Souris

624 souris immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Greffées de cellules de cancers pédiatriques qui forment des métastases au foie, elles reçoivent jusqu'à sept injections d'anticorps testés et des prélèvements de sang sous anesthésie, avant d'être tuées pour évaluer l'efficacité thérapeutique. Le porteur indique que les effets indésirables liés à la croissance tumorale touchent surtout les groupes témoins non traités. Il décrit un test in vitro concluant sur ces anticorps mais présente le modèle animal comme "indispensable et non substituable" avant les essais chez l'enfant.

Objectifs

Les objectifs du projet sont d’évaluer l’efficacité et la sécurité d’anticorps thérapeutiques ou des anticorps bispécifiques correspondants dans un modèle de souris greffées avec des cellules de cancers pédiatriques. Cette possibilité de combiner les anticorps ouvre la voie à de nouveaux traitements permettant une réponse thérapeutique et des rémissions plus importantes chez les patients. Les versions chimériques (=construit pour être toléré par la souris) de ces anticorps ont déjà été testés lors de précédents projets dans un modèle de souris (immunocompétentes) optimisé et ont prouvé leur efficacité et leur bonne tolérance dans ce modèle. Dans ce projet, nous allons utiliser un modèle de souris immunodéficientes afin de tester les versions humanisées (=construit pour être administré chez l'Homme) de ces anticorps thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le meilleur anticorps thérapeutique sera sélectionné et développé pour des essais cliniques. Ces nouvelles biothérapies (anticorps humanisés, anticorps bispécifiques) sont plus efficaces en termes de réponse thérapeutique et plus respectueuses de la qualité de vie.

Procédures

Mesure de la masse corporelle sur animal vigile (10 pesées, 1 minute maximum chacune, soit 10 minutes au total). Injection intraveineuse sur animal vigile (7 injections maximum, 3 minutes maximum chacune, temps de mise en boîte de contention + injection, soit 21 minutes au total). Prélèvement de sang sur animal anesthésié (4 prélèvements maximum, 2 minutes maximum chacun + prélèvement, soit 8 minutes au total).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont : premièrement le stress et la douleur liée à la manipulation (traitements, prélèvements de sang et pesées) et la contention des souris lors de l’administration des traitements (injections intraveineuse) Deuxièmement, l’injection de cellules tumorales conduit à la formation de métastases hépatiques, et des effets indésirables peuvent apparaître chez les animaux en fin d’expérimentation notamment sur les groupes témoins non traités par les anticorps (au fur et à mesure de la croissance des tumeurs métastatiques). Ces effets indésirables sont pris en compte dans l’annexe 1 attachée à cette demande de projet.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés afin de permettre la réalisation de prélèvements pour évaluer l’efficacité thérapeutique des anticorps et de réaliser également des analyses complémentaires.

Remplacement

Il existe à ce jour un test in vitro nommé ADCC (Test de cytotoxicité à méditation cellulaire) qui permet de contrôler que l’anticorps peut reconnaitre et lier la cellule cancéreuse cible et provoquer sa destruction via des cellules effectrices. Nous avons réalisé ces tests sur les candidats anticorps humanisés notifiés dans cette saisine et les résultats se sont avérés probants. Cette étude donc nécessite impérativement un tissu tumoral en place dans un système physiologique et pharmacodynamique et comprenant un réseau vasculaire capable de se remodeler à partir de toute cellule de l’organisme. Le modèle animal reste indispensable et non substituable pour de telles études et donc un passage obligé avant de pouvoir commencer les études chez les patients.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés tient compte des contraintes statistiques. De plus, nous conserverons tous les prélèvements de sang, d’organes et tissus pour des analyses ultérieures. L’optimisation du modèle syngénique dans un précédent projet, nous a permis d’optimiser les injections, de prélèvements et d’ainsi de diminuer le nombre d’animaux par groupe

Raffinement

Nous assurerons une surveillance quotidienne des animaux par l’expérimentateur (en plus de celle réalisée quotidiennement par le personnel animalier) et nous fixerons des points limites sévères qui conduiront à la mise à mort des animaux dès leur apparition. Nous assurerons aux souris un hébergement de qualité avec 3 à 5 souris par cage enrichie (frisotis). Concernant les injections (cellules tumorales ou traitements), une application de lidocaïne sera effectuée sur le site d’injection quelques minutes avant injection.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence. Grâce à beaucoup d’études, de nombreux outils cellulaires et moléculaires ont été développés. Chez la souris, la distribution de l’antigène ciblé, l’O-Acétyl GD2 est semblable à celle décrite chez l’Homme : absence d’expression dans les tissus sains et surexpression dans les cancers chez la souris De plus, nous utilisons un modèle de souris sur lequel notre équipe a déjà évalué des traitements à base d’anticorps et pour lequel nous connaissons bien le développement. Les animaux sont âgés de 8 semaines, soit un poids approximatif de 20g au début des expérimentations, ce qui est idéal pour la bonne réalisation des injections intraveineuses (veines caudales bien visibles et suffisamment grosses). De plus, ce choix s’inscrit dans la continuité des études précédentes pour lesquelles des souris de 8 semaines avaient également été utilisées dans des traitements similaires avec d’autres anticorps.

56 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sevrées puis soumises à un régime pauvre en protéines modélisant la malnutrition infantile, elles reçoivent jusqu'à vingt-cinq injections sous-cutanées d'un analogue hormonal, un test de tolérance au glucose par gavage avec prélèvements à la queue, puis une laparotomie pour prélever le sang de la veine porte avant mise à mort. Le porteur affirme que le régime carencé n'induit ni faim ni stress anormal chez les jeunes souris. Il indique qu'aucun modèle in vitro ne reproduit un "organisme entier" en contexte de malnutrition et rattache les retombées à la prise en charge des enfants.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur dans les pays en développement, touchant environ 150 millions d'enfants dans le monde. Des études récentes ont montré que le microbiote des individus mal nourris était sévèrement impacté par l'appauvrissement en nutriments et qu'une intervention probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets positifs sur la santé, au-delà des effets nutritionnels traditionnels) permettait de compenser partiellement le retard de croissance dans le contexte de malnutrition chez un modèle préclinique de rongeur. En plus des retards de croissance classiquement décrits dans le contexte de la malnutrition, un déficit en protéines pendant l'enfance résulte en des déficits neurocognitifs, métaboliques et immunitaires sévères qui persistent à l'âge adulte. Cependant, les altérations métaboliques exactes se produisant en contexte de malnutrition protéique chronique, ainsi que les éventuels bénéfices d’une intervention probiotique dans ces conditions, sont encore mal connus. Des études portant sur les cellules productrices d’hormones de l’intestin (appelées entéroendocrines), ont permis d’identifier une sous-population de cellules particulièrement impactée par la malnutrition protéique juvénile. Le but de ce projet est 1) D’évaluer comment les effets bénéfiques d’une intervention probiotique en contexte de malnutrition sont dépendants de ces cellules et 2) de caractériser plus finement les modifications de la signalisation d’une hormone produite par ces cellules dans un contexte de malnutrition protéique juvénile par rapport à un régime contrôle. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d’un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition et pour l’étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C’est pourquoi cette étude nécessite l’expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s’agit d’un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Bénéfices attendus

Les altérations métaboliques induites pas la malnutrition protéique dans un contexte juvénile sont encore mal connues. Ce projet permettra d’identifier les modifications précises du métabolisme qui surviennent en condition de malnutrition et d’évaluer les potentiels effets positifs d’un traitement avec une bactérie probiotique (micro-organisme vivant qui, lorsqu’il est ingéré en quantité suffisante, exerce des effets bénéfiques pour la santé au-delà des effets nutritionnels classiques). De futures cibles thérapeutiques permettant d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition protéique chronique au travers d’un traitement nutritionnel et probiotique adapté pourront ainsi être identifiées.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime nutritionnel faible en protéine (qui entraîne un retard de croissance modélisant la malnutrition protéique juvénile) ou à un régime contrôle pendant la durée de la procédure, ainsi que, pour certains animaux, à un traitement avec une bactérie probiotique ou un placebo dans le creux de la joue 5 jours sur 7. La moitié des animaux recevra 5 jours par semaine pendant la durée de la procédure une injection sous-cutanée d’un analogue hormonal (soit 25 injections au total). L’autre moitié des animaux recevra, une seule injection sous-cutanée d’un antagoniste de cette même hormone. Un test de tolérance au glucose durant 120 minutes sera réalisé sur les animaux vigiles (voie orale par gavage) et 7 prélèvements sanguins de 2-3 μL (5 prélèvements toutes les 15 minutes puis 2 prélèvements toutes les 30 minutes) et 3 prélèvements de 20 µL post gavage seront réalisés au bout de la queue afin de mesurer respectivement la glycémie ou l’insulinémie au cours du temps. Enfin, un prélèvement de sang dans la veine porte sera réalisé en fin de procédure. Pour cela, 30 minutes après une injection de buprénorphine, les animaux seront anesthésiés avec de la kétamine et de la lidocaïne et une laparotomie sera réalisée. Le prélèvement en veine porte durera deux minutes. L’ensemble des interventions seront réalisées sur 56 animaux femelles appartenant à deux procédures.

Impact sur les animaux

Ces procédures devraient entraîner des nuisances modérées sur les animaux. Le régime pauvre en protéine utilisé dans le cadre de ces procédures a déjà été utilisé et il n’engendre pas de sensation de faim, ni d’agressivité chez les animaux juvéniles. Ce régime vise à modéliser le retard de croissance induit par la malnutrition protéique chronique, il entraîne donc une plus faible croissance en taille et en poids par rapport au régime contrôle pendant la durée de la procédure. Aucune modification de l’activité, ni de stress anormal n’a cependant été détecté chez les animaux nourris avec le régime pauvre en protéine. Pour limiter les effets délétères du régime pauvre en protéine sur les animaux, leur poids sera surveillé de façon régulière et les animaux seront mis à mort si un des points limites est atteint. Leur comportement sera également surveillé de manière quotidienne. Le test de tolérance au glucose implique des prélèvements sanguins au bout de la queue pouvant induire une douleur et un stress. L’injection sous-cutanée peut entraîner un gonflement ou un œdème, dont l’apparition sera surveillée quotidiennement après la procédure. La cicatrisation du bout de la queue sera également surveillée. Pour la procédure impliquant des injections sous-cutanées de sémaglutide : les injections sous-cutanées peuvent induire de l’inflammation, les points d’injection seront surveillés quotidiennement.

Devenir

L'ensemble des femelles ayant subi la procédure expérimentale seront mises à mort à la fin de la procédure. En effet, la mise à mort est nécessaire afin de réaliser des prélèvements de sang et d'organes qui seront analysés par la suite.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition, nécessaire pour l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique pertinente des résultats obtenus, tout en contournant le problème de la variabilité entre individus. Le nombre de 7 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité au vu de nos résultats précédents. Dans une optique de réduction, l'ensemble des organes impliqués dans le métabolisme, mais qui ne seront pas directement utilisés dans le cadre de ce projet, seront conservés au congélateur pour d'éventuelles analyses ultérieures. Le protocole expérimental utilisera des souris issues d’une reproduction chez un fournisseur agréé. Le choix d’utiliser des souris issues d’un fournisseur permettra de mieux contrôler certains paramètres liés à l’âge et à la croissance juvénile afin d’assurer une analyse pertinente et un résultat statistiquement significatif.

Raffinement

Afin de limiter les nuisances sur le bien-être des animaux au cours de cette procédure expérimentale, les animaux seront surveillés de manière quotidienne. La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine afin d’identifier tout signe de souffrance que les animaux pourraient développer en cours d’expérimentation. Les animaux seront identifiés par tatouage (au début de la procédure, sous anesthésie) afin de permettre un suivi individuel de ces paramètres. La prise alimentaire sera également mesurée en pesant la nourriture présente pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. A la suite des injections, l’apparition d’un œdème ou d’un gonflement au point d’injection sous-cutanée ainsi que la bonne cicatrisation du bout de la queue suite aux prélèvements sanguins seront surveillés cinq fois par semaine et pourront donner lieu à l’application locale d’antiseptiques le cas échéant. Des points limites suffisamment prédictifs pour pallier à tout stress et toute souffrance animale seront établis. L’atteinte des points limites entraînerait alors la mise à mort des individus concernés. Le protocole du régime expérimental et l’administration de probiotique, ainsi que le prélèvement en veine porte avant mise à mort ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. Les animaux recevront une analgésie et une antalgie avant le prélèvement en veine porte.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de son microbiote, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin de comparer l'effet d'un probiotique dans un contexte malnutrition. Les animaux seront suivis à partir du 21ème jour post-natal (âge du sevrage et de l'identification par tatouage de la patte), et pendant les 35 jours de traitement post-sevrage (traitement commencé à jour 21 (P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’à jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier la signalisation GLP-1 en condition de malnutrition pendant la période juvénile. Il faut donc utiliser des animaux juvéniles après leur sevrage.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection unique dans la veine de la queue destinée à faire répliquer le virus de l'hépatite D, certaines développant des tumeurs du foie avant d'être tuées pour prélever le foie et le sang. Le porteur affirme que ces tumeurs n'affectent guère l'animal, le foie étant peu innervé, et qu'il les collecte avant qu'elles ne gênent. Il indique avoir mené le maximum d'expériences sur lignées cellulaires et présente le passage in vivo comme nécessaire à l'étude de l'inflammation hépatique.

Objectifs

Le virus de l’Hépatite D (VHD), infecte le foie humain et cause de profondes modifications de l’organe. Une co-infection avec le virus de l’hépatite B (VHB) mène souvent au développement d’une cirrhose puis d’un cancer du foie (carcinome hépatocellulaire). Ce cancer, dont l’incidence est en constante augmentation, constitue la troisième cause de mortalité due au cancer dans le monde, du fait d’un manque de traitement efficace. Bien qu’il existe un vaccin qui protège contre le VHB et VHD, les personnes déjà infectées (environ 20 millions de personnes dans le monde infectées par le VHD) n’ont aucune option thérapeutique. Le but de notre projet est de développer un modèle de réplication du VHD chez la souris afin de : 1- étudier les perturbations du foie liées à la réplication de ce virus, notamment déterminer les perturbations de la cellule infectée par le virus, l’hépatocyte. 2- évaluer dans ce modèle la pathologie causée par des virus de la même famille, découverts récemment dans plusieurs espèces animales (rongeur et serpent pour ce projet).

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’améliorer la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la physiopathologie causé par le virus de l'hépatite D. Ils pourront aussi aider à mieux évaluer les pathologies qui pourraient être causées par les virus de la même famille (retrouvés chez les rongeurs ou les serpents), ce qui n’a jamais été évalué chez l'animal. Finalement, à plus long terme, le développement de ce modèle pré-clinique pourrait contribuer à accélérer le développement d’antiviraux très attendus, qui inhiberaient la réplication de cette famille de virus. Trouver des antiviraux efficaces contre cette famille de virus reste un besoin médical de première importance, sachant qu’aucune molécule actuelle n’arrive à éliminer complètement la réplication du VHD chez les patients infectés.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule injection dans la veine caudale (15 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets sont, pour certains animaux, le développement de tumeurs du foie. Elles se développent sans affecter de manière importante l’animal car nous collectons les tumeurs lorsqu’elles sont encore de taille réduite. De plus, le foie est un tissu peu sensible (peu innervé), et le développement tumoral n’affecte pas le fonctionnement de l’organe. Les animaux sont évalués quotidiennement (avec une grille d’évaluation) pour, si besoin, arrêter l’expérience avant toute apparition de nuisance pour l’animal.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure afin de collecter les foies et du sang pour analyses.

Remplacement

Nous avons effectué le maximum d’expériences sur des lignées cellulaires en testant la réplication des réplicons de différentes espèces, il est désormais nécessaire de réaliser les expériences in vivo, notamment pour l’étude de l’inflammation dans le tissu hépatique. Dès que possible, nous rebasculerons sur les lignées cellulaires pour caractériser les perturbations de la cellule induites par la réplication virale.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé avec notre service de statistiques afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, tout en conservant une taille pertinente pour répondre à notre hypothèse biologique. Nous avons calculé avec le service de statistiques de notre institut que le nombre minimal d’animaux par groupe doit être de 10. Nous nous sommes limités aux expériences indispensables, notamment en réduisant le nombre de points analysés après l'injection.

Raffinement

Nous avons planifié rigoureusement (notamment en suivant les recommandations européennes) et optimisé les procédures expérimentales afin de minimiser les contraintes pour les animaux. Les expériences précédentes montrent que les procédures expérimentales proposées préservent le bien-être animal. Une grille de score a été mise en place pour l’observation quotidienne des animaux afin de d’euthanasier les animaux et collecter les foies avant le développement éventuel de gêne liée à la présence de tumeurs.

Choix des espèces

La souris est l'espèce animale de choix pour l'étude des cancers du foie et de la physiologie hépatique. Le modèle proposé est le plus proche de la maladie humaine, permettant d’analyser les premières étapes du développement de tumeurs. La souris est également un modèle d’étude classique pour tester de nouveaux médicaments dans les cancers. Ces approches sont soutenues par de nombreuses publications scientifiques dans des revues internationales, et ont conduit à de nombreux essais cliniques chez l’homme, et, au final, à l’approbation de nouveaux traitements. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (7-8 semaines). Nous voulons modéliser au mieux le fonctionnement de l’organe et la pathologie humaine (cancer de l'adulte).

1 010 souris vont être utilisées, la plupart tuées à l'issue et deux cents réutilisées dans d'autres protocoles, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines subissent un stress néonatal ou un régime obésogène, puis une chirurgie stéréotaxique injectant un virus dans le cerveau, des prises de sang à la queue et des tests comportementaux avec privation alimentaire. Le porteur attend un comportement anxieux ou dépressif chez les souris stressées ou rendues obèses, objet même de l'étude sur la dépression humaine. Il affirme que l'étude des facteurs environnementaux et du comportement ne peut se faire que sur animal vivant et rattache les retombées aux troubles de l'humeur.

Objectifs

La dépression représente un problème de santé publique majeur. Parmi les facteurs impliqués dans la vulnérabilité à la dépression, l’adversité dans l’enfance et l’obésité associée au mode de vie sédentaire et aux habitudes alimentaires occidentales sont des facteurs de risques importants. Cependant, les mécanismes impliqués dans la physiopathologie de la dépression restent mal connus. Des travaux récents suggèrent que des processus inflammatoires et des dysfonctions du système dopaminergique mesocorticolimbique contribuent à la physiopathologie de certains symptômes dépressifs. L’objectif de ce projet est d’examiner les effets du stress précoce et de l’inflammation liée à l’obésité dans l’apparition désordres émotionnels à l’âge adulte et de mieux comprendre les mécanismes neurobiologiques sous-jacents. Pour cela nous utiliserons des méthodes de transfert de gènes viraux chez des souris ayant subies un stress néonatal ou rendues obèses à l’âge adulte pour moduler la transmission dopaminergique. Un total de 1010 animaux est envisagé pour ce projet. L’étude de l’impact des facteurs environnementaux et du comportement ne peut être réalisée que sur animaux vivants, rendant impossible le remplacement de ceux-ci par des modèles in vitro. Toutes les précautions possibles seront prises afin de raffiner nos procédures et réduire au mieux l’inconfort des animaux.

Bénéfices attendus

Ce travail apportera des données scientifiques utiles pour une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la perte de motivation associée au stress précoce et à l’obésité, et plus précisément le rôle de la voie GTP-CH1. Puisque ce projet s’inscrit dans le cadre de recherches translationnelles (c’est-à-dire permettant d’aborder une même question par des approches précliniques et cliniques), il permettra à plus long terme de développer de nouvelles stratégies nutritionnelles et/ou pharmacologiques pour améliorer la réponse thérapeutique et la prise en charge des individus atteints de troubles de l’humeur, en particulier lorsque ces derniers sont associés à un contexte d’obésité.

Procédures

- Des prises de sang seront réalisées à la veine de la queue (7 prélèvements sur 2 heures représentant moins de 100uL de sang) sur une partie des animaux vigiles pour mesurer différents paramètres métaboliques. - Des injections intrapéritonéales seront réalisées pour évaluer la sensibilité des animaux à l'insuline. - L’ensemble des souris sera soumis à une chirurgie stéréotaxique afin d'injecter un virus recombinant dans une région spécifique du cerveau. Cette procédure sera réalisée une seule fois sur chaque animal. - Une partie des animaux sera soumise à des procédures comportementales de façon journalière (5 jours sur 7) durant 3 à 4 semaines, nécessitant une légère déprivation alimentaire.

Impact sur les animaux

- Un comportement anxieux et/ou de type dépressif est attendu chez les souris soumises au stress précoce et au régime hyperlipidique et fait l'objet de cette étude. - L’exposition chronique au régime hyperlipidique entraine une prise de poids et des désordres métaboliques pour les souris. - La chirurgie peut être cause de douleur chez l’animal. Le stress thermique induit par l’anesthésie est contrôlé par l’installation des souris sur un tapis chauffant assurant un maintien de la température à 37°C. Le dessèchement oculaire potentiel est prévenu par l’application d’un gel ophtalmique. - Les injections et prises de sang peuvent être cause de douleur pour l’animal. - Les procédures de conditionnement opérant nécessitent une déprivation alimentaire légère et un isolement en cage individuelle le temps de la procédure.

Devenir

Les mères, mâles reproducteurs et mâles C57Bl/6 utilisés pour le screening (200 animaux) seront préférentiellement réemployés dans d’autres protocoles. Le reste des animaux sera euthanasié à l’issue des procédures.

Remplacement

L’objectif du projet est de mieux comprendre chez l'animal les mécanismes mis en jeu dans le développement des troubles de l'humeur induits par un stress précoce ou une exposition chronique à un régime obésogène. L’emploi de modèles animaux est donc nécessaire pour répondre à la question posée. L’utilisation du modèle murin se justifie par l’emploi de modèles génétiquement modifiés pour comprendre les bases moléculaires de ces comportements. La recherche d'alternatives dans des bases de données démontre que les solutions de rechange ne sont pas à ce jour disponibles ou applicables.

Réduction

Lorsque cela est possible, les mêmes souris seront soumises à plusieurs tests lors de l'évaluation comportementale. De même, un maximum de mesures biologiques (périphériques et cérébrales) sera réalisé sur chaque animal dans la limite de compatibilité entre les différentes techniques. Ceci permettre de réduire au maximum le nombre de souris nécessaire à l'étude. Aucun dupliqua du travail proposé n'est aujourd'hui identifié. Le nombre total d’animaux est susceptible d’être revu à la baisse en fonction du succès des reproductions.

Raffinement

- Les animaux seront hébergés en cages collectives (sauf exceptions précisées par la suite) et environnement enrichi (igloo, bâtons à ronger et lanières de papier). - Du fait de la restriction alimentaire durant certaines expériences, les animaux seront observés et pesés quotidiennement. - Concernant la chirurgie stéréotaxique, des analgésiques et anesthésiques seront administrés. Les animaux seront observés jusqu'au réveil puis 2 fois par jour pendant 3 jours. Les points limites seront évalués à l'aide d'une grille de score. Si des blessures apparaissent, elles seront immédiatement soignées et les animaux seront surveillés 2 fois par jour. Si un animal présente un comportement anormal traduisant un état de mal-être il sera immédiatement isolé et surveillé. Si l'animal ne montre pas d'amélioration significative il sera sacrifié dans les 48h. - Pour limiter le stress lié au tests comportementaux les souris seront manipulées régulièrement en amont afin de limiter le stress induit par l’expérimentateur.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée ici est la souris, dont la petite taille et la facilité de manipulation permettent un hébergement facile au sein de l’animalerie du laboratoire, dans le respect des règles d’éthique. Les manipulations nutritionnelles sont également faciles à conduire chez la souris et les expériences de comportement sont faciles à mettre en œuvre et très bien maitrisées au laboratoire qui possède tout l’équipement dédié. De plus, ce projet nécessite l'utilisation de modèles transgéniques disponibles uniquement dans des modèles souris. - La procédure de stress précoce sera réalisée sur des femelles lactantes. - Concernant la cohorte impliquant la mise en place d’un phénotype obèse, les souris seront mises sous régime obésogène ou contrôle à partir du sevrage, pour une durée de 15 semaines. Ce choix repose sur les données de la littérature, notamment issues de notre laboratoire, montrant qu’un début d’exposition au régime obésogène au stade de l’adolescence induit des perturbations métaboliques mais aussi de la sphère émotionnelle, majorées, comparativement à une exposition plus tardive (stade adulte). - La suite des expériences (études comportementales, évaluation de la transmission dopaminergique) sera réalisée à l’âge adulte, 15 semaines après le sevrage.

120 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie d'implantation sous la peau d'un biomatériau osseux, avant d'être tué pour l'analyse histologique des tissus. Le porteur indique que l'implantation peut provoquer une gêne ou une douleur légère et fixe un seuil d'euthanasie. Il décrit cette étape sur souris comme un préalable à des essais sur os de rat puis chez le "gros animal", et affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ensemble formation osseuse, vascularisation et innervation.

Objectifs

En raison des changements de mode de vie et du vieillissement des nations industrialisées, les lésions osseuses traumatiques et les fractures fragiles induites par l'ostéoporose représentent un énorme défi médical et socio-économique. Notre projet vise à créer une nouvelle approche de régénération osseuse, qui combine l'administration de gènes et l'impression 3D pour la création de matériaux personnalisés qui permettraient d'aboutir à une meilleure réparation osseuse par la stimulation conjointe de la réparation des nerfs, des vaisseaux et des os. Ici, il s’agit de réaliser une première évaluation de nos matériaux en les implantant sous la peau de souris, en préalable à des expérimentations sur site osseux chez le rat. Cette évaluation servira deux objectifs : d’une part, évaluer la biocompatibilité (réaction inflammatoire, réaction à corps étranger, …), et d’autre part évaluer la fonctionnalité (formation osseuse, vascularisation, innervation) des produits, pour définir la ou les formulations les plus appropriées pour l’application chez le rat en modèle de réparation osseuse.

Bénéfices attendus

Les résultats des expériences d’implantation de nos matériaux menées sur modèle souris sont un préalable à la poursuite des travaux sur site osseux chez le rat. De mauvais résultats obtenus avec ce biomatériau et/ou l'un des gènes administrés conduiront à l’abandon de l’élément mis en cause. En revanche, des résultats positifs (régénération osseuse au moins partielle, supérieure à celle observée avec le matériau de référence) permettent d'envisager dans un premier temps les expérimentations en site osseux chez le rat, et dans un deuxième temps le dépôt de demandes de financement pour la poursuite des études : tests chez le gros animal, puis essais cliniques.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une chirurgie d'implantation sous-cutanée (acte chirurgical unique d'une durée de 5 à 10 minutes)

Impact sur les animaux

L'implantation sous-cutanée peut entraîner une gêne voire une douleur légère. L’estimation de la souffrance est réalisée par le personnel de l’animalerie selon les standards européens. Au-delà d'un certain seuil, l’animal sera euthanasié sans attendre.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de leur temps expérimental pour procéder à une analyse histologique des tissus de la région opérée.

Remplacement

L'utilisation en clinique d'un nouveau procédé chirurgical avec un biomatériau nécessite impérativement une phase d'expérimentation pré-clinique. Des études in vitro ont été réalisées pour éliminer une éventuelle toxicité cellulaire du biomatériau et pour évaluer le potentiel régénératif de celui-ci. Aucune méthode in vitro actuelle (ex. organoïdes, sphéroïdes,...) n'a démontré la capacité ou ne présente de validation scientifique permettant d'étudier simultanément la formation osseuse, la vascularisation et l'innervation induites par les biomatériaux tout en tenant compte de la complexité d'un être vivant (système immunitaire, flux sanguin...).

Réduction

Ne seront testés in vivo que les matériaux ayant démontré in vitro une absence de cytotoxicité, et une seule lignée de souris sera utilisée. Les échantillons explantés à l'issue des temps expérimentaux seront utilisés pour plusieurs types de marquages et détections. Deux implantations seront réalisées par souris, en tenant compte de la taille du matériau et de la taille des animaux. La possibilité d'implanter au moins deux matériaux par animal, de réaliser un suivi longitudinal, d'analyser plusieurs paramètres à partir des mêmes prélèvements sur animaux après euthanasie, permet de collecter un maximum d'informations sur les animaux utilisés.

Raffinement

L’opération est réalisée sous anesthésie générale. Afin de réduire la souffrance des animaux, des analgésiques sont utilisés lors de l’opération, puis de nouveau en cas de douleur après l’opération. En cas de lésion sérieuse ne pouvant être traitée par suture et/ou antiseptique, l’animal est euthanasié. La cage reçoit un surcroît d’enrichissements le jour de la chirurgie de manière à distraire l’animal de la gêne liée à la présence du matériau implanté, et ainsi limiter les risques d’arrachement de l’implant, de rupture des points de suture, et d’infection de la plaie.

Choix des espèces

Nous utiliserons des souris présentant une immuno-déficience marquée, adaptée à l'implantation de matériaux contenant des cellules humaines. Les souris seront implantées à l'âge de 7 à 12 semaines. À cet âge la taille de la souris facilite la manipulation expérimentale et l´implantation sous-cutanée.

72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues obèses et diabétiques par un régime gras et sucré sur vingt-quatre semaines, elles subissent des tests de tolérance au glucose après jeûne, un test d'endurance sur tapis, des échographies sous anesthésie et l'introduction d'une sonde dans la carotide avant d'être tuées pour analyse des organes. Le porteur affirme que l'obésité et la dysfonction cardiaque n'entraînent pas de surmortalité sur la période. Il indique étudier le mécanisme d'action des gliflozines, un traitement déjà utilisé chez les patients, pour l'optimiser à terme.

Objectifs

Le diabète entraine très souvent des complications cardiaques avec notamment l’apparition d’un mauvais fonctionnement du cœur, appelé cardiopathie diabétique, et pouvant mener à l’insuffisance cardiaque. Or, le diabète est en pleine expansion dans notre société, ce qui confirme la nécessité de constantes recherches pour mieux cibler les solutions thérapeutiques. Récemment, les gliflozines, i.e. des inhibiteurs des co-transporteurs sodium-glucose (SGLT2), ont démontré un effet bénéfique sur la diminution de la survenue d’évènements cliniques majeurs chez les patients insuffisants cardiaques. Les résultats prometteurs d’un nouveau traitement de l’insuffisance cardiaque par les gliflozines ouvrent une nouvelle voie thérapeutique pour les patients. Néanmoins, pour optimiser les molécules actuelles, nous devons d‘abord identifier leurs mécanismes d’action. En effet, en plus de leur action au niveau des reins, les gliflozines semblent avoir un effet cardiaque direct, notamment sur le métabolisme. Ainsi, notre projet a pour objectif de comprendre comment la gliflozine agit sur la cellule cardiaque, notamment sur la communication du signal calcium entre le réticulum, réservoir de calcium, et la mitochondrie, source d’énergie au sein de la cellule cardiaque dans un modèle chez la souris de cardiomyopathie diabétique. Ces informations permettront de préciser le mécanisme d’action de cette molécule en vue de l’optimiser.

Bénéfices attendus

Notre étude permettra de préciser le mécanisme d’action des gliflozines au niveau cardiaque, mais aussi dans les autres organes, afin d’envisager à terme le développement de nouvelles molécules plus spécifiques et avec une meilleure efficacité pour un plus grand nombre de patients insuffisants cardiaques.

Procédures

Le protocole dure au total 24 semaines. La moitié des souris seront mises sous régime standard pendant 24 semaines et l’autre moitié sera mise sous régime enrichie en lipides et en sucrose. Au bout de 16 semaines, la moitié de chaque groupe aura une supplémentation dans leur nourriture avec la gliflozine, pour mimer le traitement chez les patients. Le développement du diabète chez les souris sera mesuré par un test à 15 et 22 semaines. Pour cela, les souris seront mises à jeun pendant 6 heures, puis une injection de glucose ou d'insuline, selon le test, sera réalisée et la glycémie sera mesurée toutes les 15 minutes pendant 1 heure. Un test d’endurance sera également effectué à 23 semaines sur tapis de course (durée du test : 20min). Les souris auront été au préalable habituées au tapis de course, 1 fois par jour pendant 3 jours (2mn par session). Une échographie sera effectuée à 16 et 23 semaines sous anesthésie gazeuse (durée anesthésie générale :30min) pour étudier la fonction contractile du cœur. Pour étudier la communication du calcium, la moitié des souris de chaque groupe recevra une injection pour exprimer un senseur du calcium (durée anesthésie générale :11min ; durée injection : 30s). Pour mesurer la pression artérielle, la moitié des souris de chaque groupe seront anesthésiées sous analgésie pour introduire une sonde de mesure dans la carotide (durée anesthésie générale :30min) et seront ensuite mises à mort pour prélèvements des organes à analyser.

Impact sur les animaux

Nous nous attendons durant ce régime riche en sucre et en gras à une prise de poids corporelle importante et rapide, ainsi qu’à un dysfonctionnement cardiaque caractérisé par un cœur plus gros et un remplissage du cœur par le sang diminué, raison de l’étude. Toutefois, l’obésité et la dysfonction cardiaque/métabolique n’entrainent pas de surmortalité, ni d’effets indésirables sur les animaux sur la période considérée (24 semaines). Aucun effet indésirable n’est attendu en réponse aux examens échographiques (non invasifs) réalisés sous anesthésie générale, ni à l’injection réalisée sous analgésie et anesthésie.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en fin d’expérimentation pour permettre l’analyse (moléculaire et cellulaire) des différents organes.

Remplacement

Notre projet ayant pour but d’étudier la cardiopathie diabétique impliquant un mauvais fonctionnement contractile du cœur suite à un dérèglement d’origine métabolique et multi-organe, le recours à l’expérimentation animale est nécessaire. Cependant, l’isolation de cellules contractiles du cœur des souris de cette étude permettra de réaliser de nombreuses analyses en limitant le nombre d’animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux par procédure a été calculé à l’aide d’un logiciel de statistiques afin de déterminer le plus précisément possible le nombre minimal d'animaux permettant d'obtenir des résultats statistiquement exploitables, soit au maximum 72 animaux sur 2 ans. Par ailleurs, les prélèvements des autres organes en parallèle du cœur ont été mutualisés sur chaque procédure afin de limiter le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Afin de supprimer toute souffrance ou douleur liées aux injections et prélèvements, ceux-ci seront réalisées sous prémédication analgésique et anesthésique local. L’examen échographique sera réalisé sous anesthésie générale. Par ailleurs, des points limites et critères d’arrêt adaptés à chaque procédure ont été définis. Les souris sont soumises à une période d’habituation sur le tapis de course. La mise à jeun courte de 6h avant les tests métaboliques est réalisée au matin, ce qui correspond au début de période diurne pour les animaux (c’est à dire à leur période de plus faible activité et en situation post-prandiale).

Choix des espèces

La physiologie de la souris étant « proche » de celle de l’Homme, pour la problématique étudiée ici, nous avons choisi de réaliser l’ensemble de nos expériences chez cette espèce animale. Les animaux C57BL/6-Ola-Hsd auront 5 semaines lors de la mise en place de la diète pour 6 mois, menant à un âge de 29 semaines à l'issue de la procédure. La mise en place de la diète dès cet âge permet le développement d’une cardiopathie diabétique.

6 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Immunodéficientes et castrées chirurgicalement, elles reçoivent la greffe d'un fragment de tumeur humaine puis jusqu'à trois administrations quotidiennes, pour tester des traitements contre des cancers hormono-résistants du sein, de l'ovaire et de la prostate. Le porteur présente ces xénogreffes issues de patients comme "les seuls" modèles reconstituant la complexité des tumeurs humaines et affirme que ce travail sur animal "ne peut être remplacé". L'efficacité clinique des molécules testées reste hypothétique, l'objectif immédiat étant de les sélectionner avant un éventuel passage chez l'humain.

Objectifs

Le cancer représente la deuxième cause de mortalité dans les pays développés et de nombreux cancers sont connues pour être favorisé par certaines hormones, il s’agit principalement des cancers du sein et des ovaires chez la femme et de la prostate chez l’homme. Ces tumeurs hormonodépendantes, qui présentent des récepteurs hormonaux peuvent être traitées par hormonothérapie, cependant, ce traitement hormonal n'a qu'un effet transitoire, d'une durée variable, et bloque la prolifération du cancer sans le guérir. En dépit de l’amélioration constante de la prise en charge de ces patients, de nombreux progrès restent à faire et de nombreux travaux sont actuellement menés afin de mettre sur le marché de nouveaux traitements thérapeutiques anti-tumoraux visant ces tumeurs hormono-résistantes.

Bénéfices attendus

L’objectif de ce projet est de déterminer in vivo sur des animaux castrés porteurs de tumeurs hormonorésistantes, les propriétés anti-tumorales de traitements innovants (petite molécule et/ou biothérapie) afin d’identifier ceux potentiellement efficaces en clinique. L’évaluation de ces traitements innovants permettra de définir leur efficacité anti-tumorale ainsi que les informations nécessaires pour choisir leur posologie en vue de leur utilisation future en clinique. Ce projet se base sur l’utilisation de modèles de tumeurs humaines greffées sur souris castrées ou PDX pour Patient Derived tumor Xenografts. Ces modèles développés au cours des dernières années sont donc des souris castrées porteuses d’une tumeur humaine. Ce sont actuellement les seuls qui permettent de reconstituer sur animal la complexité des tumeurs humaines. Les résultats obtenus sur ces modèles permettent ainsi une réelle extrapolation en médecine humaine. Nous disposons actuellement d'une collection de 24 PDX différentes représentatives des tumeurs hormono-résistantes.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 procédures chirurgicales distinctes d’une durée de 30 minutes maximum par souris, toutes deux réalisées sous anesthésie générale : 1/ Implantation interscapulaire d'un fragment tumoral 2/ Castration chirurgicale par incision cutanée bilatérale inférieure à 1cm au niveau de l’aine pour les mâles ou au niveau des reins pour les femelles. Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées minimum 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les traitements, les animaux recevront au maximum 3 administrations quotidiennes. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles, des prélèvements de sangs pourront être effectués, dans le respect des directives européennes.

Impact sur les animaux

Actes chirurgicaux d’implantation tumorale et de castration. Hypothermie au moment de l’anesthésie. Stress physique au moment des prélèvements sanguin.

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. Leur réutilisation n'est pas possible compte tenu des procédures expérimentales que ces animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) qui pourraient avoir un impact négatif sur les résultats d'une autre étude.

Remplacement

Il est essentiel, avant toute administration à l’Homme, de valider le potentiel thérapeutique de chaque traitement innovant dans des modèles permettant d’étudier tous les paramètres observables, depuis l’administration jusqu’à l’élimination des composés administrés tout en prenant en compte les interactions possibles avec les cellules non-tumorales de l’organisme. Ces études in vivo constituent une des nombreuses étapes du développement préclinique d’un médicament mais ce travail sur animal ne peut être remplacé.

Réduction

Les modèles de PDX utilisés sont parfaitement maitrisés et permettent de n’utiliser que le nombre strictement nécessaire d’animaux pour obtenir des résultats pertinents. Les traitements retenus pour ce projet auront été sélectionnés au préalable lors d’études in vitro permettant la réduction du nombre de groupe à tester. Il sera, de plus, possible d’évaluer plusieurs traitements au sein d’une même étude, sur un même modèle tumoral (1 seul groupe contrôle pour plusieurs traitements différents) et ainsi réduire le nombre total d’animaux inclus dans le projet. Toujours d’après les résultats in vitro, seuls les traitements démontrant les meilleurs effets anticancéreux seront testés in vivo permettant au mieux de réduire le recours aux études in vivo aux traitements ayant le meilleur potentiel thérapeutique anticipé.

Raffinement

Nous utiliserons toutes les données compilées préalablement dans le cadre du développement préclinique du traitement à évaluer. Ceci permettra de prédéfinir les doses potentiellement efficaces et minimisant les effets secondaires. Nous pourrons ainsi raffiner l’étude en étant certain de travailler à des doses permettant d’évaluer l’efficacité des traitements et non leur toxicité, en minimisant ou supprimant tout effet secondaire indésirable pouvant masquer l’objet de l’étude. Les animaux seront acclimatés au moins 7 jours avant d’être greffés, puis seront greffés sous anesthésie avec un mélange d'anesthésique et de tranquillisant. Seuls les animaux présentant des tumeurs en croissance et inclus dans la phase de traitement seront castrés. Outre la surveillance quotidienne post-greffe et castration, les animaux seront surveillés au moins une fois par jour pendant le traitement afin de déceler et notifier rapidement tout signe de changement dans le comportement ou l’état de santé des animaux. En cas de modification du comportement normal ou de l’état de santé des animaux surveillés, des actions visant à prévenir douleur ou angoisse comme par exemple interruption du traitement seront appliquées. Le projet dont la durée sera de 5 années sera constitué de 40 études visant à évaluer différents traitements innovants sur différents modèles de PDX. Les études comprendront chacune 163 animaux au maximum, soit un total de 6520 animaux au maximum.

Choix des espèces

Différentes souches de souris toutes immunodéficientes, afin de ne pas rejeter les fragments tumoraux d’origine humaine, provenant d'éleveurs agréés, peuvent être utilisées dans le cadre du projet. Les animaux seront tous des souris adultes âgées de 5 à 13 semaines en fin de période d'acclimatation, afin d’optimiser la prise de greffe car le système immunitaire résiduel qui se développe avec l’âge peut empêcher les tumeurs de pousser. La majorité des études (90%) nécessitant une castration sera réalisée sur des souris mâles (modèles prostates).

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour altérer une voie de signalisation lipidique, elles alternent des régimes pauvres puis riches en sel, passent jusqu'à quatorze heures par semaine en cage métabolique et subissent des prélèvements de sang et d'urine ainsi que des mesures de pression, avant d'être mises à mort pour analyse des tissus. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche la mise à mort anticipée par dislocation cervicale. Il affirme que l'étude d'une voie de signalisation dans un contexte d'"échanges cellulaires complexes" ne peut être menée in vitro et renvoie les retombées contre l'hypertension au long terme.

Objectifs

L'hypertension artérielle représente une des causes majeures de mortalité et de morbidité dans le monde ainsi qu’un problème majeur de santé publique. L'identification et la caractérisation physiopathologique qui l’entoure est donc importante afin de développer de nouvelles thérapies contre ces maladies. Des études génétiques et physiologiques effectuées chez l'homme ou le primate, ont démontré qu'une alimentation riche en sel représente le facteur de risque le plus répandu d'hypertension. Les mécanismes responsables de cette sensibilité au sel ne sont cependant toujours pas clairement identifiés. Des études récentes ont montré que la signalisation lipidique contribue à la régulation de la pression artérielle chez les souris nourries avec un régime alimentaire normal. Ce projet vise à déterminer si la signalisation lipidique est également impliquée dans la modulation de la pression artérielle en réponse aux modifications de l'apport alimentaire en sel. Le choix de l'espèce murine nous permet d’avoir conjointement accès à des animaux génétiquement modifiés tout en permettant de moduler les apports en sodium et étudier l'impact sur la pression artérielle. Nous allons générer des souris chez lesquelles la signalisation lipidique a été génétiquement altérée dans différents types de cellules et les nourrir avec des régimes riches ou faibles en sel. Cela nous permettra d'évaluer l’implication de la signalisation lipidique dans la modulation de la pression artérielle par le sel alimentaire. Ce projet nous permettra de faire varier les régimes sodés chez les souris mutantes et leurs témoins respectifs afin d’effectuer des analyses de la tension artérielle, des protéines et des électrolytes sanguins. Il nécessite 480 souris sur 5 ans et a été élaboré afin de respecter les règles éthiques des 3R : Les méthodes alternatives in vitro ne nous permettent pas de tester nos hypothèses et nécessitent l’utilisation d’un modèle animal. Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux requis pour obtenir des résultats statistiquement interprétables et atteindre l’objectif scientifique du projet. Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance régulière. Enfin, des points limites ont été établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. A terme, les résultats de ce projet seront utiles pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de l'hypertension.

Bénéfices attendus

A cour terme les resultats de cette étude permetrons d’évaluer le rôle de la signalisation lipidique dans la régulation de la pression artérielle chez la souris. A long terme, le nouvel aperçu physiopathologique fourni par les résultats de ce projet sera utile pour le développement de nouvelles stratégies pour le traitement de l'hypertension.

Procédures

Les souris seront soumises à différentes procédures tout au long de ce projet : Tous les animaux seront soumis à des changements de régimes alimentaires (pauvre en sodium pendant 3 semaines puis riche en sodium ou en potassium pendant 3 semaines). Des prélèvements d’urine de manière hebdomadaire sur 7 semaines (recueil en continu en cage métabolique, 14h par semaine). Des prélèvements de sang sous anesthésie gazeuse (3 fois sur 7 semaines, environ 5 minutes par souris). Tous les animaux subiront également des mesures de pression sanguine (3 séries sur 7 semaines, environ 10 minutes par souris).

Impact sur les animaux

Les animaux pourront subir un stress supplémentaire attenant au changement de régime alimentaire (3 semaines par régime), à la mesure de pression sanguine ainsi qu’à la mise en cage métabolique 14 heures par semaine durant les phases de régime pauvre ou riche en sel.

Devenir

Les animaux, après avoir subi le régime riche en sel seront mis à mort afin de permettre l’analyse de tissus prédéterminés pour analyses immuno histo chimiques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est nécessaire pour ce projet car nous évaluons l'impact de la perturbation des voies de signalisation dans des types cellulaires distincts dans un contexte où les autres types cellulaires de l'organisme restent inchangés. Dans ce contexte d’echanges cellulaires complexes, ces études ne peuvent donc pas être réalisées in vitro (mesure de la pression sanguine, modification de régime alimentaires, analyse de sang et d’urine).

Réduction

De nombreux paramètres de natures variées sont à prendre en compte dans cette étude (Pressions sanguines, taux de calcium et de potassium, numération sanguine, dosage de S1P sur plasma, immuno-histochimie) ce qui rend difficiles tout calculs statistiques concernant le nombre minimum d’animaux requis. Pour cela nous nous sommes basés sur les études reportées dans la littérature utilisant les mêmes approches expérimentales afin d’utiliser la même approche statistique. Afin de réduire le nombre total de souris nous soumettrons les groupes à 2 régimes différents avec une phase de récupération d’une semaine entre les 2 plutôt que d’utiliser un groupe pour chaque régime alimentaire.

Raffinement

Afin de prévenir au maximum la souffrance et l’angoisse infligée aux animaux, toutes les étapes de la procédure se dérouleront avec une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie et tout comportement anormal sera renseigné à la personne en charge du protocole. Deux fois par semaine (avant et après la mise en cage métabolique), l’un des responsables ira observer et peser tous les animaux entrés dans la procédure et remplira la grille de score établie durant toute la durée de l’expérience : Le poid de référence sera celui relevé une semaine avant le passage en régime pauvre en sodium. - Variation du poid corporel : 0= Normal 1= Perte de poid inferieur à 10% 2= Perte de poid entre 10% et 20% 3= Perte de poid supérieur à 20% - Variation de l’aspect général : 0= Normal 1= Mauvais état du pelage 2= Position anormale (dos voûté, couché sur le côté) 3= difficultés respiratoires (sifflements, râle) - Blessures éventuelles : 0= Pas de blessure 1= Réduction de la mobilité, atrophie musculaire 2= Hémorragie, automutilation Tout animal ayant un score égal à 2 subira des soins adaptés (gelée nutritive, surveillance accrue, traitement des plaies). Tout score supérieur ou égal à 3 atteint pour l’un ou l’ensemble des critères ci-dessus par un animal entrainera la mise à mort de manière anticipée par dislocation cervicale par le personnel compétent. Pendant les phases de régimes salés (HSD) les souris seront dans des cages à double litière et double coton afin d’améliorer leur confort. Lors de la perfusion intra cardiaque les animaux seront mis sous anesthésie profonde par injection IP d’un mélange de 180 mg/kg Kétamine et 10 mg/kg Xylasine. Afin de prévenir une douleur éventuelle, ils seront également sous traitement d’analgésique lors de cette procédure (Buprénorphine, injection IP de 0,05 à 0,1 mg/kg).

Choix des espèces

Nous étudions les souris car elles se prêtent particulièrement à des manipulations génétiques. Par exemple : Les souris chimériques que nous avons créées, nous permettent d'aborder spécifiquement le rôle de S1P circulant dans le sang plutôt que S1P dans les tissus rénaux, chez la souris adulte. Par ailleurs, la physiologie de la souris est maintenant bien caractérisée et de nombreux tests ont été développés pour mesurer les paramètres cardio vasculaires, dans les meilleures conditions possibles et en réponse aux exigences de l'expérimentation animale. Nos études portent sur la régulation de la pression artérielle. Elles sont donc menées sur des animaux adultes (souris agées au minimum de 8 semaines).

2 800 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection sous-cutanée de cellules cancéreuses puis des chimiothérapies et immunothérapies répétées, la tumeur pouvant gêner leurs déplacements, avant d'être tuées quand elle dépasse un seuil ou pour prélèvement. Le porteur fixe des points limites, perte de poids supérieure à 20 %, léthargie ou ulcération de la tumeur, déclenchant la mise à mort. Il présente l'organisme vivant comme le seul cadre "prédictif" pour évaluer des combinaisons thérapeutiques en oncologie.

Objectifs

Le but du projet est d’évaluer le rôle de CXCL10 (une chimiokine permettant le recrutement des lymphocytes T CD8) sur l’efficacité antitumorale d’une immunothérapie (anti-PD-1), des chimiothérapies ou d’une association des deux thérapies utilisées en clinique, dans différents modèles de cancers chez la souris. Nous étudierons également les infiltrats immunitaires dans les tumeurs. Ainsi nous pourrons 1) évaluer l’efficacité des traitements en présence ou non de CXCL10 et 2) déterminer si certaines cellules immunitaires voient leur nombre et leur activité modifiée en fonction du traitement. Cette étude nous permettra également de comprendre les mécanismes de résistance aux traitements actuellement utilisés en clinique.

Bénéfices attendus

En 2018, les cancers du côlon du pancréas et du poumon font partie des cancers les plus fréquents avec le cancer de la prostate et du sein. Ces 3 types de cancers représentent les cancers causant le plus de décès. Actuellement, le traitement des cancers colorectaux, du pancréas et du poumon repose sur l’utilisation de chimiothérapies. Bien que ces chimiothérapies aient un effet antitumoral avéré, elles ne conduisent pas systématiquement à une rémission totale du patient, en particulier dans les cas de cancers avancés. Il a été montré que le système immunitaire jouait un rôle important dans la réponse aux traitements par chimiothérapie. En effet, l’activation de certaines cellules immunitaires pourra favoriser la réponse des patients au traitement, alors que leur blocage conduira à son inefficacité. Ainsi, l’immunothérapie a été associée à la chimiothérapie afin d’augmenter son efficacité dans de nombreux cancers. Cependant, cette association n’est pas efficace pour le cancer du pancréas et pour certains cancers colorectaux. Il apparait donc important d’étudier les mécanismes responsables de cette résistance. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de CXCL10, une chimiokine impliquée dans le recrutement des lymphocytes T CD8 cytotoxiques, sur l’efficacité anti-tumorale de l’immunothérapie ou de la chimiothérapie ou d’une association des deux thérapies, utilisées en clinique dans différents modèles de cancers murins. Dans ce projet, nous évaluerons l’efficacité des traitements sur la croissance tumorale. Etant donné que certaines cellules du système immunitaire peuvent contribuer à l’élimination des cancers, nous étudierons leur présence et leur état d’activation au niveau des tumeurs, chez les souris traitées ou non par l’immunothérapie et/ou la chimio-immunothérapie (immunomonitoring, Nanostring). L’intérêt de ce travail est donc de mieux comprendre les mécanismes immunologiques associés aux tumeurs et de rechercher des moyens de potentialiser l’immunothérapie, la chimiothérapie et/ou la chimio-immunothérapie, jusqu’alors peu efficaces dans le traitement du cancer.

Procédures

- Injection par voie sous-cutanée de cellules cancéreuses murines : - Geste réalisé sous anesthésie générale gazeuse - Une seule injection par animal - Durée 5 minutes - Nombre de souris : 2800 - Traitements par chimiothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une seule injection par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400 - Traitements par immunothérapie par voie intrapéritonéale : - Geste réalisé sur animal vigil - Une injection trois fois par semaine pendant 3 semaines par animal - Durée 1 minute - Nombre de souris : 2400

Impact sur les animaux

L’injection de cellules tumorales en sous-cutané génère une masse tumorale au niveau du flanc droit pouvant gêner la liberté de mouvement de l’animal. On note que lorsque le volume tumoral est supérieur à 2000 mm3 (~300mm2), ou que la tumeur parait gêner le déplacement de la souris celle-ci sera sacrifiée. Une altération de l’état général est possible, du fait de la pathologie cancéreuse induite. Donc surveillance régulière du poids, posture douloureuse, léthargie, absence de toilettage… Si un point limite est atteint, la souris sera sacrifiée. D’éventuels effets secondaires des traitements anti-cancéreux sont possibles : les chimiothérapies et immunothérapies utilisées ont déjà fait l’objet de recherches sur l’animal, il n’est pas attendu d’effet secondaire important. Surveillance régulière de l’état général et des points limites.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure, soit parce que la taille de la tumeur dépassera 2000mm3, soit parce que les tumeurs seront prélevées pour les tests biologiques.

Remplacement

Le cancer est une maladie complexe impliquant des mécanismes de contrôle et des interactions possibles seulement dans un organisme vivant. En effet, la recherche a permis de comprendre l’importance de l’environnement dans lequel le cancer se développe et les multiples interactions avec le système immunitaire, le stroma tumoral, le système vasculaire et le métabolisme. En conséquence, pour être prédictifs, l’évaluation de l’efficacité ou de l’échec de nouvelles combinaisons thérapeutiques en oncologie doit être réalisée sur les organismes vivants. Nous réalisons à ces fins des études translationnelles sur des modèles d‘animaux greffés avec des cellules tumorales.

Réduction

Les expériences ne seront réalisées que deux fois ce qui permet donc de réduire le nombre d’animaux de l’étude. Le nombre de souris par groupe a été estimé en utilisant un test bilatéral et en considérant qu’un traitement sera efficace s’il modifie la moyenne des valeurs de 20% avec une différence significative (test de Student). Si l’un des modèles ne donne pas les résultats escomptés (absence de recrutement de lymphocytes CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10 visualisé par immunomonitoring dans la partie I) ou s’il s’avère que les points limites sont atteints prématurément, celui-ci sera abandonné dès la partie I.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des conditions qui répondent à leurs besoins (groupes, environnement enrichi) et seront habitués aux techniques de préhension. Les animaux sont suivis au minimum 3 fois par semaine par des techniciens responsables d’études. Une anesthésie générale gazeuse sera réalisée avant chaque greffe. Points limites : - perte de poids dépassant 20% par rapport au poids maximum enregistré : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - posture ou autre expression de la douleur : arrêt des traitements ; si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - absence de toilettage : arrêt des traitements et surveillance de l’apparition d’autres points limites ; - léthargie, immobilité : si persistance au-delà de 24h, mise à mort de l’animal ; - une mauvaise cicatrisation ou une ouverture des sutures : mise à mort de l’animal. - Points limites spécifiques à la présence de tumeurs et dont l’atteinte entrainera l’euthanasie des animaux : - volume tumoral supérieur à 2000 mm3 (300mm2) ; - tumeurs gênant les fonctions vitales et motrices ; - ulcération ou nécroses de la tumeur sous-cutanée supérieure à 20% de la surface totale de la tumeur ; - difficultés respiratoires. Le projet se déroule en 3 parties. L’absence de faisabilité (points limites atteints) ou de résultats (absence de recrutement de CD8 dans les tumeurs surexprimant CXCL10) conduira à l’arrêt de certains modèles.

Choix des espèces

Les souris présentent des caractéristiques physiologiques qui permettent une variété de techniques d’administration et de prélèvement présentant des analogies avec ce qui est réalisé en recherche clinique sur l’homme. Diverses souches de souris immunocompétentes sont disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques, indispensables à la recherche préclinique en immuno-oncologie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 8 et 12 semaines d’âge) pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles avec des animaux possédant un système immunitaire mature et un poids corporel > 20g.