Souris

70 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Le protocole vise à créer chez elles un modèle de nécrolyse épidermique toxique, une réaction cutanée grave, par des injections répétées et un transfert de cellules, puis à tester un anticorps. Le porteur indique attendre un œdème cutané puis un décollement de l'épiderme, des atteintes des muqueuses et des conjonctivites, les animaux étant mis à mort dès le décollement, et pratique chaque jour un test de Nikolsky qui consiste à presser la peau pour voir si l'épiderme se détache. Il affirme qu'aucune alternative in vitro ne peut reproduire ce qui se passe dans un "organisme entier" et juge le modèle in vivo "obligatoire".

Objectifs

Les réactions d’allergie médicamenteuse, appelées également toxidermies médicamenteuses, sont des effets secondaires fréquents chez les patients hospitalisés (1‐3%). Il s’agit de réactions de type d’hypersensibilité retardée dues à des lymphocytes T, au cours desquelles la prise de médicament est l’élément déclencheur. Ces réactions allergiques peuvent être de sévérité très variée. Les plus sévères sont connues sous le nom de nécrolyse épidermique toxique . Il s’agit d’une réaction rare (2-4 patients/million d’habitants/an) mais extrêmement sévère, avec décollement et nécrose de la partie supérieure de la peau, parfois sur l’ensemble du corps. Ces réactions sont potentiellement mortelles (~30%) ou entraînent fréquemment de graves séquelles (>50% des patients). Malheureusement il n’existe à ce jour aucun traitement ayant fait preuve de son efficacité dans cette pathologie, et la seule prise en charge consiste à arrêter le traitement responsable et à prendre en charge la cicatrisation des patients dans un centre de grands brûlés. Des études réalisées chez les patients atteinds de toxidérmie sévères ont permis d’identifier un biomarqueur qui est exprimé de façon prédominante sur les cellules immunes responsables de la maladie. Ce biomarqueur constitue une cible de traitement nouvelle et prometteuse. Avant toutefois de passer chez l’homme, des études précliniques chez l’animal sont indispensables. A l’heure actuelle il n’existe pas de modèle de nécrolyse épidermique toxique chez la souris. Aussi ce projet a pour but dans un premier temps de mettre en place un modèle murin susceptible de mimer les atteintes cutanées observées au cours de la maladie, puis dans un 2e temps, de tester l’efficacité d’un anticorps thérapeutique à bloquer ce biomarqueur, ceci afin de prévenir ou retarder l’apparition de symptômes cliniques dans ce modèle.

Bénéfices attendus

1-Développement d’un nouveau modèle expérimental susceptible de mimer la nécrolyse épidermique toxique, et qui pourra par la suite être utilisé pour mieux comprendre le développement de cette affection. 2-Faire la preuve de concept que l'utilisation d’un anticorps thérapeutique permet de bloquer la réponse immune et d’inhiber le développement des symptômes cliniques chez l’animal, ouvrant de nouvelles perspectives pour l’évaluation d’un anticorps similaire (déjà commercialisé) chez les patients atteints d’allergie médicamenteuse.

Procédures

Les animaux seront injectés en vigiles par injections à plusieurs reprises (selon les animaux=1 ou 2 injections tous les 5 jours, soit 3 ou 6 injections au total, durée 30sec). Le transfert des cellules sera fait par injection sur des animaux anesthesiés (1 injection, 40sec). Des tests de Nikolsky (legère pression de la peau avec le doigt) seront réalisés sur les animaux quotidiennement sous anesthésie (30 sec). Les animaux seront pesés 2 fois par semaine en vigile (15sec). Les oreilles des animaux seront egalement mesuré quotidiennement 5jours/7 sous anesthesie (durant 21 jours maximum, durée 30 sec)

Impact sur les animaux

Les anesthésies peuvent entrainer du stress chez les animaux. Les injections générent un stress et une légère douleur. Pour les animaux qui vont developper une réaction mimant les symptômes de la nécrose épidermique toxique avec des atteintes cutanées : on s'attend à ce que les premiers symptômes arrivent entre 7 et 10 jours après le début de la procédure, et a ce que les animaux développent dans un premier temps un léger œdème cutanée (qui sera suivi par l'augmentation de l'épaisseur de l'oreille) ce qui pourra engendrer de l'inconfort, peux être des grattages chez ces animaux. Puis dans un deuxième temps on devrait observer un détachement de l’épiderme par endroit. Celui-ci sera suivi quotidiennement par la réalisation d’un test de Nikolsky sur des animaux anesthesiés (en exerçant avec un doigt une très légère pression / frottement sur la peau afin de voir si l’épiderme se détache). A noter que des atteintes des muqueuses , et des conjonctivites sont possibles ainsi qu’une modification significative de l’activité.

Devenir

tous les animaux seront mis à mort en vue de réaliser des analyses sur la peau. Ces analyses permettront d'analyser les populations de cellules qui infiltrent le tissus et de bien les caractériser afin de valider le modèle et egalement de pouvoir confirmer au niveau cellulaire l'efficacité ou non de l'anticorps d'intérêt.

Remplacement

La finalité du projet est de tester un nouveau traitement susceptible de bloquer la réponse immune et d’inhiber le développement des symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique. Le signe clinique clé de la pathologie est le détachement de la membrane basale suite à l’activité cytotoxique de cellules spécifiques qui vont infiltrer le tissus. Il n’est pas possible de mimer cette réponse physiopathologique dans un modèle in vitro et aucune autre alternative ne peux mimer ce qui se passe dans un organisme entier, de ce fait l’utilisation d’un model in vivo est obligatoire pour évaluer ce traitement.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique. Il a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que la 2e partie de ce projet ne sera réalisée qu'en fonction des résultats obtenus pour le développement du modèle expérimental.

Raffinement

Des mesures seront mises en œuvre afin d’optimiser le bien-être des animaux. A leur arrivée dans l'animalerie, une période d'acclimatation d'une semaine sera respectée avant le début des procédures expérimentales. Les animaux seront maintenus entre 4 et 5 souris par cage, afin de les maintenir au maximum en groupe social. Des points limites bien définis, suffisamment précoces et prédictifs, pour prévenir tout stress et limiter la survenue de symptômes douloureux ont été mis en place. L’observation des animaux sera effectuée 7jours/7 et nous attacherons une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dès l’apparition des premiers symptômes cliniques de la nécrolyse épidermique toxique (décollement de l'épiderme), les animaux seront mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour explorer les maladies immunologiques, telles que l’allergie ou l’inflammation cutanée, en raison des nombreux outils qui ont été développés pour caractériser les réponses immunitaires. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de cytokines inflammatoires. Les souris entrent dans les procédures à l’âge de 5-22 semaines, période correspondant à l’âge de maturité du système immunitaire.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ce volet jumeau d'un même protocole multicentrique impose à chaque animal deux chirurgies cardiaques espacées de quatre semaines, des séances d'imagerie sous anesthésie, des courses forcées sur tapis roulant et des prélèvements sanguins, pour caractériser la récupération du cœur après un stress pathologique transitoire. Les bénéfices avancés pour l'Homme restent formulés au conditionnel et à long terme, l'objectif immédiat étant le séquençage des gènes exprimés dans le cœur. Le porteur décrit l'insuffisance cardiaque comme une atteinte de l'"organisme entier" et affirme la "nécessité" du modèle murin.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du cœur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de cœurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront déployées dans 2 zootechnies disposant d'outils et compétences complémentaires.

Bénéfices attendus

Le projet s'inscrit dans les recherches expérimentales pour l'amélioration future de la prise en charge et du traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbi-mortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.

Procédures

La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.

Impact sur les animaux

L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Elles constituent les sources de douleur (chirurgies et période post-opératoire) mais toutes les mesures d’analgésie nécessaires et validées seront prises pour l'empecher. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.

Devenir

Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.

Remplacement

Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).

Réduction

L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.

Raffinement

Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en œuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.

Choix des espèces

La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances et techniques acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible thérapeutique identifiée lors de la réalisation du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur et l'inactiver.

650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit deux chirurgies cardiaques, une pour induire la pathologie puis une pour la corriger quatre semaines plus tard, suivies d'échographies et de scanners sous anesthésie, de courses forcées sur tapis roulant et de prélèvements sanguins répétés, pour étudier le remodelage inverse du cœur. Les retombées annoncées pour les patients, un vieillissement en meilleure santé et de nouvelles cibles thérapeutiques, sont renvoyées au conditionnel et au long terme, alors que l'objectif immédiat reste de décrire des mécanismes moléculaires. Le porteur affirme que l'insuffisance cardiaque touche l'"organisme entier", ce qui rendrait une approche in vivo "indispensable", et conclut au recours à la souris.

Objectifs

L'insuffisance cardiaque (IC) se développe suite à l’accumulation d’altérations induites par un stress pathologique comme l’hypertension ou les atteintes des artères coronaires. Ces multiples altérations sont regroupées sous le terme général de remodelage. Les avancées thérapeutiques permettent de ralentir cette progression vers l’IC et parfois de lever le stress cardiaque initial. Cependant de nombreux patients voient leur fonction cardiaque décliner inexorablement ou secondairement. Des études récentes conduites chez l'Homme et chez l’animal ont montré que suite à un stress cardiaque pathologique transitoire, certaines lésions semblent irréversibles, d'autres s’estompent constituant un processus de remodelage inverse. L’analyse au niveau moléculaire de ce processus indique qu'il correspond en fait à un nouvel état plutôt qu’à un retour à la normale. Ces données sont cohérentes avec la description clinique d’altérations tardives après une prise en charge efficace dans un premier temps. Ce retentissement à long terme sera probablement de plus en plus fréquent avec le vieillissement de la population. Le projet vise à identifier, in vivo dans un modèle murin, les mécanismes intimes, cellulaires et moléculaires, impliqués dans le remodelage inverse et susceptibles de favoriser une récupération plus complète et durable. Les recherches précliniques sur cette problématique sont à ce jour balbutiantes. Le projet permettra de compléter ces études en profitant des dernières avancées technologiques, de proposer et de tester des stratégies thérapeutiques complémentaires et nouvelles. Sur la base d'un modèle murin bien caractérisé de pathologie cardiaque, adapté pour être transitoire, ces objectifs seront suivis par 1) une caractérisation moléculaire approfondie du coeur en phase de récupération de la pathologie comparée à celle de coeurs sains et malades. Cette approche sans à priori, par séquençage à large échelle des gènes exprimés dans ces différentes conditions permettra de décrire les évènements moléculaires et de générer de nouvelles hypothèses d'intervention. 2) le suivi de la trajectoire du vieillissement, normale ou altérée, après récupération par des explorations physiologiques régulières d’une cohorte d’animaux. 3) la réalisation d’essais précliniques d’interventions (exercice, traitements, thérapie génique) pour favoriser la récupération. Les techniques utilisées seront conduites dans 2 zootechnies disposant d'outils et de compétences complémentaires.

Bénéfices attendus

traitement de pathologies humaines et le maintien en bonne santé. Il s'intéresse à une cause majeure de morbimortalité dans les pays dits développés, les maladies cardiovasculaires. Il se penche sur un aspect nouveau de l'atteinte cardiaque, les altérations persistantes malgré une prise en charge efficace. A long terme chez l'Homme, la description de cette atteinte et la compréhension de ses mécanismes pourraient permettre de favoriser un vieillissement en meilleure santé et aussi de cibler des mécanismes pathologiques nouveaux lors du traitement. Le projet déploit les dernières avancées technologiques (séquençage haut débit) pour une meilleure description moléculaire des altérations, une évaluation fonctionnelle approfondie et des essais précliniques de test d'interventions thérapeutiques. A plus court terme, la faisabilité d'une mise en place d'un modèle in vitro de fibroblaste activé sera testée. Ce type cellulaire participe de manière importante à l'atération du muscle cardiaque en synthétisant en son sein une matrice rigide responsable de défauts mécaniques et électriques cardiaques. Cette matrice excessive constitue un type de lésion nommée fibrose. Après récupération, cette fibrose persiste et aucun traitement ne cible spécifiquement cette altération, actuellement. L'établissement d'un modèle ex vivo permettrait de diminuer le nombre d'animaux nécessaires pour des études futures de certains mécanismes du remodelage pathologiques ou de criblage de candidat-médicament.

Procédures

La mise en place du modèle expérimental de récupération de la dysfonction cardiaque repose sur la réalisation de 2 interventions chirugicales (d'environ 30 min chacune) : une d'induction de la pathologie puis, 4 semaines après, une de correction. Pour les différents objectifs du projet, les animaux sont soumis à des techniques non invasives d'imagerie sous anesthésie générale : echocardiographie, examen d'environ 10 min utilisé pour le suivi c'est à dire répété à intervalle régulier (max 1fois/semaine) et scanner, examen de 2h réalisé une fois en fin de protocole. Le suivi des animaux sera également mené par des mesures répétées (fréquence de 1 fois/mois) de l'activité physique maximale via une épreuve de course sur tapis roulant avec mesure de la performance (durée de course) confirmée par un marqueur sanguin nécessitant le prélèvement d'une goutte de sang. Pour certains objectifs du projet, incluant une approche préclinique, l'administration de médicaments (quotidienne) ou d'agent de thérapie génique (unique) sera réalisée.

Impact sur les animaux

L’approche expérimentale nécessite 2 interventions chirurgicales. Il faut noter que la 2nde permet de mettre fin au stress cardiaque pathologique qui autrement conduirait à l'insuffisance cardiaque. Les chirurgies comportent toujours un risque, comme chez l'Homme. Toutes les mesures d'anesthésie et d’analgésie nécessaires pour prévenir et empecher la douleur sont prises. Pour les modifications pathologiques induites par la première chirurgie, il n’y a pas de symptômes et les lésions s'accumulent progressivement, silencieusement (pas de douleur, pas de retentissement sur l'activité au moins dans les conditions d’hébergement sédentaire des animaux). L'altération de l'état général de l'animal qui pourrait être associée à ce type de pathologie n'est présente qu'à un stade très avancé qui n’est pas l'objet de ce projet. La limitation des atteintes sera mesurée objectivement par les mesures non invasives d’imagerie cardiaque (echocardiographie). Pour les stress, ils sont de bas niveaux (echographie et scanner réalisés sous anesthésie générale gazeuse, course sur tapis roulant), transitoires et limités au besoin scientifique du projet.

Devenir

Toutes les procédures se soldent par l'euthanasie des animaux et le prélèvement des tissus d'intéret. Ils serviront à des analyses des tissus, des cellules, des protéines et de l'expression des gènes. Ainsi, chaque animal utilisé apportera un maximum d'informations pertinentes pour les objectifs scientifiques du projet grâce à des mesures intégrées sur le phénotype (fonction cardiaque, capacité d'exercice) associées à des mesures détaillées de laboratoire.

Remplacement

Le mécanisme du remodelage cardiaque aboutissant à l'insuffisance cardiaque (IC) en réponse à un stress implique tous les types cellulaires constitutifs du tissu mais aussi le recrutement de cellules, en particulier inflammatoires et l’interaction avec d’autres organes (rein, système nerveux, …). L’IC est donc une pathologie touchant tout l’organisme rendant indispensable une approche in vivo. De manière analogue, le remodelage inverse nécessite la même approche. De plus, le meilleure critère d'évaluation de la fonction cardiaque est la capacité physique à l'image de ce qui est réalisé chez l'Homme (périmètre de marche, épreuve d'effort).

Réduction

L’approche sans à priori utilisant un criblage à large échelle sera réalisée avec le minimum d’animaux possibles car son objectif est principalement d’identifier les pistes à approfondir. Ensuite cette approche in vivo est complémentaire d’études in silico (modélisation informatique) et in vitro qui seront conduites en parallèle et en complément. L’étude informatique des réseaux de gènes nous aidera à identifier les éléments clés. Le criblage à large échelle combiné à une analyse informatique permettra de recueillir un maximum de données à partir des animaux inclus dans le protocole. Ensuite, les molécules candidates pour améliorer la prise en charge seront testées chez les animaux dont le nombre sera déterminé par une approche statistique adaptative. Elle favorise l'utilisation d'un nombre minimum d'animaux nécessaire sans compromettre les résultats scientifiques grâce à une analyse intermédiaire des résultats obtenus sur un effectif réduit d'animaux par rapport à l'effectif total planifié. La décision est alors prise de poursuivre si les résultats sont encourageants ou de stopper l'essai si l'intervention testée est trop peu efficace. Pour tous les points du projet, la technique chirurgicale utilisée correspond au dernier développement publié pour permettre une diminution de la variabilité du remodelage ce qui entraîne une diminution du nombre d’animaux comparativement à la technique historique.

Raffinement

Les procédures susceptibles d’induire la douleur sont bien identifiées : l’approche chirurgicale d’induction et de correction de la pathologie cardiaque. Lors de ces interventions, l’analgésie locale en complément d’une analgésie générale (morphinique) permet de prévenir la douleur. De plus, les chirurgies seront réalisées par un chercheur rompu à la technique permettant des opérations rapides et des ouvertures minimales diminuant les risques opératoires et participant à une meilleure récupération. Les derniers développements de la technique chirurgicale qui rapportent un meilleur taux de succès seront mis en oeuvre. Le suivi est renforcé dans la période post-opératoire (48 h), l'analgésie est poursuivie et les animaux disposent d'aliments spécifiques, dédiés à la récupération. Il n’y a pas de source de douleur ensuite : le remodelage induit est silencieux même si les animaux sont suivis quotidiennement. Les stress potentiels associés aux procédures sont de faible intensité, de courte durée (anesthésie/reveil, course forcée) et espacés dans le temps. Les animaux sont par ailleurs hébergés dans un environnement enrichi (matériel de nidification) et les groupes sociaux sont conservés tout au long de l’étude.

Choix des espèces

La souris est le mammifère chez lequel la grande majorité des études précliniques ont été conduites. Les connaissances acquises par la communauté scientifique sur cette espèce, toutes nécessaires à tirer le plus d'information à partir du présent projet, permettent l'analyse fine de l'expression génique et l'exploration poussée de la physiologie cardiovasculaire. De plus, il s’agit de l’espèce pour laquelle les modifications génétiques sont les plus aisées actuellement, permettant de tester plus aisément les hypothèses scientifiques. Elle combine donc les avantages d’être de la même classe que l’Homme et d’exister sous diverses souches génétiquement modifiées permettant des démonstrations expérimentales puissantes. Les animaux seront utilisés majoritairement à l’âge de jeune adulte (à partir de 6 semaines) car les pathologies étudiées sont, le plus souvent, des pathologies acquises. L’utilisation d’animaux jeunes est en revanche éloignée de la situation clinique mais permet une bonne récupération des procédures expérimentales chirurgicales et donc une bonne qualité de vie. Si une cible identifiée au point 1 du projet necessite un outil de thérapie génique, seule la procédure d'injection de vecteur viral sera réalisée avant, à 3-4 semaines lorsque le système immunitaire n'a pas été en contact avec des virus banals qui pourraient induire une réaction croisée avec le vecteur qui l'inactiverait.

376 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque souris subit une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, par section partielle ou par contusion, provoquant une paralysie des pattes, une incontinence urinaire, un risque d'escarres et une douleur pouvant atteindre l'hyperalgie et l'allodynie. L'objectif est de tester un traitement oral limitant la cicatrice gliale pour favoriser la récupération motrice. Le porteur affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité de la lésion in vivo et qualifie ce modèle animal d'"incontournable".

Objectifs

Les lésions de la moelle épinière (LME) touchent 2.5 millions de patients dans le monde (dont 40 000 en France) et induisent des symptômes allant de troubles neurologiques sensori-moteurs minimes à la tétraplégie complète souvent associés à des douleurs neuropathiques. Il n'existe aucun traitement curatif efficace pour aucun des symptômes induits par une LME. Il est donc de grand intérêt de mettre en place des stratégies thérapeutiques visant à augmenter la récupération motrice et sensitive suivant une LME. Après une lésion de la moelle épinière une cicatrice se forme et constitue un obstacle physique et chimique à la repousse des cellules nerveuses lésées, empêchant ainsi la récupération fonctionnelle. Cette cicatrice est majoritairement composée de deux types de cellules. Nous avons montré chez des individus jeunes, qu’un traitement pharmacologique qui limite la prolifération d’une des deux populations cellulaires formant la cicatrice, donné par voie orale avant et juste après une section partielle de la moelle épinière favorise la récupération motrice chez les souris. Dans un but de transposition à la clinique, nous allons tout d’abord étendre notre approche (1) à un traitement initié plus tardivement lors de phases chroniques après la LME (transposition aux patients chroniques) et (2) à des individus plus âgés. De plus nous allons tester ces approches dans un autre modèle de LME, la contusion (ou choc) médullaire, plus proche de la réalité clinique.

Bénéfices attendus

Les lésions de la moelle épinière (LME) induisent des symptômes allant de la paraplégie partielle à la tétraplégie complète. Il n’y aucun traitement curatif. Développer des travaux s’intéressant aux phases aiguës et chroniques représentent donc un enjeu majeur tant sur le plan de la santé individuelle que sur le plan économique et social. Les lésions médullaires étant d’origines variées chez l’homme (section par arme blanche, choc et écrasement…) nous utilisons des modèles similaires chez l’animal car ils représentent actuellement les paradigmes expérimentaux les plus pertinents pour comparer à la pathologie humaine. De plus, l’étude à des âges différents est aussi importante dans un contexte de translation à la clinique avec une population vieillissante dans les pays industrialisés. Notre projet est donc conçu avec un objectif de recherche translationnelle grâce à (1) l'utilisation d'un traitement par voie orale, (2) le traitement post lésionnel en phases aigüe et chronique, (3) l’analyse dans 2 modèles lésionnels, (4) l’étude d’individu jeunes et âgés, et (5) le suivi de l'évolution de la lésion par IRM comme chez l’homme. Nous obtiendrons aussi des informations mécanistiques sur le dialogue moléculaire des deux populations cellulaires formant la cicatrice gliale.

Procédures

Tout ou partie des animaux seront soumis à plusieurs interventions. Le prélèvement de tissu d’oreille est nécessaire pour effectuer le génotypage des animaux et sera effectué sur animaux vigiles de manière unique au moment du sevrage (J21). Les animaux subiront des lésions de la moelle épinière sous anesthésie générale d'une durée 30 min (n=376) . Les animaux seront évalués à différents temps au niveau comportemental (2 tests différents sans contraintes pour l’animal) afin de déterminer la récupération des fonctions motrices après lésion de la moelle épinière (fréquence, durée, nombre). La moitié des animaux recevra via l’alimentation un traitement pharmacologique pour une durée de 7 jours soit juste après la lésion, soit 4 semaines ou 10 semaines après la lésion (le composé est inséré dans les croquettes). Les animaux recevront des injections quotidiennes en intra-péritonéal durant 7 jours soit juste après la lésion, soit avant l'euthanasie des animaux en fonction des groupes étudiés. Les animaux recevront une injection en sous cutanée d'anesthésique local (moins de 1min) puis une injection IP d’anesthésique (moins d'1 minute) afin de procéder aux prélèvements de tissus post-mortem et d’initier les études moléculaires, cellulaire ainsi que l’analyse des tissus.

Impact sur les animaux

Le génotypage peut induire un stress pour l’animal. Les injections quotidiennes en i.p. peuvent induire un stress pour l’animal. Nuisances motrices : paralysie de la patte arrière du côté de la lésion spinale (hémisection) ou des deux pattes (contusion), une récupération spontanée du support de poids est observée dès le 5ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection et dès le 14ème jour après la lésion dans le cas de la contusion. Nuisance urinaire : le contrôle du sphincter urinaire est altéré dans les deux modèles lésionnels, une récupération spontanée est observée dès le 7ème jour après lésion dans le cas de l’hémisection et le 14ème jour après une contusion. Nuisances sensitives : suite à la chirurgie des signes de détresse (pilo-érection, déshydratation, apparence voûtée, yeux enfoncés ou comportement d'isolement) peuvent être observés. 24-48hrs suivant la lésion, la douleur des animaux peut être de niveau 3 (hyperalgie, allodynie). Suite à la chirurgie, une perte de poids est observée pendant 1 à 2 jours après la lésion. A cause de la paralysie des escarres peuvent se former. Suite à la lésion, des comportements de domination peuvent être observés. Une anesthésie peut induire une hypothermie transitoire et un dessèchement de la cornée.

Devenir

A la fin des expériences, les animaux seront euthanasiés afin collecter les tissus d’intérêt pour faire des analyses post mortem histologiques, cellulaires et moléculaires. Notre projet est donc conçu avec un objectif de recherche translationnelle grâce à (1) l'utilisation d'un traitement par voie orale, (2) le traitement post lésionnel en phases aigüe et chronique, (3) l’analyse dans 2 modèles lésionnels, (4) l’étude d’individu jeunes et âgés, et (5) l'imagerie de la lésion par IRM. Nous obtiendrons aussi des informations mécanistiques sur le dialogue moléculaire des deux populations cellulaires formant la cicatrice gliale. L’analyse des tissus du système nerveux central est le seul moyen permettant de valider ou non nos hypothèses.

Remplacement

La règle des 3R sera appliquée. L’alternative à l’expérimentation animale est encouragée par l’utilisation des cultures primaires de neurones et de cellules gliales. Néanmoins, l’environnement cellulaire des neurones dans son ensemble (astrocytes, microglies) est limité par les co-cultures. Les cellules cultivées ne peuvent pas remplacer la complexité physiologique et pathologique que l’on a in vivo. In vivo un nombre important de populations cellulaires interagissent tant sur le plan moléculaire que structurel, ceci ne peut être reproduit in vitro. Les modèles animaux de traumatisme médullaire représentent donc actuellement le paradigme expérimental le plus pertinent qui reproduit fidèlement la pathologie humaine. Ces modèles animaux seront utilisés pour étudier l’altération tissulaire et cellulaire ainsi que les modifications moléculaires in vivo et nous aideront à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques. Ces approches thérapeutiques ne peuvent être menées que chez l’animal et représentent une étape préclinique capitale et incontournable si l’on projette une application clinique.

Réduction

Ce projet permet l’utilisation de tous les animaux produits. De plus de nombreuses analyses sont effectués sur les mêmes animaux. Grâce aux études précédentes que nous avons mené mais également par anticipation des approches statistiques que nous utiliserons nous avons déterminé un nombre d’animaux permettant de conclure sans engager d’expériences supplémentaires tant pour les approches comportementales, histologiques (évaluation de la puissance statistique d’un protocole en fonction des effectifs) . Afin d’optimiser les lots, nous avons décidé de développer cette étude portant à la fois sur les 2 sexes, mais également à deux âges différents, ce qui permet l’utilisation de tous les animaux générés. Dans le cadre de l’étude transcriptomique, nous veillons à optimiser les lots d’animaux générés en réservant les animaux porteurs du transgène pour les expériences de biologie moléculaire, les compagnons de portée non transgénique seront utilisés dans les autres expériences.

Raffinement

Afin de réduire le stress, les expérimentateurs seront toujours les mêmes au cours de l’étude et les animaux seront habitués aux tests. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement de l’environnement (hutte, coton). Pour la gestion de la douleur, utilisation d’anesthésiants adaptés mais compatible avec les lésions de la moelle épinière et le type de données analysées (biais). Réduction de la souffrance : soins quotidiens spécifiques (zone d’incision vérifiée, vessie vidangée manuellement 2 fois par jour, absence d’escarre, prise alimentaire vérifiée). Signes de détresse vérifiés 2 fois par jour après la lésion [au moins 2 semaines, (pilo-érection, déshydratation, apparence voûtée, yeux enfoncés, perte de poids, comportement d'isolement)]. Nous utilisons une évaluation par grille de score adaptée permettant après concertation de déterminer un seuil de souffrance nécessitant l’euthanasie de l’animal concerné.

Choix des espèces

Les souris sont les animaux le plus utilisées dans le cadre de la recherche sur les LME, en particulier avec le développement de plusieurs modèles chirurgicaux différents (section, compression, contusion). Travailler avec cette espèce nous permet de comparer avec les résultats précédemment obtenus dans notre groupe et dans les autres équipes de recherche. Les souris expriment un marqueur fluorescent, ), spécifiquement dans les astrocytes et la microglie . Ceci permet le tri cellulaire et l’obtention de population pure de cellules ainsi que l’identification sans marquage des cellules gliales . Nous travaillons avec ces deux souches depuis de nombreuses années et avons donc de nombreuses données disponibles. Les animaux sont opérés à 3 mois et observés pendant 1, 2, 6 ou 12 semaines. Nous utilisons des animaux adultes car les souris plus jeunes présentent des phénomènes de récupération spontanée plus importants et surtout non homogènes. Ceci n’est ni compatible avec des analyses statistiques fiables ni avec notre optique de transposition à la clinique. Les animaux sont gardés 1, 2, 6 ou 12 semaines pour avoir un suivi des évènements moléculaires, cellulaires, tissulaires et phénotypiques en phase chronique. Ceci est primordial dans le cadre d’une transposition à la clinique pour des patients aigus et chroniques.

1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié subit une chirurgie cérébrale sous anesthésie pour la pose de transmetteurs, toutes reçoivent des injections quotidiennes pendant quinze jours, et le porteur anticipe des crises d'épilepsie potentiellement mortelles pour 10 % des animaux. L'objectif est de créer des souris porteuses de deux gènes inactivés pour étudier la sclérose tubéreuse de Bourneville. Le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire le développement cortical et l'épilepsie.

Objectifs

Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels dans le cerveau. Ces modèles nous permettrons de mieux comprendre les mécanismes conduisant à des désordres neurologiques et des crises épileptiques.

Bénéfices attendus

L'établissement de modèles murins pertinents de la sclérose tubéreuse de Bourneville avec atteintes cérébrales permettra de mieux comprendre la physiopathologie de la sclérose tubéreuse de Bourneville et de découvrir des mécanismes génétiques responsables du développement de malformations corticales et de la formation des crises d’épilepsie. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans la sclérose tubéreuse de Bourneville et dans d’autres pathologies neurologiques et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les patients réfractaires aux traitements actuels.

Procédures

1200 souris seront utilisées dont 600 souris qui auront de la chirurgie sous anesthésie générale (chirurgie de 3 minutes) pour subir des injections. Les 1200 souris seront soumises à des traitements pharmacologiques par injections quotidienne pendant 15 jours d'une durée de 1min. 600 souris subiront une chirurgie sous anesthésie générale de 20 min afin d’enregistrer les crises épileptiques et les paramètres physiologiques en continue sans stress des animaux sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

La cinétique des signes cliniques des animaux épileptiques est bien connue et démontrent un phénotype précoce et sévère. Nous anticipons que le phénotype des animaux que nous avons générés, sera potentiellement moins sévère que celui des animaux épileptiques. Cependant, nous ne pouvons exclure que ces animaux développent un phénotype équivalent et nous nous attendons à observer chez ces animaux la survenue des crises épileptiques même si plus tardives et moins fréquentes mais qui pourraient être léthales pour 10% des souris. Les traitements pharmacologiques par injection n'entrainent pas d'effet néfaste. Les injections répétées sont susceptibles d’entraîner des irritations, si cela est observé, les injections seront suspendues jusqu’à disparition de celle-ci et une solution apaisante sera appliquée. La pose des transmetteurs pour permettre la télémétrie se fera sous anesthésie générale. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après les chirurgies. Il n'est pas connu de risque de rejet du transmetteur.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Le développement corticale et l’épilepsie est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations endocrines. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes d'intérèt sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. les traitements pharmacologiques ne présentent pas de toxicité et ont déjà été testées in vitro ainsi que in vivo aux mêmes doses. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.

Réduction

L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. Dans ce modèle, un groupe de 25 animaux est suffisant donc des groupes de 25 animaux seront utilisés. L'estimation du nombre d'animaux a été réalisé en comptant une perte de 10% de nos animaux.

Raffinement

Les souris seront surveillées quotidiennement par les membres qualifiés de l'animalerie afin de détecter tout signe de douleur ou de maladie. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton, de bâtonnets de bois et de tunnel. Les souris seront hébergées par 5 en cage ventilée. Les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites 2 fois par semaine. Le traitement pharmacologique choisi sera administré quotidiennement et sera effectué par un technicien expérimenté à l'aide de seringues très fine qui donnent une injection quasi indolore. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. Les traitements pharmacologiques par injection ne provoquent pas d'effet néfaste. Les injections auront lieu alternativement à gauche ou droite. Pour éviter une irritation, une solution apaisante sera appliquée. La pose de transmetteur sera faite sous anesthésie générale avec une analgésie. Les animaux seront placés sur une plaque chauffante après la chirurgie. Des points limites spécifiques ont été définis. Tout animal en souffrance sans possibilité de le soulager sera mis à mort.

Choix des espèces

Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes d'intérèt, jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons d’un large répertoire de lignées de souris modèles, ce qui permet d’évaluer l’interaction parmi plusieurs éléments de cette signalisation ; 4) nous disposons également de nombreux outils adaptés à la souris ; 5) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. 6) l'âge postnatal est le stade de développement privilégié pour étudier la survenue des crises épileptiques.