Souris

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections abdominales et intraveineuses au niveau de l'œil, des prélèvements sanguins sous anesthésie, puis sont infectées par un virus provoquant une perte de poids temporaire, avant prélèvement de la rate et du foie. Il s'agit d'étudier le rôle d'une protéine de l'inflammation dans la réponse antivirale des lymphocytes T. Le porteur affirme que les interactions entre cellules immunitaires ne peuvent pas être remplacées par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

Les lymphocytes T, qui sont une population de cellules du système immunitaire, jouent un rôle essentiel dans la défense contre les infections virales aigües (telles que la grippe) et chroniques (comme les hépatites B ou C). La compréhension des mécanismes régissant ces fonctions a donc un fort intérêt fondamental et thérapeutique. Des données de la littérature, indiquent qu’une protéine de l’inflammation pourrait jouer un rôle majeur dans l’élimination des virus, via son rôle dans les lymphocytes T. Nous souhaitons ainsi tester sa fonction in vivo, dans un modèle d’infection virale aigüe et un modèle d’infection chronique, qui reflètent fidèlement le déroulement de ces maladies chez l’homme. La charge virale et la réponse immunitaire seront ainsi mesurées après infection de souris témoins et déficientes pour la protéine d’intérêt.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait nous permettre de mettre en évidence un nouveau mécanisme de régulation de la fonction des lymphocytes T dans le contexte des réponses anti-virales, donnant ainsi des indices sur la physiopathologie des infections aigues et chroniques chez l’homme.

Procédures

-Injections dans l’abdomen : 1 injection sur 20 animaux vigiles, 2 à 3 secondes/injection. -Injections intra-veineuses au niveau de l’oeil: 1 injection sur 20 animaux sous anesthésie générale gazeuse, 5 secondes/injection sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ. -Prélèvements sanguins au niveau de l’oeil : 1 prélèvement sur 20 animaux, 10 secondes/prélèvement sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ. 2 prélèvements à 10 jours d’intervalle, sur 20 autre animaux : 10 secondes/prélèvement sous anesthésie générale gazeuse de 1 minute environ.

Impact sur les animaux

Certaines procédures peuvent induire une douleur légère à modérée (injections intraveineuses et abdominales, prélèvements sanguins). Le protocole d’injection et de prélèvement que nous suivrons est bien établi pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. L’injection dans l’abdomen peut éventuellement provoquer une inflammation locale temporaire. L’injection intraveineuse et les prélèvements sanguins peuvent éventuellement provoquer une inflammation au niveau de l’oeil. Une perte de poids limitée et temporaire (4 jours) est attendue suite à l’infection virale.

Devenir

Les animaux seront mis à mort afin de prélever les rates et foies. L’objectif est d’analyser la charge virale et le phénotype immunitaire. Ceci permettra de documenter la fonction de la protéine d’intérêt non seulement dans l’élimination du virus mais également sur le type de réponse immunitaire mis en place.

Remplacement

Un certain nombre d'expériences in vitro, suggérent un rôle d’une protéine de l’inflammation dans la fonction anti-virale des lymphocytes T. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer la fonction de la protéine d’intérêt dans un contexte physiologique pertinent. À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la bio-informatique, les interactions entre les différentes cellules immunitaires et leur microenvironnement, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Une taille d'échantillon de 10 souris/groupe est calculée. Ces éxpériences n’ont jamais été réalisées, et il n’y a pas de double emploi des animaux.

Raffinement

Le protocole d’injection et de prélèvement que nous suivrons est bien établi pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. Les injections et prélevements par voie intraveineuse seront accompagnées de l’appication d’une goutte d’anesthésique local pour limiter la douleur, et seront effectués en alternance sur chaque oeil. De plus l’utilisation de l’anesthésie générale gazeuse, un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs, et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Le comportement, le poids, et l’apparition éventuelle d’inflammation au site d’injection seront suivis tout au long de l’expérience, et l’altération d’un de ces paramètres entraînera une surveillance accrue. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation sur la souris est justifié par l’existence d’un modèle transgéniques nous permettant de mesurer le rôle de la protéine d’intérêt dans les réponses immunitaires, et l’existence de virus modèles, reflétant le déroulement des infections virales comme la grippe ou les hépatites B et C chez l’homme. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 30 semaines.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer du sein leur sont greffées sous la peau, puis elles reçoivent des traitements par voie orale, sous-cutanée ou par gavage pendant plusieurs semaines, la tumeur étant prélevée à la mise à mort. L'objectif est de comprendre la résistance à l'hormonothérapie du cancer du sein via une protéine. Le porteur affirme que les travaux in vitro ne reproduisent pas l'activité de cette protéine dans la tumeur et qu'un modèle de greffe chez la souris est requis.

Objectifs

Les patientes atteintes de cancer du sein qui présentent une tumeur exprimant un récepteur aux estrogènes sont traitées par hormonothérapie. En clinique les traitements de ces patientes par hormonothérapie diminuent le taux de rechute et améliorent la survie des patientes. Néanmoins l’efficacité de ces thérapies est limitée par la résistance à ces traitements, car jusqu’à 40% récidivent. C’est pourquoi de nouvelles molécules sont en cours de développement. Le problème majeur est qu’il n’existe pas de marqueur prédictif de réponse à ces traitements. Récemment, il a été identifié une protéine, dont la présence dans le noyau cellulaire participe à l'activité anti-tumorale des traitements. L’objectif du projet est de comprendre le rôle de cette protéine dans la réponse des patientes aux différentes hormonothérapies et de restaurer la sensibilité aux hormonothérapies dans des modèles résistants, en régulant la bonne localisation de cette protéine. Pour ceci, un modèle murin développé à partir de greffe de cellules cancéreuses humaines permettra de reproduire la réponse anti-tumorale observée chez les patientes sensibles ou résistantes aux traitements hormonaux, et d'étudier le rôle de cette protéine.

Bénéfices attendus

L'utilisation de ce modèle murin de xénogreffes qui mime la tumeur des patientes hormono-sensibles permettra de mieux comprendre la résistance au traitement par des hormones et donc d'identifier des biomarqueurs de la sensibilité des patientes à l’hormonothérapie, d’adapter les traitements des patientes ayant un cancer du sein hormonosensible et donc d'entrevoir de nouvelles thérapies.

Procédures

Des cellules humaines de cancer du sein sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est endormie durée 4 min, une seule injection de 0.1 ml, durée 20 sec. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine au maximum, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les composés sont administrés par voie orale dans l’eau de boisson (à partir de l’entrée des souris en protocole jusqu’à la mise à mort),ou par injection sous cutanée (1x/semaine, 10 sec, pendant 4 semaines maximum), ou par gavage (1x/sem à 5 x/sem selon le composé, 45 sec, pendant 4 semaines maximum).

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané entrainera le développement de tumeur, en réponse à la stimulation par l'estrogène dans l’eau de boisson. Un surdosage d'estrogène pourrait induire un gonflement abdominal (jamais observé dans les conditions utilisées). Tumeur : nécrose ou un gêne à la locomotion (très rare). Injections répétées peuvent entrainer une irritation. Multi-contentions peuvent engendrées un stress.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure car la tumeur sera prélevée pour des analyses immunohistochimiques, biochimiques et moléculaires.

Remplacement

Nos travaux menés in vitro dans des cellules de cancer du sein suggèrent l'activité bénéfique d'une protéine dans la réponse aux antiestrogènes ches les patientes atteintes d'un cancer du sein hormonosensible. Ces travaux in vitro ne permettant pas de reproduire l'activité de la protéine telle qu'elle est observée dans les tumeurs chez la patientes. Des études in vivo seront faites grâce à un modèle de greffe de cellules humaines de cancer du sein, chez la souris. Ce modèle murin mime ainsi la tumeur mammaire humaine et est nécessaire à l'observation des caractères de la tumeur chez les patientes.

Réduction

La formation de tumeur chez les souris est d'environs 80% dans ce modèle murin de cellules de cancer du sein. Nous étudierons l'inhibition de la croissance entre les souris traitées et les souris non traitées. Pour mesurer une différence significative des traitements, sur la croissance des tumeurs, entre les groupes de souris traitées et celles ne recevant pas le traitement, il faut greffer 10 souris par groupe.

Raffinement

Les analyses de croissance des tumeurs seront non-invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requièrent pas d'injection d'anesthésiant. De l'aliment humidifié en fond de cage sera disposé si un animal présente une gêne de la mobilité due à la croissance tumorale ou une irritation lors de gavage (très rare). Les traitements seront planifiés, en fonction de leur fréquence, de façon à ce qu'un animal recoive un seul traitement par gavage par jour. La greffe des cellules sera faite sous anesthésie. Une anesthésie locale par application de crème sera réalisée lors de l'indentification des animaux

Choix des espèces

La souris immunodéficiente est couramment utilisée en oncologie car l’inoculation de cellules tumorales humaines n’induit pas le rejet de la greffe dans cette espèce. Les études concernent le cancer du sein, c'est pourquoi l'expérimentation sera réalisée avec des souris femelles de 8 semaines, car à cet âge, l’ensemble des fonctions est mature.

4 224 souris opérées sous anesthésie, la tête fixée dans un dispositif qui repère les coordonnées du cerveau pour y injecter un virus, et 864 autres injectées dans une veine de la queue, éveillées et sous contention après chauffage : 5 088 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes mises à mort par injection à l'issue. Des prises de sang sont prévues toutes les deux semaines pendant huit semaines pour mesurer leur réponse immunitaire. Le projet doit cartographier les régions du cerveau qu'atteignent de nouveaux vecteurs viraux de thérapie génique selon la voie d'injection, avant des essais sur des lignées de souris atteintes de maladies neurodégénératives. Le porteur présente ce tri comme un moyen de réduire le nombre d'animaux non-humains utilisés plus tard, et écrit que sa stratégie "permet de limiter le nombre d'animaux utilisés (5088)".

Objectifs

L’objectif de ce projet est de définir de nouveaux vecteur médicaments pouvant atteindre différentes structures du cerveau, selon différentes voies d’injection. La thérapie génique par vecteur virale (AAV) a démontré durant la dernière décennie son efficacité pour le traitement des maladies d’origine génétique. Ainsi, de nouveaux médicaments ont reçu leur autorisation de mise sur le marché . Néanmoins, de nombreux défis restent à relever. Premièrement, selon la maladie ciblée il est important de redessiner une stratégie. En effet, les essais cliniques nous montrent que la même stratégie par AAV peut avoir des effets opposés et cela même si les maladies sont proches. Deuxièmement, concernant le traitement de maladies du cerveau, le type d’injection (dans le cerveau ou dans le sang) affecte la dispersion du produit et donc, les cibles atteintes. Des études préliminaires ayant démontré l’amélioration de la distribution d’un AAV modifié pour les structures cérébrales en injection locale chez la souris, nous évaluerons l’efficacité de nos autres candidats selon différentes voies d’injections. Ces résultats permettront d’utiliser les meilleurs vecteurs dans les meilleures conditions d’injection lors des études de preuves de concept pour le traitement de différentes maladies neurodégéneratives, réduisant ainsi le nombre d’animaux nécessaires à l’obtention de résultats robustes.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux caractériser les nouveaux vecteurs médicaments. Ainsi, lors des études de preuve de concept dans des modèles de maladies neurodégénératives, seuls les AAVs atteignant les cibles d’intérêt de manière adéquate (temps et quantitativement) seront injectés via la route d’injection la plus pertinente, limitant ainsi le nombre d’animaux nécessaire à la définition des conditions thérapeutiques. Ce projet permettra in fine le développement de médicaments innovants pour les maladies neurologiques.

Procédures

Injection locale dans le cerveau : réalisée sur animal préalablement anesthésié et analgésié et maintenu sous anesthésie. La tête de l’animal est maintenue en position par un dispositif permettant d’établir des coordonnées précises du cerveau. Geste réalisé sur 4224 animaux, une seule fois par animal. Durée totale de la chirurgie : 1h30 pour les phases de pré-chirurgie et chirurgie, puis jusqu’au réveil de l’animal. Injection par voie veineuse : réalisé sur un animal vigile sous contention après dilatation préalable des veines de la queue (chauffage). Geste réalisé sur 864 animaux, une seule fois par animal. Durée totale : maximum de 5 minutes sous contention. Prélèvements sanguins permettant de mesurer la réponse immuniaire : 1 fois toutes les 2 semaines pendant 8 semaines.

Impact sur les animaux

-Chirurgie : risque anesthésique, saignement, risque hypothermique, risque d’assèchement des muqueuses, déshydratation, perte de liquide céphalorachidien, infection. - Injection intraveineuse de l’AAV (voie caudale) : saignement, contention - Prélèvements sanguins multiples : contention, hématome

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort par injection

Remplacement

Le principe de la thérapie génique repose sur l’utilisation d’un virus médicament pour véhiculer un gène médicament jusqu’aux cellules à traiter. Les interactions entre le virus médicament et les différentes composantes de l’organisme (système immunitaire par exemple) ne peuvent pas être toutes reproduites simultanément dans les modèles cellulaires ou informatiques. De plus, le système nerveux est un système complexe ayant une structure tridimensionelle particulière, ne pouvant être reproduite. Parallèlement à l’utilisation d’animaux, nous mettons en place des cultures de tissus qui nous permettront de réaliser une première sélection de nos virus médicaments, limitant ainsi le nombre d’animaux injectés.

Réduction

La stratégie choisie permet de limiter le nombre d’animaux utilisés (5088). Seuls les virus médicament ayant été décrits comme efficaces dans le cerveau seront testés, réduisant ainsi le nombre de souris utilisées. Par ailleurs, des mâles et des femelles seront inclus dans les études afin d’obtenir la meilleure représentativité des réponses biologiques et de réduire le nombre d’animaux sans introduire de biais et permettant ainsi d’optimiser l’élevage des animaux achetés chez les éleveurs agréés. Ces résultats seront ensuites utilisés pour alimenter les programmes d’essais de thérapie génique dans les modèles de maladies neurodégénératives. Ainsi le nombre d’animaux présentant un phénotype délétère dans les prochaines études pourra être réduit.

Raffinement

Des études pilotes permettront de déterminer la dose optimale de virus médicament, la vitesse d’injection et le nombre de points d’injection nécessaires et suffisant pour assurer le meilleur traitement. • Condition de vie des animaux : les animaux seront hébergés en groupes sociaux avec du matériel de nidification et un abri dans chaque cage afin de limiter le stress. Une période d’acclimation de 7 jours minimum sera respectée. Les souris seront pesées avant injection puis toutes les semaines afin de suivre les variations de poids. Les souris sont manipulées régulièrement pour s’habituer à l’utilisateur • Procédure d’injection locale : les animaux seront traités avec des anesthésiques et analgésiques avant et jusqu’à 3 jours après la chirurgie. Toute suspicion de souffrance animale sera soumise à un examen du vétérinaire présent à l’animalerie qui validera la nécessité de mise à mort ou non de l’animal. • Procédure d’injection systémique : les animaux seront placés dans un appareil de contention, sous lampe chauffante afin de maximiser la dilatation des veines de la queue et de réduire le temps de contention. • Approche statistique : Basé sur les connaissances actuelles dans le domaine de la thérapie génique, nous avons alors utilisé un test statistique définissant un nombre de 6 souris par groupe.

Choix des espèces

Il a été démontré précédement que la souris est un modèle prédictif du potentiel thérapeutique chez l’homme. De plus, les différents modèles de maladies neurodégénératives étants murins, il est nécessaire de valider les différents paramètres dans cette espèce afin de réaliser de façon efficace et optimale le développement de nouveaux traitements. Des animaux de 8 à 10 semaines seront utilisés. Ce stade correspond à un plateau dans le développement du cerveau de la souris couplé à un système immunitaire mature. De plus, la taille des animaux à cet âge est adequate avec un taux de récupération post-chirurgie plus élevé (moins de surcharge pondérale et de maladies métaboliques réduisant ainsi les risques liés à l’anesthésie et à l’analgésie)

1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une société privée sous-traitant ici l'irradiation et l'imagerie de souris porteuses de tumeurs. Elles subissent l'implantation de cellules tumorales par diverses voies, des traitements répétés et un suivi par imagerie sous anesthésie, avant d'être renvoyées vers l'établissement d'origine. Le résumé précise que ces souris sont considérées en "utilisation continue" et réaffectées à une autre autorisation, sans que leur mise à mort soit établie dans ce projet. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode de substitution et que la souris est l'espèce la plus adaptée à ce modèle d'évaluation de médicaments anticancéreux.

Objectifs

Une société privé réalise des prestations vis-à-vis de ses clients (industries pharmaceutiques, biotechnologies, ect..) quant à l'évaluation de l'efficacité et de l'innocuité de nouveaux traitements anticancéreux en développement. La réalisation de ces études implique l'utilisation d'animaux notamment souris. Pour certaines phases des études mises en oeuvre au sein de l'animalerie de la société, celle-ci sollicite des plateformes d'expérimentation animal pour la réalisation d'étapes clefs (application des traitements par radiothérapie et imagerie par Bioluminescence et IRM).

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité thérapeutique de nouveaux médicaments dans des modèles murins pertinents de différents cancers (sous-cutanées, intra-péritonéal, intra-veineux, intra-cérébraux, ovariens, intra-prostatiques, coliques, hépatiques, pulmonaires, osseux ou encore mammaires). Ces modèles devant être représentatifs des tumeurs humaines et permettre d’évaluer au mieux l’effet bénéfique de nouvelles stratégies thérapeutiques.

Procédures

Une implantation de cellules tumorales par voie intraveineuse (1x 1min), ou intrapéritonéale (1x 1min), ou sous-cutanée (1x 1min), ou intracérébrale (1x 1min), ou intra-cérébrale (1x 30 min), ou intra-ovarienne (1x 15 min), ou intra-prostatiques (1x 15 min), ou coliques (1x 15 min), ou hépatiques (1x 15 min), ou pulmonaires (1x 1min), ou osseuse (para-tibiale ou intra-fémorale) (1x 5 min) ou encore mammaires (1x 5 min). L'application d'un traitement de référence ou novateur administrés classiquement 1 à 5 fois par semaine pendant 1 à 4 semaines par voies locale ou systémique (orale (2 min), intrapéritonéale (1 min), sous-cutané (1 min), intramusculaire (2 min) ou intraveineuse (1 min) (Il est a noter qu'un même lot d’animaux ne subira qu’une seule voie d’administration). Un suivi par imagerie réalisé une à deux fois par semaine sous anesthésie comme par exemple par Bioluminescence (durée moyenne = 10 min) ou encore par IRM (durée moyenne = 30 min). Des prélèvements sang limité à 1 par semaine (Volume maximal prélevé = 10% du volume circulatoire).

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs chez la souris pourra à terme être associé à des effets délétères (ex: perte de poids). De même, l’utilisation de traitements novateurs pour lesquels par définition nous ne connaissons pas tous les effets, pourront également induire des effets délétères. Les procédures chirurgicales d'implantation induiront des douleurs suite à l'incision et à la cicatrisation. Les effets de la radiothérapie, notamment sur les aspects digestifs (diarhée, saignement).

Devenir

Les animaux sont inclus dans une autre demande d'autorisation d'expérimentation déposé par la société. A la fin des expérimentations ils réintégreront cette autre demande d'autorisation. Dans ce contexte les animaux sont considérés en utilisation continue et non en réutilisation.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ces études sont réalisées chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) permettant de répondre aux objectifs scientifiques des études. A noter qu'avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris fait partie des espèces les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques : 10 animaux / par groupe. L’analyse statistique sera de façon générale la suivante : • Comparaison du groupe véhicule avec le groupe produit de référence.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses incluant les étapes d'anesthésies • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites Les expériences de radiothérapie et d'imagerie par Bioluminescence et IRM sont faites en assurant le confinement des animaux pour éviter les contaminations. Pour les analyses IRM, l’examen étant d’une durée de 30 à 60 min, la fréquence respiratoire des animaux est suivi tout au long de la procédure. Après les manipulations, les animaux sont replacés dans leur cage et observés jusqu’au réveil complet. Après la réalisation des expérimentations les souris sont ramenées au sein de l’établissement d’origine où le suivi tumoral est assuré.

Choix des espèces

Les souris font partie des espéces les plus couramment utilisé dans les études visant à évaluer l'efficacité et l'innocuité de nouveaux candidats médicaments Animaux adultes (généralement 6 à 18 semaines). Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.