Souris

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire une ataxie cérébelleuse humaine, elles subissent un génotypage puis des tests comportementaux répétés, dont un passage dans un bassin de nage à 27 degrés, pour évaluer un composé pharmacologique avant et après l'apparition des symptômes. Le porteur indique une fatigue musculaire de courte durée et un stress liés aux tests, et suit les animaux sur plusieurs mois avant une mise à mort pour prélèvement de tissus. Il affirme que sa lignée avec délétion du gène est le "seul" modèle animal reproduisant la maladie.

Objectifs

Ce projet vise à étudier une ataxie cérébelleuse d’origine génétique qui se manifeste chez les patients par une ataxie cérébelleuse avec une évolution lente et progressive pouvant être associée à une intolérance à l’exercice, un retard mental faible à modéré, des crises d’épilepsie et des pseudo-épisodes vasculaires cérébraux. Le laboratoire a developpé un modèle de souris avec délétion totale du gène qui reproduit la pathologie humaine. Ainsi, l’objectif de ce projet est de tester sur ce modèle l’efficacité d’un composé pharmacologique dans deux approches pré- et post-symptomatiques.

Bénéfices attendus

Le bénéfice de ce projet est de mettre en place des essais pré-cliniques qui, s’ils s’avèrent concluants, déboucheront sur un transfert de ces essais vers la clinique dans le but de traiter les patients atteints de cette ataxie dégénérative.

Procédures

Ce projet comprend : - Une étape d’identification et génotypage des animaux qui aura lieu une fois entre l’âge de 2 et 3 semaines. - Une étape incluant des tests comportementaux sera réalisée sur les animaux vigiles. La durée de ces tests est comprise entre 30 secondes et 5 minutes.

Impact sur les animaux

Procédure avec degré de gravité modérée : Les animaux peuvent avoir une fatigue musculaire de courte période, seront mouillées après passage dans un bassin de nage à 27°C. Pourront avoir un stress lié aux tests comportementaux.

Devenir

Dans ce projet, les animaux qui seront etudiés à différents âges seront replacés dans leur cage entre chaque série de tests afin d’assurer l’étude longitudinale sur un même lot d’animaux. A la toute fin des études, les animaux seront mis à mort pour prelevement de tissus.

Remplacement

En parallèle de la création d’un modèle animal de la maladie, les alternatives non-animales (in vitro) ont été utilisées en première intention par notre équipe pour étudier les mécanismes pathologiques. Nous venons de démontrer l’efficacité du traitement proposé dans ce projet à l’aide d’une autre approche in vitro. Ces approches ne peuvent remplacer l’utilisation d’animaux et l’appréciation globale du bénéfice du traitement chez le modèle animal de la maladie car ce n'est que le reflet d'un seul type cellulaire, or la maladie impacte plusieurs organes (cervelet, muscles). La création du modèle animal et son étude in vivo permettra de définir les conditions optimales de transfert du traitement chez le malade. La souris avec délétion du gène que nous avons développé est le seul modèle animal reproduisant la maladie et permettant d’apprécier l’efficacité de traitements pharmacologiques.

Réduction

Toutes les procédures sont conçues pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, tout en tenant compte du nombre minimum nécessaire pour appliquer les tests statistiques adaptés. Les travaux de notre équipe et les données préliminaires nous permettent d’estimer le nombre de souris pour avoir une valeur statistique suffisante (10 souris par condition pour les différentes analyses). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, autant que possible, nous effectuerons une étude sur un même lot d’animaux à différents âges et les mêmes animaux seront utilisés pour réaliser les différentes analyses.

Raffinement

Les animaux seront maintenus dans les conditions standard d’hébergement et l’environnement sera enrichi (igloo polycarbonate, rouleau de cellulose,...). Tout au long des procédures, un suivi régulier des animaux sera réalisé (une à deux fois par semaine). Il nous permettra de s’assurer du bon vieillissement des animaux au fil des mois. Ce suivi est basé sur la mise en place de points limites et méthodes de prise en charge d’éventuel stress et douleur spécifiques à notre projet. Certains prélèvements impliquent une mise à mort sous anesthésie générale et une fixation des tissus.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et la génétique sont bien connues. Les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des souris génétiquement modifiée est liée à l'absence de modèle mammifère naturel correspondant à la maladie humaine. Par ailleurs, nos données de l’étude du modèle murin avec délétion totale du gène montrent que ce modèle reproduit les caractéristiques pathologiques necessaires pour tester des solutions thérapeutiques. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration pré-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 1 mois à l’âge de 6 mois. Les souris étudiées dans le cadre d’une administration post-symtomatique de l’agent pharmacologique seront étudiées de l’âge de 4 mois à l’âge de 14 mois.

1 440 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection dans l'œil ou dans le cœur d'un vecteur viral, puis subissent jusqu'à six examens de la vue sous anesthésie répétée, dont fond d'œil, tests optocinétiques, tomographie et électrorétinogrammes, pour tester des thérapies géniques contre des dégénérescences de la rétine. Le porteur indique que les injections peuvent provoquer des décollements de rétine et des hémorragies oculaires, et que les anesthésies répétées exposent à l'hypothermie. Il affirme que l'étude du système visuel ne peut se faire que chez l'animal, faute de méthode de modélisation.

Objectifs

La perte de la vue représente un handicap majeur pour les personnes qui en sont atteintes. Afin que ces personnes puissent rester complètement autonomes, il apparaît essentiel de trouver des thérapeutiques efficaces pour ralentir l’évolution d’une perte visuelle ou de la restaurer chez les personnes l’ayant perdue. Notre objectif est de combattre les maladies dégénératives de la rétine en utilisant des thérapies géniques vectorisées par des virus adéno-associés (virus non pathogènes, non immunogènes et qui permettent un transfert efficace de gène dans les cellules). L’efficacité des différentes thérapies testées sera évaluée sur la structure anatomique de la rétine par tomographie à cohérence optique, sur l’acuité visuelle des animaux par des tests optocinétiques et sur la fonction rétinienne par des électrorétinogrammes, à différents points dans le temps, dans différents modèles de souris de dégénérescence rétinienne.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre en avant la preuve de concept d’efficacité d’une ou plusieurs thérapies géniques dans des modèles de souris de rétinite pigmentaire. Le bénéfice attendu est à terme d’amener en clinique cette/ces thérapies géniques pour des maladies dégénératives de la rétine.

Procédures

- Injection intraoculaire : les animaux recevront une injection intraoculaire (une seule par œil) de la thérapeutique à évaluer. L’injection est rapide (5 à 10 minutes) et sera réalisée sous anesthésie générale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intraoculaire de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intracardiaque. - Injection intracardiaque : les animaux recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à évaluer. L’injection est très rapide (30 secondes) et sera réalisée sous anesthésie locale. Les souris ne passeront qu’une seule fois par cette étape expérimentale. Les souris qui recevront une injection intracardiaque de la thérapeutique à tester ne recevront pas d’injection intraoculaire. - Fond d’œil : suite à l’injection de la thérapeutique, le fond d’œil des animaux sera visualisé pour contrôler la qualité de l’injection réalisée. La procédure est rapide (5 minutes) et sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé 1 à 3 fois selon les conditions expérimentales. - Test optocinétique : ce test permet d’estimer la fonction visuelle in vivo. L’acquisition d’images dure environ 10 minutes par animal et sera réalisée sur animal vigile. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Tomographie à cohérence optique : ce test permet de visualiser la structure anatomique de la rétine (différentes couches de cellules). L’acquisition d’images dure environ 5-10 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie gazeuse Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Electrorétinogramme : ce test permet d’évaluer la fonction de la rétine (capacité des cellules de la rétine à répondre à un stimulus lumineux). L’analyse dure environ 30 minutes par animal et sera réalisée sous anesthésie générale. Tous les animaux de l’étude seront soumis à cet examen qui sera réalisé au maximum 6 fois par animal entre l’âge de 35 à 150 jours. - Euthanasie par des méthodes réglementaires en vue de prélèvements : en fin de procédure expérimentale, les souris seront euthanasiées pour collecter des échantillons pour des analyses microscopiques des tissus et des analyses biochimiques ultérieures.

Impact sur les animaux

Les injections sous-rétiniennes peuvent provoquer des lésions temporaires comme des décollements localisés de la rétine et de petites hémorragies oculaires. Les injections intrapéritonéales, sous-cutanées et intracardiaques peuvent induire une douleur ponctuelle réversible. La majorité des gestes expérimentaux auxquels seront soumises les souris seront réalisés sous anesthésie induisant une répétition des anesthésies. L’anesthésie peut provoquer une hypothermie chez la souris qui est la première complication et cause de mortalité lors d’anesthésie de rongeurs. Un léger stress peut être engendré lors du changement d’environnement des animaux (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme) et lors des tests confinés d’optocinétiques.

Devenir

Tous les animaux de l’étude (1440) seront euthanasiés à la fin des procédures afin de collecter des échantillons pour des analyses histologiques et biochimiques post-mortem

Remplacement

Nous étudions dans ce projet le fonctionnement du système visuel après un traitement thérapeutique à plusieurs niveaux. Ceci ne peut être étudié que chez l’animal puisque le fonctionnement du système visuel doit être intact. Il n'existe pas de méthodes alternatives par modélisation.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés (1440 souris) sera toujours limité au minimum nécessaire pour fournir des données biologiquement et statistiquement significatives. Les tests statistiques réalisés seront adaptés aux échantillons de petite taille afin de limiter le nombre d’animaux par groupe (12 souris par groupe). Ce nombre de 12 souris par groupe est basé sur des études antérieures du laboratoire utilisant des techniques similaires. Plusieurs tissus seront prélevés sur toutes les souris utilisées dans ce projet afin de collecter un maximum d’échantillons et d’éviter de relancer des expérimentations additionnelles.

Raffinement

- Les animaux seront examinés quotidiennement par le personnel qualifié de l’animalerie et/ou les utilisateurs et seront hébergés dans les conditions conformes à la réglementation. - Les animaux seront hébergés dans des cages de stabulation avec enrichissement (tunnel en carton, coton), alimentation et abreuvement à volonté. - Une anesthésie courte gazeuse, permettant un réveil rapide de l’animal, sera privilégiée quand les procédures le permettent. Les animaux bénéficieront d’une anesthésie générale gazeuse pour les procédures courtes (injection intraoculaire, imagerie), et d’une anesthésie générale par injection d'anesthésiants pour les procédures plus longues (électrorétinogrammes). Une anesthésie locale de la cornée sera réalisée pour les injections intraoculaires et les électrorétinogrammes. Un gel hydratant sera utilisé pour protéger la surface cornéenne pendant les procédures. L’anesthésie pouvant provoquer une hypothermie, les souris seront placées sur un tapis chauffant durant toute la durée de l’anesthésie et en chambre thermostatée jusqu’à leur complet réveil. - Une nouvelle aiguille sera utilisée pour chaque animal pour limiter la douleur induite lors d’injections intraoculaires/intracardiaques/intrapéritonéales (dans la cavité abdominale)/sous-cutanées. - Application d'une pommade anti-inflammatoire et antibactérienne en post-injection intraoculaire et à la fin des électrorétinogrammes. - Un temps de repos minimal de 24h sera réalisé entre une anesthésie gazeuse et une anesthésiepar injection d'anesthésiants et de 7 jours entre deux anesthésies par injection d'anesthésiants. - Pour limiter le stress des animaux lors du changement d’environnement (mise en chambre noire la veille de l’électrorétinogramme), les souris resteront dans leur cage habituelle d’hébergement, avec leurs congénères et l’enrichissement habituel (tunnel en carton et coton), ainsi que nourriture et eau à volonté. - Une signalétique particulière des animaux en expérimentation est utilisée. Elle permettra une surveillance adaptée des animaux en fonction des points limites définis à chaque procédure afin de s’assurer de leur bien-être. - Des critères d’arrêt ou points limites ont été déterminés pour chaque étape de la procédure expérimentale. - Les animaux provenant de l’extérieur observeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum.

Choix des espèces

Cette étude sera réalisée sur des modèles de souris car il existe différents modèles génétiques de rétinopathie proches du phénotype humain. Nous utiliserons plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ayant des mutations différentes et une vitesse de dégénérescence rétinienne différente, pour modéliser la variabilité observée chez les patients. L’âge auquel les animaux entreront dans la procédure dépendra du phénotype et de la stratégie utilisée (selon si nous voulons injecter avant ou après que la dégénérescence rétinienne ait commencée). Les souris seront donc injectées soit au stade « nouveau-né » (entre 2 et 4 jours de vie, avant le développement définitif de la barrière hémato-rétinienne), soit à l’âge de 15 jours (avant que la dégénérescence des photorécepteurs ne soit trop avancée), soit à l’âge de 5 ou 8 semaines (lorsque la dégénérescence des photorécepteurs est quasiment complète).

322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime appauvri en fibres et pro-inflammatoire, des gavages répétés et des prises de sang, et 40 % d'entre elles absorbent un produit induisant une inflammation intestinale pendant sept jours, cinq fois de suite. Le porteur indique attendre une perte de poids de 5 à 10 % et des diarrhées durant les phases inflammatoires, et héberge les souris seules pour éviter la coprophagie. Il justifie le recours à l'animal par l'impossibilité de modéliser in vitro la rupture de la symbiose entre l'hôte et son microbiote.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles, dont maladies inflammatoires chroniques intestinales, obésité, diabète…, ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à notre environnement (microbiote, régime alimentaire). Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins des êtres vivants. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres au sein du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Récemment il a été montré que ce déséquilibre résulte d’une altération de la symbiose hôte-microbiote, elle-même caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Nos travaux suggèrent que ce déséquilibre résulte d’une rupture du dialogue microbiote-hôte due à des signaux inducteurs inflammatoires. Ce déséquilibre, récurrent dans différentes maladies chroniques, a été décrit chez l’animal et l’humain. Il se caractérise souvent par une diminution qualitative du microbiote. L’objectif de notre projet est d’étudier la mise en place d’une rupture de symbiose microbiote-hôte occasionnée par un stress inflammatoire chronique chez l’animal et d’évaluer les conséquences de cette rupture sur le vieillissement des animaux et leur descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’humain et permettront d’identifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques inflammatoires intestinales.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée. Dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales, une perturbation du microbiote intestinal est souvent associée à une dérégulation de l’état de santé chez l’humain. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance de cette perturbation conduit souvent à une succession de phases aigües de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte dans le cadre des maladies inflammatoires chroniques intestinales et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et inducteur d’inflammation susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Tous les animaux adultes recevront une solution par gavage au minimum 4 fois et au maximum 8 fois durant la procédure. Le temps de gavage contention comprise est de 5 à 10 secondes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 2 et au maximum 4 prises de sang à la queue de 40 µL. Le temps de collecte est de 2 à 3 minutes maximum. Tous les animaux adultes auront au minimum 1 et au maximum 2 prises de sang à la joue de 200 µL. Le temps de collecte contention comprise est de 30 seconde à 1 minute maximum. Les fèces de tous les animaux adultes seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne ou hebdomadaire en fonction des différentes périodes établies dans les procédures. Les animaux seront placés dans un pot de collecte 5 min maximum. 40% des animaux adultes recevrons dans l’eau de boisson un produit induisant l’inflammation de l’intestin durant sept jours consécutifs répéter 5 fois avec une semaine de récupération entre chaque prise.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle, entrainant un stress modéré, afin d’éviter des contaminations croisées de microbiote par coprophagie. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur prise de poids et soient sujets à des diarrhées pendant les phases inflammatoires aigues. Des prises de sang engendrant un léger stress de très courte durée seront réalisées et les animaux seront également gavés oralement avec des solutions permettant d’évaluer respectivement le temps de transit et la perméabilité intestinale. Ces protocoles constitueront un stress modéré notamment dû à la contention. Des signes de douleurs intestinales (diarrhée) sont attendus pendant les phases inflammatoires.

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser in vitro ou in silico la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte. En effet, comprendre et caractériser l'évolution de la symbiose microbiote-hôte nécessite la mise en place d'intéractions bidirectionnelles complexes entre l'hôte et son microbiote. Ces intéractions sont difficilement controlables et pertinentes dans des modèles in vitro actuel de type microbiote/organoïde, notamment sur des temps longs tels que ceux décrient dans notre projet, ou nous ciblons particulièrement les périodes post stress et plus particulièrement la résilience ou non de la symbiose.

Réduction

D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 134 animaux pour le groupe contrôle et 188 animaux pour le groupe expérimental sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux, leur comportement et leur prise de poids.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies inflammatoires chroniques intestinales en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

7 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'antigènes, parfois adjuvés, et subissent des prélèvements sanguins répétés jusqu'à quatre par jour, pour environ cinquante études d'immunisation par an. Le prélèvement final, mortel, récupère un volume important de sang. Le porteur affirme qu'une immunisation in vivo reste "nécessaire" dans certains cas et indique avoir réduit d'environ 20 % le nombre d'animaux par rapport au projet précédent.

Objectifs

L’objectif des protocoles d’immunisations sont utilisés à des fins scientifiques et médicales. Les applications pour leur utilisation peuvent être diverses comme par exemple : Fabrication de tests de diagnostic permettant la détection de maladies en médecine humaine, Préparation de médicaments pour usage en médecine humaine (médicaments biologiques), Applications diverses en recherche et développement.

Bénéfices attendus

Ces études d’immunisation sont utilisées à des fins scientifiques et médicales. Ces études sont bénéfiques pour les patients à court terme (e.g. fabrication de tests de diagnostic de type ELISA) et à moyen/long terme (eg. Phase de recherche et développement pour la mise à disposition de médicaments biologiques). Réalisation d’environ 50 études par an d’immunisation avec une moyenne de 30 animaux par étude.

Procédures

Tous les animaux rentrant dans une étude d’immunisation peuvent être soumis à des injections d’antigène et des prélèvements sanguins répétés. Concernant les injections, les volumes maximum sont de 0.5 mL / site (4 sites maximum) pour la voie sous-cutanée, 0.05mL/site (2 sites maximum) pour la voie intra-musculaire, 0.2mL pour la voie intraveineuse, 1mL pour la voie intra péritonéale. Une injection de dose solide est également possible (diamètre de la seringue maximal 1.4mm). - Temps minimum entre deux injections : 1 semaine sur des sites différents (sauf intraveineuse : 1 jour), à condition qu’aucune réaction anormale n’ait été observée sur l’animal. La durée d’injection est d’une dizaine de secondes à 5 minutes selon la voie. Le nombre d’injections dépend de la voie d’injection et du protocole du scientifique. Concernant les prélèvements (durée maximum 5 minutes), les animaux peuvent être soumis à des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements par jour). Une pesée hebdomadaire d’une durée inférieure à 5 minutes est réalisée jusqu’à une fois par jour selon le protocole et l’état clinique de l’animal.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances pour les animaux utilisés dans le cadre de ces études sont : Douleur, stress, perte de poids et inflammation localisée au site d’injection liés à des injections répétées d’antigènes (+/- adjuvés), Douleur, stress, perte de poids et saignements et/ou inflammations localisés aux sites de prélèvements liés aux prélèvements sanguins répétés, La contention de l’animal d’une manière générale qui peut amener à du stress chez l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés en fin de procédure. Lors du prélevement final un volume significatif de sang est récupéré.

Remplacement

La production d’anticorps par méthode in-vitro exclusive comporte des avantages mais dans certains cas (exemples :besoin de concentration en anticorps élevée, glucosylation appropriée, affinité des anticorps spécifique…), une immunisation de type in-vivo reste encore nécessaire de nos jours. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Réduction

A travers les années d’expertises gagnées par l’établissement utilisateur, il n’est pas nécessaire de commander plus d’animaux que demandés par le scientifique pour réaliser le projet. Si une exception à cela devait avoir lieu, une revue par les membres de la SBEA serait nécessaire avant d’initier le projet. Avec l’expérience acquise, le nombre d’animaux prévu dans ce projet est diminué de l’ordre de 20% par rapport au projet précédant. Pour démarrer une étude d’immunisation, le scientifique doit préalablement s’engager à ce que celle-ci-ci soit conforme aux 3R. De plus cet engagement sera écrit et vérifié par l’Etablissement utilisateur en charge de cette étude.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux, avec différents enrichissements dans leurs cages (e.g. tunnel, nidification…) . Elles sont observées chaque jour par du personnel formé et compétent et des points limites sont mis en place. Les techniciens animaliers sont encouragés à favoriser la manipulation sans stress des animaux (contention avec la technique de la cuillère ou utilisation de tunnels). Des signes cliniques spécifiques aux protocoles d’immunisation sont reconnus et appliqués comme points limites intermédiaires - entraînant une surveillance accrue avec mise en place de raffinements et traitements – et points limites terminaux - entraînant la mise à mort immédiate de l’animal. Avant les injections intra-veineuses les souris sont positionnées dans une enceinte chauffante à 38°C pendant 10 minutes pour faciliter l’injection intra-veineuse. En cas de prélèvements sanguins, les volumes prélevés ainsi que les périodes de récupération suivront la réglementation, les recommandations de la «Federation of European Laboratory Animal Science Associations » (FELASA) ainsi que les raffinements et bonnes pratiques internes. Les injections et prélèvements ne pourront être réalisés que sur des sites sans hématome ni inflammation apparente, en utilisant des aiguilles stériles adaptées (à la taille de l’animal et à la voie d’abord) et à usage unique Également après prélèvement intermédiaire de sang supérieur à 250μL, une injection est effectuée en sous cutané pour réhydrater l’animal (minimum 40ml/kg). Un anesthésiant local est appliqué en amont de l’injection d’une dose solide (15/30 minutes avant l’injection).

Choix des espèces

La souris est une espèce adaptée pour les études d’immunisation étant donné la qualité du sérum produit et elle répond donc aux demandes des scientifiques. L’âge minimal des souris à J0 est de 8 semaines. A cet age, les souris ont un système immunitaire permettant la réalisation des études de type immunisation.

342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales à la patte, jusqu'à treize séances d'imagerie sous anesthésie et des injections répétées de molécules, pour tester des candidats médicaments contre l'ostéosarcome de l'enfant. Le porteur affirme que le développement tumoral ne génère pas de douleur apparente, tout en prévoyant une surveillance trois fois par semaine et des points limites précoces. Les retombées cliniques annoncées restent renvoyées à un futur transfert vers la clinique, l'objectif immédiat étant de valider l'effet antitumoral chez la souris.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, l’ostéosarcome (OS) est un cancer rare qui touche 3.4 cas par million d’habitants/an. Ces tumeurs d’origine osseuse se développent dans diverses localisations comme au niveau des os long (tibia, fémur), épaule ou encore au niveau de la mâchoire. La survie à 5 ans des patients est d’environ 75% alors qu’elle est inférieure à 27% chez les patients dont la maladie s’est propagée à d’autres parties du corps (métastases). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. De nouvelles molécules ciblant les cellules immunitaires ont été identifiées, dont leur rôle va être de rétablir le système immunitaire afin de combattre la tumeur. Il faut donc démontrer que ces molécules possèdent des caractéristiques de candidats médicaments antitumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale de l’ostéosarcome chez l’enfant, les adolescents et jeunes adultes. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité antitumorale de ces molécules c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume de ces tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (ostéosarcome) en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte gauche avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) 13x max (entre 5 et 13 selon la procédure) pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 2 jours/7 pendant 5 semaines maximum ou 3jours/7 injection des molécules pendant 3 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (2x/semaine) pendant 90 jours maximum (de 35 à 90 jours selon les procédures)

Impact sur les animaux

La toxicité des molécules a été évaluée précédemment et n’a pas montré de toxicité aux doses que nous allons utiliser. La greffe de cellules tumorales ne génère pas de douleur, de plus quand cela est compatible l'animal est anesthésié et reçoit un antalgique. Le développement tumoral ne génère pas de signes de douleur apparente, ni de problème de locomotion. Par conséquent, les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Toutefois les animaux sont surveillés 3x/semaine pour prévenir et détecter tout mal être animal. Lors du traitement pharmacologique, un cadran sera défini et les zones d'injection seront alternées (gauche-droite-haut-bas) pour le bien-être animal. Ce protocole d'administration a déjà été mis en œuvre et il n'a pas été observé de souffrance particulière. Le développement de métastases pourrait entrainer une difficulté respiratoire, des douleurs abdominales à la palpation (foie), un envahissement de plusieurs organes altérant leur fonction qui seront détectés par imagerie (1x/semaine).

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort.

Remplacement

Pour le remplacement, les traitements à évaluer ont déjà démontré des résultats prometteurs in vitro sur de nombreux tests comme des évaluations à partir de cellules de sang humain frais ou de tumeurs isolées de patients. Les modèles tumoraux chez la souris nous permettent de valider l’effet thérapeutique de nos traitements à l’échelle d’un organisme, ainsi que d’évaluer leur potentiel effet toxique avant d’envisager un essai clinique.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. De plus, pour chaque modèle tumoral orthotopique, la progression de la tumeur sera suivie par imagerie par bioluminescence. Cette approche non invasive et quantitative nous permet de suivre la progression de la maladie et de décider de la mise à mort des souris avant même l’apparition de symptôme critique. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Nous avons généré une lignée cellulaire qui émet de la lumière afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 souris par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe au niveau de la patte, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L’utilisation des souris a un âge un peu plus précoce, nous permettra d’avoir une meilleure reproduction du système immunitaire et des hormones retrouvés chez les patients pédiatriques. Nous avons déjà démontré qu’à des âges plus précoce la prise de greffe reste fiable et donne de résultats clairs afin d’analyser l’efficacité de nouveaux traitements. De plus l’utilisation de souris nous permettra de réellement étudier le rôle de notre protéine d’intérêt dans le développement tumoral. Nous avons également l’avantage de posséder des souris génétiquement modifiées rendant possible l’utilisation d’un anticorps humain permettant alors un rapprochement entre le pré-clinique et clinique plus robuste.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur injecte, éveillées, des cellules tumorales puis quatre administrations d'un traitement directement dans la tumeur, avant prélèvement d'une quinzaine d'organes pour étudier la toxicité et le cheminement d'une thérapie anticancéreuse. Le porteur attend une gêne au déplacement liée à la tumeur et une perte de poids pouvant approcher vingt pour cent, et situe les bénéfices pour les patients à moyen terme et au conditionnel. Sur le remplacement, il indique recourir à des organoïdes et des modèles bio-imprimés, mais conclut que la toxicité ne peut être évaluée que dans un "organisme complet".

Objectifs

Les cellules dendritiques sont des cellules spécialisées dans la reconnaissance de tout ce qui n'appartient pas à notre organisme : le non-soi et sont capables de le présenter aux cellules du système immunitaire pour l'éliminer. Le porteur de projet a identifié une stratégie capable de transformer des cellules cancéreuses en ces cellules dendritiques. Elles sont alors capables de prévenir le système immunitaire, ce qui provoque une réponse immunitaire contre la tumeur dans le but de l'éliminer. De part cette capacité à réveiller et armer le système immunitaire contre une tumeur, ces cellules représentent un outil thérapeutique prometteur dans le traitement du cancer. Le but ici est de caractériser la toxicité de cette thérapie et de connaître son cheminement dans l'organisme une fois celui-ci injecté : les tissus ou organes par lesquelles il va passer avant d'être éliminé, tout cela chez la souris saines et chez la souris atteinte de cancer.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de développer et de caractériser en phase préclinique une approche thérapeutique anticancéreuse très innovante, sur un large panel d’indications oncologiques. Cette approche thérapeutique permettra au mieux de guérir les patients atteints de cancer, sinon de ralentir la progression tumorale. La thérapie étudiée devra encore passer par une phase préclinique règlementaire avant une première administration chez l’Homme.

Procédures

Les animaux seront soumis vigiles, une fois à une injection de cellules tumorales puis une à deux semaines après, selon le temps de pousse des tumeurs, à quatre injections de traitement à deux jours d'intervalle. Les groupes sains sans injection de cellules tumorales débutent le traitement en même temps que les groupes avec tumeurs. L'administration du traitement se fera en intratumoral pour les groupes avec tumeur et en sous-cutanée pour ceux sans tumeur. Les injections durent pour chaque souris quelques secondes.

Impact sur les animaux

1/Nuisances attendues : -Injection sous-cutanée de cellules : douleur à la piqûre et à l’injection ; durée de quelques secondes - Croissance d’une tumeur sur le flanc : gêne cutanée, gêne au déplacement ; durée maximum 25 jours. -injections en sous cutané ou en intratumoral : douleur de la piqûre ; 5 secondes. 2/Nuisances potentielles : -perte de poids de moins de 20% du poids maximal : 4 jours maximum -inflammation de la surface de la tumeur : douleur cutanée, démangeaisons ; maximum 48h - réaction au traitement : irritation, rougeur

Devenir

A différents temps au cours des études : 24 heures et 7 jours après la dernière injection de traitement pour les animaux avec tumeur et 24 heures, 7 jours et 30 jours après pour les animaux sans tumeur, 6 individus par groupes seront prélevés en terminal. A l'issu du dernier temps de prélèvement, ce sera la fin des études, tous les animaux auront été mis à mort. Lorsque les souris seront mises à mort, les organes et échantillons suivants seront prélevés : sang, urine, tumeur, foie, rate, poumons, reins, cerveau, cœur, gonades, glandes surrénales, moelle osseuse, moelle épinière, thymus et nœud lymphatique, pour de la quantification biochimique dans l'étude de biodistribution et pour de la quantification histologique pour l'étude de toxicologie.

Remplacement

Les interactions entre le système immunitaire et la tumeur sont complexes et impactées par différents organes lymphoïdes (la rate, les ganglions etc), ainsi que par différents paramètres de la tumeur (structure cellulaire, rigidité etc). Certaines caractéristiques individuelles seront étudiées in vitro/ex vivo (modèles organoïdes, modèles bio-imprimés), la toxicité et la biodisponibilité ne peuvent être pleinement évalués que dans un organisme complet.

Réduction

Pour le modèle de cancer de la vessie, les études de toxicologie et de biodistribution seront faites sur le nombre minimal de souris nécessaires permettant de conclure de façon fiable statistiquement avec le test statistique approprié, à savoir 12 ou 18 souris par groupe thérapeutique, pour un total de 16 groupes. Parmi ces 16 groupes thérapeutiques, 8 seront testés sur un modèle tumoral très bien connu et représentatif d’un cancer à fort besoin thérapeutique et 8 autres sur des souris saines sans tumeur pour s'affranchir d'un effet induit par la tumeur. Dans notre expérience, les effectifs de 12 ou 18 souris par groupe permettent de caractériser avec les tests statistiques adéquats des différences significatives. Le modèle tumoral utilisé a été préalablement testé in vitro pour sa bonne réponse à la thérapie étudiée. Pour chaque groupe thérapeutique, différents organes et échantillons seront analysés post-mortem sur 6 souris indépendantes à deux ou trois temps différents pour connaître les effets et le cheminement du porduit au cours du temps : le site d’injection, foie, rate, poumons, reins, cerveau, cœur, gonades, glande surrénale, moelle épinière, nœud lymphatique, thymus, moelle osseuse, sang et urine).

Raffinement

Pendant 7 jours avant la mise en place du protocole les souris seront acclimatées aux expérimentateurs du projet afin de limiter leur stress. Toutes les précautions seront prises pour détecter et minimiser la souffrance, la douleur et le stress des animaux (observation quotidienne, pesée des animaux, traitement antalgique si besoin). Les animaux auront accès à de la nourriture humide en cas de perte de poids légère. Des prélèvements en point final (tumeurs, organes et échantillons) seront réalisés pour pouvoir obtenir le maximum d’informations des animaux utilisés.

Choix des espèces

Nous avons besoin d’animaux présentant un système immunitaire compétent, et d’un modèle tumoral de souris. La souris immunocompétente est un modèle de choix pour ce type d’étude car il existe un large panel de tumeurs de souris représentatives de différentes indications oncologiques, ce qui n’est pas le cas chez les autres espèces de rongeurs de laboratoire. Par rapport aux rats, la souris permet également d’utiliser moins de composés pour obtenir une dose/poids. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser la prise tumorale.