sont tous ces mécanismes et ces dynamiques que nous voulons étudier. Dans ce but, nous réaliserons au cours du développement embryonnaire, c'est-à-dire lors de la gestation, des transferts de gènes...par une technique que l'on appelle l'électroporation. Nous pourrons ainsi étudier l’effet de la version modifiée sur le développement des cellules du cerveaux (neurones et des cellules qui les accompagnent que l’on appelle cellules gliales) et comprendre les mécanismes fins mis en jeu. Ces échanges de gènes se feront à des moments précis du développement embryonnaire, lors de la génération de populations de cellules précises, dans le cortex cérébral et le cervelet. Nous étudierons la prolifération des cellules, le nombre de cellules générées, les différents type-cellulaires, la morphologie et la taille des neurones…) Cette étude chez la souris permettra de compléter avec un modèle in vivo de mammifère, des études réalisées chez la drosophile et sur des modèles in vitro sur cellule humaine.
Bénéfices attendus
Cette étude in vivo permettra d’acquérir des connaissances précieuses sur les mécanismes mis en jeu dans la régulation de la génération des différentes cellules du cerveau lors du développement. Elle sera mise en perspective avec d’autres études menées en parallèle chez la drosophile et dans des cultures in vitro de cellules humaines ou organoïdes, afin de comprendre comment ces mécanismes se sont ajustés au cours de l'évolution, dans différentes espèces. De plus, cette étude constituera un socle pour de futures découvertes permettant de comprendre certaines maladies développementales du cerveau. Par exemple, la microcéphalie qui peut être due à des altérations de la durée de certaines étapes clés lors du développement. De plus en plus d’études montrent que des conditions comme le syndrome du chromosome X fragile et les troubles du spectre autistique seraient dus à un déséquilibre des neurones excitateurs et inhibiteurs. Il est probable que ce déséquilibre soit dû à des altérations subtiles dans la chronologie de la génération de ces neurones. Les mécanismes explorés dans cette étude pourraient donc apporter des pistes de réflexion voire des réponses pour parvenir à mieux expliquer ces troubles du développement.
Procédures
Pour ce projet, il est prévu d’utiliser 2850 animaux. Des interventions sous anesthésie générale sont réalisées sur les femelles gestantes pour faire des injections aux embryons en cours de développement dans l’utérus. Une prise en charge de la douleur est assurée lors de la chirurgie des femelles gestantes par l’utilisation d’analgésiques. La chirurgie doit durer au maximum 30 min. Des injections intrapéritonéales de produits seront aussi réalisées sur animal vigile, en contention afin de permettre de figer les cellules en train de se diviser pour ensuite pratiquer des analyses de l’ADN. Cette injection unique doit durer quelques secondes.
Impact sur les animaux
Lors de l’électroporation in utero, les animaux seront anesthésiés, ce qui entraine un potentiel risque pour l’animal (hypothermie, non récupération d’une pleine vigilance) et les embryons (risques d’avortement). Un risque hémorragique, infectieux est possible au niveau du site de chirurgie. Une douleur lors des injections est possible, elle ne doit pas durer plus que le temps de l’injection. La contention pourra, elle aussi, générer un stress à l’animal.
Devenir
Les femelles gestantes seront euthanasiées dans le but de prélever et d’analyser les cerveaux des embryons afin d’étudier le développement des cellules. Les souriceaux (P7-P21) seront euthanasiés dans le but de prélever et d’analyser leur cerveau afin d’étudier le développement des cellules.
Remplacement
Notre projet vise à comprendre les mécanismes de développement du cerveau en prenant en compte toute sa complexité (diversité des types cellulaires, interactions cellulaires, contraintes physiques, signalisations…). Suivant le principe de remplacement, des études sur drosophiles, ainsi que sur cellules humaines, un travail in vitro ou encore l’utilisation d’organoïdes sont réalisées et permettent de disséquer certains aspects et mécanismes impliqués dans les processus étudiés. En revanche, il est indispensable dans le cadre de cette étude, de passer par une approche in vivo chez le Mammifère afin de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. De plus, les outils génétiques disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision le moment d’inactivation du gène d’intérêt.
Réduction
Le nombre d’animaux (2850) utilisés sera limité au strict nécessaire pour obtenir des données statistiquement robustes et sera calculé pour chaque type d’analyse. Toutes les quantifications se feront en aveugle. Nous travaillons en étroite collaboration avec des statisticiens présents dans notre unité pour définir toutes les tailles d'échantillons et les tests statistiques appropriés. Nous comptons observer de nombreux paramètres (stade différentiation des cellules selon le stade développement, longueur des axones, morphologie des cellules, …) qui pourront être analysés sur les mêmes échantillons.
Raffinement
L’animalerie est agréée, les conditions d’hébergement en portoirs ventilés (température, hygrométrie, éclairage et espace) et les conditions d’enrichissement de l’environnement (maison et matériel pour faire un nid, papier kraft), d’alimentation et de soins quand nécessaires, seront contrôlées. Une période d’acclimatation d’une semaine sera effectuée avant toute procédure expérimentale pour les animaux arrivant de l’extérieur. Les femelles gestantes seront regroupées (2 par cage) afin d’éviter leur isolement et auront une alimentation adaptée à leurs besoins physiologiques. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie (pré- et post-opératoire) ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. En cas d’observation de la moindre douleur post-opératoire, les souris recevront un traitement analgésique, et si cette douleur persiste, les animaux seront euthanasiés pour éviter toute souffrance. Durant toute la période d’anesthésie, l’animal sera placé sur tapis chauffant afin de maintenir sa température. Toute injection sera réalisée avec une seringue adaptée et une aiguille très fine. Des points limites ont été établis : En cas de non-récupération de la complète vigilance suite à la chirurgie, l’animal sera examiné par la structure chargée du bien-être animal et le vétérinaire. Si aucun signe d’amélioration n’est visible après 24h (prostration, état du pelage, réduction de mobilité, absence de prise de poids lors de la gestation, etc), l’animal sera euthanasié car un état de stress prolongé pourrait compromettre le bon déroulé de l’expérience. Si des signes d’avortement (saignements, expulsion de fœtus morts, écoulements vaginaux anormaux…) sont observés, l’animal sera euthanasié. Tout au long de la vie des animaux, un suivi rigoureux sera réalisé pour s’assurer de leur bien-être en collaboration avec la structure chargée du bien-être animal et du vétérinaire.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des femelles gestantes d’au moins 2 mois y compris leurs embryons et des souriceaux. Afin d’inactiver ou intégrer nos gènes d’intérêt au stade embryonnaire, les interventions sont réalisées sur les femelles gestantes sous anesthésie générale pour faire des injections aux embryons en cours de développement dans l’utérus. Une injection supplémentaire d’agents intercalants de l'ADN sera réalisée sur ces femelles gestantes dans le cas où les tissus seront prélevés au stade embryonnaire. Dans le cas où les tissus seront prélevés sur souriceaux, l’injection se fera sur les souriceaux (P7, P21). Ces produits permettront de marquer les cellules en train de se diviser pour ensuite pratiquer des analyses. Pour notre étude, nous utiliserons des modèles de mouches, ainsi que des modèles in vitro de cellules humaines et organoïdes. Cependant, il est indispensable de comparer ces données avec un modèle in vivo de cerveau de Mammifère. Nous avons fait le choix de la souris car les outils génétiques et moléculaires développés dans notre domaine de recherche ont été réalisés pour des travaux chez la souris. Les animaux génétiquement modifiés qui sont nécessaires à cette étude sont uniquement disponibles chez la souris. Notamment, les lignées génétiquement modifiées qui vont nous permettre d’explorer les stades de développement qui nous intéressent disponibles chez la souris nous permettent de contrôler avec précision l’inactivation de nos gènes d’intérêt.
Étude du rôle global de PDL1 et de MCT4 dans la métastase osseuse de cancer pulmonaire. Effets immunitaires et non immunitaires.
- Recherche appliquée
- Cancers
402 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal reçoit une injection de cellules cancéreuses dans le tibia, suivie d'un suivi radiographique hebdomadaire pendant douze semaines et de traitements par voie intraveineuse ou orale. Le porteur indique un développement tumoral attendu, une douleur se manifestant par une boiterie, et une sortie de l'étude avant que le volume tumoral ne dépasse 10 % du poids de l'animal. Il affirme que l'environnement tumoral est impossible à recréer in vitro et conclut au caractère "indispensable" du modèle murin pour étudier les protéines PDL1 et MCT4.
Objectifs
Le cancer pulmonaire est une cause fréquente de mortalité chez l’homme. 40 % des patients vont présenter des métastases osseuses qui assombrissent leur pronostic. Lorsque le cancer est métastatique, il est incurable et diminue drastiquement la survie des patients. Les cellules cancéreuses sont caractérisées par l’expression différentes de nombreuses protéines impliquées dans le fonctionnement cellulaire ce qui permet aux cellules cancéreuses de se multiplier anormalement. Parmi les protéines augmentant l’agressivité du cancer, MCT4 et PD-L1 jouent un rôle important dans plusieurs cancers dont le cancer pulmonaire. En revanche, il n’y a pas de données chez les patients porteurs de métastases osseuses. MCT 4 est la principale protéine qui exporte l’acide lactique des cellules tumorales dans leur environnement. Dans l’os, ce lactate soutient le développement des métastases osseuses en stimulant la lyse osseuse (principale caractéristique des patients souffrants de métastases osseuses d’origine pulmonaire) et en favorisant une immunité pro-tumorale. L’inhibition pharmacologique de MCT4 sur des modèles murins montre une diminution du développement tumoral de plusieurs cancers. Néanmoins, dans les métastases osseuses, cette approche n’a jamais été essayée alors qu’elle s’avère prometteuse. PDL1 est une protéine impliquée dans l’inactivation des cellules immunitaires anti tumorales (lymphocytes T CD8+). Son rôle est documenté dans les cancers pulmonaires et les métastases des tissus mous mais inconnu au sein de la métastase osseuse des cancers pulmonaires. Les immunothérapies PD-1/PD-L1 sont une avancée majeure dans le pulmonaire métastatique. Dans les métastases osseuses l’efficacité de ces traitements n’est pas connue. Aussi, nous souhaitons étudier le rôle de ces protéines dans la métastase osseuse en réalisant des injections intra tibiales de cellules cancéreuses qui expriment en forte quantité ou sans expression de ces protéines. Nous étudierons également des traitements inhibant ces protéines et observerons l’effet sur les métastases osseuse.
Bénéfices attendus
Le bénéfice est de comprendre le rôle de PDL1 et MCT4 dans la métastase osseuse ainsi que déterminer si l’utilisation de traitement ciblant pharmacologiquement ces protéines présente un intérêt thérapeutique dans un modèle de recherche pré-clinique.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des prélèvements vigiles ni de procédures chirurgicales. Les animaux seront anesthésiés une fois lors de l’injection des cellules cancéreuses dans le tibia (5 min) puis une fois par semaine pour le suivi radiographique (5 min) des lésions osseuses pour une durée maximale de 12 semaines. Les animaux traités par voie intra veineuse auront 9 injections de traitement ou de contrôle au total sur 3 semaines (1 min). Les animaux traités par voie orale auront une prise quotidienne de traitement pendant 3 semaines (15min).
Impact sur les animaux
Les modèles expérimentaux de cancérologie sont des modèles dommageables et il est attendu un développement de cancer chez les animaux. La douleur peut survenir et se manifester par une boiterie chez les souris. Aussi, nous utiliserons un protocole strict de suivi des animaux en utilisant des échelles de points limites. Ces points limites sont les situations prédéfinies à ne pas atteindre pour respecter le bien-être animal. Les animaux seront sortis de la procédure avant atteinte des points limites expérimentaux et les pilotes expérimentaux permettrons de suivre le délais d’apparition de ces situations sur un petit nombre d’animaux avant utilisation d’un plus grand nombre. Les injections de traitement répétées peuvent conduire à un inconfort momentané et des blessures chez les animaux et pour y remédier, nous procèderons à des injections à différents endroits.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole. A la fin de la procédure, les tumeurs osseuses, ainsi que les organes des souris qui sont le siège de métastases (généralement poumons, os, foie) seront prélevés pour peser les tumeurs. Les tumeurs et les organes métastatiques seront ensuite fixés et inclus en paraffine afin de réaliser des études histologiques.
Remplacement
Remplacement : Bien que l’étude in vitro permette la compréhension de nombreux processus du cancer, cela ne prend pas en compte l’environnement tumoral, dont l’impact est majeur. L’étude d’une tumeur in vivo permet la considération des cellules tumorales, immunitaire, osseuses, fibroblastiques (autres cellules de l’environnement tumoral) ainsi que la vascularisation de l’hôte, leur interactions et fonctionnement ensemble. Un tel modèle est impossible à recréer in vitro, ainsi, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable à notre étude. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.
Réduction
Réduction: Nous avons utilisé une approche statistique et consulté la littérature pour déterminer la taille des groupes d’animaux nécessaire à la réalisation à chaque protocole de l’étude. Pour chaque groupe, nous allons réaliser une analyse du tissu osseux qui nécessite 10 animaux, une analyse de l’expression des gènes qui nécessite 4 animaux et une analyse des populations cellulaires qui nécessite 4 animaux soit 18 animaux.
Raffinement
Raffinement : Les souris cohabiteront par groupe de 3, dans des cages à couvercles filtrants de 424 cm² avec un milieu enrichi (objets partagés par les animaux, frisottis, épaisseur de litière importante, copeaux doux) et aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. Afin de réduire le stress des animaux, une période d’acclimatation de deux semaines sera observée à la suite de leur réception. La litière sera changée de moitié toutes les semaines pour réduire le stress des animaux. Pendant cette période les animaux seront uniquement manipulés afin de les habituer au contact de l’utilisateur et réduire leur stress, nous les familiariserons à boire à la pipette afin de pouvoir leur administrer le traitement anti MCT4 de cette manière plutôt que de réaliser un gavage afin de limiter leur stress. Lors de l’injection des cellules tumorales, les cellules seront stériles, vérifiées sans champignons et sans bactéries, les souris seront anesthésiées et la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. L’état de bien-être des souris sera évalué quotidiennement en évaluant la qualité de la fourrure de l’animal, un isolement ou manque de dynamisme. En cas de douleur les animaux seront traités avec de la rimadyl (carprophène) associée à la buprénorphine (à la posologie adaptée et par voie sous cutanée). Les soins et traitements des animaux seront réalisés par le personnel compétent de l’animalerie définis avec le vétérinaire désigné. L’identification d’un point limite (perte de poids, respiration pénible, réticence à se déplacer, volume tumorale supérieur à 10% de du poids de l’animal) entraînera la sortie de l’animal de l’étude et sa mise à mort. Lors des injections de traitements anti-PDL1, nous privilégierons l’injection intra veineuse (différents sites d’injection caudale, jugulaire et saphène) aux injections intra péritonéales afin de limiter l’inflammation du péritoine. Tous les organes des animaux seront prélevés à la fin de la procédure.
Choix des espèces
Les souris C57/Bl6 et C57/Bl6 nude sont couramment utilisées en recherche cancérologique. Les souris nude présentent une déficience en lymphocytes T. Le phénotype dommageable est dû à la mutation génétique qui prévient le rejet des cellules tumorales humaines par la souris. Dans le contexte de notre étude, les protocoles seront réalisés avec des souris âgées de 6 semaines. A cet âge, l’ensemble des fonctions sont matures.
Etude biochimique, histologique et pharmacologique chez la souris modélisant des malformations corticales génétiques épileptogènes chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
32 256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Des femelles gestantes subissent une chirurgie pour modifier génétiquement le cerveau des embryons par électroporation in utero, et leur descendance développe des crises d'épilepsie, provoquées si besoin par injection d'un agent épileptogène, avec des traitements par injections, gavage ou injection intracérébrale. Le porteur décrit des crises pouvant être quotidiennes, des œdèmes cérébraux, de l'agressivité et des avortements, et prévoit la mise à mort dès l'atteinte de points limites ou dans les deux heures suivant l'injection épileptogène. Il affirme que la culture cellulaire ne reproduit ni les crises ni les interactions cellulaires et conclut au recours à des "organismes entiers".
Objectifs
L'épilepsie touche plus de 50 millions de personnes dans le monde. Les épilepsies focales sont parmi les plus fréquentes et sévères des épilepsies, et sont souvent liées à une malformation cérébrale, en particulier ce que l’on appelle les dysplasies focales corticales. Les dysplasies focales corticales sont caractérisées par une désorganisation locale du cortex cérébral et la présence de cellules neurales anormales et de taille anormalement grande. Ces anomalies du développement sont responsables d’épilepsies qui résistent aux traitements médicamenteux sont associées à des déficits cognitifs et des pathologies psychiatriques précoces. Les dysplasies focales corticales sont induites par plusieurs gènes d’une voie de signalisation particulière appelée mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères). Ces anomalies du développement cérébral peuvent être dues à des mutations génétiques présentes uniquement dans une population neuronale restreinte et apparaissant précocement au cours du développement du cerveau. Il est nécessaire de mieux comprendre l’origine des crises épileptiques suite à ces mutations afin de pouvoir développer de nouveaux médicaments antiépileptiques, et potentiellement proposer une médecine personnalisée. Afin de modéliser ces épilepsies focales d’origine génétique, nous proposons d’induire ces mutations dans le cerveau au cours du développement en travaillant directement sur les embryons au niveau de l’utérus de souris en gestation. Cette technique dite « d’électroporation » permet d’induire l’expression de gènes mutés ou d’en inhiber d’autres dans une sous-population de neurones, mimant ainsi les mutations (c’est-à-dire présentes uniquement dans la partie du cerveau affectée par cette épilepsie). Ce travail de recherche permettra de mieux comprendre les mécanismes à l’origine des crises épileptiques en fonction des différents gènes mutés. Nous évaluerons, tout d’abord, ces nouveaux modèles génétiques de malformations cérébrales à l’origine des crises d’épilepsie d’un point de vue histologique et biochimique. Puis nous testerons différents traitements antiépileptiques innovants sur nos modèles par voie injectable, orale ou intracérébrale. Enfin, nous testerons l’effet de ces traitements sur des crises provoquées par l’injection d’un agent qui génère des crises d’épilepsie dans nos différents modèles si les crises n’arrivent pas spontanément.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche permettra de créer de nouveaux modèles de malformation corticale épileptogène induite par des mutations génétiques. Ces pathologies sont rares, graves et orphelines. En effet, la majorité des patients atteints par ces mutations présente une épilepsie pharmaco-résistante qui nécessite donc le recours à une ou plusieurs chirurgies couteuses et invasives (tant sur le plan physique que psychologique) pour contrôler les crises. Il est donc urgent d’utiliser des modèles reproduisant la physiopathologie de ces maladies afin de : - tester des thérapies innovantes afin de permettre à court terme de diminuer voir d’abolir le recours à ces chirurgies mais également de proposer une thérapie aux patients présentant une forme non opérable. - découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter à la fois l’épilepsie mais également les comorbidités associées à ces pathologies (autisme, dépression, troubles de l’hyperactivité, …) - mieux comprendre le lien entre voie mTOR (mechanistic target of rapamycin, cible de la rapamycine chez les mammifères) et épilepsie afin d’ouvrir de nouvelles perspectives de recherches et de thérapies pouvant potentiellement être utilisées pour des patients atteints de différentes mutations.
Procédures
Chirurgie sous anesthésie et analgésie sur les mères gestantes afin d’induire des mutations dans le cerveau des embryons à travers la paroi utérine (électroporation in utero), afin de générer les groupes d’animaux génétiquement modifiés pour la suite de notre étude. Durée maximale 1h, une seule fois. Pour les souris électroporées (différents lots) : -Euthanasie sans traitement préalable (souris n’ayant pas de modification génétique ou simple observation clinique). -Traitement intrapéritonéal : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines). -Traitement par voie orale (Gavage) : Administration par gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum). -Traitement par injection intracérébrale : injection unique sous anesthésie générale en analgésié, durée maximale 1h10. -Traitement et Pentylènetétrazole : injection intrapéritonéale de molécules thérapeutiques (1 injection de 30s tous les 2 jours pendant 2 semaines) OU Gavage de molécules thérapeutiques (1 gavage de 1 min tous les 2-3 jours pendant 3 semaines maximum) OU Injection intracérébrale (1 injection unique sous anesthésie et analgésie) PUIS Injection intrapéritonéale d’un agent épileptogène (1 injection de 30s).
Impact sur les animaux
1) Pour l’opération permettant d’induire des mutations dans le cerveau d’embryons d’une femelle gestante (électroporation in utero, procédure 1) : Isolement de la femelle préopératoire et jusqu’à la naissance des embryons. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et utérin, inconfort général durant les heures suivant la chirurgie, perte d’embryon(s), mise-bas prématurée. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. 2) Pour les souris génétiquement modifiées issues de la procédure 1 : Le développement prédit de crise d’épilepsies avec potentiellement plusieurs crises par jour. Possible agressivité des souris envers leurs congénères pouvant entrainer stress et blessures. 3) Injection chronique intra-péritonéales : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur (œdème, hématome) dus à l’insertion répétée de l’aiguille sur le site d’injection. 4) Gavage oral : stress durant la manipulation des souris, perte de poids et possible douleur au niveau de l’œsophage due à l’insertion répétée de la sonde dans le système digestif. 5) Injection intracérébrale : Injection intracérébrale sous anesthésie. Risques de déficience respiratoire, cardiovasculaires et hypothermiques durant l’anesthésie. Possible douleur au niveau du site d’ouverture et inconfort général durant les heures suivant l’injection. Possible risque d’infection au niveau du site d’ouverture. Œdème cérébral dû à l’injection. 6) Injection de Pentylènetétrazole : stress durant la manipulation des souris, perte de poids, crises épileptiques et possible douleur sur le site d’injection.
Devenir
Femelles gestantes opérées afin d’induire des mutations cérébrales dans le cerveau des embryons : les femelles gestantes seront euthanasiées après le sevrage des souriceaux. Du fait de la chirurgie, elles ne peuvent être réutilisées pour des accouplements. Procédures exploratoire, traitements et injection de Pentylènetétrazole (agent inducteur de crises épileptiques) : les souris seront euthanasiées dès qu’un point limite sera atteint, ou dans les 2 heures suivant l’injection de Pentylènetétrazole ou en fin de procédure (âge maximum 1an). Nos analyses nécessitant le prélèvement du tissu cérébral, aucune souris ne peut être gardée en vie en fin de procédure.
Remplacement
Les résultats attendus de cette étude ne peuvent être obtenus par modélisation informatique car celle-ci nécessite des données expérimentales encore manquantes. De même, la culture cellulaire ne reproduit pas les interactions cellulaires, les voies de migration cellulaires, ni les crises d’épilepsie. La modélisation in vitro n’est donc pas indiquée dans notre type d’étude. De plus, nous ne pouvons éthiquement pas reproduire les modifications cérébrales nécessaires à notre étude chez des patients sains, ni tester nos traitements expérimentaux sur les patients atteints de ces troubles sans études précliniques préalables. Enfin l’utilisation d’organismes entiers, à la physiologie proche de l’humain et communément utilisé en étude préclinique nous permettra de tenir compte de la pharmacodynamie et de la pharmacocinétique de nos potentiels traitements. Nous pourrons ainsi rapporter les éventuels effets indésirables, la durée de traitement, la dose efficace et les effets attendus de nos traitements lors de nos discussions avec les cliniciens en charge des patients atteints de ces troubles avec lesquels nous travaillons étroitement.
Réduction
Nous ferons une planification rigoureuse des expériences en testant préalablement la faisabilité des expériences, en combinant différents protocoles au cours d’une même expérience et en réalisant une exploitation maximale des données à l’aide de l’utilisation appropriée de tests statistiques. Le calcul du nombre d’animaux est fait suivant les recommandations internationales par calcul de puissance statistique afin d’obtenir des résultats fiables. Il nous faut donc au moins 10 souris par groupe traitement. Ce calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes entre nos groupes (soit 5760 souris). La première procédure comprend un groupe exploratoire (288 souris), pour lequel, nous avons prévu 3 souris par groupe afin de limiter le nombre d’animaux utilisés, tout en obtenant des résultats fiables. Nous ne sélectionnerons que les souriceaux positifs aux mutations génétiques induites au stade embryonnaire. Dans la mesure du possible, nous utiliserons les souris contrôles (non mutées) comme contrôles de plusieurs modifications génétiques. Cependant, ne connaissant pas la physiopathologie de ces mutations induites, nous ne pouvons pas d’avance connaitre l'âge des souris utilisées dans les groupes de traitement. Nous ne pouvons donc pas être certains de la possibilité de ce double-emploi des contrôles. Nos calculs du nombre de souris se basent donc sur le scénario utilisant le nombre maximal de souris où aucun des pathologies induites par les 4 mutations prévues ne présenterait un décours concomitant à un autre et où chaque groupe aurait donc son propre groupe contrôle. Enfin, nous avons prévu un groupe exploratoire, nous permettant d’identifier le stade de traitement le plus adéquat afin de limiter les groupes d’études des différents traitements. Enfin nous commanderons nos souris gestantes à un stade permettant de vérifier l’état de gestation. Notre période d’acclimatation sera donc réduite (2 à 7 jours) mais la livraison à un stade de gestation plus précoce permettant le temps d’acclimatation recommandé engendrerait la livraison de femelles potentiellement non gestantes, inutilisables, à euthanasier. La souche que nous utilisons étant peu sensible au stress, nous préférons donc utiliser une période d’acclimatation courte afin de réduire le nombre d’animaux. Dans ces conditions, le taux de survie des mères à ce type de chirurgie est très proche de 100 pourcent.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages ventilées (maximum 6 par cage) avec accès à l’eau et à des croquettes à volonté, enrichies d’un nid de coton, et d’une maison en cas d’inconfort (animal isolé) ou pour les souris gestantes. Les souris injectées avec un convulsivant seront isolées pendant une période de 10 à 120min (selon durée des symptômes) dans une cage de grande dimension afin de limiter les risques de commotions ou de blessures lors des convulsions, après 30min de familiarisation à la cage. Le phénotype de nos lignées est encore inconnu. Les premiers lots de souris seront donc observés 3 fois par semaine du stade P10 (afin de limiter les risques de rejet de la mère par de trop nombreuses manipulation du nid) et jusqu’à 3 mois, puis quotidiennement après apparition de la première crise épileptique du lot. Les lots suivants seront surveillés quotidiennement au stade d’apparition des crises. Si une souris fait une crise de plus de 15 minutes ou présente une posture hypertonique post-crise, elle sera euthanasiée. De plus, lors des injections avec le convulsivant, si une souris fait plus de 15 crises, elle sera euthanasiée. Les souris feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier et de l’équipe de recherche. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. En cas d’apparition d’un comportement d’agressivité envers les congénères, la cage sera enrichie (maisonnette, boule de papier, séparateurs) et ne sera changée que partiellement afin de conserver la hiérarchie de dominance au sein du groupe. En cas d’inefficacité de ces mesures, la souris agressive sera isolée dans une cage enrichie afin d’éviter le risque de blessure. Avant le début de la chirurgie, nous administrons une dose d’analgésique. En cas de souffrance post-chirurgicale, la souris recevra une nouvelle dose toutes les 24h, jusqu’à la mise-bas des souriceaux. Après cette mise-bas, nous surveillerons les signes de douleur de la femelle, et si les souriceaux sont bien nourris par observation de la présence de lait dans l’estomac à travers la peau. Dans les groupes de traitement et injection de convulsivant : les mouvements, le poids, le grimace-score, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés attentivement jusqu’à euthanasie de fin de procédure (maximum 2h). S'ils révèlent une dégradation ou une souffrance de l'animal, celui-ci sera euthanasié plus précocement.
Choix des espèces
Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques : (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez la souris (2) Les souches des souris que nous utiliserons ont été majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (3) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les femelles gestantes seront utilisées à l’âge adulte (plus de 2 mois). Leurs embryons seront génétiquement modifiés au cours de la gestation. L’efficacité de notre méthode de modification génétique des souris utilisées par la suite est vérifiée visuellement par la présence ou non de tache fluorescente à l’aide d’une lampe. Pour le groupe exploratoire, les souris seront euthanasiées à 4 stades différents avant et après sevrage : -un stade postnatal précoce afin de caractériser le développement cérébral de nos modèles -un stade précoce à l’apparition des crises épileptiques -un stade tardif après l’apparition des crises -un stade supplémentaire selon les symptômes observés chez les premiers lots Pour les traitements, les souris seront utilisées après sevrage et au stade déterminé par le groupe exploratoire, jusqu’à l’âge d’un an maximum.
Effet neuro protecteur et neuro régénérateur de nouvelles biomolécules dans un modèle souris de glaucome
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Troubles sensoriels
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système nerveux
2670 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Un pincement du nerf optique leur provoque une cécité d'un œil, suivi d'injections de biomolécules dans l'œil ou par voie intraveineuse, le porteur indiquant que le pincement et les injections oculaires causent une douleur. La mise à mort est justifiée par la récupération des rétines et des nerfs optiques, aucune souris ne pouvant selon le porteur être réutilisée, replacée ou adoptée. Il présente l'effet neuroprotecteur et régénérateur de ces molécules comme une piste pour éviter la cécité dans le glaucome, au conditionnel.
Objectifs
Le glaucome est une des principales causes de déficit visuel. Les neurones présents dans la rétine (RGC, Cellules Ganglionnaires Rétiniennes) transmettent les informations captées par les photorécepteurs sous forme de signal électrique par via leur fibre nerveuse (axone) qui parcourt le nerf optique (NO) jusqu’au cerveau. Dans le glaucome, ces axones et les RGC dégénèrent, provoquant une cécité irréversible. Un modèle robuste de cette pathologie est obtenu chez la souris par un pincement maitrisé du NO provoquant la dégénérescence des axones qui le composent. Nous souhaitons tester dans ce modèle les propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices de biomolécules « NV » Sur des cultures de neurones, les NV favorisent la survie des cellules, l’élongation des prolongements cellulaires qui permettent les connections entre neurones et leur repousse après lésion. Ces résultats suggèrent que les NV pourraient être utilisés pour protéger les RGC de la mort cellulaire (effet neuroprotecteur) dans le glaucome et favoriser la repousse de leurs axones dans le NO (effet neurorégénérateur). Nos études ont montré que l’injection intraoculaire de vecteurs AAV2 (virus adéno-associé 2) codant pour le peptide NV de première génération (AAV2-NV1) favorise la survie des RGC et la repousse de leur axone, efficacité renforcée en présence de CNTF (ciliary-derived neurotrophic factor), un facteur de croissance neuroprotecteur et neurorégénérateur (effet synergique d’AAV2-NV1 et AAV2-CNTF). De plus, ces travaux ont permis de montrer l’absence de toxicité ou d’effets secondaires lors de l’injection intraoculaire d’AAV2-NV1. Nous avons développé de nouvelles générations de NV, modifiées pour augmenter leur affinité pour leur cible et donc leur efficacité, et conjuguées à des CPM (Cell Penetrating Molecules) tels que les VHH (molécules dérivées de chaines lourdes d’immunoglobulines de lama capables de franchir les membranes cellulaires) ou des peptides étiquettes (ciblage préférentiel des neurones en fixant le récepteur de l’acétylcholine) afin d’augmenter leur stabilité et leur adressage aux neurones. Nous souhaitons tester ces nouvelles générations de NV dans le modèle souris de glaucome afin d’identifier la molécule ayant l’efficacité maximale avec une toxicité minimale pour ensuite développer ce candidat comme médicament pour le glaucome en l’amenant à l’essai clinique.
Bénéfices attendus
Les biomolécules NV développées dans notre laboratoire possèdent des propriétés neuroprotectrices et neurorégénératrices susceptibles d’apporter une réponse à de nombreuses pathologies dégénératives. Dans le glaucome, l’augmentation de la pression intraoculaire cause une dégénérescence des axones dans le nerf optique, une mort des cellules ganglionnaires rétiniennes et à terme la cécité. Dans le cadre de ce projet, l’administration de ces molécules a pour but d’induire la régénération des fibres axonales dans le nerf optique après lésion, ce qui aura pour bénéfice de reconnecter l’œil au cerveau et donc d’éviter la cécité causée par cette lésion. Leur effet neuroprotecteur devrait quant à lui permettre la survie des cellules ganglionnaires rétiniennes dans la rétine, dont les axones forment le nerf optique.
Procédures
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur de nos biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes) et est réalisé sous anesthésie profonde et analgésie. L’injection intravitréenne de nos biomolécules NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes). L’injection intraveineuse de NV est réalisée sous anesthésie profonde et analgésie. Ce geste technique est rapide (moins de deux minutes).
Impact sur les animaux
Afin d’étudier l’effet neuroprotecteur et neurorégénérateur des biomolécules NV, un pincement du nerf optique sera pratiqué chez des souris. Ce pincement provoquera une cécité unilatérale. Il est attendu que le pincement du nerf optique et l’injection des biomolécules NV dans l’œil causent une douleur chez la souris.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés. En effet, toutes les procédures requièrent la récupération de tissus (rétines, nerfs optiques) destinés à être analysés en vue de démontrer l’effet thérapeutique de notre molécule NV.
Remplacement
Les biomolécules NV utilisées dans ce projet sont préalablement validées in vitro pour leur efficacité et leur absence de toxicité sur des cultures de cellules neuronales, des cellules épithéliales rétiniennes et des explants de rétines. Les cellules neuronales et épithéliales rétiniennes ne nécessitent pas l’utilisation d’animaux (lignées cellulaires). Les explants de rétine, réalisés à partir de rétines de souris, permettent de tester plusieurs constructions et concentrations de NV avec un nombre réduit de souris, ce qui permet par la suite de ne tester in vivo que les molécules NV efficaces in vitro. Les explants de rétine constituent un modèle in vitro très proche du modèle in vivo (même espèce, même tissu) et facilite l’extrapolation.
Réduction
Le nombre d’animaux requis pour établir l’efficacité des biomolécules dans ce modèle a été calculé par un test de puissance statistique à partir de nos résultats antérieurs. La mise à mort des animaux pour la récupération des yeux et des nerfs optiques étant nécessaire au projet, la réutilisation des animaux n’est pas envisageable. Les deux yeux des souris seront valorisés quand cela sera possible afin de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Les techniques de chirurgie de l’œil nécessaires à la réalisation du projet ont été acquises auprès d’un laboratoire de référence. La maîtrise des bons gestes chirurgicaux limitera les risques d’altération de la lentille lors des injections intraoculaires et augmentera la probabilité de créer des lésions du nerf optique bien calibrées et donc exploitables. Les animaux recevront des antalgiques avant et après lésion ainsi qu’une anesthésie locale juste avant le pincement du nerf optique. Les gestes chirurgicaux seront réalisés sous anesthésie générale à l’isoflurane. La surveillance des animaux sera quotidienne durant les 3 jours suivant les pincements/injections, puis bihebdomadaire. Les animaux seront mis à mort en cas de dépassement des points limites fixés pour les différentes procédures. Après le réveil des animaux, les animaux sont remis dans leur cage et gardés pour une durée variable dépendante de la procédure (entre 1 heure et 44 jours pour la procédure la plus longue).
Choix des espèces
Nous avons choisi le modèle souris pour sa taille et son anatomie, particulièrement adaptées à la chirurgie ophtalmique. De plus, certains de nos tests seront réalisés avec des souris génétiquement modifiées existantes. Souris adultes âgées de 8 semaines. Les expériences sont réalisées à un stade où les rétines sont matures et dans lesquelles les neurones ont une capacité régénératrice minime afin de reproduire des conditions semblables à celles de la pathologie chez l’homme.
Ischémie reperfusion rénale sur souris uninephrectomisées
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
390 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une microchirurgie de 45 minutes, avec ablation d'un rein puis clampage de l'artère et de la veine du rein restant pendant 30 minutes pour provoquer une ischémie, suivie de prélèvements sanguins et de traitements quotidiens pendant sept jours. Le porteur indique que la chirurgie peut entraîner des douleurs, une perte de poids et la mort sous anesthésie chez les animaux âgés, les souris perdant plus de 20 % de leur poids étant mises à mort. Il affirme que la complexité physiologique ne peut être reproduite in vitro et présente ce modèle comme un moyen de réduire l'échec des candidats médicaments en clinique.
Objectifs
10% de la population mondiale est atteinte de maladie rénale chronique (CKD). Cette condition pathologique caractérisée par de nombreuses atteintes tissulaires au niveau rénale conduisent à la perte de fonction de l’organe et des décès prématurés due à des problèmes cardiovasculaires. Cependant, les mécanismes et facteurs impliqués dans l’accélération de la maladie sont encore mal identifiés. A ce jour, il n’existe encore aucune thérapie permettant de soigner ou de limiter l’avancement des maladies rénales chroniques. Malgré une intensification des efforts de recherche dans le développement de nouveaux médicaments, les industriels pharmaceutiques font face à un taux très important d’échec dans les phases de tests cliniques sur l’Homme. Une raison avancée à ces taux d’échec clinique élevés est une faible pertinence des modèles expérimentaux utilisés lors des phases précliniques. En effet, les modèles utilisés couramment ne permettent pas de reproduire les conditions observées chez l’Homme et manque de pertinence physiologique. L'objectif de ce projet est de mettre en place un nouveau modèle expérimental de souris afin d'évaluer l'efficacité de médicaments ciblant les lésions rénales aïgues. Le modèle de souris développé dans ce projet permettra d'améliorer la prédiction d'efficacité de nouveaux candidats médicaments afin de limiter la progression des maladies rénales chez l'Homme.
Bénéfices attendus
La mise en place et le succès de ce projet permettra de proposer un nouveau modèle expérimental in vivo qui exprime une série de désordres physiologiques retrouvés chez l’Homme. Ainsi les tests précliniques d’efficacité de nouveaux candidats médicaments pour le traitement des maladies rénales, pourront être réalisés sur un modèle pertinent d’un point de vue physio-pathologique avec le but de réduire le taux d’échec d’efficacité des candidats médicaments pendant les phases cliniques.
Procédures
Chaque animal subira : - 1 seule procédure de microchirurgie d'une durée totale d'environ 45 min: Laparotomie, ablation du rein droit, puis clampage de l'artère et de la veine rénale du rein gauche pendant 30 minutes (ischémie). Déclampage puis suture de l'abdomen (muscle et peau). - prélèvements sanguin quotidien (sur 7 jours) de 20 à 100 ul de sang par légère incision au niveau de la queue ou via une ponction de la veine faciale (durèe environ 1 min par animal). - traitements quotidien par les candidats médicaments pendant 7 jours consécutifs (durèe inférieure à 1 min par animal).
Impact sur les animaux
Les animaux qui interviendront dans ce projet subiront des effets indésirables liés à la procédure de microchirurgie. Ces effets indésirables ont été classés par ordre décroissant de gravité et de probabilité : - Lésions du rein ayant subit la procédure d’ischémie reperfusion. La conséquence est une réduction significative de la fonction de ce rein après quelques semaines. - Douleurs liées à la microchirurgie, notamment à l’incision cutanée et musculaire pour l’accès au rein à clamper - Anesthésie profonde pouvant entraîner la mort chez les animaux âgés - Perte de poids après chirurgie - Lésions vasculaires au niveau du clamp pouvant entraîner une mauvaise reperfusion de l’organe
Devenir
Tous les animaux inclus dans ce projet seront mis à mort et disséqués afin de collecter le rein pour des analyses histologiques.
Remplacement
En parallèle des modèles expérimentaux basés sur l'utilisation d'animaux (rongeurs), nous travaillons au développement de modèles in vitro basés sur la culture de cellules rénales humaines. Cependant, ces modèles in vitro ne peuvent pas substituer l'importance des observations réalisées par les tests sur animaux. En effet, la complexité physiologique et les réponses systémiques aux candidats médicaments ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Les procédures chirurgicales et expérimentales seront basées sur les protocoles détaillés dans la littérature. Sur la phase de test de produits pharmaceutiques, un nombre de 13 souris par groupe de composé testé sera utilisé. Ce nombre a été déterminé en fonction du risque de perte lors de la procédure chirurgicale, et de l'efficacité hétérogène des interventions chirurgicale. Celui-ci est estimé à 30% de perte ou absence de réponse. De ce fait, avec 13 souris par groupe au départ, nous pourrions envisager un nombre de 9 souris par groupe en fin de procédure de traitement. Ce nombre sera suffisant pour effectuer des observations scientifiquement et statistiquement pertinentes. Les effets des candidats médicaments seront évalués par comparaison avec les groupes traités par le solvant seul. Les données enregistrées seront analysées par des tests statistiques appropriés : - Pour des données uniques en fin d'expérimentation, il seront analysés par ANOVA 1-way ou par le test de Kruskal-Wallis (en fonction de l'analyse des variances). - Pour des données enregistrées en longitudinales, celles-ci seront analysées par ANOVA 2-way + Bonferonni’s post-test.
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l'inconfort aux animaux, un manipulateur expérimenté en microchirurgie sur rongeurs sera responsable de la procédure chirurgicale. De plus, les procédures de microchirurgies seront réalisées sous anesthésie générale (Kétamine 100mg/kg +Xylasine 10mg/kg) en IP. L’animal recevra aussi une dose d’analgésique Buprénorphine (1mg/Kg) pour réduire les douleurs au réveil. Un control quotidien avant, pendant et jusqu'au terme de l'experimentation sera effectué par les expérimentateurs afin de garantir la propreté des cages, des quantités suffisantes d'eau et de nourriture ainsi qu'un enrichissement adéquat dans les cages d'hébergement (igloo polycarbonates autoclavables et réutilisables + carton) . Pendant les périodes de traitement par les candidats médicaments, les expérimentateurs conduiront un suivi quotidien du poids corporel, de la comsommation d'eau et de nourriture ainsi que de l'état général des animaux. Ces observations seront enregistrées et analysées. Les animaux qui auront perdu plus de 20% de leur poids initial ou dont l'état général est dégradé (isolement, baisse d'activité, entretien de la fourrure, perte de poils, respiration anormale) sur 2 jours consécutifs seront retirés de l'expérimentation et mis à mort. A noter que les candidats médicaments qui seront testés pour leur efficacité auront déjà été évalués pour leur toxicité au préalable, et que le risque d'effets secondaires liés au traitement est minime. De plus, l'étude sera conduite par des personnels qualifiés et formés au respect des conditions du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée par la communauté scientifique dans le cadre de l’étude de la fonction rénale après une ischémie-reperfusion. L’avantage de ce type d’animal est qu’il répond très bien à la procédure d’uninephrectomie + ischémie-reperfusion et constitue un excellent mime pathophysiologique des conditions retrouvées chez l’Homme. De plus, grâce à leur système immunitaire spécifique, les souris ne présentent pas de risque d’infection post-opératoire. La procédure sera réalisée sur des animaux disponibles auprès d’élevages agrées (Charles River). Les animaux utilisés auront atteint l'age adulte, c'est à dire plus de 8 semaines
Mise en place d’un modèle de stress infantile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
D'anciens reproducteurs mâles, retenus pour leur agressivité, infligent à des souris mères des défaites sociales de 10 minutes répétées sur six jours, afin d'exposer indirectement leurs souriceaux à l'agression physique de leur mère. 532 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, d'autres mères étant aspergées d'urine de mâle ou séparées de leurs petits 10 minutes par jour pendant six jours. Le porteur indique que la défaite sociale induira une "douleur physique" chez les mères et que la "douleur psychique" est "la base du modèle", puis exclut toute analgésie qui pourrait interférer avec l'étude. 160 souriceaux passent ensuite, à l'adolescence et à l'âge adulte, des tests de comportement social, d'anxiété, d'anhédonie et de résignation, sans que ces tests soient nommés. 270 souris restent en vie, 200 souriceaux et 40 femelles réaffectés à l'élevage si le comportement maternel n'est pas atteint, et 30 mâles agressifs gardés pour de futures défaites sociales, les 262 autres étant mises à mort.
Objectifs
Les expériences de vie précoce pendant l’enfance, qu’elles soient positives ou négatives, peuvent laisser des traces indélibiles sur le cerveau et le développement psychologique. En effet l’exposition précoce à des traumatismes psychosociaux, incluant entre autres la maltraitance infantile, est indiscutablement l’un des plus importants facteurs prédicteurs de pathologies psychiatriques à l’adolescence et à l’âge adulte, notamment de la dépression et du suicide. Différents modèles animaux chez la souris ont été mis en place pour étudier les conséquences du stress précoce sur le développement cérébral et psychologique, mais ces modèles se concentrent principalement sur des périodes tardives du développement (après le sevrage), et nos connaissances des effets à long terme sur le cerveau du stress infantile sont extremement limitées. Nos connaissances des mécanismes cellulaires participant à la formation et à la persistance des mémoires traumatiques précoces sont aussi très lacunaires. Afin d’étudier ces mécanismes, nous nous proposons ici de mettre en place et de tester la validité d’une procédure de stress indirect (l'expositition indirecte de souriceaux à l'agression physique de leur mère) basée sur l’experience sensorielle et la contagion émotionnelle, pouvant mimer chez la souris un traumatisme psychologique infantile avant le sevrage des animaux. Nous testerons finalement comment cette expérience peut precipiter la survenue de comportements de type anxieux et dépressifs à l’adolescence et l’age adulte.
Bénéfices attendus
Il n’existe actuellement aucun modèle animal permettant d’étudier les conséquences du trauma infantile sur le cerveau. Pour autant, l’adversité précoce est sans conteste le premier facteur de vulnérabilité pour les maladies psychiatriques telles que la dépression, les troubles anxieux, le syndrome de stress-posttraumatique, et pour le suicide. Outre la souffrance morale induite par ces pathologies, elles constituent un enjeu majeur de sante publique compte tenu du fardeau socio-économique engendré. Ces pathologies sont difficiles à prendre en charge, avec des traitements qui sont actuellement peu satisfaisants en termes de cout et d’efficacité. La mise en place d’un modèle pertinent de trauma psychosocial infantile permettrait dans ce cadre de mieux comprendre, d’un point de vue fondamental, comment le stress précoce affecte le cerveau et son développement. Cela permettrait également de disposer d’un outil pertinent pour étudier les mécanismes cellulaires mis en jeu dans la formation et la persistance des mémoires traumatiques précoces, et comment elles influent notre comportement. Si l’objectif à court terme de cette recherche fondamentale n’est pas la mise au point d’un outil thérapeutique visant à améliorer la prise en charge de populations cliniques victimes de trauma psychosocial pendant l’enfance, il est certain qu’une étape indispensable vers cet objectif est la compréhension des mécanismes neurobiologiques mis en jeu.
Procédures
- 8 mères ne subiront aucune manipulation (groupe contrôle) - 16 mères subiront une aspersion d'urine de mâle. - 16 mères subiront une séparation de leurs petits de 10 min pendant 6 jours. - 16 mères seront exposées à une défaite sociale durant 10 min et répétées sur 6 jours - 16 mères seront aspergées d'urine de mâle et isolées 10 min de leur petit, et cela, à un rythme d'une fois par jour sur 6 jours. - 60 mâles seront utilisés pour sélectionner des individus agressifs. - 40 souris sentinelles seront utilisées pour sélectionner des individus agressifs. - 360 petits seront pesés soit entre 3 et 8 jours postnatal soit entre 14 et 21 jours apres la naissance. - 160 petits seront utilisés dans des tests comportementaux, deux fois par test (une fois pendant l'adolescence, l'autre fois à l'age adulte). Ces tests sont effectués au cours de sessions uniques, allant de 3 à 10 minutes, et visent à mesurer les comportements sociaux, les conflits motivationnels et l'anxieté, l'anhédonie et la résignation des animaux.
Impact sur les animaux
Le modèle de défaite sociale (DS) induira de la douleur physique chez les mères sujettes directement au modèle. Il induira également de la douleur psychique, un état de stress aigu pendant la procédure mais aussi durable, en induisant possiblement un phénotype anxiodépressif chez les souris exposées au modèle. Cette douleur psychique est la base du modèle, l’objectif étant d’étudier comment ces changements comportementaux sont transmis aux souriceaux des mères exposées ou modifient leur comportement. L’exposition indirecte à la défaite sociale des souriceaux n’aura aucune incidence d’un point de vue physique, puisqu’elle n’est effectuée que sur les mères. Il est possible cependant que dans l’éventualité où la DS perturberait le comportement maternel, cela induise une détresse physiologique et sensorielle des souriceaux en diminuant la qualité des soins fondamentaux promulgués par leur mère. C’est pour cette raison qu'une attention particulière sera donnée au monitoring des souriceaux et du comportement maternel tout au long du protocole. Par ailleurs si notre hypothèse est validée, il est possible que le modèle induise chez les souriceaux une détresse psychique liée au stress, ce qui est notre objectif, afin d’étudier les substrats neurobiologiques et conséquences comportementales de ce stress. Etant donné que les tests de comportement sont basés sur des mesures quantitatives ou qualitatives d’exploration dans des dispositifs nouveaux et donc possiblement anxiogènes, il est possible que les tests utilisés puissent induire un stress léger chez les animaux. Ces tests sont cependant de courtes durées (10 minutes maximum), et ne sont pas basés sur des situations hautement aversives. Ces tests ne sont d’ailleurs pas connus pour induire de changements physiologiques ou comportementaux durables chez les animaux.
Devenir
Pour la validation du modèle, tous les animaux experimentaux (200 souriceaux et 40 femelles) seront réaffectés à notre élevage de souris (à condition que nos résultats ne montrent aucune atteinte au comportement maternel), afin de permettre la génération de nouveaux souriceaux. Les souris agressives utilisees pour la defaite sociale (nous estimons à la moitié le nombre de souris qui rempliront les critères d'agressivité, soient 30 souris) seront par ailleurs maintenues en vie pour de futures experiences de défaite sociale. Les souris sentinelles servant à selectionner les souris agressives, les souris non agressives, et toutes les souris utilisées pour etudier les effets du modèle sur le comportement seront mises à mort à la fin des expériences.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro ou in silico n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. La souris est par ailleurs un choix pertinent de par les homologies structurelles qui existent avec l’homme dans l’organisation des zones cérébrales impliquées dans la réponse au stress et les émotions.
Réduction
Nous souhaitons ici pouvoir évaluer une taille d’effet forte et être confiants dans les effets que nous observons, garantissant ainsi la fiabilité de nos conclusions et la reproductibilité future du modèle. Nos effectifs intègrent donc le fait de pouvoir comparer statistiquement les groupes expérimentaux pour les différentes variables comportementales (témoins, DS susceptibles : c’est-à-dire qui ont un comportement altéré à la suite du modèle de DS, DS résilients : qui ne présentent pas de modification comportementale à la suite du modèle). Basé sur la literature des effets comportementaux du stress et des changements neurobiologiques qui y sont associés, un dimorphisme sexuel est suspecté. C’est pourquoi nous utiliserons à la fois des males et des femelles en considerant ici le sexe comme une variable d’analyse. Seuls les mâles agressifs sélectionnés pourront être réutilisés pour la suite des expériences. Les effets du modèle sur le comportement des souriceaux sera testé à la fois à 22 jours et à l’âge adulte (63 jours) sur les mêmes souris, plutôt que d’utiliser des cohortes différentes pour ces différents temps de mesure, diminuant ainsi le nombre d’animaux utilisés. En l’absence d’effet délétère sur le comportement maternel et la survie des souriceaux, les animaux utilisés pour la validation du modèle pourront réintégrer l’élevage. Les tests statistiques seront adaptés à de petits effectifs expérimentaux.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimisées avec la mise à disposition de plusieurs supports pour la construction des nids (carton, coton, papier) et de bâtons de bois pour favoriser le comportement de ronger qui est important pour cette espèce (Raffinement hébergement). Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure seront réalisées avant les tests comportementaux. Les mères seront habituées à la manipulation au moins une semaine avant la naissance des petits. Les jeunes seront manipulés avec douceur et par des personnes habituées à manipuler des jeunes souriceaux. Nous incluons ici une procédure pilote en trois étapes pouvant chacune donner lieu à un arrêt total des expériences. La phase du projet étudiant l’impact de la DS indirecte sur les jeunes sera uniquement lancée si nous n’observons aucune surmortalité des petits par rapport aux mères contrôles au cours de cette procédure pilote (Raffinement des procédures). Des grilles d’évaluation de la douleur physique et de la qualité des soins maternels ont été créées pour définir précisément les points limites. Ce modèle visant à induire des atteintes psychiques, l’analgésie et le renforcement positif, ou tout traitement pouvant interférer avec l’étude ne peuvent être envisagés (réduction des douleurs physiques et psychiques associées aux procédures).
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris et la possibilité d’utiliser des animaux transgéniques permettant l’utilisation d’outils de neurosciences intégratives font de la souris le modèle animal le plus pertinent. Des souris OGM (phénotype non-dommageable) seront utilisées permettant d’induire l’expression permanente d’un rapporteur fluorescent dans les neurones activés pendant une fenêtre temporelle précise. Le choix de cette lignée est donc motivé par le fait que si notre modèle induit un phénotype robuste chez la descendance des souris exposées à la défaite sociale, elle nous permettra de visualiser les neurones activés pendant la défaite sociale, et d’étudier plus en avant la formation, la consolidation et le rappel de cette trace mnésique, ce qui est un objectif à long terme de ce projet. Les mâles agressifs seront d’anciens reproducteurs adultes, car c’est à cet âge que le comportement agressif est le plus marqué. Les souris femelles « sentinelles » seront âgées de 8 semaines (même âge que les mères qui seront utilisées pour la validation du modèle et la mesure de ses effets comportementaux). Mères expérimentales: jeunes adultes (8 semaines) ce qui est nécessaire pour la mise à la reproduction. Progéniture des mères expérimentales : de 3 jours après la naissance à l’âge adulte, car le modèle vise à induire un stress postnatal très précoce, pendant la période infantile. Les effets comportementaux du modèle seront testés après sevrage (à 21 jours) et à l’âge adulte (à 63 jours), puisque nous souhaitons connaitre les conséquences comportementales à long terme du modèle.