Souris

2920 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tuées pour prélèvement d'organes et une vingtaine réutilisées dans un autre projet. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections intradermiques dans les oreilles, un anticorps IgE puis l'antigène, provoquant une inflammation de l'oreille, suivies d'administrations de candidats médicaments et de prélèvements sanguins répétés. Le porteur décrit ce modèle d'anaphylaxie cutanée passive comme un outil de "screening" de molécules pour les maladies auto-immunes et indique n'avoir pas relevé de signe de douleur au-delà de l'inflammation locale. Il affirme qu'un modèle substitutif in vitro n'a pas abouti et revendique le recours à l'"organisme" complet de la souris.

Objectifs

L’objectif de cette demande d’autorisation est de mettre en place un modèle d’anaphylaxie passive cutanée (PCA : Passive Cutaneous Anaphylaxis) permettant d’étudier rapidement l’impact de candidats médicament sur la dégranulation des cellules mastocytes in vivo, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto immunes. Pour cela un anticorps au format IgE dirigé contre un antigène du non soi est injecté sous anesthésie générale dans le pavillon de l’oreille en intradermique pour sensibiliser la souris, puis quelques heures plus tard l’antigène (et un colorant physiologique et indolore pour la souris permettant de suivre la perméabilité vasculaire) est injecté provoquant dans les minutes qui suivent un gonflement de l’oreille et une coloration bleue de l’oreille (deux paramètres que nous suivrons) due à une activation des cellules mastocytes qui vont relarguer de nombreux granules comme l’histamine notamment. L’évaluation de candidats médicaments dans ce type de modèle vise à évaluer si le traitement par ces candidats permet de diminuer l’anaphylaxie (réaction allergique survenant rapidement après contact avec l’agent inducteur) observée au niveau cutané, mécanisme impliqué dans certaines maladies auto-immunes. Dans le processus de développement d’un candidat médicament, ce type d’étude se situe en aval des études in vitro et in silico. Il permet de sélectionner les candidats sur la base de leur capacité à diminuer l’activité du système immunitaire dans le domaine des maladies auto-immunes et également d’étudier la biodisponibilité de ces candidats (distribution de la molécule dans le corps durant les traitements). Les études incluses dans ce projet prévoient des évaluations cliniques et biologiques (prélèvements sanguins pour notamment doser la présence des anticorps en cours d’étude et prélèvements d’organes terminaux pour valider l’expression des cibles thérapeutiques). Ces prélèvements sont adaptés en termes de volume/fréquence conformément aux standards éthiques et réalisés avec les méthodes les moins contraignantes possibles (ex : prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène)

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont de pouvoir évaluer l’impact de nos candidats médicaments sur la dégranulation des mastocytes dans un modèle préclinique en amont de toute étude clinique.

Procédures

Selon la phase de développement du modèle et la procédure expérimentale associée mise en oeuvre : -chaque souris reçoit deux injections intradermiques (une dans chaque oreille) réalisées sous anesthésie générale (moins d'une minute) ; +/- 23h plus tard et selon la phase de la mise au point : administration du véhicule, composé de référence ou candidat médicament en per os, Intra veineuse, sous cutanée ou intra péritonéale sur souris vigile (moins de 30 secondes) ; suivi 1 heure plus tard d’une injection en intraveineuse en vigile (moins de 30 secondes) ; photographies de la coloration de l’oreille et mesures de l’épaisseur de l’oreille par pied à coulisse sur souris vigile (au maximum 4 mesures - moins d'une minute à chaque mesure) ; Durée totale des études de 48h heures maximum.Tout au long de l’étude chaque souris pourra se voir prélever un petit volume de sang par µsampling (prélèvement de petit volume sanguin à la veine saphène - moins de 30 secondes).

Impact sur les animaux

Inflammation locale de l’oreille de la souris durant de la durée de l’étude (1 heure à 24 heures) -Administration de composés candidats médicaments selon les voies classiques intra-péritonéale intra-veineuse sous-cutanée ou per os

Devenir

Les souris incluses dans la première phase de mise au point de ce modèle ne nécessitant pas de prélèvements de tissus pourront être réutilisées dans le cadre d’un autre projet. A l’issue de chaque procédure, les animaux seront sinon euthanasiés pour collecte des organes et tissus et analyses in vitro des échantillons (immohistochimie, etc).

Remplacement

La recherche de nouveaux médicaments dans la prise en charge des maladies auto-immunes repose sur une première phase d’identification de candidats médicaments efficaces sur leur cible au moyen de modélisations in silico et in vitro. L’efficacité thérapeutique d’un candidat médicament ne peut être démontrée qu’après administration chez l’animal, dans le contexte d’un organisme complet et complexe incluant l’ensemble des mécanismes physiopathologiques. Les pathologies auto-immunes sont par essence multifactorielles et impliquent un grand nombre de types cellulaires et de médiateurs, qu’il n’est donc pas possible de modéliser complètement in vitro. Seules les molécules les plus abouties et les plus avancées dans leur développement sont administrées in vivo. Dans le cadre plus spécifique de ce projet, les tentatives de mise en place d’un modèle substitutif à ce modèle in vivo n’ont pour l’instant pas abouti et nous ne disposons pas d’un modèle de dégranulation in vitro suffisamment fiable et permettant le même niveau de prédictibilité que celui mené dans l’organisme de la souris avec toute sa complexité et l’intégralité des différents composants du système immunitaire.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés sera affiné au fur et à mesure de la mise en place de ce modèle. Les conditions expérimentales des premières étapes sont directement basées sur les données de la littérature pour ce modèle très communément réalisé. Un accompagnement par le service Biostatistique sera assuré afin d’affiner les designs expérimentaux, d’estimer la variabilité des paramètres et in fine le nombre d’animaux nécessaire par groupe pour les procédures 2 et 3 à l'aide d'un t test. De plus pour les premières phases chaque animal sera son propre contrôle, une seule des deux oreilles recevant l’agent inducteur et la seconde étant le contrôle.

Raffinement

L’administration de l’antigène par voie systémique va entrainer une inflammation locale du pavillon de l’oreille ayant reçu l’anticorps au forma IgE de cet antigène. Dans le cadre de cette DAP les doses utilisées du couple Anticorps/Antigène sont basées sur une analyse bibliographique et pour lesquels il n’a pas été relevé de souffrance ou de signes de douleur (si ce n’est l’inflammation locale de l’oreille qui est le paramètre étudié dans ce modèle) Des prélèvements de sang répétés en cinétique sont réalisés à différents temps afin de mesurer les paramètres biologiques d’intérêt et/ou le taux plasmatique du médicament. Les prélèvements de sang sont effectués selon la technique du « multisampling » à la veine latérale de la patte, méthode systématiquement privilégiée par rapport aux autres techniques usuelles car rapide, réalisable plusieurs fois sur un même individu, et respectant les volémies et les conditions physiologiques de la souris. Cette technique permet également de réduire considérablement le nombre d’animaux inclus par étude Les administrations intradermiques dans chaque oreille sont réalisées sous anesthésie générale. Un suivi quotidien des animaux sera réalisé par les expérimentateurs et le personnel assurant leur soin. Ce suivi permettra d’identifier tout signe de souffrance et d’appliquer les mesures nécessaires au soulagement des souris en cas d’atteinte de points limites prédéfinis. Les souris seront hébergées en groupes sociaux et disposeront de matériel de nidification dans leur cage d’hébergement.

Choix des espèces

La souris présente certains traits caractéristiques similaires à l’Homme dans la biologie des réactions immuno-inflammatoires rendant ainsi pertinente son utilisation. De nombreux modèles ont montré un fort parallélisme dans les différents médiateurs mis en jeu lors des maladies auto-immunes (auto-anticorps, cellules du système immunitaire, cytokines, …). Par ailleurs l’utilisation de candidat médicament comme les anticorps nécessitent souvent l’utilisation de modèles murins dits humanisés, dans lesquels le gène cible a été remplacé par manipulation génétique par le gène cible humain sans incidence sur le phénotype. La protéine humaine exprimée pourra alors être détectée par le ou les anticorps candidats Idéalement, les souris sont utilisées à l’âge adulte, à partir de 8-9semaines, soit un poids corporel d’environ 18-20g. C’est l’âge classiquement utilisé dans tous les protocoles qui seront réalisés dans la sélection des candidats médicaments.

1280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des nouveau-nés reçoivent des cellules souches humaines pour reconstituer un système immunitaire humain, puis les souris subissent des greffes de peau avec deux greffons suturés en environ 90 minutes, des greffes d'îlots pancréatiques, l'induction d'un diabète par injection d'alloxan et une imagerie intravitale répétée. Le porteur indique que ces greffes peuvent provoquer des douleurs postopératoires et une perte de poids. Il affirme que l'efficacité de la thérapie cellulaire ne peut être évaluée qu'in vivo et présente les bénéfices pour les patients au conditionnel et à terme.

Objectifs

Aujourd'hui, la greffe d'organe est souvent le dernier recours pour les patients dont les organes vitaux sont défaillants. La greffe permet de retrouver une qualité de vie et d’améliorer la survie des patients. Néanmoins, les traitements anti-rejet ont de nombreux effets secondaires (infections et cancers). Le but de ce projet de recherche, prévu sur une période de 5 ans, est de développer une thérapie cellulaire et génique pour supprimer le besoin en anti-rejets. Il s’agit de modifier génétiquement les cellules régulatrices du système immunitaire du receveur pour qu’elles neutralisent la réaction de rejet. L’efficacité in vitro et in vivo de ces cellules régulatrices modifiées a été établie. Il est désormais indispensable de démontrer et d'optimiser leur efficacité dans des modèles précliniques de greffe pour mieux garantir un effet protecteur à long terme, une étape nécessaire pour son utilisation future chez l'homme. Seul un modèle murin de transplantation est capable de récapituler la complexité des phénomènes de rejet. Quatre types de modèles murins seront utilisés pour tester et optimiser l'utilisation d’immunothérapies dont les CAR-Tregs : 1- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules souches humaines (souris humanisées) 2- un modèle de greffe de peau chez des souris 12 semaines après la reconstitution partielle du système immunitaire par des cellules mature humaines (souris semi-humanisées) 3- un modèle de greffe d’ilots chez des souris 12 semaines après la reconstitution de leur système immunitaire par des cellules humaines (souris humanisées) et 4-un modèle de maintien de la tolérance immune avec deux greffes de peau successives chez la souris humanisée. Au total, deux lignées immunodéprimées seront utilisées.

Bénéfices attendus

A terme, ces expériences permettront : - de démontrer la synergie d'une immunothérapie ciblant les cellules dirigées contre les greffons et de CAR-Tregs - de montrer la possibilité d’expandre les CAR- Tregs in vivo, - et d'établir l'efficacité des CAR-Tregs à prévenir le rejet aigü et chronique de greffe de peau et d’ilots dans des modèles précliniques de souris humanisées. Cette nouvelle stratégie thérapeutique ambitionne d’améliorer la prévention des rejets en transplantation d’organe, tout en s’affranchissant de la toxicité des drogues immunosuppressives administrées au long cours. La prévention des réactions de rejet dans ces trois modèles complémentaires serait un argument préclinique très robuste et convaincant pour porter cette nouvelle stratégie vers une utilisation clinique.

Procédures

Injection des cellules souches: Des nouveaux nés recevront des cellules souches humaines par voie intrahépatique sans anesthésie. Ce geste est réalisé une fois et dure quelques secondes. Injection et prélèvement sanguin: réalisés dans le sinus rétro-orbitaire en alternance sur chacun des yeux sous une courte anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

Les greffes de peau et d’îlots peuvent induire chez les animaux des douleurs les jours suivant la chirurgie accompagnée d’une perte de poids (>10%) et une perturbation de la mobilité par le bandage. L’injection d’alloxan risque d’induire une hypoglycémie transitoire avec une augmentation du taux d’insuline plasmatique due à la destruction du pancréas.

Devenir

A l’issus de chaque procédure, les animaux seront mis à mort pour le prélèvement d'organes.

Remplacement

Des études fonctionnelles in vitro ont été réalisées avec des cellules humaines afin d’optimiser la préparation de la thérapie cellulaire. Toutes les étapes visant à améliorer l’efficacité de la modification génétique des cellules régulatrices ont été mises au point in vitro. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des CAR Trégulateurs dans les différents organes, ou leur capacité à migrer dans les greffons, et à induire une tolérance. En effet, lorsque les cellules sont greffées, elles se transforment en réponse à leur environnement, en particulier l’environnement inflammatoire induit pas la réaction de rejet, ce qui peut complètement modifier leur persistance et leur activité tolérogène. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.

Réduction

Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés. Le suivi par imagerie intravitale permet un suivi longitudinal des animaux et donc une réduction de leur nombre. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Les résultats seront partagés avec la communauté scientifique pour éviter les doublons.

Raffinement

Afin de limiter la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques (buprénorphine) sont prévues. Une grille de score permettant d’évaluer objectivement les éventuelles souffrances, douleurs et détresses a été établie pour définir des points limites permettant d’anticiper l’administration d’analgésiques ou la mise à mort de l’animal si nécessaire. Une anesthésie gazeuse sera pratiquée pour chaque geste invasif (injection iv, prélèvement sanguin, chirurgie). Pour toute anesthésie prolongée, les animaux seront placés sur une plaque thermostatée permettant de maintenir leur température corporelle et du gel oculaire sera appliqué. La contention nécessaire pour l’imagerie in vivo sera accompagnée d’une anesthésie sous forme gazeuse par isoflurane. Dans le cas de l’anesthésie gazeuse, la vigilance de l’animal sera surveillée par pincement de la palme plantaire, mobilité des vibrisses et suivi du mouvement thoracique respiratoire et ce, jusqu’au réveil complet de l’animal. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). Les souris seront élevées en communauté. Cependant si cela n’est pas possible (agressivité entre deux souris par exemple), d’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvant seuls dans les cages. Pour réduire le nombre de manipulations et limiter le stress des animaux, l’imagerie in vivo sera faite en même temps la mesure du score.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. De plus, la souris est un modèle permettant d’effectuer des modifications génétiques relativement facilement. Ces modifications nous permettent d’avoir des modèles immunodéficients nécessaires pour la création de lignée dites humanisées, qui se rapprochent du système immunitaire humain. Pour la constitution des souris humanisé par injection de cellules souche humaines, les animaux seront âgés de 1 à 3 jours car c’est une période durant laquelle la greffe de cellule humaine est la plus efficace. Concernant les greffes de peau/ilots, elles seront réalisées 14 semaines post injection des cellules humaines pour permettre une reconstitution complète du système immunitaire humain. Pour le modèle de greffe d'ilots sur souris partiellement humanisées, les animaux seront greffés à l’âge de 8 à 12 semaines.

750 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces femelles reçoivent une injection intramusculaire d'un vecteur AAV puis passent dix séances d'imagerie de bioluminescence et dix prises de sang sous anesthésie, pour mettre au point un médicament vétérinaire stérilisant présenté comme une alternative à la castration chirurgicale des chiens et chats. Le porteur inscrit le projet dans une démarche de "bien-être animal" et affirme que les souris remplacent chiens et chats aux étapes précoces, tout en prévoyant la mort des 750 souris utilisées. Il affirme qu'aucune méthode substitutive ne permet d'identifier une dose efficace et sûre.

Objectifs

Nous souhaitons réaliser des essais d’efficacité et d’innocuité chez la souris en vue de développer un médicament vétérinaire permettant une alternative à la castration chirurgicale des animaux de compagnie. L'enjeu de cette demande d’autorisation de projet s’inscrit dans un contexte de développement d’une solution alternative à une mutilation inutile et s’inscrit dans une démarche globale favorisant le bien-être animal. Outre le fait d’éviter la souffrance animale, la solution développée permettra de prévenir le recours à des euthanasies inutiles effectuées aujourd’hui sur des chiens et chats errants. Dans le respect de la règle des 3R : Afin de limiter au maximum le recours aux animaux durant ce projet, les premiers tests de sélection des candidats médicaments ont été/seront réalisés in vitro en laboratoire. Néanmoins, l'absence de méthodes substitutives à l'utilisation d'animaux permettant d’identifier aux mieux une dose efficace et sécurisée pour les animaux de compagnie font que des essais chez la souris sont justifiées. L’emploi de souris permet de remplacer l’emploi de chiens et de chats à des étapes précoces du développement. Afin de respecter la notion de raffinement, le bien-être de nos animaux sera pris en compte de leur réception à leurs morts : condition d'élevage des animaux adaptée, présence d'enrichissement dans les cages, visite quotidienne par du personnel qualifié. Une période d’acclimatation de 2 semaines sera respectée entre la réception des animaux et le début de la procédure. De plus lorsque cela est nécessaire les animaux seront anesthésiés et surveillés. De même, certains prélèvements pourront être effectués sur animal mort. Pour l'ensemble de la procédure, des critères d'arrêt par rapport à la souffrance strictes seront appliqués. Nous demandons pour réaliser l'ensemble de ces essais 750 animaux au total sur une période de 5 ans.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu est de trouver une alternative à la castration chirurgicale qui est traumatisante pour les animaux.

Procédures

Injection intramusculaire : une fois pour un temps de 1 min Imagerie de bioluminescence : 10 fois pour un temps de 20 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement. Prélévement de sang : 10 fois apour un temps de 1 min avec 15 jours à 1 mois d'espacement.

Impact sur les animaux

L'injection intra-musculaire d'AVV peut provoquer une inflammation en locale. La manipulation des souris et notamment l'imagerie réalisée nécessite des anesthésies gazeuses.

Devenir

Les animaux utilisés présentent un risque modèrés pour l'homme ou pour l'environement.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative à la réalisation de ce projet, c’est-à-dire un système biologique qui reproduit partiellement ou entièrement les conditions cliniques, analytique et/ou moléculaire de notre objet d'étude. II est impossible d'obtenir les informations fournies dans cette étude sans l'utilisation de souris. Les conclusions recherchées ne peuvent pas encore être obtenues par des modèles alternatifs d'étude in vitro, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité, l’interactivité et la diversité des compartiments biologiques mis en œuvre.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaire par lot a été défini statistiquement. Il est ici de 15.

Raffinement

Concernant l’objectif de réduction de la souffrance, de la douleur et/ou de l’angoisse infligées aux animaux, les souris seront suivies quotidiennement par du personnel qualifié pour détecter d’éventuels signes cliniques ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans le respect de la législation. Les conditions d’hébergements sont adaptées au statut sanitaire de ces animaux (cages, nourritures et litières sont stérilisées. De plus, chaque cage reçoit un enrichissement du milieu. ). En ce qui concerne les données de comportement et de physiologie, l’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie.

Choix des espèces

Les animaux utilisés sont des souris femelles de 5 semaines (démarrant l’expérimentation à 7 semaines après 2 semaines d’acclimatation). De plus, les femelles sont plus aisément manipulables que les mâles et que nous pouvons nous limiter au genre femelle pour réduire le nombre d’animaux (dans le respect des 3R). Les hormones de reproduction étant similaires chez la souris et chez les animaux de compagnie, cette espèce est adaptée à notre étude. Les souris seront utilisées à l'âge de 7 semaines, âge pour lequel elles sont reconnues comme pubères et fertiles et dont on pourra confirmer l’induction d’une stérilisation biologique et après 2 semaines d’acclimatation.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes puis des jeunes reçoivent par voie orale des composants du cannabis pendant dix à trente-cinq jours, pour tester l'hypothèse d'un lien entre cette exposition et le cancer du testicule. Le porteur signale le stress de l'administration orale et un risque de fausse route pouvant conduire à euthanasier l'animal, et met à mort les souris pour prélever le sang et les testicules. Il indique disposer de lignées cellulaires et de cultures d'organes humains mais affirme qu'elles ne remplacent pas l'animal.

Objectifs

Le cancer du testicule constitue le cancer le plus fréquent chez l’homme entre 15 et 40 ans. L’étiologie de ce cancer est encore mal comprise. Les données épidémiologiques convergent pour indiquer que l’exposition à des facteurs environnementaux pendant certaines fenêtres de vulnérabilité, telles que le développement et la puberté, est impliquée dans la tumorisation des cellules germinales testiculaires. Récemment, la consommation de cannabis, substance illicite la plus consommée par les adolescents et les femmes en âge de procréer, a été corrélée au développement de tumeurs du testicule chez de jeunes consommateurs. Il a été établi que le développement de ce type de cancer affecte la fertilité. Dans ce contexte et sur la base de nos résultats préliminaires, nous postulons que les cannabinoïdes (CA), molécules contenues dans le cannabis, favorisent l'apparition du cancer du testicule en perturbant la maturation des cellules souches germinales. Le but de ce projet est donc d’évaluer si une exposition aux principes actifs du cannabis pendant la vie fœtale et/ou la puberté affecte la différenciation et la fonction testiculaire et pourrait ainsi favoriser le développement de tumeurs germinales.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche permettrait de mettre en exergue les conséquences d'un cumul d'exposition auxquelles les populations les plus vulnérables sont soumises, et ce en comparaisons avec une exposition uniquement gestationnelle ou uniquement pubertaire.

Procédures

Traitement par administration orale repetée (pendant 10 jours ou pendant 35 jours). Ce geste est rapide (10 à 20 secondes par animal).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont le stress induit par l'administration orale des souris gestantes pendant 10 jours ainsi que des souris prépubères pendant 35 jours. La possibilité de fausse route est également un risque induit par ce traitement. Bien que les doses utilisées ici sont des doses utilisées en thérapie humaine, nous ne pouvons exclure un effet néfaste des cannabinoïdes utilisés sur le développement pré- ou postnatale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation afin de prélever les organes ainsi que les matrices biologiques à investiguer dans le cadre de notre étude. Il s'agit du sang, des testicules, de l'épidyme et du foie.

Remplacement

Alternativement aux modèles animaux, il existe des lignées de cellules cancéreuses testiculaires humaines. Nous utiliserons ces dernières afin de travailler sur les voies de signalisation spécificiques modulées en présence de CBD et/ou THC. Nous utilisons également des modèles de cultures organotypqiques de testicules adultes et foetaux humain pour investiguer la réponse de l'organe aux traitements. Ces modèles ne permettent pas d'obtenir la réponse de l'organisme, contrairement aux modèles animaux, et notamment de prendre en considération les interactions mère-foetus tout comme l'effet des traitements sur l'axe hypothalamo-hypophysaire, axe régulant la fonction reproductive. Ils restent complémentaires mais ne peuvent se substituer à l'utilisation d'animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental sera de 6 pour nous permettre de mener à bien des études statistiques et de prendre en compte la "réduction" de la règle des 3R.

Raffinement

Pour réduire au maximum le stress des animaux, les traitements seront administrés par voie orale par des personnes expérimentées en présence de musique qui, nous l'avons constaté, a pour effet de relaxer les animaux comme l'expérimentateur. Les animaux seront observé quelques minutes après le traitement pour vérifier l'absence de fausse-route. Si une fausse-route s'avérait constaté, l'animal serait euthanasié. Plusieurs paramètres du bien-être des animaux (mobilité, poids,activité de toilettage) sont particulièrement surveillés pendant la procédure et des points limites adaptés ont été définis.

Choix des espèces

Nous avons choisis la souris Swiss ici pour sa fertilité élevée et sa facilité d'élevage et de traitement. Les animaux seront utilisés du stade embyonnaire jusqu'à 8 mois.

1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois chirurgies, ovariectomie, implantation d'un comprimé d'hormonothérapie, injection de cellules tumorales ou curage ganglionnaire, précédées d'injections de tamoxifène, pour étudier l'effet des œstrogènes sur le microenvironnement d'une tumeur mammaire et sur le lymphœdème. Le porteur qualifie de modérées les douleurs liées aux chirurgies et au développement des tumeurs, et prélève les organes en fin de vie. Il affirme qu'aucune stratégie de remplacement ne permet d'étudier ces processus et que la souris est le seul modèle disponible.

Objectifs

L'hormonothérapie est un des premiers traitements du cancer du sein exprimant le récepteur des oestrogènes (dit ERα-positif) et a permis de réduire largement le nombre de récidives chez les patientes et ainsi d'augmenter la survie chez ces femmes. Or, l'impact de ce traitement sur le micro-environnement de la tumeur, de tumeurs dites ERα-négatives (n'exprimant pas le récepteur des oestrogènes), est encore mal connu, alors qu'une certaine efficacité a été observée dans les premiers essais cliniques . De plus, de nombreuses résistances apparaissent, ainsi que des lymphoedèmes secondaires qu'il reste à mieux comprendre pour mieux le traiter. Le lymphodème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer et qui est souvent associée à ces traitements d'hormonothérapie. Ce projet cherche donc à mieux caractériser l'impact de cette hormonothérapie sur le micro-environnement tumoral dans le cadre du cancer du sein, pour trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce travail est un travail qui étudie les mécanismes d'actions spécifiques du récepteur des oestrogènes ERα dans la réponse à un traitement d'hormonothérapie par les SERMS (Selective Estrogen Receptor Modulators) sur les cellules endothéliales, non seulement sur les cellules endothéliales vasculaires mais aussi sur les cellules endothéliales lymphatiques. Cette étude permettra à terme de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter les cancers ERα négatives , en particulier là où les autres stratégies anti-angiogéniques ont échoué. De plus, cette étude de l'impact d'ERα dans la réponse à l'hormonothérapie sur le réseau lymphatique permettra de mieux comprendre le développement du lymphoedème secondaire à la chirurgie du cancer du sein afin d’améliorer les traitements et la qualité de vie des patientes ayant subi un curage ganglionnaire.

Procédures

Les animaux pourront subir jusqu'à 3 chirurgies (ovariectomie (durée 20 min),implantation petit comprimé pour traitement par l'hormonothérapie (durée 5 min), injection de cellules tumorales (durée 5 min) ou curage ganglionnaire ( durée 30 min)) après 5 injections consécutives de Tamoxifène pour induire la Cre-recombinase sur les animaux transgéniques génétiquement modifiées. Toutes ces procédures sont espacées de 2 à 3 semaines pour laisser à l'animal le temps de récupérer des chirurgies et du stress éventuel occasionné. Tous les prélévements sont effectués en phase terminale, sans réveil.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes (tumeurs, poumons, pattes, utérus, foie) et réaliser des analyses immunohistochimiques et/ou moléculaires

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de l'hormonothérapie (anti-oestrogènes) dans le cadre du traitement du cancer du sein. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de la réponse à l'hormonothérapie . De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel l’invalidation génique du récepteur aux oestrogènes a été générée. De plus, c'est le seul modèle où l'on peut avoir un suivi de la croissance tumorale avec formation de métastases.