Souris
Etude du rôle métabolique et cardiovasculaire des récepteurs impliqués dans le métabolisme des lipoprotéines et la fonction mitochondriale
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système musculosquelettique
2 900 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. La plupart sont soumises jusqu'à soixante semaines à un régime gras et sucré, à des tests de tolérance au glucose, à des chirurgies de prélèvement du foie ou de la bile, et une partie à une irradiation aux rayons X suivie d'une greffe de moelle osseuse. Le porteur indique que la manipulation, l'irradiation et l'injection d'un composé inflammatoire peuvent provoquer peur, douleur ou fièvre. Il justifie le recours à la souris par la disponibilité de lignées transgéniques et de données antérieures sur le métabolisme des lipides.
Objectifs
Le laboratoire étudie les mécanismes favorisant le développement des maladies métaboliques (maladie du foie, diabète, obésité) et vasculaires (athérosclérose). Dans cet objectif, il utilise des modèles murins génétiquement modifiés sur des protéines ou récepteurs impliqués dans la régulation de l'homéostasie lipidique et aussi glucidique. Les objectifs du projet sont de 4 niveaux et décrits à la suite: - comprendre à l'échelle du vivant le métabolisme des lipoprotéines ainsi que le fonctionnement des mitochondries - mettre en évidence sur des animaux génétiquement modifiés les anomalies de ce métabolisme sous un régime normal et sous un régime gras - Etudier/décrire l'impact des délétions génétiques sur le fonctionnement des organes - étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme.
Bénéfices attendus
Ce projet aboutira a une avancée potentielle en connaissances scientifiques. Les bénéfices attendus: 1/ dans le cadre des études de recherche fondamentale, il s'agira de: - Comprendre/décrire dans un organisme l'impact des invalidations génétiques sur la physiopathologie du métabolisme glucidique et lipidique. - Comprendre/décrire l'activité métabolique des mitochondries, l'expression des gènes et les réactions métaboliques au sein des tissus génétiquement modifiés. - Comprendre l'impact d'une alimentation déséquilibrée sur le vieillissement des organes, 2/ dans le cadre de la recherche d'outils, cibles à visée thérapeutique pour un transfert chez l'homme: - Identifier des candidats/protéines tissulaires cibles de futurs médicaments.
Procédures
Les animaux (2900 souris) sont placés sous un régime riche en gras et sucre (2660 animaux, durée maximale: 60 semaines). Le poids et la masse grasse corporelle sont mesurés sur les animaux vigiles avec une technologie non invasive (2160 animaux, 3 minutes). Le diabète est mesuré au cours d'un test de charge orale en sucre, et un autre test implique une injection d’insuline dans l’abdomen. Ces tests impliquent des prélèvement de sang à la queue à différents temps (2160 animaux, durée de l'expérimentation: 2h). Les consommations alimentaires et de boissons ainsi que les dépenses énergétiques sont évaluées sur des animaux vigiles grâce à l’utilisation de cages dédiées où chaque animal est isolé avec un visuel sur les congénères (480 animaux vigiles, durée: 48h). L’utilisation du tapis roulant permet d’évaluer les performances physiques de chaque animal (480 animaux, durée: 15 minutes à 1 heure). Des actes chirurgicaux sont effectués sur les animaux anesthésiés pour mesurer les capacités métaboliques du foie : un prélèvement de bile (foie) est réalisé à un groupe pour mesurer les lipides excrétés dans la bile (480 souris, durée: 1 heure) ; sur un autre groupe, le sang et le foie sont prélevés (360 animaux, durée: 1 heure) ; sur une autre série, le foie est prélevé afin de réaliser une culture de cellules du foie (500 animaux, durée: 30 minutes) et d’en étudier les caractéristiques. Des prélèvements à la queue sont réalisés sur l’animal vigile afin d’étudier la sécrétion par le foie de lipides (480 souris vigiles, durée: 4h). En amont, un composé est injecté dans l’abdomen des animaux afin de bloquer les voies concourant à l'élimination de ces lipides du sang. Afin de mesurer l'élimination du cholestérol par le foie, des macrophages sont prélevés chez des souris (ayant au préalable reçu par injection un composé chargé d'attirer les macrophages dans l'abdomen) sous anesthésie, par piqûre dans l'abdomen, (240 souris, durée : 30 min) puis sont ré-injectés dans l’abdomen d'un autre groupe, sous une forme chargée en cholestérol. Des prélèvements de sang sont réalisés sur l’animal receveur à la queue à différents temps, puis, le foie est prélevé en terminal sous anesthésie (480 souris, durée totale: 48h). Afin d’étudier le rôle du système immunitaire dans les mécanismes, des animaux vigiles sont irradiés (rayons X) puis ils reçoivent une greffe de moelle osseuse lors de l'injection dans le coin de l’œil sous anesthésie générale (360 souris, durée: 48 heures).
Impact sur les animaux
Les expérimentations prévues peuvent induire des nuisances ou effets indésirables sur les animaux. La peur et le stress sont des nuisances qui peuvent survenir lors de la manipulation des animaux, leur isolement dans certaines procédures, ou lors de l'administration d'un produit anesthésiant avant un acte chirurgical. La fatigue est un effet indésirable attendu lors de l'épreuve d'endurance sur tapis roulant. D'autres nuisances possibles, sont la sensation de fatigue, la douleur ou de la fièvre qui peuvent être observées : - suite à l'administration d'une substance (thioglycolate) qui induit une réaction inflammatoire dans le péritoine et aussi, - suite à l'irradiation de l'animal afin de procéder à une greffe de moelle osseuse.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux sont euthanasiés. Ceci est nécessaire afin de prélever les tissus et organes à des fins d'histologie ou d'autres analyses. Ces examens donnent des informations complémentaires aux données mesurées sur l'animal vivant. Ils permettent de comprendre les mécanismes biologiques mis en jeu dans un tissu ou organe, le développement des lésions au cours du temps, et, les cellules impliquées. Ces prélèvements permettent aussi de réduire le nombre d'animaux dans les expérimentations.
Remplacement
Nos travaux visent à étudier à l'échelle du vivant, dans un tissu ou organe, les mécanismes biologiques qui favorisent le développement des maladies métaboliques. Sur cette base, un transfert peut-être envisagé sur des cellules cultivées in vitro afin d'étudier des mécanismes précis. Ainsi, des études, in vitro, sur des lignées de cellules sont prévues pour comprendre les réactions biochmiques immédiates à l'échelle de la cellule et limiter dans la mesure du possible l'utilisation des animaux à cette fin.
Réduction
1/Plusieurs données peuvent être obtenues avec un même animal : sécrétions biliaires, tests de tolérance au glucose et à l'insuline, prélèvements de tissus, prélèvement de plasma pour l'étude des lipoprotéines (profils), prélèvement de foie pour le développement de la culture primaire d'hépatocytes,... 2/ une réflexion biostatique est réalisée en amont de la procédure/expérience, pour limiter le nombre d'animaux. 3/La formation et l'encadrement des expérimentateurs dans les procédures permet d'optimiser l'obtention de mesures/données fiables et interprétables sur un faible nombre d'animaux. 4/ les animaux seront utilisés dans les expériences/procédures jugées indispensables en fonction de l'avancée du projet.
Raffinement
Pour optimiser la fiabilité des résultats, des mesures visant à réduire voire supprimer la douleur, le stress, et améliorer le bien-être des animaux sont mises en oeuvre: - les animaux seront élevés et hébergés dans une animalerie agréée. - les moyens pour limiter le stress aux animaux sont appliqués: enrichissement des cages, animaux invités à coopérer dans les actes non invasifs et non douloureux (exemple: test de tolérance au glucose ou à l'insuline, mesure de la composition corporelle au minispec), expériences réalisées dans une pièce calme en présence d'un faible nombre d'expérimentateurs - les expérimentateurs seront encadrés dans les protocoles par un sénior et rompus aux procédures expérimentales ce qui permet de limiter le stress et la douleur - en cas de transport de l'animal, un transporteur agréé pour transport d'animaux sera réquisitionné - des points limites (ou critères d’arrêt anticipés) de la procédure seront établis - dans la mesure du possible et en fonction de la statistique, les animaux prévus dans les mesures invasives seront réduits. - des soins adéquats seront prévus avant, pendant et après l’opération (anesthésie/analgésie), - la réduction de la durée de certaines études (surtout toxicologiques), - la mise en place de procédures d’euthanasie appropriées.
Choix des espèces
Nous souhaitons utiliser la souris pour plusieurs raisons : - La souris est un animal petit,facile à élever dans une animalerie. Cet animal possède un taux élevé de reproduction ce qui nous permet d’avoir à disponibilité un nombre suffisant d’animaux dans notre protocole. - Nous disposons de lignées murines transgéniques pour réaliser notre projet. Ces modèles permettent d'étudier et d'identifier le rôle de certaines protéines ou récepteurs dans les mécanismes biologiques étudiés au sein d'un tissu ou organe. - Les procédures de notre protocole sont adaptées à la souris. - Nous disposons de données scientifiques du métabolisme des lipides sur ce modèle animal. - Nous maîtrisons d'un point de vue scientifique l'état de l'art sur la physiopathologie de l'atherosclérose sur ce modèle animal. Les animaux seront utilisés au stade adulte, à partir de l’âge de 12 semaines. Cet âge est classiquement utilisé dans les études portant sur le métabolisme ou l'athérosclérose. Des mises sous régime gras contenant du sucrose et du cholestérol pourront avoir lieu, à partir de cet âge, sur une durée maximum de 60 semaines. Les longues durées de régime sont classiquement utilisées pour étudier le développement de l'athérosclérose chez la souris. Ce protocole permet aussi d'étudier les effets du régime alimentaire déséquilibré sur le long terme.
Evaluation des propriétés pharmacologiques de nouveaux composés antipaludiques
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
3 196 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. Elles sont infectées par le paludisme au moyen d'une injection de globules rouges parasités, reçoivent des composés à tester, puis subissent des prélèvements de sang à la queue. Le porteur indique que l'infection peut provoquer une hypothermie, puis, en cas de paludisme cérébral, une ataxie, une paralysie partielle et un coma irréversible, les animaux atteints étant mis à mort. Il conclut que la souris reste le modèle de routine faute de modèles humanisés moins coûteux.
Objectifs
Notre projet vise à mettre au point une molécule antipaludique par voie orale pour le traitement du paludisme. L'objectif est de sélectionner un candidat pour la phase pré-clinique parmi des composés développés par notre laboratoire en collaboration avec des équipes de chimie médicinale. Les composés testés in vivo seront sélectionnés parmi les composés très actifs in vitro contre le parasite du paludisme et montrant une faible toxicité contre les cellules de mammifères. Nous évaluerons en premier lieu l’efficacité de ces molécules contre Plasmodium in vivo chez la souris. En effet, une molécule qui est active in vitro peut être moins efficace in vivo car éliminée rapidement par l'organisme ou générer des effets secondaires. La dose nécessaire ainsi que le nombre d’administration pour obtenir une guérison complète seront déterminés. Dans un second temps, les paramètres pharmacocinétiques du ou des meilleurs candidats in vivo seront évalués chez la souris saine et infectée afin de sélectionner le candidat correspondant le mieux aux critères définis par l’organisation mondiale de la santé.
Bénéfices attendus
Le paludisme (malaria) est une maladie parasitaire qui touche une centaine de pays en voie de développement et 40% de la population mondiale vit dans des zones à risque. Les estimations les plus récentes font état de plus de 200 millions de cas cliniques dans le monde. La maladie a causé 627 000 morts en 2020 dont 90% en Afrique sub-saharienne. Elle touche, en particulier, les enfants de moins de 5 ans et les femmes enceintes. L'arsenal thérapeutique actuellement disponible pour lutter contre le paludisme étant insuffisant et de plus menacé par l'augmentation de la résistance des parasites aux derniers antipaludiques, il est urgent de trouver de nouvelles thérapies efficaces afin de tendre vers l'élimination de la maladie. Les efforts doivent privilégier des mécanismes d'action nouveaux et innovants par rapport aux molécules existantes afin de retarder au maximum l'apparition de résistances. C’est le cœur de notre projet, qui vise à développer de nouveaux composés à activité antipaludique en se focalisant sur des molécules visant des métabolismes parasitaires non encore ciblés par les médicaments actuels. Le projet devrait permettre la sélection d’un candidat à un développement clinique. L’obtention d’un antipaludique original permettra d’une part de lutter efficacement contre le paludisme et de sauver la vie de milliers d’enfants chaque année mais contribuera aussi, en diminuant le nombre de cas, à améliorer la qualité de vie (diminution des épisodes fébriles, des séquelles notamment neurologique, des jours d’école ou de travail perdus, …) des habitants des pays touchés.
Procédures
Prélèvement de sang sur les souris donneuses après euthanasie des souris. Pour les tests d’activité antipaludique : - Infection par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles, injection unique. La procédure prend moins d’une minute. - Administration d'un composé ou du véhicule. Les animaux sont vigiles. Administration unique ou une fois par jour pendant 4 jours. L’administration du composé prend moins d’une minute. - Prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue : 1 fois par jour pendant plusieurs jours. Les animaux sont vigiles. Chaque prélèvement prend 5 secondes. Pharmacocinétique/pharmacodynamie : - Infection par injection de globules rouges parasités. Les animaux sont vigiles, injection unique. La procédure prend moins d’une minute. - Prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue : 1 fois avant le début de l’expérience et 1 fois avant le prélèvement de la totalité du sang. Les animaux sont vigiles. Le prélèvement d’une goutte de sang prend 5 secondes - Traitement : administration du composé ou du véhicule. Les animaux sont vigiles. Administration unique. L’administration du composé prend moins d’une minute. - Prélèvement de la totalité du sang. Les animaux sont sous anesthésie profonde. Le prélèvement prend moins d'une minute.
Impact sur les animaux
Léger stress lors de la contention pour l'infection et l’administration du composé. Un prélèvement de sang sur animaux vigile sera effectué au bout de la queue après l’infection de la souris; possibilité de développer les signes cliniques suivants à partir de 50% de parasitémie :poil hérissé, isolement, dos courbé, urine rouge, hypothermie. En cas de neuropaludisme ou paludisme cérébral, les souris montrent les signes cliniques suivants : ataxie, puis paralysie partielle puis coma irréversible. La parasitémie reste faible. Si des signes de toxicité apparaissent le traitement est suspendu et les souris sont euthanasiées si besoin.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés. Pour les tests d'activité, les animaux non guéris par les composés sont euthanasiés pour éviter les souffrances liées à l'infection. Les animaux guéris ne peuvent être réutilisés d'une part parce qu'il ont subit une procédure sévère et d'autre part car ils ont développé une immunité contre le parasite. Pour les tests de pharmacocinétiques, les animaux sont euthanasiés pour récupérés le sang et les organes.
Remplacement
Afin de minimiser le recours au test sur les animaux, nous avons adopté une stratégie de criblage en entonnoir. Une première phase (la plus importante) se situe en amont de la partie expérimentation chez l’animal. Toutes les nouvelles molécules sont testées in vitro à la fois sur des globules rouges parasités par Plasmodium falciparum (le Plasmodium humain le plus dangereux) pour leur activité antipaludique contre le parasite et sur des cellules de mammifères pour leur activité toxique. Ceci permet de déterminer l’index de sélectivité de chaque molécule. Cet index de sélectivité doit être d’au moins 10 (10 fois plus actif contre P. falciparum que contre des cellules humaines) pour envisager d’être testées dans un modèle du paludisme in vivo chez la souris. Cette première phase très sélective permet de réduire considérablement le nombre de molécules à tester chez l’animal. Les molécules testées in vivo chez la souris impaludée seront choisies parmi les molécules présentant une bonne activité antipaludique, une faible toxicité ainsi qu’une bonne stabilité.
Réduction
Afin de minimiser le nombre d’animaux utilisés, nous avons choisi d’effectuer un criblage en entonnoir, ce qui permet de diminuer le nombre de molécules testées à chaque étape et donc de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux par lot a été déterminé en fonction des expériences. Une simulation statistique a été réalisée afin d’évaluer le nombre minimum de souris par groupe nécessaire pour observer des effets significatifs. Elle est basée sur les expériences précédemment réalisées au laboratoire ou publiées dans la littérature. Plusieurs molécules seront testées dans la même expérience afin d’utiliser un seul lot contrôle pour plusieurs molécules. Pour la pharmacocinétique, si la méthode de dosage de la molécule qui sera testée permet une quantification dans un faible volume sanguin, nous réduirons le nombre de souris de moitié. L’utilisation de souris exclusivement femelles pendant toutes les premières étapes permet de diminuer le nombre de souris nécessaires de moitié puisque nous regardons l'effet de la drogue sur le parasite et non sur l'animal. Nous testons ensuite l’incidence du sexe uniquement avec la ou les meilleures molécules.
Raffinement
Avant l’expérimentation, les souris sont manipulées régulièrement pour les habituer à être manipulées et éviter un stress lors de l’expérience. Les souris sont hébergées dans des cages avec des igloos et des copeaux pour améliorer leur bien-être. Les animaux sont surveillés pendant toute la durée de l’expérimentation qui dure un mois pour les tests antipaludiques. Dans le cas d’apparition de premiers signes de neuropaludisme (ataxie, paralysie partielle) avant la fin du test (jour 5) des granulés mouillés de nourriture peuvent être ajoutés dans la cage pour être sûr que ces animaux auront accès à la nourriture. En cas de signes cliniques sévères, les animaux sont euthanasiés.
Choix des espèces
La recherche de nouveaux antipaludiques est principalement dirigée contre le plasmodium humain P. falciparum. Les seuls modèles animaux permettant l’étude de ce parasite sont les singes Aotus ou Rhesus splénectomisés ou la souris humanisée, deux modèles animaux compliqués et coûteux. L’étude in vivo de l’activité antipaludique de composés est donc réalisée en routine chez le modèle souris contre des plasmodium murins. En effet, le cycle de vie ainsi que la morphologie et le métabolisme des différents stades de développement de tous les parasites du paludisme chez les mammifères sont comparables. Les plasmodium murins sont non-pathogènes pour l’homme et ne sont transmissibles entre rongeurs qu’exclusivement par piqûre d’une espèce spécifique de moustique du genre Anopheles, absent en France métropolitaine. Les souris seront âgées de plus de 5 semaines. A cet âge le système immunitaire de la souris est bien en place et permet d’obtenir des réponses aux médicaments reproductibles. De plus l’infection par Plasmodium est aussi très reproductible.
Etude du rôle de Bob1 dans la réponse immune allogénique dans un modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intramusculaire puis jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant dix jours, et un prélèvement de sang intracardiaque sous anesthésie avant leur mise à mort. Le porteur indique un inconfort et un stress liés aux injections répétées, sans attendre d'autre effet des molécules testées. Il affirme que le modèle murin est le seul modèle préclinique adapté pour étudier la réponse immunitaire après une greffe de poumon.
Objectifs
BOB1 est un facteur exprimé dans les lymphocytes. Dans des travaux antérieurs de l’équipe il a été montré que chez des patients transplantés le niveau d’expression de BOB1 dans les lymphocytes est associé au risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire. Pour étudier la fonction de BOB1, nous développons des petites molécules inhibitrices qui font l’objet d’une demande de dépôt de brevet. Nous avons démontré que le ciblage de BOB1 réduit les réponses des lymphocytes in vitro. L’inhibition de BOB1 devrait permettre de « calmer » les lymphocytes activés qui devraient moins agresser le greffon.. Un des axes de ce projet consiste à développer différents petits inhibiteurs de BOB1, à les valider in vitro et finalement à étudier in vivo l’effet de l’inhibition spécifique de BOB1 par ces molécules sur la réponse immune allogénique (qui se met en place après une greffe). Pour cela, nous utilisons un modèle murin de réponse immune allogénique, que nous avons mis au point et déjà utilisé dans d’autres travaux. Les petits inhibiteurs qui seront validés in vitro feront l’objet d’une étude pharmacocinétique in vivo chez la souris au préalable. Basés sur ces résultats, nous souhaitons les utiliser dans le modèle murin de réponse allospécifique afin d’étudier le rôle de BOB1 dans ces mécanismes et le potentiel bénéfice thérapeutique qui pourrait y être associé, pour des patients ayant subi une greffe de poumons.
Bénéfices attendus
D’un point de vue cognitif, la compréhension du rôle de BOB1 dans la réponse allo-spécifique est le premier bénéfice attendu de ce projet. Au delà, l’identification d’inhibiteurs de cette voie est très prometteuse dans le but de développer des approches thérapeutiques pour prévenir le risque de dysfonction chronique du greffon pulmonaire, chez des patients transplantés.
Procédures
Les animaux recevront une injection intra-musculaire (durée 1 minute, animal anesthésié). Certains lots d’animaux recevront jusqu’à 2 injections intra-péritonéales par jour pendant 10 jours (durée 30 secondes chaque, animal vigile). Un prélèvement sanguin intra-cardiaque (durée 1 à 2 minutes, animal anesthésié) est prévu avant euthanasie des animaux.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet nous procèderons à des injections intra-péritonéales répétées, et un certain inconfort, limité dans le temps (passage de l’aiguille au travers de la peau et du péritoine), pourra être ressenti par les animaux. De plus la répétition de ces injections sur une durée de 10 jours pourrait engendrer un certain stress des animaux. Les différents inhibiteurs auront tous été validés pour une absence de toxicité in vitro, et in vivo dans une étude de pharmacocinétique. Nous n’escomptons pas d’effets indésirables de ces molécules par elles-mêmes ou comme conséquence de l’inhibition de la réponse immune spécifique. Toutefois, comme il s’agit de molécules nouvelles, les animaux feront l’objet d’une surveillance attentive au cours du traitement.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures sont euthanasiés pour récupérer les organes, le sang, la rate, les ganglions et mener des analyses de biologie cellulaire et d’immunologie.
Remplacement
Les premières études des conséquences de l’inhibition de BOB1 ont été autant que possible réalisées sur des cellules en culture, y compris les premiers tests de toxicité cellulaire des inhibiteurs. De plus tous auront fait l’objet d’une étude de pharmacocinétique in vivo au préalable. Le passage aux études in vivo est réduit aux tests nécessaires qui requièrent un système physiologique complexe, qu’il n’est pas encore possible de modéliser in vitro. Pour la réalisation de ce projet, l'utilisation d'animaux vivants, en l’occurrence le modèle murin, est indispensable car il constitue le seul modèle préclinique adapté.
Réduction
Nous estimons que pour ce projet 1200 animaux seront étudiés : Nous estimons un nombre total de 200 lots de 6 animaux. De façon à réduire au plus le nombre d’animaux nécessaires, le calcul des effectifs a été réalisé par un calcul de puissance, basé sur des expériences préliminaires réalisées dans des conditions comparables, et à l'aide de tests statistiques. Nous pourrons être amenés à manipuler moins de souris si certains des inhibiteurs, parmi les 10 étudiés ne passent pas les étapes préalables de toxicité cellulaire et d’étude pharmacocinétique in vivo. Dans un but de réduire le nombre d’animaux, nous pourrons réduire le nombre de groupes contrôles s’il s’avère que les solvants et les concentrations sont les mêmes pour plusieurs inhibiteurs et en absence d’autres effets potentiels de paramètres extérieurs qui pourraient interférer. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation.
Raffinement
Les animaux provenant de l’extérieur seront stabulés une semaine au sein de l’animalerie. Les souris seront placées dans des conditions optimales (température, hygrométrie, cycle jour nuit 12h/12h, enrichissement des cages, nourriture ad libitum). Afin de limiter le stress des animaux, un foisonnement à base de frisures de papier kraft sera mis dans les cages. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, si toutefois des souris paraissent agressives lors du protocole, une séparation pourrait être nécessaire avec le maintien d’un enrichissement de type tunnel rouge ou dôme. Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux. Toute manipulation invasive sera précédée d’une courte anesthésie générale gazeuse. Le niveau d’anesthésie sera régulièrement contrôlé tout au long de la procédure par test des réflexes et de la respiration et pour prévenir d'une potentielle hypothermie les animaux seront placés sur un tapis chauffant. La mise en place d’une grille de suivi strict des points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur au cours de l’expérimentation. Dans le cas où un point limite sera atteint avant la fin de l’expérimentation, l'euthanasie de l’animal sera faite. Enfin une veille scientifique continue sera effectuée, évitant ainsi toute expérimentation déjà rapportée dans la littérature.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Il nous permet d’étudier un processus complexe tel que la réponse immune allo-spécifique, à notre connaissance il n’y a pas d’autre modèle pertinent. Les souris utilisées pour ce projet de recherche sont des souris adultes de 6 à 8 semaines, car le système immunitaire est mature. A des âges plus avancés le système immunitaire peuvent varier, ce qui pourrait engendrer une plus grande variabilité dans l’induction de l’immunité et dans son inhibition.
Première étape du Développement d’une approche de thérapie génique pour la neuropathie à axones géants chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
90 souris saines vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Elles reçoivent une injection intraveineuse de vecteurs de thérapie génique sous anesthésie, avant le prélèvement de leurs organes pour analyse. Le porteur indique des risques de dépression cardio-respiratoire, d'hypothermie, de saignement et de toxicité liée au traitement. Il décrit cette étape comme préliminaire, la preuve d'efficacité contre la neuropathie à axones géants devant être menée ensuite par un collaborateur sur des souris malades.
Objectifs
La neuropathie à axones géants (GAN) est une maladie sévère du cerveau et des nerfs due à une perte de fonction d’une protéine bien identifiée (gigaxonine), conduisant au décès des patients et pour laquelle il n’existe à l’heure actuelle pas de traitement pour prévenir ou stopper les symptômes. L’objectif de ce projet est de réaliser les étapes préliminaires de la mise au point d’une approche de thérapie génique chez des souris normales, non malades . Tout d’abord par le choix de la construction génétique et virale à utiliser puis de la dose permettant une expression suffisante de la protéine d’interet. Ces données seront reprises chez notre collaborateur (pour l’étude d’efficacité thérapeutique dans le modèle murin présentant un déficit sur la protéine responsable de la maladie (gigaxonine).
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet est de réaliser les étapes préliminaires de la mise au point d’une approche de thérapie génique chez des souris normales, sans pathologie pour ces premières étapes afin de mener ensuite chez nos collaborateurs une étude de preuve de concept de l’efficacité de cette approche thérapeutique dans le modèle murin de la maladie et à plus long terme un essai chez l’Homme pour proposer une solution thérapeutique qui n'existe pas à ce jour.
Procédures
Les effets indésirables possibles sont: - Une injection sous anesthésie avec un risque de dépression cardio-respiratoire et par conséquent une douleur ou lesion sans autre geste avant l'euthanasie
Impact sur les animaux
Les effets indésirables possibles sont: - Une injection sous anesthésie avec un risque de dépression cardio-respiratoire - un risque d’hypothermie - un risque de saignement à l’injection - un risque éventuel de toxicité lié au traitement
Devenir
En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés , car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires en post-mortem.
Remplacement
Toutes les études préalables possibles en culture ont été réalisées afin de valider la surexpression de gigaxonine comme molécule thérapeutique. Cependant, les étapes finales de choix de promoteur pour évaluer les niveaux d’expression et la toxicité associée ainsi que la dose à administrer en vue de l’etude thérapeutique ne peux être remplacée et doit être menée chez la souris. Les étapes pour choisir la meilleure construction génétique a utiliser et notamment le choix du promoteur nécessite un passage dans un individu vivant, la souris étant le modèle de choix. Cette étude va nous permettre d’apprécier les niveaux d’expression ainsi que la toxicité associée à notre thérapie génétique au sein d’un organisme mammifère dans son intégrité. Ces données vont nous aiguiller sur la dose à administrer qui sera à utiliser pour débuter la phase thérapeutique
Réduction
Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe en prenant en compte la fiabilité statistique des échantillons. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaires. De ce fait un nombre de 10 souris par groupe a été choisi pour la première étape et valider les niveaux d’expression à 1 mois, et 15 souris par groupe pour la seconde étape sur un suivi de 5 mois . Ceci va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 90 souris est nécessaire pour ce projet. De façon général nos résultats seront analysés statistiquement avec des tests adaptés.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises en oeuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (et prise en compte des points limites éventuels) et de soins adaptés si nécessaire. Les animaux seront hébergés dans des conditions très protégeés pour la zone d’élevage et sans pathogène pour la zone expérimentale (portoirs ventilés en pression positive ; Entre 3 à 6 souris par cage au maximum ; Cycle nycthémère de 12h ; Hygrométrie et température contrôlés), ainsi que de l’enrichissement répondant aux besoins physiologiques des souris (nidification, cachette et matériel à ronger). Les procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie.
Choix des espèces
Notre étude doit déterminer les niveaux d’expression et sera ainsi menée sur des souris C57BL6J possédant le même fond génétique que les souris qui seront utilisées par la suite par notre collaborateur. Les souris (mâles et femelles) seront utilisées à l’âge d’un mois correspondant à l’âge de traitement nécessaire pour la suite dans les souris modèle de la pathologie et suivi sur 1 mois ou 5 mois post injection intraveineuse. Cet âge correspond de plus à un individu développé et myélinisé similaire à l'âge de traitement des enfants GAN par le futur
Etude du pouvoir antitumoral d’une molécule à base de fer in vivo
- Recherche fondamentale
- Oncologie
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses humaines du sein ou du pancréas sous la peau, les tumeurs étant ensuite fragmentées et regreffées sur d'autres souris, puis des injections répétées d'une molécule à base de fer dans la queue. Le porteur indique que la croissance tumorale et les injections répétées peuvent provoquer douleur et lésions. Il conclut que ces études précliniques restent nécessaires au dépôt de brevet et à la poursuite d'essais cliniques.
Objectifs
Malgré les progrès dans leur diagnostic et traitement, les cancers du pancréas et certains cancers du sein ont encore un pronostic défavorable. Ainsi il est primordial de trouver de nouveaux traitements. Ce projet a pour but d’étudier le pouvoir anti-cancéreux d’un nouveau produit à base de fer (à une dose déjà montrée comme non toxique pour les souris) sur des souris ayant reçus une greffe au niveau du flanc, sous la peau, de cellules cancéreuses humaines (pancréas ou sein).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet à court termes sont de prouver que la molécule a un effet anticancéreux dans un modèle animal (souris). A long terme, cela permettrait de réaliser d’autres essais pré-cliniques voir cliniques et in fine améliorer le traitement des patients atteints du cancer du pancréas et du cancer du sein.
Procédures
Les animaux recevront une injection unique de cellules cancéreuses (mammaires pour une partie et pancréatique pour une autre partie) au niveau du flanc sous la peau. Une fois les tumeurs développées, elles seront fragmentées pour être greffées sur de nouvelles souris et ce à deux reprises. Cela permet d’obtenir un modèle tumoral fiable. La durée de cet acte est approximative car cela dépendra du temps que mettent les cellules à former une tumeur à chaque étape. 14 souris seront nécessaires pour cette étape (7 par modèle de cancer : sein et pancréas). Ensuite, aura lieu les greffes des fragments obtenus lors de la dernière transplantation, aux 66 souris nécessaires pour l’injection du composé. Une fois les tumeurs obtenues, les souris seront réparties en groupes pour les injections. Pour chaque modèle (cancer du sein et cancer du pancréas), il y aura 3 groupes de 11 souris , 1 groupe contrôle et deux groupes recevant 2 modalités d’injections de la molécule différentes. Pour chaque groupe, 4 souris seront mises à mort en cours d’expérimentation (étude de l’effet précoce de la molécule sur la tumeur) et les 7 autres en fin d'expérimentation.
Impact sur les animaux
Durant les actes expérimentaux, les souris seront soumises à différents injections. Elles seront également soumises à une chirurgie légère. A la suite de ces actes, les souris pourront ressentir une soif ou/et une faim moins importante que d’habitude. Les injections répétées de la molécule au niveau de la queue peuvent entrainer une douleur et une atteinte des tissus au niveau du site d’injection, afin d’éviter cela, nous injecterons à différents endroits de celle-ci. Le développement des tumeurs peut entrainer une douleur et une gêne, au fur et à mesure de la croissance de la tumeur. Les animaux seront donc susceptibles de gratter la zone de greffe ou d’injection. Après tout acte chirurgicaux ou injections, les animaux seront isolés le temps qu’ils récupèrent toutes leurs facultés mais seront rapidement remis en cage collective afin d’éviter un stress lié à l’isolement de l’individu.
Devenir
Pour la première partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort en cours de procédures pour récupérer au fur et à mesure les tumeurs et les fragmenter / regreffer. Pour la deuxième partie de l’expérimentation, tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tumeurs et étudier l'effet des différentes injections à un temps précoce ou à l'issu de l'expérimentation (temps tardif)
Remplacement
Aucune méthode alternative de remplacement ne permet de satisfaire l’objectif de Remplacement à notre connaissance. Ces études précliniques chez l’animal restent nécessaires au dépôt de brevet concernant son effet anticancéreux sur les animaux et à la poursuite d’études cliniques pour exploiter pleinement les capacités antitumorales de la molécule AIM3 dans le traitement de cancer du pancréas et du cancer du sein triple négatif
Réduction
Dans le but de réduire au maximum le nombre de souris, nous avons décidé d’éviter un quatrième groupe contrôle (ne recevant qu’une injection de la solution dans lequel est repris le composé). Nous utiliserons donc un seul groupe contrôle pour les comparaisons aux deux groupes traités.
Raffinement
Les expériences seront réalisées afin de minimiser le stress et l’apparition de douleurs chez les animaux. Les injections seront effectuées sur animaux anesthésiés afin de limiter le stress engendré par la contention. La présence d’enrichissement dans les cages (frisure de papier kraft, de bûchettes et/ou tunnel) est un critère de raffinement. Des critères d'arrêt anticipés de l'expérimentation en cas de survenue d'une complication ont été identifiés. Dès qu’un des points limites est atteint la souris en question sera écartée du protocole et mise à mort par dislocation cervicale à la suite d’une anesthésie gazeuse.
Choix des espèces
Le modèle de souris « nude » du fait de sa déficience en système immunitaire est le modèle animal le plus approprié pour des études en cancérologie expérimentale car il permet d’injecter chez l’animal des cellules cancéreuses d’origine humaine sans risque de rejet. La taille de la tumeur de la souris est suffisante pour l’analyse de la distribution de la molécule d’intérêt. 8 semaines : adulte, poids d’au moins 20 g. La veille bibliographique réalisée sur les études in vivo établies à partir de modèle de cancer du pancréas et de cancer du sein démontrent l’utilisation de souris femelles « nude » sans système immunitaire âgées de 8 semaines.
Etude pilote d’activation d’un gène dans les muscles lisses bronchiques de souris après exposition à des vecteurs viraux dans l’étude de l’asthme sévère
- Recherche fondamentale
- Système respiratoire
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées de souffrance légère. Elles reçoivent des instillations intranasales de vecteurs viraux sous anesthésie gazeuse, avant le prélèvement de leurs organes quelques semaines plus tard. Le porteur indique qu'un essoufflement peut apparaître après l'instillation, traité par un bronchodilatateur. Il présente cette étude pilote comme une étape vers la compréhension du remodelage bronchique dans l'asthme sévère, sans avancer de bénéfice clinique direct.
Objectifs
L’asthme est une maladie très fréquente des voies respiratoires, touchant 300 millions de personnes dans le monde. L’asthme dit sévère s’applique aux patients présentant un asthme dont le contrôle est impossible malgré des traitements inhalés à fortes doses. Un des besoins non couverts dans l’asthme sévère est la prévention efficace des exacerbations. Les exacerbations sont des épisodes caractérisés par une majoration des symptômes (essoufflement, toux, respiration sifflante ou oppression thoracique) et par une diminution de la fonction respiratoire. L'asthme est notamment caractérisé par un changement dans la structure de la bronche pulmonaire avec une augmentation de la taille du muscle bronchique. La taille du muscle lisse bronchique est donc un critère important dans l’étude de l’asthme, car son augmentation est associée à une fonction respiratoire dégradée et à un taux d’exacerbation plus élevé. L’augmentation de la taille du muscle bronchique chez les personnes asthmatiques est dû à un mécanisme encore inconnu. Pour comprendre comment et pourquoi le muscle bronchique a une taille plus importante chez les malades, nous souhaitons développer une nouvelle technologie basée sur la thérapie génique. Cette technologie est un outil indispensable pour l’étude du fonctionnement des gènes impliqués dans ce mécanisme. Notre but est d’utiliser cette approche afin de diminuer l’expression des gènes concernés jouant un rôle dans le remodelage bronchique et donc dans l’augmentation de la taille du muscle bronchique. Notre projet a pour objectif de mettre en place une technique innovante qui permettra de comprendre ce mécanisme pour, à terme développer des traitements plus efficaces.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote nous permettra d’avancer dans le décèlement des gènes jouant le rôle clé dans le remodelage des voies aériennes, pour à terme pouvoir proposer de nouveaux traitements aux patients asthmatiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des instillations intra-nasales (introduction par goutte à goutte de la solution d'intérêt) sous anesthésie gazeuse, d'une durée de 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir un léger stress suite à l’anesthésie sous isoflurane. Un risque de dyspnée (=essoufflement-respiration difficile et inconfortable) chez l’animal après instillation de la solution sous anesthésie gazeuse peut apparaître.
Devenir
L’objectif de ce projet est la récupération des organes des animaux afin d’étudier l’activation de l’expression du gène après l’exposition aux particules AAV. Quelques semaines après l’instillation intranasale les animaux seront euthanasiés et les organes seront prélevés.
Remplacement
En raison de la complexité de la communication intercellulaire menant à la maladie, il n’existe pas de modèle in vitro qui permet d’estimer l’évolution du remodelage bronchique dans l’asthme. L’utilisation du modèle d’asthme chronique murin dans nos études nous donnera une meilleure compréhension des phénomènes.
Réduction
Se souciant de réduire le nombre des animaux en expérimentation, comme pour chaque test statistique, nous avons défini le nombre de souris par groupe pour obtenir des résultats significatifs, et nous réaliserons de multiples études ex vivo sur différents organes et selon différentes techniques. L’évaluation de l’expression du gène sera faite à l’aide d'un test statistique. Afin de réaliser ce test, les groupes de souris doivent être composés de 10 souris minimum. Nous pourrons comparer les organes des souris de nos six groupes avec ceux d'animaux témoins qui ne participeront pas à la procédure expérimentale et ne recevront donc aucun traitement.
Raffinement
Afin de diminuer la souffrance et l’angoisse des animaux, des dispositifs sont prévus (anesthésie pour les instillations), raffinement des conditions d’hébergement (hébergement en groupe sociaux, frisottis et bâtonnets), vérification par la structure en charge du bien-être des animaux et nous avons soigneusement décrit des points limites en relation avec notre protocole (critères de perte de poids, comportement anormal ou difficulté respiratoire). La dyspnée éventuelle peut être traitée par l'utilisation pendant 15 secondes d’un broncho-dilatateur d’action rapide (type Ventoline®).
Choix des espèces
La souris est une espèce classiquement utilisée pour l’étude de la réactivité des voies aériennes normales et pathologiques. De plus, le laboratoire utilise cette espèce depuis plusieurs années, et dispose donc pour cette espèce de nombreuses données sur lesquelles s’appuie la présente étude. Les animaux inclus dans le protocole sont des souris âgés de plus de 5 semaines.
Etudes des activités électriques corticales et sous-corticales chez la souris.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
2 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes subissent une neurochirurgie d'environ une heure pour implanter des électrodes d'enregistrement cérébral, puis des stimulations sonores et des injections de composés pouvant aller jusqu'à deux par jour pendant vingt-huit jours. Le porteur, qui travaille pour un donneur d'ordre, veut identifier des marqueurs cérébraux transposables à l'humain pour tester des molécules contre les troubles neurologiques et psychiatriques. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent pas être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques.
Objectifs
Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Consciente des limites des traitements actuels, l’industrie pharmaceutique investit du temps et de l’argent pour tenter de mettre sur le marché de nouvelles thérapies du Système Nerveux Central avec un axe prioritaire sur les troubles de la mémoire, de la perception ou encore les troubles psychiatriques (en 2013, 287 molécules en développement pour la maladie d’Alzheimer et 110 molécules pour la Schizophrénie). L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Cela signifie d’appréhender cette problématique par une approche consistant à utiliser les données existantes de la recherche clinique pour construire de nouvelles solutions de recherche préclinique et se baser sur des marqueurs biologique des pathologies utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Les activités cérébrales de base sont largement conservées dans l’évolution des mammifères montrant le fort potentiel translationnel de cette méthode. Dans ce projet, nous étudierons les activités électriques cérébrales spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines.
Bénéfices attendus
Le développement de nouveaux médicaments est très coûteux et prend beaucoup de temps. Afin d’optimiser ce développement et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et utilisation de marqueurs d’évaluation d’efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables entre les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l’humain et le rongeur. Dans ce projet, nous utiliserons des souris afin de modéliser des pathologies neurologiques et psychiatriques. Nous cherchons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur des modèles animaux de pathologies neurologiques. Ces marqueurs biologiques translationnels nous permettront également de tester de nouvelles molécules thérapeutiques.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée, un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après une administration d’un composé médicamenteux. Lors des tests pharmacologiques en administration longues durée, les injections peuvent être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir une neurochirurgie d’environ une heure comprenant la période d’anesthésie. Afin de prévenir toute douleur lors de cette neurochirurgie, une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores une à deux fois par semaine. Il est possible que les animaux aient un léger sursaut à la première stimulation sonore mais les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress à long terme sur les animaux. Certains animaux subiront également des traitements pharmacologiques ; l'injection peut induire un stress, une douleur au site d’injection mais sur un temps très bref de quelques secondes. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tout test de composé sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l’inverse une excitation du fait des mécanismes d’action des molécules testées. Lors des expériences, les animaux seront installés dans des isoloirs, ils seront libres de leurs mouvements mais dans un espace réduit.
Devenir
Ce projet implique l’implantation de dispositifs d’enregistrement de signaux électroencéphalographiques. De plus, dans certains cas, une vérification d’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus cérébraux seront nécessaires. Les animaux seront donc tous mis à mort à la fin du projet.
Remplacement
Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).
Réduction
Dans ce projet, les changements des activités cérébrales enregistrées par éléctroencéphalogramme seront mesurés pour les activités de base. Pour les activités cérébrales induites par des stimulations sonores, nous évaluerons les réponses électriques enregistrées. Le nombre d'animaux sera limité au nombre minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. Il a été estimé selon notre expérience antérieure nous ayant permis d'obtenir un nombre suffisant d’animaux enregistrés pour réaliser les tests statistiques précédents.
Raffinement
Après une semaine d’acclimatation à la zone d’hébergement, les souris subiront une neurochirurgie. Une injection d'antidouleur sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Après la neurochirurgie, l’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et de définir les points limites adaptés. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (coton, maison en carton). Pour les expériences d’enregistrements évoqués, les stimulations sonores utilisées seront limitées à une intensité sonore en dessous de l’intensité dommageable et qui n’induit pas de réaction de stress sur les animaux.
Choix des espèces
Dans ce projet nous utiliserons des souris. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. La sélection de la souris est aussi basée sur des études précédentes réalisées par le client. Les animaux sont manipulés au minimum à l'âge de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications des activités électriques chez des animaux adultes. A ce stade, les circuits électriques du cerveau sont matures et présentent des caractéristiques matures.
Elevage et maintien de souris transgéniques modèles pour l’étude de l’hétérogénéité des macrophages associés aux tumeurs sur le développement tumoral et l’évolution du cancer
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
8 000 souris transgéniques vont être utilisées dans un projet d'élevage classé en souffrance légère, la plupart tuées à l'issue et environ 250 transférées vers d'autres projets. Chaque animal subit une biopsie de l'oreille et l'implantation d'une puce RFID sous anesthésie locale pour le génotypage. Le porteur indique que les reproducteurs sont tués après six portées et que les souris au mauvais génotype sont réutilisées ailleurs. Il revendique plus de soixante lignées comme indispensables pour étudier les macrophages des tumeurs, l'effectif de 8 000 servant surtout à produire et entretenir ces lignées.
Objectifs
Les tumeurs solides ne sont pas seulement composées de cellules tumorales, mais également de fibroblastes, de cellules immunitaires telles que les lymphocytes ou les cellules myeloïdes et de matrice extracellulaire, un ensemble de molécules extracellulaires sécrétées par les cellules qui fournissent un support structurel et fonctionnel ; le tout formant ce que l'on appelle communément le microenvironnement tumoral. Parmi les cellules immunitaires, les macrophages appelés dans ce contexte « macrophages associés aux tumeurs » sont notamment retrouvés dans une proportion élevée et les observations cliniques ont établi une corrélation claire entre l'abondance de ces macrophages et la sévérité du pronostic. Des études récentes notamment basées sur des approches bio-informatiques ont révélé une grande plasticité des macrophages dans les tissus sains et les tumeurs. Pour étudier l'impact de ces cellules sur le micro-environnement tumoral et l'évolution des tumeurs, un grand nombre de lignées de souris transgéniques sont indispensables (plus de 60).
Bénéfices attendus
Identification de nouvelles cibles thérapeutiques et le développement de nouveaux traitements plus spécifiques et efficaces que ceux existants pour de nombreux cancers.
Procédures
Une biopsie de tissu au niveau de l'oreille de 1 mm de diamètre, durée 15 secondes. Une injection de transpondeur RFID sous anesthésie locale, durée 1 minute.
Impact sur les animaux
La biopsie d'environ 1 mm de diamètre au niveau de l'oreille entraîne une douleur de courte durée. L'injection d'un transpondeur RFID de la taille d'un grain de riz sous anesthésie locale entraîne également une douleur de faible intensité. Ces interventions n'ont pas de conséquence à moyen ou long-terme.
Devenir
Réutilisés: animaux n'ayant pas le bon génotype transférés vers un autre projet- Euthanasie des reproducteurs après 6 portées au maximum et des animaux génétiquement modifiés non utilisables pour d'autres buts - Autres animaux gardés en vie pour utilisation continue dans des projets autorisés de recherche de l'équipe.
Remplacement
Pour étudier la plasticité des macrophages associés aux tumeurs, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable pour récapituler le microenvironnement tumoral et ses intreactions avec le reste de l'organisme (cellules immunitaires) et corroborer ou non les résultats précédant établis par des approches in vitro, in silico (bioinformatique) et ex vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été calculé au plus juste en utilisant le calculateur d'élevage du laboratoire Jackson et en se basant sur l'expérience acquise avec ces lignées dans le passé. Les individus n'ayant pas le bon génotype seront , quand c'est possible, transférés à d'autres projets et utilisés.
Raffinement
Les animaux bénéficieront d'une surveillance clinique quotidienne et d'un environnement enrichi en tout temps. Des points limites ont été définis et seront strictement appliqués. Les animaux seront hébergés en groupes de 5 avec un enrichissement de la cage (swizzlenest, barre à ronger, tunnel ou maison en carton). L'eau et la nourriture leurs sont proposés à volonté et lorsque les animaux présentent une faiblesse, un complément alimentaire (Dietgel) leur est proposé avec facilité d'accès.
Choix des espèces
Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation chez la souris est indispensable pour étudier l’immunité et l’effet des traitements sur la réponse anti-tumorale dans leur globalité Les biopsies et les identifications seront faites à 4 semaines.
Développement d’une stratégie de ciblage des macrophages synoviaux pour le traitement personnalisé des différents pathotypes d’arthrose dans des modèles murins
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
3 320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie de déstabilisation du ménisque du genou, une autre reçoit des injections de collagénase dans l'articulation pour induire une arthrose, et toutes reçoivent des injections intra-articulaires d'un traitement ciblant les macrophages. Le porteur indique que l'arthrose peut provoquer douleur, prostration et isolement, et que des infections des sutures ou des points d'injection restent possibles. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit simultanément tous les paramètres de la maladie.
Objectifs
L’arthrose est une pathologie dégénérative et inflammatoire affectant 50% de la population mondiale de 65 ans et plus. Cette pathologie atteint l’ensemble de l’articulation (cartilage, os, membrane synoviale) et est caractérisée par des douleurs et une raideur articulaire importante. Alors que l’arthrose est la plus commune des maladies rhumatismales, seuls des traitements traitant les symptômes de la douleur et non les causes précises de l’arthrose existent, ne permettant pas d’enrayer la dégradation articulaire. Il apparaît donc primordial de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques spécifiques de l’arthrose. L’inflammation de la membrane synoviale (tissu entourant la zone d’interface entre deux os, lubrifiée par du liquide synovial) semble être un mécanisme clé dans l’initiation et la progression de l’arthrose. Les macrophages, cellules immunitaires impliquées dans la surveillance de notre organisme et dans certaines réactions inflammatoires, représentent la population immunitaire la plus importante dans la membrane synoviale et plusieurs études ont montré leur rôle pathologique au cours du développement et de la perpétuation de l’arthrose. De plus, nos résultats préliminaires ont identifié plusieurs sous-populations de macrophages d’intérêt au sein d’échantillons de membranes synoviales de patients atteints d’arthrose. L’objectif de ce projet vise donc (1) à valider chez la souris l’identification d’une ou plusieurs populations de macrophages de la membrane synoviale impliquées dans l’arthrose ; et (2) à développer une stratégie de ciblage de ces macrophages pour le traitement spécifique de l’arthrose. Pour cela, l’utilisation de trois modèles murins différents est nécessaire afin de représenter au mieux les différents sous-groupes de patients atteints d’arthrose observés en clinique. L’ensemble de ces données ouvrira la voie à l’étude de cette stratégie de ciblage spécifique des macrophages dans l’arthrose pour une utilisation thérapeutique. Enfin, dans la littérature, des données montrent une association entre les modifications du microbiote intestinal (ensemble des microorganismes du système digestif) et le développement de l’arthrose. Ainsi, nous mettrons à profit les expérimentations précédentes et nous analyserons le microbiote intestinal des trois modèles murins d’arthrose afin d’étudier le lien, à l’heure actuelle incompris, entre composition de ce microbiote et développement de l’arthrose.
Bénéfices attendus
La prise en charge des patients atteints d’arthrose est à ce jour peu efficace et, compte-tenu l’absence de traitement curatif permettant de réduire ou de stopper la dégradation articulaire, le développement de traitements de l’arthrose représente un défi majeur. Ce projet permettra d'une part, de confirmer l’implication des macrophages de la membrane synoviale dans le développement et la progression de l'arthrose ; et d'autre part, d’apporter la preuve de concept de l’efficacité d’un nouveau traitement spécifique de cette maladie, ciblant les macrophages de la membrane synoviale dans différents modèles murins représentant la diversité des manifestations cliniques et biologiques observées chez les patients. Ces travaux pourront, à plus long terme, permettre de proposer des stratégies thérapeutiques personnalisées pour des essais cliniques chez le patient chien (animal présentant naturellement de l’arthrose, de façon similaire à l’Homme) puis chez l’Homme. En parallèle, ce projet permettra également d’approfondir l’axe de recherche du microbiote dans l’arthrose. Il permettra, pour la première fois, d’évaluer l’impact du développement de l’arthrose sur la composition microbienne intestinale. Ainsi, ces résultats préliminaires ouvriront la voie à des études ultérieures et leur impact pour les patients sera majeur.
Procédures
Une partie des animaux seront soumis à une chirurgie d’environ 15 minutes consistant en une déstabilisation d'un ménisque (cartilage servant de cales et d’amortisseurs à l’articulation) du genou droit. Une autre partie sera soumise à deux injections intra-articulaires de collagénase (molécule permettant d’induire une dégradation précoce du cartilage) dans le genou droit. L’ensemble des animaux recevra une ou plusieurs injections intra-articulaires du traitement spécifique, appelé lipoplexes, permettant de modifier l’activité des macrophages de la membrane synoviale pour le traitement de l’arthrose. Ces opérations seront effectuées dans des conditions d’asepsie strictes, sous anesthésie gazeuse et associées à un traitement anti-douleur pré- et post-opératoire.
Impact sur les animaux
Lors du développement de l’arthrose, de la douleur peut être ressentie par l’animal. Celui-ci peut alors entrer se proster, s’isoler des autres animaux et cesser les interactions comme par exemple le toilettage social. Dans le modèle d'induction chirurgicale de l'arthrose, une déchirure de la peau, inopinée et indépendante de l’incision initiale pendant la chirurgie, pourrait avoir lieu. De plus, dans de rares cas, une infection pourrait intervenir au niveau des sutures post-chirurgicales, au niveau du point d’injection du modèle d'induction chimique de l'arthrose ou au niveau du point d’injection des lipoplexes servant au ciblage des macrophages de la membrane synoviale. De façon générale, les animaux sont suivis régulièrement et différents indicateurs précoces d’une éventuelle douleur et/ou détresse (points limites) seront attentivement observés (changement de poids corporel, apparence physique, comportement non provoqué…) afin d’apporter les soins nécessaires et le plus rapidement possible aux animaux.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés afin de collecter des tissus et procéder à des analyses radiologiques, histologiques et cellulaires.
Remplacement
L’articulation se compose de différents tissus et types cellulaires, ainsi que d’un liquide synovial. L'ensemble de ces composants agissent ensemble pour maintenir un état sain stable. Cependant, dans certains cas pathologiques, ces différents composants peuvent interagir et participer au maintien d'une pathologie, comme dans le cas de l'arthrose. Cette dernière a des causes et des conséquences multiples pour laquelle il n’existe pas, à ce jour, de modèle in vitro (expérience en laboratoire, réalisée hors d’un organisme vivant) permettant de reproduire simultanément tous ces paramètres associés. C’est pourquoi, ce type d’étude nécessite une preuve d’efficacité in vivo dans des modèles utilisant des animaux.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum mais suffisant pour démontrer des différences pertinentes (statistiquement significatives) et reproductibles entre les groupes. De plus, pour mettre au point l'utilisation des lipoplexes, permettant le ciblage des macrophages dans les animaux, des tests préliminaires in vitro seront réalisés sur des cellules en culture et sur des cultures de membrane synoviale, ainsi que des tests préliminaires in vivo sur des souris non arthrosiques, permettant in fine de limiter au maximum le nombre d'animaux utilisés. L’association du projet principal, concernant le ciblage des macrophages dans les trois modèles murins d’arthrose, avec le projet secondaire, portant sur l’étude préliminaire du microbiote intestinal dans l’arthrose, permet de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l'obtention de conclusions fiables concernant les deux questions de recherche distinctes.
Raffinement
De façon générale, un suivi hebdomadaire des animaux permettra d’évaluer leur état de santé. Dans les cas particuliers du suivi post-opératoire et du suivi post-injection, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les 3 premiers jours. S’ajoute à cette observation une surveillance réalisée par les animaliers lors de l’entretien des cages des animaux. Les souris sont hébergées en groupes sociaux de 5 souris par cage avec des frisottis et un dôme, permettant de l'amélioration ou enrichissement du milieu de vie. Les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de chacun 12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront sous couverture anesthésique et analgésique adaptée, en pré- et post-opératoire. La chirurgie, même si celle-ci ne dure pas plus de 15 minutes, et la phase de réveil seront effectuées sur tapis chauffant afin d’éviter toute hypothermie éventuelle.
Choix des espèces
L’utilisation de la souris est justifiée car il s’agit d’un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens pré-cliniques. De plus, de nombreux outils et méthodes d'analyse sont disponibles. Dans le cas de l’arthrose, plusieurs modèles murins ont été développés, faisant de cette espèce la plus décrite dans la littérature internationale pour l’étude de cette pathologie. D’autres part, elle permet la constitution de groupes d'animaux suffisamment larges pour pouvoir effectuer des analyses pertinentes et reproductibles. Enfin, des études précédentes dans notre laboratoire ont montré qu’il était possible d’injecter des volumes suffisants et de manière précise dans l’articulation, assurant la faisabilité de notre stratégie. Notre protocole démarrera chez des souris arrivées à maturité squelettique et âgées de 9 semaines minimum. Cet âge correspond à l’âge à partir duquel une induction de l’arthrose est possible et documentée dans la littérature. Dans le cas du développement d’une arthrose spontanée, les protocoles débuteront chez des souris âgées de 12 mois (âge minimum à partir duquel une arthrose spontanée se développe).
Effets therapeutiques de l’ouverture de la barriere hemato-encephalique sur la propagation des lesions dans un modele murin de maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 20 reproducteurs, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souris transgéniques reçoivent une inoculation intracérébrale d'extraits de cerveaux de patients atteints d'Alzheimer, puis cinq séances d'ouverture de la barrière hémato-encéphalique par ultrasons sous anesthésie, avant un test de mémoire. Le porteur indique que ces souris développent une paralysie des membres postérieurs et un amaigrissement, et que la chirurgie intracérébrale peut provoquer une douleur. Il affirme qu'aucune alternative non animale ne peut se substituer à ces souris transgéniques.
Objectifs
La maladie d’Alzheimer est une maladie neurodégénérative incurable qui est devenue un impact majeur de santé publique. La maladie d’Alzheimer est caractérisée par l’accumulation anormale de différentes protéines dans le cerveau des patients. Une de ces protéines est nommée Abéta et se dépose sous forme de plaques appelées plaques amyloïdes. De nombreux essais cliniques, chez l’animal et chez l’homme, montrent une élimination de la protéine Abéta du cerveau des patients mais sans effet sur les symptômes. Une autre protéine, la protéine tau, s’accumule également dans le cerveau des patients. Tau s’agrège à l’intérieur des neurones et fait l’objet de nombreuses recherches cliniques et pré-cliniques, notamment parce qu’elle est fortement liée au déclin cognitif des patients. Un obstacle majeur au développement de thérapies efficaces dans la maladie d’Alzheimer repose cependant sur l’existence d'une barrière « sang-cerveau » qui contrôle les entrées et sorties entre le cerveau et l’extérieur. Cette barrière a pour rôle de protéger le cerveau. Cependant, la barrière sang-cerveau rend aussi difficile la pénétration des molécules thérapeutiques dans le tissu cérébral. Ces dernières années, un moyen d’ouvrir cette barrière a été décrit. Il s’agit de l’utilisation d’ultrasons appliqués sur la surface du crâne, associée à l’injection intraveineuse de microbulles (produits de contraste échographique couramment utilisés) qui permettent de distendre, de manière transitoire et sans effet secondaire, les parois de la barrière et ainsi autorisent la pénétration des molécules thérapeutiques. Cette technique a déjà été appliquée avec succès dans le traitement par chimiothérapie des tumeurs cérébrales. Concernant la maladie d’Alzheimer, il a été montré chez l’animal des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière seule sur l’élimination des protéines pathologiques (Abéta et tau). Cependant, les effets de l’ouverture de barrière sur la propagation des lésions dans le cerveau ne sont pas connus. En particulier, est-ce que l’ouverture transitoire de la barrière sang-cerveau permet de freiner la progression des agrégats de protéines tau en empêchant leur passage d’une aire cérébrale à une autre ? Cette question constitue l’objet de notre travail. Celui-ci sera réalisé sur des souris génétiquement modifiées pour reproduire les accumulations de protéine tau caractéristiques de la maladie d’Alzheimer.
Bénéfices attendus
Plusieurs études récentes ont montré des effets bénéfiques de l’ouverture de la barrière via l’association des ultrasons avec les microbulles chez l’animal avec une diminution de l’accumulation de la protéine Abéta et de la protéine tau dans le cerveau. Le ou les mécanismes par lesquels l’ouverture seule de la barrière (non associée à l’injection de molécule thérapeutique) permettrait ces effets thérapeutiques restent à ce jour non connus. Par ailleurs, d’autres études ont montré que l’inoculation intra-cérébrale d’extraits de cerveaux d’individus atteints de maladie d’Alzheimer provoquait expérimentalement, chez l’animal, une augmentation de la propagation de la pathologie. Ainsi, notre projet a pour visée de déterminer l’effet de l’ouverture de la barrière par ultrasons sur la propagation de la pathologie tau. Notre hypothèse est que l’ouverture de barrière permettra de freiner la dissémination-propagation des lésions. Au long terme, ces recherches pourraient permettre le développement de stratégies thérapeutiques et diagnostiques innovantes et, parallèlement, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques à l’origine de la maladie d’Alzheimer.
Procédures
Les animaux transgéniques sont un modèle de maladie d’Alzheimer avec des lésions cérébrales et des signes cliniques (paralysie, perte de poids) qui peuvent être précoces. Pour cette raison, les animaux feront l’objet d’un suivi rapproché pendant toute la durée de l’étude (examen et pesée 1-2 fois par semaine). Pour les animaux, il y aura au maximum 3 étapes expérimentales : La première consiste en l’inoculation intra-cérébrale des extraits de cerveaux de patients présentant une Maladie d’Alzheimer. Celle-ci est réalisée, chez 130 souris, sous anesthésie générale. Cette chirurgie est unique, d’une durée d’environ 30 minutes, et associée à une prise en charge de la douleur (analgésiques). Par la suite (15 jours plus tard), aura lieu la seconde étape (ouverture de la barrière par ultrasons). Cinq séances d’ouverture de la barrière par ultrasons (en externe, sans ouverture du crâne) seront réalisées à un rythme d’une séance par semaine. Lors de chacune de ces séances, les souris seront anesthésiées. La durée d’une séance pour chaque animal est d’environ 10 minutes. Au bout de 5 semaines de traitement par ouverture de barrière, 80 des 130 animaux seront finalement évalués par un test de mémoire non-invasif (observation du comportement spontané dans une enceinte carrée pendant 2x10 minutes). Le test sera réalisé 72 heures après la dernière séance de sonication. A la fin de l’étude, l’examen du cerveau des souris sera effectué en postmortem afin d’explorer l’effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation de la pathologie chez les souris. Pour produire les 130 souris nécessaires au projet, nous utiliserons les animaux reproducteurs de notre colonie (20 mâles transgéniques). Le nombre total d’animaux est donc de 150.
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées dans cette étude présentent un phénotype dommageable et développent vers l’âge de 7 mois (parfois plus tôt) des lésions des voies motrices entraînant une paralysie des membres postérieurs. Ce tableau clinique s’accompagne d’un amaigrissement lié aux difficultés d’accès à la nourriture et à la boisson. Comme nous utiliserons des souris jeunes (4-6 mois) nous ne devrions pas observer ces phénotypes dommageables. Les deux manipulations chirurgicales de ce projet (inoculations intracérébrales et ouverture de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels. Ceux-ci comprennent le risque d’hypothermie lors de l’anesthésie, le risque de déshydratation et le risque de d’anomalies cardiaques et respiratoires liées au produit anesthésique. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie si celle-ci est correctement réalisée (chirurgie courte, utilisation de produits anti-douleurs). Concernant l’étape d’ouverture de la barrière, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. En effet, celle-ci n’implique pas d’ouverture cutanée. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, sans restriction d’accès à l’eau ou à l’alimentation, sans menace pour l’animal, et impliquant un stress modéré lors de la manipulation (sortie de la cage) et du placement dans un nouvel environnement.
Devenir
A l’issue de la procédure, l’ensemble des animaux expérimentaux (n = 130) sera ensuite euthanasié pour prélèvement de leurs cerveaux à visée d’analyse. Les animaux transgéniques servant à la reproduction (n = 20) seront euthanasiés.
Remplacement
L’étude préclinique, fondamentale ou appliquée de la maladie d’Alzheimer, nécessite le recours aux modèles animaux, seuls à même de reproduire le contexte physiologique de cette pathologie neurodégénérative complexe. Il n’est donc pas possible de substituer aux souris transgéniques une alternative non-animale. Ce modèle de souris est le modèle le plus couramment utilisé dans les études précédentes sur le sujet.
Réduction
Le nombre d’animaux produits et maintenus sur site est réduit au maximum. La taille des groupes d’animaux (10-20 souris par groupe expérimental) produits pour les futures études est définie en fonction de nos expériences antérieures et des données de la littérature afin de permettre de générer des données fiables. L’ensemble des animaux seront produits sur site (colonie implantée depuis plusieurs années). 7 lots expérimentaux seront utilisés : Expérience 1 (étude pilote) – Effet de l’ouverture de la barrière sur la propagation des lésions cérébrales 3 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale couplée (ou pas) à une ouverture de la barrière. Ces 3 lots serviront à l’évaluation du traitement sur la cible principale (lésions tau dans le cerveau). Expérience 2 (plan expérimental complet) - Effet de l’ouverture de la barrière sur les fonctions cognitives et les lésions cérébrales 4 lots d’animaux (normaux ou transgéniques) recevront une inoculation intracérébrale (« Alzheimer » ou « contrôle ») couplée à une ouverture de la barrière. Les animaux seront ensuite testés dans un test de mémoire. Ces 4 lots permettront une description complète (clinique, neuropathologique et biochimique) des effets du traitement (inoculation intracérébrale + ouverture de la barrière). Au total, 130 souris seront utilisées pour les expériences et 20 souris transgéniques seront utilisées pour la production des animaux expérimentaux.
Raffinement
L’établissement utilisateur où sont hébergés les animaux étant agréé, les conditions de température et d'hygrométrie sont contrôlées quotidiennement. Les animaux sont hébergés par groupes de 4 ou 5 souris et bénéficient également d’un enrichissement matériel (coton ou kraft pour faire un nid, maisons en cellulose). Nous avons déjà mis en place un programme qui vise au suivi rapproché de la lignée de souris modèle de maladie d’Alzheimer afin de détecter l’apparition de symptômes dommageables. Ce suivi sera réalisé pendant toute la durée de l’étude, de la naissance à la mort, et permettra de détecter les animaux avec des signes cliniques et de prendre des mesures adaptées (prise en charge de la douleur, aménagement environnement, euthanasie). Les deux étapes du projet (inoculation intracérébrale et ouvertures de la barrière hémato-encéphalique) sont associées aux risques anesthésiques habituels (hypothermie, deshydratation, sur- ou sous-dosage) pour lesquels plusieurs mesures seront mises en place (tapis chauffant, réhydratation avant la chirurgie, surveillance rapprochée de la sédation). Une surveillance post-opératoire sera également mise en place. La chirurgie d’inoculation intra-cérébrale pourrait de plus provoquer une douleur pendant et après la chirurgie chez l’animal mais nous avons prévu de prévenir celle-ci par l’administration d’anti-douleurs (analgésiques) avant et après la chirurgie associée à l’anesthésie. Aucun autre effet indésirable n’est attendu pour cette chirurgie. Concernant les étapes d’ouverture de la barrière « sang-cerveau » et d’évaluation comportementale, il n’est pas attendu d’effet indésirable supplémentaire à ceux de l’anesthésie. Enfin, l’étape d’évaluation de la mémoire repose sur un comportement spontané de l’animal, avec accès à l’eau et l’alimentation, sans renforcement aversif, et n’impliquant à priori pas de stress majeur chez l’animal (si ce n’est la manipulation et le placement dans un nouvel environnement). Le suivi rapproché des animaux au cours de la phase d’élevage et d’expérimentation permettra d’identifier l’atteinte de points limites et d’intervenir pour minimiser toute souffrance animale.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris transgéniques qui développent des lésions similaires à celles des patients atteints de maladie d’Alzheimer. Il n’existe pas à notre connaissance de modèle autre que ces souris transgéniques permettant d’atteindre les objectifs du présent projet. Toutes les expérimentations seront réalisées sur l’animal à l’âge adulte. Les injections intracrâniennes seront effectuées sur les animaux jeunes adultes (âgés de 4 mois), âge auquel les lésions de type Alzheimer ne sont pas encore importantes et la boite crânienne est mature et stable, autorisant une chirurgie stéréotaxique précise. Les traitements d’ouverture de barrière seront initiés à l’âge de 4.5 mois (début des lésions) sur une durée d’un mois et demi avant évaluation comportementale et l’euthanasie des animaux. L’évolution des lésions à 6 mois pourra ainsi être évaluée et leur régression après traitement mesurée.
Etude de l’activité antitumorale de nanoparticules d’or par photothérapie thermique sur un modèle murin de carcinome basocellulaire en comparaison avec la chirurgie
- Recherche appliquée
- Cancers
90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, puis une injection intratumorale de nanoparticules d'or suivie d'une irradiation laser sous anesthésie, un groupe subissant à la place l'ablation chirurgicale de la tumeur. Le porteur indique que l'hyperthermie du traitement peut provoquer une douleur, gérée par anesthésie et analgésie. Il justifie le recours à l'animal par un microenvironnement tumoral trop complexe pour de simples cellules en culture.
Objectifs
Nous travaillons sur le développement de nanoparticules (NP) d'or pour le traitement par PTT (photothermie plasmonique) de carcinomes basocellulaires. En excitant les NP avec un laser émettant dans l'infra-rouge, on génère une hyperthermie suffisamment importante pour détruire les cellules par apoptose. Des études in vitro et in vivo ont déjà été menées sur nos NP et ont permis de démontrer une efficacité : induction de mort cellulaire, régression partielle ou totale des tumeurs. L'objectif de cette étude est d'optimiser les paramètres du traitement afin d'obtenir la meilleure efficacité possible de notre traitement (idéalement 100% de régression totale) sur ce modèle et d'effectuer une comparaison avec le traitement de référence actuel qui est la chirurgie. Si la chirurgie est relativement efficace pour ce type de cancer, elle a l'inconvénient de laisser des cicatrices inesthétiques. Or comme ce cancer se produit généralement sur les zones exposées au soleil et donc visibles telles que le visage, cela peut avoir un impact important sur la qualité de vie des patients.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus seront de valider le schéma thérapeutique qui pourra être appliqué en clinique et apporter la démonstration aux cliniciens que la PTT peut être utilisée en remplacement de la chirurgie.
Procédures
Tous les animaux subiront une greffe de cellules en sous cutanés (100μl sur le flanc droit sous anesthésie gazeuse d'une durée d'une à deux minutes). Une dizaine de jours plus tard, les animaux de 7 groupes subiront une injection intratumorale sous anesthésie gazeuse d'une durée d'une à deux minutes suivi 30 minutes plus tard d'une irradiation laser (10 minutes sous anesthésie gazeuse après injection d'un analgésique en sous cutané), et ce, 1 ou 2 fois à 3 ou 14 jours d'intervalle. Un groupe d'animaux subira une résection chirugicale du volume tumoral. Toutes ces manipulations seront réalisées sous anesthésie gazeuse couplée à une injection d'anlagésique (buprénorphine injectée en sous cutanée).
Impact sur les animaux
Il est possible que l'hyperthermie générée lors du traitement soit la cause d'une douleur, c'est pourquoi le traitement se déroulera sous anesthésie gazeuse et un analgésique sera injecté quelques minutes avant le traitement. Si nécessaire d'autres injections d'analgésiques seront réalisées. Pour les animaux subissant la chirurgie il est possible que les sutures générent un inconfort ou une douleur, si tel est le cas des injections d'analgésiques seront réalisées et des granulés mouillés seront disposés au fond des cages pour faciliter l'accès des animaux à l'eau et la nourriture.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'étude car elles seront soient porteuses de tumeurs soient présenteront une régression compléte qu'il faudra confirmer en histologie.
Remplacement
Des études in vitro ont été réalisées en amont pour démontrer l'efficacité d'un tel traitement mais le microenvironnement tumoral étant plus compliqué que de simples cellules en culture il est nécessaire de passer sur des modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au strict minimum nécessaire pour avoir des résultats statistiquement significatifs. Les conditions à tester ont pu être limitées grâce aux études précedemment réalisées.
Raffinement
Lors de l'irradiation et de la chirurgie, les souris seront anesthésiées par voie gazeuse et un analgésique sera injecté quelques minutes avant l'irradiation au cas où l'hyperthermie engendrerait une douleur. Par ailleurs, des points limites ont été établis, entrainant la consultation d'un vétérinaire qui décidera soit de la mise à mort anticipée de l'animal si nécessaire ou des soins à lui apporter.
Choix des espèces
Afin de pouvoir évaluer de nouvelles thérapies, les modèles animaux sont un passage obligatoire après l'évaluation in vitro (sur des cellules en culture). Le rongeur est le modèle le plus utlisé actuellement pour l'évaluation de nouvelles thérapies. Le modèle retenu pour cette étude est un modèle murin car il a déjà été documenté et pour le choix des souris il s'agit de souris Athymic nude qui sont immunodéprimées et ne vont ainsi pas rejeter les cellules tumorales humaines qui vont leur être greffées. Pour finir, l'étude ne portera que sur des souris femelles car aucun effet sexe n'a été observé précedemment et ce seront des animaux adultes de 6 à 8 semaines seront utilisés car les prises de greffe sont plus homogènes sur des individus jeunes.
Etude des effets de la stimulation magnétique répétitive trans-médullaire sur l’inflammation du tissu cérébral, la neurogenèse hippocampique et la cognition après lésion de la moelle épinière chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
138 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance pouvant aller jusqu'à sévère. La plupart subissent une lésion de la moelle épinière sous anesthésie, qui provoque une paralysie des membres postérieurs et des difficultés à se déplacer pour se nourrir, puis une partie reçoit une stimulation magnétique et passe un test de reconnaissance d'objet. Le porteur veut mesurer l'effet de cette stimulation sur l'inflammation cérébrale et la cognition après le traumatisme. Il affirme qu'il n'existe pas d'alternative aux expériences sur l'animal vivant et conclut que le modèle animal reste nécessaire.
Objectifs
Les traumatismes médullaires sont le plus souvent d’origine traumatique (LMT) et entrainent un handicap fonctionnel majeur chez l’homme (paraplégie ou tétraplégie, incapacité à se déplacer, assistance ventilatoire à vie…). De plus, il a également été mis en évidence chez les patients atteints de LMT que ces derniers souffraient de troubles cognitifs avec par exemple une survenue d’épisodes dépressifs. Récemment, une étude chez l’animal a permis de démontrer que la LMT induit une inflammation massive de l’encéphale, pertube la neurogenèse hippocampique et entraine un déclin des fonctions cognitives. Des études menées dans notre laboratoire ont permis de mettre évidence pour la première fois que la transplantation de cellules gliales olfactives au niveau du site de lésion médullaire permet de réduire l’inflammation cérébrale et permet également de restaurer les fonctions cognitives. Nous voudrions ici reproduire ces résultats mais avec un autre type de thérapie, la stimulation magnétique répétitive trans-médullaire (rTSMS). En effet, dans une précédente étude nous avons démontré que cette thérapie permet d’induire une récupération fonctionnelle motrice et tissulaire chez la souris et également chez le rat. La rTSMS a notamment un rôle sur l’inflammation et la réactivité microgliale. De ce fait, ce projet a pour objectif de mesurer les effets de la stimulation magnétique répétitive trans-médullaire sur l’inflammation du tissu cérébral, la neurogenèse hippocampique et la cognition après lésion de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) notamment sur la capacité de ce traitement à induire une récupération des fonctions cognitives chez la souris suite à une lésion de la moelle épinière. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement après lésion médullaire chez l’Homme afin d’éviter les problèmes cognitifs qui surviennent après ce type de lésions.
Procédures
- 118 souris seront utilisées sur lesquelles seront réalisées une lésion de la moelle épignière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. Le lendemain et jusqu’au 15ème jour, sous anesthésie générale, la moitié des souris (soit 49 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes à raison de 10hz pendant 10 secondes suivies de 20 secondes sans stimulation à un intensité de 0.4T. 30 souris seront utilisées afin de réaliser des expériences de reconnaissance d’objet, ces expériences sont non-invasives et non douloureuses et se feront sur animal vigile. Ces expériences nécéssitent de réaliser trois cessions par temps expérimentaux (15, 30 et 60 jours après la réalisation de la lésion). Chacune des cessions durera entre 5 et 10 minutes. 20 animaux « controles » sans lésion seront également utilisés afin d’obtenir des valeurs controles pour les différents expériences (histologie, RT-QPCR et test cognitif). L’ensemble des animaux (138 souris) sera fixé, 61 jours après la lésion pour ceux (118 souris) ayant subis une lésion afin de récupérer la moelle épinière et le cerveau. La chirurgie qui permet de fixer les animaux durera 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil
Devenir
L’ensemble des animaux (138 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (61 jours maximum après la lésion de la moelle épinière) afin de procéder au prélévement de la moelle et du cerveau. Les souris ayant subis des lésions médullaires ne peuvent faire l’objet d’un don ou bien d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer l’inflammation et la neurogenèse hippocampique, ainsi que la récupération fonctionnelle de l’animal suite à une lésion de moelle épinière après un traitement par stimulation magnétique répétitive.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir des études précédentes effectuées dans notre Laboratoire, à savoir que les expériences histologiques et de RT-qPCR nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux et les expériences fonctionnelles nécessitent un minimum de 12 à 15 animaux. Des tests statistiques non paramétriques de type Mann Whitney seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe. L'utilisation de 10 à 15 animaux pour certaines expériences se justifie par la variabilité pouvant être observée notamment lors des tests fonctionnels (motivation des animaux).
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés après induction gazeuse sans contention. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur est rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés (myorelaxant/anesthésie/analgésie). Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse aux mécanismes cellulaires et moléculaires présents dans la moelle épinière et le cerveau adulte. Une meilleure compréhension de ces mécanismes permettrait de pouvoir proposer des thérapies plus efficaces aux personnes souffrant de paraplégie ou de tétraplégie. Il nécessite la mise en place de modèles comparables aux pathologies humaines. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de modèles animaux. Les lésions médullaires chez l’Homme concerne le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.