Souris
Investigation des Plasmas Froids Atmosphériques pour le traitement des adénocarcinomes pulmonaires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
447 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Porteuses de tumeurs pulmonaires, elles font l'objet d'un suivi de croissance tumorale, d'apparition de métastases et d'imagerie, avant euthanasie par dislocation cervicale. Le résumé public reste très succinct, la rubrique bénéfices se limitant à la phrase cela permet de travailler sur un organisme entier et la rubrique procédures indiquant seulement l'absence de prélèvement sur animal vigile. Le porteur justifie l'étude d'un récepteur exprimé à la fois par les cellules tumorales et immunitaires par l'impossibilité de le tester in vitro.
Objectifs
Ce projet est justifié du point de vue scientifique au travers de : (1) la validation du projet global par les instances scientifiques qui financent l’expérimentation. Les responsables sont porteurs de différents projets impliquant les protocoles d’expérimentation animal détaillé plus bas qui ont été validés et donc soutenus par différentes instances telles que l’INSERM et SU. (2) la validation au niveau international des protocoles développés à travers la publication d’articles scientifiques dans les journaux à comité de lecture. La participation des responsables dans ce domaine est référencée sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed. (3) Nous avons préalablement montré que TLR7 a un rôle pro-tumoral dans un modèle de tumeur pulmonaire, en sous- cutanée. Les modèles animaux expérimentaux sont les seuls modèles permettant de réaliser cette étude, puisque ce récepteur est exprimé à la fois par les cellules tumorales et les cellules immunitaires, et l'impact de la stimulation de ce récepteur ne peut être testé qu 'in vivo.
Bénéfices attendus
Cela permet de travailler sur un organisme entier
Procédures
Il n'y a pas de prélèvements sur annimaux vigiles ou d'actes chirurgicales
Impact sur les animaux
Les animaux commerciaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne. Les animaux seront gardés en groupes et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris pour minimiser l’angoisse. Concernant les conditions de stabulation, notre animalerie a mis en place un programme d’enrichissement qui consiste à placer des nids végétaux dans les cages. La stabulation des animaux sera conventionnelle (litière normale, cages ventilées individuellement, 5 animaux maximum par cage de Type IIL, température 22°C (+/-2°C), éclairage alterné jour/nuit 12h/12h de 7h du matin à 7 h du soir) et ils recevront un régime alimentaire normal (nourriture Mucedola 4RF25 ou 21 ad libitum ainsi que l'eau par biberon). Nous utiliserons un test bilatéral standard de comparaison des moyennes de souris mutées comparées aux contrôles, avec un risque d’erreur de 5%. Notre stratégie d’observation consiste en une surveillance quotidienne par le personnel de l’animalerie d’une part. De plus, nous assurons en plus une surveillance et un contrôle 2 fois par semaine pour les souris dès leurs arrivées à l'animalerie avec recherche de signes d’altération de l’état général (poil mal entretenu, souris isolée et recroquevillée, non réactive, amaigrissement et de difficultés respiratoires (augmentation de la fréquence respiratoire). En cas de signe de souffrance les souris seront euthanasiées par dislocation cervicale. Afin d’assurer une validité statistique aux expériences, un nombre de 10 souris par groupe sera utilisé pour suivre l’évolution de la croissance tumorale, l’apparition des métastases et l’infiltrat immunitaire. Chaque expérience sera répétée trois fois. Les résultats seront comparés grâce aux tests non paramétriques de Mann-Whitney et ANOVA.
Devenir
Les animaux seront euthanasiées par dislocation cervicale
Remplacement
Nous menons dans notre laboratoire des études de compréhension des mécanismes impliquant TLR7 conduisant à des effets pro-tumoraux et de résistance au traitement par chimiothérapie chez des souris atteintes de tumeurs pulmonaires. La complexité de ce système ne pouvant en aucun cas être remplacée par des modèles in vitro puisque nous devons étudier les effets de la stimulation de TLR7 dans un organisme où à la fois les cellules tumorales et les cellules de l’hôte peuvent exprimer et être stimulées par ce récepteur. De plus, les souris C57TyrC (albinos) que nous utilisons dans notre modèle sont couramment utilisées en recherche en immunologie des tumeurs, par différents laboratoires, ce qui permet d'échanger et de discuter les résultats obtenus avec les laboratoires qui étudient d’autres aspects du même modèle. De plus, nous avons sélectionnés des souris albinos afin de réduire le bruit de fond lors des acquisitions à l’aide de l'imagerie IVIS (Lumina II - Perkin Elmer).
Réduction
Reduce (Réduire) le nombre d'animaux en expérimentation : les expériences seront regroupées pour limiter le nombre des animaux des groupes contrôles. Nous utiliserons un pied à coulisse pour mesurer le volume tumorale et des techniques d'imagerie non invasive pour l’apparition des métastases.
Raffinement
Refine (Raffiner) la méthodologie utilisée, ce qui implique la notion de points limites (critères d'interruption, ou "end- points") : des points limites ont été établis, pour définir à quel moment euthanasier les animaux au cours des expériences, si des signes de souffrances sont visibles. Ceci ne peut donc pas être étudie in vitro. De plus, Les animaux auront un temps d'acclimatation de 8 jours avant d'être expérimentés. Les animaux seront observés de façon quotidienne et seront gardés en groupes de 5 et hébergés dans des cages appropriées offrant suffisamment d’espace vital. Un milieu enrichi adapté est prévu pour l’hébergement des souris.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale adaptée pour conduire nos expériences avant tout dans un souci d’intégration de nos recherches dans un contexte scientifique où toutes les études similaires sont menées chez cet animal. Il s’agit d’une espèce pour laquelle notre animalerie est parfaitement adaptée, qui se manipule facilement et qui permet le recours à des modèles génétiquement modifiés. Nous utilisons des souris C57Bl/6 albinos, provenant du fournisseur Janvier Labs. Cette lignée albinos est une lignée dont la mutation provient d’une mutation spontanée dans la lignée C57Bl/6. Cette lignée est couramment utilisée pour les expériences de bioluminescence Les animaux sont utilisés à l'âge de 7 à 9 semaines. Ce stade de développement a été choisi car les souris sont sevrées, ont atteint leur taille adulte et ont un système immunitaire mature. Les animaux sont identifiées au niveau de la queue à l'aide d'un marqueur dès que les tumeurs sont palpables (2 semaines après injection de cellules tumorales)
Rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un gène de l'autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l'activité locomotrice, l'anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L'objet est d'étudier le rôle de l'autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l'autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'effet d'un tel défaut sur le comportement ne peut s'étudier autrement qu'in vivo.
Objectifs
Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.
Procédures
Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).
Impact sur les animaux
A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.
Devenir
A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.
Remplacement
L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.
Réduction
Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.
Raffinement
Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).
Efficacité anti-cancéreuse d’un lentivecteur encapsulé dans des polymères ciblant les lymphocytes T dans un modèle de cancer hématologique induit chez la souris NSG greffée avec des cellules souches CD34-positives humaines
- Recherche appliquée
- Cancers
105 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendues immunodéficientes et greffées avec des cellules souches humaines, elles reçoivent des injections répétées à doses croissantes d'un traitement anticancéreux, des prélèvements sanguins et une imagerie par bioluminescence une à deux fois par semaine, avant euthanasie. L'objet est le développement préclinique d'une immunothérapie contre des cancers du sang avant un essai clinique, les retombées pour les patients restant renvoyées à ce projet futur. Le porteur affirme que la biodistribution ne peut se modéliser in vitro et invoque l'effet de l'organisme entier.
Objectifs
Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR in vivo (stratégie d’immunothérapie cellulaire) ciblant un marqueur tumoral que nous souhaitons mener jusqu’à la démonstration de sa sécurité et de son efficacité thérapeutique dans des indications de cancers du sang. Ces résultats sont un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2022. Il s’agit d’évaluer l’efficacité anti-tumorale lorsque notre CAR in vivo est injecté et distribué entre les différents compartiments de l'organisme dans un modèle murin humanisé. Ce projet nous permettra également de démontrer chez l’animal que la modification des cellules sanguines est bien spécifique des lymphocytes T (globules blancs du système immunitaire) ciblés et que notre CAR in vivo est bien toléré lors d’administrations répétées à des doses croissantes. Ces problématiques ne peuvent être abordées que via l’expérimentation animale. Aussi nous explorerons l’efficacité anti-cancéreuse, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines. Le choix de la souris NSG-hCD34+ est justifié car c’est un modèle de référence en oncologie très largement caractérisé́ et dont la prédictibilité a été démontrée dans de nombreuses études en immunothérapie.
Bénéfices attendus
Ce projet d’expérimentation animale constitue une étape cruciale du développement préclinique de notre CAR T-cell in vivo dirigé contre le marqueur tumoral CD19 qui doit nous permettre de démontrer sa sécurité et son efficacité thérapeutique dans des modèles de cancers hématologiques. Cette preuve de concept d’efficacité anti-cancéreuse est un prérequis avant de lancer un essai clinique de phase I/II en 2023 chez les patients atteints de cancers hématologiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements sanguins à 5 temps différents (J-7, J+3, J+10, J+17, fin de projet). Ils seront aussi soumis à des injections par perfusions ou injections, ces perfusions/injections seront au nombre de 3 à 5 d'affilé. Ils passeront ensuite des examens d'imagerie par bioluminescence 1 à 2 fois par semaine.
Impact sur les animaux
Suite aux protocoles expérimentaux et aux anesthésies, une perte de poids peut être observée.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale après anesthésie générale à l'isolflurane
Remplacement
La biodistribution d'un composé implique une interaction forte entre les différents compartiments de l'organisme, c'est à dire un échange entre le sang et les organes. Actuellement, il n'est pas possible de modéliser cette répartition tissulaire in vitro. Par ailleurs, même si l'innocuité des composantes de notre produit (lentivecteur + polymère + agent de ciblage anti-CD3) a déjà été vérifiée dans nos tests cellulaires et in vivo (par d’autres groupes), l'effet de l'organisme entier sur le lentivecteur associé au polymère ne peut être complétement évalué. Afin de mimer le plus possible les conditions physiopathologiques humaines, nous explorerons l’efficacité, la biodistribution et la sécurité de notre produit sur des souris NSG (NOD scid gamma) immunodéficientes mais greffées avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines. L’expérimentation chez la souris est nécessaire pour démontrer que la transduction des cellules cibles est toujours efficace quand notre produit injecté en systémique et distribué entre les différents compartiments de l'organisme.
Réduction
Afin de minimiser la consommation inutile des 105 souris qui pourraient être exposées à des doses dépassant la dose maximale tolérée, nous avons prévu 3 procédures qui seront lancées de manière séquentielle après avoir vérifié que les doses et protocoles d’injections de la procédure précédente ne présentent pas de toxicité macroscopique particulière. Le nombre de souris par groupe nécessaire et suffisant pour pallier à la forte variabilité interindividuelle observée en imagerie de bioluminescence et en cytométrie de flux a été défini. De plus il permet de démontrer l’efficacité du traitement par rapport aux groupes contrôles grâce à l’analyse statistique des résultats (tests one-way ANOVA et Kaplan-Meier) avec une signification suffisante (valeur p
Raffinement
Afin de raffiner nos procédures et limiter le stress et la souffrance chez les animaux, nous utiliserons des protocoles précis d'anesthésie et de prise en charge de la douleur par l'injection d'analgésie. Nous respecterons les points limites établis par la surveillance quotidienne des animaux et le suivi de leur état via une fiche de scoring. Leur environnement est aussi quotidiennement contrôlé et l'enrichissement est présent et adéquat au vue de l'espéce (batonnet de coton, sizzle ball, demi dôme de cellulose)
Choix des espèces
La souris est le modèle de référence en oncologie, notamment du fait de l'existence de souches dont le système immunitaire a été très largement caractérisé. La multitude de références bibliographiques en fait donc un modèle de choix. Par ailleurs, de nombreuses études en immunothérapie ont montré de bons résultats dans le modèle murin NSG-hCD34+. Ces animaux sont greffés avec des cellules souches hématopoïétiques CD34-positives humaines et se caractérisent par une excellente maturation des cellules T et la présence de cellules CD4+ et CD8+ dans la circulation et autres tissus. Cette souche constitue un modèle idéal pour vérifier in vivo la spécificité pour les lymphocytes T des promoteurs humains et des aptamères anti-CD3 développés en interne. Enfin le modèle de lymphome choisi et basé sur l’injection systémique de cellules Ramos humaines exprimant la Luciférase est également un modèle reconnu qui a été utilisé pour l’évaluation préclinique de différents agents anti-cancéreux. Les animaux utilisés seront adultes. Ce choix est nécessaire pour pouvoir injecter des volumes d’au moins 250 µL en iv ou 450 µL en perfusion contrôlée et lente (22,5 µL/min) étant contraints par les titres (nombre de particules virales infectieuses) de nos préparations de lentivecteurs. Après réception dans l’animalerie et observation de la quarantaine, une période supplémentaire de 2 semaines d’acclimatation des animaux à leur nouvel environnement et régime alimentaire sera respecté afin de réduire autant que possible l’état de stress des individus et ainsi avoir des animaux dans un état général optimal pour supporter des anesthésies générales répétées.
Etude de l’effet anti-tumoral d’un inhibiteur de kinases dans un modèle de tumeurs coliques spontanées chez la souris
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
46 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Génétiquement modifiées pour développer des tumeurs coliques spontanées, elles reçoivent du tamoxifène puis un inhibiteur de kinases par gavage deux fois par semaine pendant un mois, avant mise à mort et prélèvement des intestins. Le porteur indique que les adénomes peuvent provoquer perte de poids, diarrhées, prolapsus et saignements rectaux, et vise à tester cet inhibiteur en prévention chez des familles à risque. Il affirme que la carcinogenèse spontanée reste le modèle le plus adapté et ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
La survenue d'un cancer est, en partie, le résultat d’un défaut du système immunitaire, due en particulier au potentiel des cellules cancéreuses à inhiber ces cellules. La caractérisation de ces mécanismes a permis le développement de différentes stratégies thérapeutiques anti-cancéreuses telle l’immunothérapie. Le blocage des points de contrôle immunitaire est, de nos jours, l'immunothérapie la plus développée et la plus utilisée. Cependant, malgré des résultats concluants, cette immunothérapie n’est pas efficace chez tous les patients et ne peut être utilisée en prévention de l’apparition de la tumeur. Ainsi, la mise au point de nouvelles stratégies d'immunothérapies utilisant de petites molécules au moins aussi efficaces et utilisables de manière préventive, reste une nécessité. Il est maintenant bien documenté que les protéines kinases jouent un rôle dans le développement de la tumeur, d’où leur ciblage comme stratégie dans les traitements des cancers. Parmi ces inhibiteurs de kinase, le H89 induit une régression tumorale dans un modèle de cancer colique chez la souris. Cet effet antitumoral nécessite la présence d’un système immunitaire efficace. De manière très intéressante, nous avons pu montrer que l’injection préalable de H89 à la greffe des cellules tumorales chez la souris, inhibait la prise tumorale. Ce projet a pour but de mettre en évidence la capacité du H89 à prévenir le développement de tumeurs en utilisant cette fois-ci un modèle de souris génétiquement modifiées dans lesquelles se développe des tumeurs coliques spontanées.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus dans ce projet sont un retard dans le développement des tumeurs coliques, voir une inhibition totale de l’apparition de ces tumeurs. Ce projet a pour but de montrer l’intérêt d’utiliser en prévention cet inhibiteur de kinases dans les familles porteuses de mutations les rendant susceptibles au développement de tumeurs coliques.
Procédures
Les animaux recevront des injections intrapéritonéales ou des gavages de tamoxifène pendant 5 jours puis recevront ou non le H89 par gavage 2 fois par semaine, pendant 1 mois.
Impact sur les animaux
Dans la première procédure permettant de déterminer la dose et voie d’administration du tamoxifène, nous ne nous attendons pas à avoir d’effets indésirables. La voie ip à 1 mg est décrite dans la littérature comme n’induisant pas d’effets indésirables. L’administration par gavage est également largement décrite dans la littérature et connue elle aussi pour n’induire aucune toxicité sur cette courte durée. Dans la deuxième procédure, les souris vont développer une carcinogenèse colique sous 135 jours selon le modèle décrit dans la littérature. Pendant cette période, la formation des adénomes au niveau intestinal peut générer dans de rares cas de la perte de poids, des diarrhées, des prolapsus et saignements rectaux.
Devenir
A l’issu de ces procédures, tous les animaux seront mis à mort par dislocation cervicales sous anesthésie à l’isoflurane et les intestins seront alors collectés pour vérifier l’apparition de la mutation (Procédure 1) et des adénomes coliques (Procédure 2).
Remplacement
L’utilisation d’un modèle animal est nécessaire pour évaluer l’efficacité d’une molécule à inhiber le développement spontané d’une tumeur. La carcinogenèse est un processus lent et complexe nécessitant un dialogue entre la cellule cancéreuse porteuse de la mutation et le microenvironnement tumoral. Les modèles de tumeurs greffées chez la souris ne permettent pas d’avoir à faire à une carcinogenèse similaire à celle retrouvée chez l’Homme. Le modèle de carcinogenèse spontanée chez la souris reste le modèle le plus adapté pour répondre à cette question.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, nous réalisons une première procédure nous permettant de mettre au point l’utilisation du tamoxifène pour induire la mutation dans les cellules épithéliales coliques. Cette procédure sera réalisée sur 2 groupes de 3 souris. Après avoir validé l’un ou l’autre des modes d’administration du tamoxifène, nous pourront réduire les groupes d’animaux (traités ou non-traités) à 20 animaux et utiliser le test statistique de Kruskal-Wallis pour déterminer la significativité des résultats.
Raffinement
L’hébergement se fera en groupe pour éviter le stress. Du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Le développement des adénomes au niveau intestinal peut générer dans de rares cas la perte de poids, des diarrhées, des prolapsus et saignements rectaux. Nous calculerons deux fois par semaine le score clinique des souris grâce à une échelle de score prenant en compte les critères suivants : perte de poids, saignement rectal, prolapsus rectal, diarrhée, comportement et apparence. L’addition du score de chaque critère donnera une note sur 18. Le suivi des souris passera à 3 fois par semaine lorsque le score atteindre les 2/18, un score de 6 entraînera la mise à mort des souris par dislocation cervicales après anesthésie à l’isoflurane.
Choix des espèces
Ce modèle de souris C57Bl6 mutée (Apclox/+Vil creERT2) représente le modèle idéal permettant de reproduire le développement de tumeurs coliques spontanées. L’injection de tamoxifène doit être réalisée lorsque les souris ont entre 6 et 8 semaines selon les données de la littérature.
Essai de thérapie cellulaire de la sclérose en plaques en utilisant des cellules B régulatrices chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
1 608 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une encéphalomyélite auto-immune est induite sous anesthésie puis les souris reçoivent, selon dix-neuf protocoles, des injections de cellules régulatrices et d'autres composés, développant une paralysie ascendante des membres avant une phase de rémission. Le porteur indique que les souris sont mises à mort si elles perdent plus de 20 % de leur poids ou en cas de paralysie complète, et vise à faire de cette approche une thérapie pour guérir la sclérose en plaques. Il conclut que les migrations cellulaires en jeu ne sont pas modélisables in vitro.
Objectifs
L'objectif du projet est de caractériser l'effet protecteur d’une thérapie cellulaire utilisant des cellules B régulatrices dans un modèle de sclérose en plaques (SEP).
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est l’optimisation de cette approche pour en faire une thérapie pour guérir la SEP.
Procédures
L'EAE sera induit dans les 1608 souris sous anesthésie générale. Ces souris suivront 19 traitements différents. Le nombre de souris est indiqué pour chaque traitement additionnel: 1) 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 2) 1 injection Bregs, analyse J30: 624 souris 3) 1 injection Bregs, 1 prélèvement de sang par veine mandibulaire, analyse J30: 24 souris 4) Analyse J7: 24 souris 5) 1 injection Bregs, analyse J7: 72 souris 6) Analyse J10: 24 souris 7) 1 injection Bregs, analyse J10: 24 souris 8) Analyse J17: 24 souris. 9) 1 injection Bregs, analyse J17: 24 souris 10) Analyse J19: : 48 souris 11) 1 injection Bregs, analyse J19: 144 souris 12) Analyse J30: 264 souris 13) 1 injection Bregs, 4 injections TACI-Ig, analyse J30: 24 souris 14) 1 injection anti-CD25, 1 injection Bregs, analyse J30: 24 souris 15) 1 injection anti-CD25, analyse J30: 24 souris 16) 3 injections toxine diphtérique, analyse J30: 48 souris 17) 3 injections toxine diphtérique, 1 injection Breg, analyse J30: 24 souris 18) 4 gavages tamoxifène, analyse J30: 48 souris 19) 4 gavages tamoxifène, 1 injection Bregs, analyse J30: 48 souris.
Impact sur les animaux
L'induction de l'EAE est faite sous anesthésie générale. Le protocole d'induction de l'EAE par immunisation a été optimisé pour que la maladie entre en rémission, et pour réduire le nombre de souris requises, en rapport avec les 3Rs. Les souris développent la maladie vers J11 avec une phase de paralysie ascendante atteignant un maximum vers J17 puis une rémission avec récupération des fonctions motrices des quatre membres vers J22. L’évolution de la maladie est suivie de manière quotidienne sur un maximum de 30 jours, exceptionnellement 40 jours en cas de délai de développement. Nous employons une échelle de scores internationalement reconnue comprenant 6 stades. Les souris développent en général un score de 3 qui correspond à une paralysie partielle des membres postérieurs pendant quelques jours au pic de la maladie avant d’entrer en rémission et atteindre un score 2 correspondant à une démarche anormale vers J22. Ces souris restent donc mobiles et peuvent accéder à la nourriture et l'hydrogel placés au fond de la cage avant rémission des signes cliniques. Les souris souris seront systématiquement mises à mort si elles atteignent une perte de poids supérieure à 20%, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et partielle des membres antérieurs durant 24 heures, ou bien une paralysie complète des membres postérieurs et des membres antérieurs. Avant le développement de l'EAE, les souris sont suivies avec une grille de score incorporant poids, apparence et comportement. Les souris sont mises un mort lorsque l'un des critères ou la somme des critères dépasse un seuil limite tel qu'une perte de poids supérieure à 20%, ou bien un comportement très agité ou immobile ou avec automutilation, ou bien une apparence avec un poil très ébouriffé, des yeux plissés ou bridés, ou une posture anormale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures. Ceci est justifié par le fait que le statut de leur système immunitaire sera alors caractérisé.
Remplacement
Les protocoles expérimentaux nécessaires pour ce projet ont été optimisés par des expériences in vitro en vue de remplacement pour réduire le nombre de souris nécessaires. En outre, le protocole pour produire des Bregs a été sélectionné suite à un long travail d'optimisation in vitro afin de générer des cultures ne contenant que des Bregs. Les propriétés moléculaires de ces Bregs ont déjà été étudiées in vitro afin de réduire le recours à l'expérimentation animale. Ce projet vise à caractériser l’effet de Bregs dans un modèle de SEP. Les réponses immunitaires se développent dans les organes lymphoïdes secondaires, et impliquent des processus d’interactions entre différents types cellulaires et de migrations cellulaires qui ne sont pas modélisables in vitro actuellement. Les maladies auto-immunes du SNC impliquent aussi la migration des cellules du système immunitaire dans le SNC, puis l’interaction de ces cellules avec des cellules résidentes du SNC. Ces processus ne sont également pas étudiables in vitro. Il n’y a donc pas d’alternative au fait de conduire les investigations décrites chez la souris.
Réduction
Le protocole d'induction de l'EAE a été optimisé de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Les mesures de remplacement et de raffinement décrites en 1 et en 3 ont également permis de réduire le nombre de souris nécessaires pour ce projet.Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum pour avoir des résultats statistiquement interprétables. Cest estimations sont basées sur notre expérience, et les estimations obtenues avec le programme d'analyse de puissance statistique G*Power.
Raffinement
Le protocole d'induction de l'EAE a été raffiné de manière à ce que les souris entrent en rémission rapidement après un court épisode clinique afin de réduire la souffrance des animaux. Le protocole a de plus été raffiné de manière à ce que la maladie se développe de manière homogène chez les souris identiques génétiquement, ce qui permet de réduire le nombre de souris utilisées tout en permettant d'obtenir des résultats statistiquement valides. Nous avons établi pour chaque procédure des points limites qui permettent d'éviter toute souffrance indésirable des souris. Les animaux sont hébergés par groupe de 5 par cage maximum et ne sont jamais isolés. Des objets sont ajoutés dans leurs cages pour enrichir leur environnement. Ils sont observés tous les jours par le personnel de l'animalerie formé au bien-être animal, et les expérimentateurs. Le score clinique et le poids sont mesurés quotidiennement.
Choix des espèces
Le modèle d’EAE chez la souris proposé est bien standardisé. Le savoir disponible sur ce modèle permet de mieux définir les plans d’expérience et donc de réduire le nombre de souris nécessaires. De nombreux outils sont disponibles pour ce modèle, qui permettent d’aborder les problématiques posées de la manière la plus pertinente, et de récupérer le maximum d’information. Ce modèle expérimental a été utilisé pour le développement de thérapies aujourd’hui utilisées chez les patients atteints de SEP. Bien que ce modèle ne soit pas un calque parfait de la SEP, c’est un modèle utile pour le développement de pistes thérapeutiques pour cette pathologie humaine. L’utilisation de souris de fond génétique C57BL/6 de 6 à 14 semaines est appropriée pour ces études.
Altération de la myéline, activité cérébrale et cognition – étude pilote
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
16 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont six dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent de la cuprizone dans leur nourriture pour détruire la myéline de leur cerveau, subissent des craniotomies avec ou sans réveil pour enregistrer l'activité cérébrale, puis une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour extraire le cerveau. Cette étude pilote cherche à relier renouvellement de la myéline et cognition, dans l'espoir lointain de mieux comprendre la sclérose en plaques et le vieillissement. Le porteur reconnaît l'absence de base statistique pour fixer le nombre d'animaux et conclut qu'aucune méthode ne remplace l'expérimentation animale.
Objectifs
Comprendre le fonctionnement du cerveau et traiter ses troubles nécessitent d’étudier cet organe complexe à plusieurs niveaux d’analyse, ce qui n'est pas encore possible sur des modèles in vitro. En l’absence d’alternatives adéquates, répondre à ces questions nécessite hélas encore à ce jour le recours à l’expérimentation animale. En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement.
Bénéfices attendus
En apportant de nouvelles connaissances sur les réseaux neuronaux impliqués dans la cognition, ce projet permettra à plus long-terme de mieux comprendre la sclérose en plaques ou bien les troubles associés au vieillissement. Ce projet s’inscrit donc dans un cadre de santé publique.
Procédures
Les animaux seront soumis : - Traitement Cuprisone qui induit une démyélinisation transitoire ; ce traitement est donné dans la nourriture - Procédures chirurgicales (craniotomies) sans réveil sous anesthésie générales et analgésie afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées - Procédures chirurgicales (craniotomies) sous anesthésie générale et analgésie avec réveil et traitement adapté de la douleur éventuelle, afin d’enregistrer l’activité cérébrales avec des sondes adaptées chez l’animal vigile - Perfusion intracardiaque sous anesthésie générale et analgésie profondes dans le but d’extraire les cerveaux
Impact sur les animaux
Le modèle à la Cuprisone et les techniques d'enregistrement utilisés dans ce projet sont maitrisés depuis longtemps par les experimentateurs
Devenir
Procédure #1 : 10 souris traitées à la Cuprisone + 6 contrôles maintenues en vie. Procédure #2 : réutilise toutes les 16 souris issues de la procédure #1 10 souris traitées à la Cuprisone, dont 4 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 6 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux ; 6 souris contrôles, dont 2 seront gardée en vie pour entrer dans la procédure #3 et 4 sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux. Procédure #3 : réutilise 4 souris traitées à la Cuprisone et 2 souris contrôles préalablement enregistrées dans la procédure #2. Elles entreront en fin de procédure dans la #4. Procédure #4 : réutilise les 6 souris issues de la procédure #3 où elles sont euthanasiées afin de réaliser des analyses neuroanatomiques sur les cerveaux.
Remplacement
Le cerveau est un des organes les plus complexes, et l’objectif de ce projet est de décrypter le lien possible entre le renouvellement physiologique et pathologique de la myéline. Le caractère méconnu du fonctionnement cérébral implique que ce projet ne peut pas se passer de l'utilisation d'animaux afin d'en déterminer les mécanismes. Il n’existe pas de méthode alternative à l’expérimentation animale pour réaliser ce travail.
Réduction
Il s’agit d’une étude pilote et il n’y a pas de bases statistiques pour définir le nombre d’animaux. Compte tenu du caractère individuel des lésions, l’unité expérimentale correspond à l’animal. Seulement deux groupes d’animaux (contrôles et traités) seront utilisés, et le nombre d’animaux par groupe a été optimisé à 6 et 10 respectivement pour réduire au minimum le nombre de souris tout en obtenant des résultats significatifs. Sur la base de notre expérience en neurophysiologie, nous estimons que 6 à 10 animaux par groupe représentent un nombre nécessaire et suffisant.
Raffinement
Ce projet propose des méthodes pertinentes pour limiter la douleur, la souffrance, le stress et l’inconfort. Nous avons mis en place des points limites adaptés et précoces pour chaque procédure (comme les interventions chirurgicales) et une réponse rapide (suivi post-opératoire, analgésie (Buprécare 0,05mg/kg/24h sCut et Metacam 1mg/kg/24h sCut), suivi quotidien des animaux). Tous les actes invasifs seront pratiqués sous anesthésie générale utilisant une association de kétamine-xylazine (100 mg/kg et 10mg/kg) - Buprécare 0,05mg/kg et ropivacaïne (2mg/kg). Le bien-être animal est aussi privilégié au niveau des conditions d'hébergement (animaux à plusieurs dans de grandes cages, eau et nourriture ad libitum, enrichissement avec nid végétal, tubes en cartons et divers objets) pour minimiser le stress et être au plus près du comportement naturel de l'espèce animale.
Choix des espèces
La myéline compacte telle qu’on la trouve chez l’homme n’existe pas chez les Invertébrés ; c’est une « astuce » de l’évolution permettant d’accélérer la vitesse de conduction du signal en adéquation avec l’augmentation de la taille des organismes. C’est pourquoi nous avons besoin d’un modèle animal vertébré. Parmi ceux-ci, les rongeurs sont particulièrement intéressants de par leur capacité à remyéliniser assez efficacement après lésion. Le modèle utilisant la Cuprisone chez la souris est le modèle de référence. De plus, les dynamiques cérébrales générales analysées dans ce projet sont conservées entre les rongeurs et l’Homme. Les résultats de notre étude permettront de mieux extrapoler les mécanismes cérébraux chez l’Homme. Les expérimentations seront initiées sur des souris adultes soit relativement jeunes (2-3 mois) soit plus âgés (6-8 mois), dont certaines seront conservés pendant 6 mois avant sacrifice (à ce moment les souris seront alors âgées de 8 à14 mois).
Etude des voies de signalisation RAGE dans le syndrome sec oculaire
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une sécheresse oculaire par des injections de scopolamine quatre fois par jour et une exposition à un courant d'air continu dix heures par jour pendant douze jours, avec suivi de la production de larmes et de l'état de la cornée. Le projet étudie le rôle d'un récepteur, RAGE, dans cette pathologie, sur des souris dont ce gène est inactivé. Le porteur affirme que l'étude "ne peut pas" être menée chez le patient pour des raisons éthiques et que la règle des 3R ne permet pas de remplacer le modèle animal.
Objectifs
L'oeil sec est une pathologie de la surface oculaire, très fréquente, touchant environ 50 à 60 % des personnes de plus de 50 ans. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. Considérant la règle des 3R, nous ne pouvons pas recourir au remplacement du modèle animal décrit.
Bénéfices attendus
Le récepteur des produits avancés de glycation (RAGE) est un récepteur ubiquitaire dans l'organisme, connu pour être pro-inflammatoire, pro-thrombogène, ou encore pro-apoptotique au niveau cellulaire. Notre objectif est de caractériser le récepteur RAGE, ses voies cellulaires, et l'expression phénotypique du syndrome sec oculaire dans plusieurs tissus et fluides de l'oeil (cornée, conjonctive, cellules à mucus, larmes) ainsi qu’au niveau physiologique (développement de la maladie) chez des souris KO RAGE -/- et chez des souris "sauvages" soumises à des conditions environnementales connues pour être à risque de syndrome sec oculaire. Ainsi, nous essayons par ce projet de mieux connaitre les voies d'activation cellulaire de RAGE dans la pysiopathologie du syndrome sec oculaire. Un des bénéfice majeur de ce travail pourrait être une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques complexes du syndrome sec oculaire, notamment les voies d'activation de l'inflammation au niveau de la surface oculaire.
Procédures
Des souris KO RAGE -/- et des souris "sauvages" RAGE +/+ de la lignée C57 Black 6 (âgées de 4 à 6 semaines) seront soumises à des stimuli environnementaux connus pour être à risque de survenue de sécheresse oculaire (comme une attention soutenue sur une tâche nécessitant de la concentration, et/ou une condition venteuse avec hygrométrie faible). En parallèle, des souris témoins des 2 fonds génétiques seront utilisés comme contrôle de l’expérimentation. Dans un premier temps, l’ensemble des souris seront placées dans leur cage en condition standard pendant 8 jours: température 23 +/- 2°C, humidité 50 à 75%, alternance 12 heures lumière - obscurité (8h to 20h), et eau/alimentation ad libitum. Pour les groupes « oeil sec », l’induction du syndrome se fera par l’injection sous-cutanée 4 fois par jour (8h00, 12h00, 14h00 et 17h00) de scopolamine (0.5 mg/0.2 ml; Sigma-Aldrich) en alternant le flanc gauche et droit. Les souris seront de plus exposées à un courant d'air continu à partir d'un ventilateur placé à 15 cm devant la cage (courant d’air de 2-4 m/secondes) dans une pièce à environnement contrôlé (30-35 % humidité, 23°C, alternance jour/nuit 12h) et ce pendant 10 heures par jour durant 12 jours consécutifs. Le modèle de maladie de l’oeil sec proposé dans ce projet a déjà largement été utilisé sans effet nocif perceptible lié au traitement à la scopolamine ni à une faible humidité [Luo, L. et al., 2004 ; Yeh, S. et al., 2003]. Pour les groupes témoins, les souris seront placées dans un environnement non stressant contenant 50 à 75% d'humidité à la température de 23 +/- 2°C, sans exposition à l'air forcé et eau/alimentation ad libitum. Lors de l’expérimentation, des tests « non invasifs » seront réalisés afin d’évaluer au jour le jour l’avancée du syndrome . Tout d’abord, la perte de production de larmes sera testée en utilisant des fils de coton imprégnés de rouge de phénol qui seront placés dans le ménisque des larmes du canthus latéral pendant 30 secondes (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation). Ce test est considéré comme équivalent au test de Schirmer mené chez les patients souffrant d’un syndrome de l’oeil sec (bandelette buvard graduée permettant de quantifier la production lacrymale sur 5 minutes). En parallèle, l’étude de l’intégrité des épithéliums sera réalisée en utilisant l’instillation de fluorescéine (1%) et l’utilisation d’une lampe à fente (1 fois par jour pendant la durée de l'expérimentation).
Impact sur les animaux
La provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les symptômes de syndrome sec oculaire sont une sensation de corps étrangers, une brulure oculaire, une rougeur oculaire et une irritation de surface. Cependant, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).
Devenir
Tous les animaux sont sacrifiés avant prélèvement de leurs globes oculaires.
Remplacement
La conduite de cette étude sur l’oeil sec in-vivo ne peut pas être menée directement chez le patient pour des raisons éthiques évidentes. Ainsi, celle-ci nécessite un organisme vivant, afin d’avoir une vue d’ensemble sur le développement de la maladie et sur les acteurs impliqués dans la survenue et le caractère cyclique de cette pathologie. De nombreux travaux déjà publiés sur l’étude des anomalies de la surface oculaire (cornée, conjonctive, larmes) ont établi que l’utilisation du modèle souris apparaissait comme la meilleure solution. De plus, l’équipe de recherche possédant et utilisant déjà la lignée RAGE -/-, ce choix apparait de fait logique et justifié. Enfin, ce cercle vicieux de l’oeil sec et son processus pathologique dynamique pourront être étudiés sur ce modèle et corrélés avec les agressions subis par l’oeil humain et les capacités de cicatrisation de ce type de tissu vivant. Considérant la règle des 3R, pour le remplacement nous avons réalisé toutes les premières études en utilisant des cellules en culture afin d'éviter l'inclusion d'un trop grand nombre d'animaux.
Réduction
Afin d'inscrire cette expérimentation animale dans le cadre de la Règle des 3R (Réduire, Raffiner, Remplacer), nous réduirons notre étude à 4 groupes distincts (pour tenir compte de la variabilité expérimentale): chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 souris. Pour rappel: Ce protocole expérimental utilisant la souris nécessitera la constitution de 4 groupes distincts dont les effectifs ont été calculés pour réduire au maximum le nombre de souris afin d'optimiser la puissance statistique. En tenant compte de la variabilité expérimentale concomitante à la conduite de tels projets chaque groupe sera constitué de 10 souris pour un effectif total de 40 : Groupe 1 : Souris Wild-Type *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 2 : Souris RAGE -/- *Groupe contrôle (effectif :10); Groupe 3 : Souris Wild-Type *Groupe OEil-sec (effectif :10); Groupe 4 : Souris RAGE -/- *Groupe OEil-sec (effectif :10). Ces effectifs nous permettront d’obtenu des tests statistiques non paramétriques (Kruskal-Wallis et Mann-Whitney U test).
Raffinement
Dans l'optique de raffiner au mieux notre protocol, nous veillerons au bien-être animal (pas de surpopulation dans les cages, éviter les actes douloureux inutiles, enrichissement des cages avec des roues de course, des tubes en plastique, boîtes en carton et des matériaux de nidification). Points Limites: la provocation expérimentale d'un oeil sec n'est pas anticipé comme étant une condition risquant de provoquer une douleur majeure ou une angoisse animale. Les signes cliniques et fonctionnels du syndrome sec oculaire sont minimes à modérés: une gène oculaire à type de grains de sable, des sensations de brûlures oculaires superficielles, un prurit, une vision trouble fluctuante. L'ensemble de ce protocole ne doit pas normalement entrainer de souffrance animale. Malgrès tout, en cas de constation d'un comportement douloureux (intolérance majeure à la lumière, animal prostré, ne s'alimentant plus) ou d'un ulcère cornéen profond (stromal profond de la cornée) et/ou à risque de perforation cornéenne, l'animal sera anesthésié et sacrifié par surdosage en produits anesthésiques (Pentobarbital 150 mg/kg en injection intrapéritonéale), aboutissant à une apnée conduisant au décès. Ce type de symptômes ou constation clinique est exceptionnellement lié à un syndrome sec oculaire chez l'Homme. Ils sont le plus souvent dus à des commorbidités oculaires sous jacentes (pathologies inflammatoires, troubles liés à l'innervation cornéenne, anomalies des cellules souches limbiques, pathologies infectieuses cornéennes).
Choix des espèces
Comme évoqué dans les paragraphes précédents, le choix de la souris comme modèle d’étude va permettre : - une analyse biomoléculaire proche de la cornée humaine du fait de sa forte homologie anatomique et fonctionnelle avec l’espèce humaine. - l’utilisation du modèle murin dans le syndrome sec expérimental qui est d’ores et déjà largement décrit et reconnu au travers de la littérature. - d’utiliser les nombreux outils moléculaires accessibles, développés et validés dans le modèle murin ; et en particulier l’utilisation de souris dont le gène étudié (RAGE) est inactivé. Nous utiliserons des souris mâles Black 6 (souris « C57BL/6JRj, Janvier Labs ») âgées de 4 à 6 semaines. Ainsi toutes les souris ont le même poids et sont sevrées de l’allaitement maternel. C’est également la période optimum pour la cicatrisation des tissus.
Plateforme comportement rongeur : Validation méthodologique et formation utilisateurs
- Enseignement supérieur
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Rats : 70
1 140 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 360 dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. Ils sont placés dans des tests de comportement dont la durée va de quelques minutes à plusieurs heures, répartis en trois classes de gravité sans que le résumé précise en quoi consiste le test sévère. Ces manipulations ne visent pas à produire des connaissances mais à valider les appareils d'une plateforme de comportement et à former ses utilisateurs. Le porteur affirme que le recours aux souris et aux rats est une "étape obligatoire" impossible à remplacer.
Objectifs
Le projet vise à 1- évaluer les tests comportementaux présents dans la plateforme, à valider les différentes méthodes possibles et de créer une base de données sur les modèles commerciaux couramment utilisés au sein de l'institut et 2- former les utilisateurs aux tests au sein de l'institut par petit groupe de 2-3 personnes maximum donnant lieu à un suivi des validations internes des personnels.
Bénéfices attendus
La plateforme a pour vocation de former les utilisateurs aux différents appareillages de mesure comportemental utilisés par ces derniers. Pour cela, la plateforme pourra mettre à disposition les lots d'animaux à des fins éducatives. Les données recueillies serviront de base aux analyses des utilisateurs de la plateforme
Procédures
Dans les trois procédures, de classe légère (procédure 1), de classe modérée (procédure 2) et de classe sévère (procédure 3), les animaux sont placés dans le test et la réponse comportemental est observée. La durée d'observation dépend du test et s'étale de quelques minutes à plusieurs heures en fonction du test
Impact sur les animaux
Aucun, nous utiliserons tous les méthodes adéquates pour l'hébergement et les grilles d'évaluation de la réponse comportementale en fonction des tests.
Devenir
Procédure 1 (comportement de classe légère) : euthanasie, procédure 2 (comportement de classe modérée), procédure 3 (comportement de classe sévère)
Remplacement
S’agissant d’une plateforme comportement rongeur, le recours à des souris et des rats est une étape obligatoire du processus. Il nous est impossible de substituer ces travaux avec d’autres méthodes n’utilisant pas ces animaux.
Réduction
le nombre d'animaux utilisés est réduit au maximum mais doit permettre une formation adéquate des utilisateurs
Raffinement
raffinement, les procédures prennent en compte des temps de récupération et des nombres d’essais visant à réduire le stress et la fatigue des animaux. les animaux sont hébergés en groupe jusqu'à 6 animaux par cage, dans un milieu enrichi avec un nid et une maisonnette si l'animal est hébergé individu. Le monittoring de la température, de l'hygrométrie ainsi que le suivi est réalisé quotidiennement
Choix des espèces
la plateforme est dédiée à l’étude comportementale des rongeurs. Notre projet nécessite donc l’utilisation de souris et de rats. Les animaux seront utilisés après sevrage et jusqu’à 24 mois . Nous réaliserons la formation des utilisateurs en fonction de la thématique de recherche et des modèles animaux utilisé: par exemple maladie d'Alzheimer avec des animaux de plus de 10 mois et maladie de Charcot avec des animaux au sevrage et 2/3 mois, dans ce cas les animaux sont identifié par tatouage car génotypé entre P10-P115. Pour l'évaluation et la validation des aspects méthodologiques de ces tests comportementaux, nous utiliserons des modèles commerciaux de 2 /3 mois. Dans ce cas, les animaux ne sont pas génotypés et sont marqués sur la queue avec un stylo.
Evaluation préclinique de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires articulaires chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
Rats : 6300
29 500 rongeurs, des souris et des rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont plus de vingt-sept mille dans des procédures classées d'un niveau de souffrance sévère. On leur provoque une polyarthrite rhumatoïde par injections de collagène dans la queue ou une arthrite psoriasique par un vecteur viral, ce qui gonfle et enflamme les articulations, puis on leur administre des composés par gavage. Le projet sert à évaluer des candidats médicaments anti-inflammatoires déjà criblés sur cellules. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux modèles animaux et renvoie les bénéfices pour les patients à un horizon lointain.
Objectifs
Les maladies inflammatoires articulaires peuvent divisées en en deux catégories, la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP). - La PR est une maladie auto-immune plurifactorielles qui survient vers 45 ans avec une prévalence de 0.5-0.8% de la population générale. - L’AP est une forme d’arthrite inflammatoire qui survient ordinairement chez des personnes atteintes d’un psoriasis. De 10 à 30 % des personnes atteintes de psoriasis seront atteintes d’AP. Cette pathologie touche autant les hommes que les femmes et se manifeste généralement entre 20 et 50 ans. Il n’existe aucun moyen de guérir l’AP, mais grâce à un diagnostic précoce et à un traitement approprié, il est possible de maîtriser la maladie et de prévenir les lésions articulaires graves. Ces deux maladies inflammatoires articulaires se caractérisent par une atteinte et une dégradation osseuse de l’articulation conduisant à un enraidissement douloureux puis à une incapacité du patient à mobiliser l’articulation affectée. De nombreux patients ne répondent pas aux traitements actuels qui reposent sur les antiinflammatoires non-stéroïdiens, les corticoïdes et les immunosuppresseurs, des anticorps monoclonaux anti-CD20, des anti-TNFa ou encore des anti-IL-6. Des traitements plus performants sont nécessaires. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de maladie inflammatoire articulaire.. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules utilisées chez les animaux ont préalablement été testées et validées in vitro.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de polyarthrite rhumatoïde et d’arthrite psoriasique.
Procédures
Dans ce projet, les souris recevront 2 injections indradermiques de collagène dans la queue pour les modèles de polyarthrite rhumatoïde. Un modèle AP inductible par une unique injection intraveineuse d'une vecteur viral codant une cytokine pro-inflammatoire sera également utilisé chez la souris. Nous utiliserons également des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.
Impact sur les animaux
Les animaux developperont les signes cliniques de la la polyarthrite rhumatoïde (PR) et l’arthrite psoriasique (AP) qui se caractérisent un gonflemment et une inflammation des articulations du poignet et des doigts.
Devenir
Tous les animaux inclus dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptée à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analgesie sera prévu. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature
Travaux pratiques d’une formation pour être concepteur de projet ou applicateur de procédures expérimentales, modèles rat et souris
- Formation professionnelle
Rats : 600
1 200 rongeurs, six cents souris et six cents rats, vont être utilisés dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger, réutilisés ensuite dans d'autres travaux pratiques. Ils servent à entraîner des stagiaires aux gestes de base, préhension, contention, injection intra-péritonéale de sérum physiologique, et à des tests de comportement, open-field, labyrinthe en croix surélevée, planche à trou et chambre claire-obscure. Ces manipulations n'ont pas de finalité de connaissance mais visent la formation réglementaire des concepteurs et applicateurs d'expériences. Le porteur affirme qu'aucune méthode de substitution ne restitue les comportements de l'animal et que les gestes doivent être acquis sur l'espèce cible vivante.
Objectifs
Les personnels des établissements utilisateurs d'animaux à des fins scientifiques ont pour obligation d'être compétents en expérimentation animale. Cette compétence repose pour les concepteurs sur un niveau de formation initiale, une formation spécialisée et une formation continue. Pour les applicateurs, la compétence repose sur la formation spécialisée et la formation continue. Le projet de travaux pratiques présenté ici comprend la partie pratique des deux programmes de formations spécialisées "concepteur" et "applicateur". Il comprend deux procédures expérimentales : un TP pour acquérir les gestes de base : préhension, contention, administrations, prélèvements et un TP pour se familiariser aux tests de comportements pratiqués chez les rongeurs : Open-field, Labyrinthe en croix surélévée, planche à trou, chambre claire-obscure.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont l'apport d'une compétence pratique à la préhension, la contention, certaines techniques d'administration et de prélèvements et de se familiariser à des tests simples mais néanmoins informatifs pour l'étude du comportement des animaux.
Procédures
Pour le TP sur les gestes de base, les actes les plus contraignants sont l'administration de sérum physiologique en intra-péritonéale (piqûre d'aiguille). Ce sont dans les deux cas des gestes brefs qui durent quelques secondes. Pour le TP sur le comportement, les actes expérimentaux réalisés sur les animaux ne sont pas douloureux, tout au plus, il sont stressés quelques minutes du fait d'un environnement nouveau. Les trois tests expérimentaux durent entre 3 et 10 min chacun. Les deux TP sont des procédures expérimentales de classe légère.
Impact sur les animaux
Les animaux vont être manipulés en réduisant au maximum les nuisances, car ils le seront selon les recommandations du Centre 3R anglais. Les nuisances les plus importantes seront tout au plus de gravité légère et comprennent une administration intra-péritonéale (nuisance équivalente à une piqûre d'aiguille).
Devenir
Les animaux seront réutilisés car ils auront été impliqués dans des procédures légères uniquement.
Remplacement
Pour ce projet, il n'existe pas de méthodes de substitution qui pourrait restituer fidèlement les comportements et réactions des animaux qui peuvent être complexes. Les gestes étant spécifiques de l'espèce rat ou souris, ils doivent être acquis chez l'espèce cible. Toutefois, des outils vidéos en provenance d'une source reconnue de tous (NC3R = Centre 3R anglais) et d'un intérêt indéniable seront utilisés en tout premier lieu, avant la pratique car ils présentent des méthodes modernes, de préhension/contention par exemple. La mise en place des TP sur animaux vivants est donc complétée par une approche préalable complémentaire basée sur les vidéos du centre NC3R. Les gestes ou approches à acquérir imposent que l'animal soit vivant pour évaluer les critères de réussite.
Réduction
Nous sommes attentifs à réduire au maximum le nombre d'animaux, à un rat et une souris par stagiaire, ce qui permet d'atteindre l'objectif pédagogique visé. Par ailleurs, les animaux impliqués dans le TP comportement, nécessairement naïfs, seront utilisés dans un second temps pour le TP gestes de base, permettant de mutualiser l'utilisation d'animaux entre les différentes procédures. Ils ne seront pas euthanasiés mais seront également impliqués quelques mois après la formation dans d'autres TP universitaires (qui feront l'objet de demandes d'autorisation de projet indépendantes de celle-ci).
Raffinement
Les animaux impliqués dans les procédures expérimentales de ce projet sont hébergés dans la zone d'hébergement pendant plusieurs semaines avant les TP, avec une enrichissement social et physique (acclimatation). Les procédures menées sont tout au plus de classe légère (administration intra-péritonéale de sérum physiologique). Les tests de comportement sont tout au plus un peu stressants pour les animaux. Dans ces conditions, aucune administration d'antalgique ne sera réalisée car elle n'est pas pertinente. Les autres gestes comme la préhension et la contention ne sont pas douloureux. Toutefois, une attention particulière sera portée à l'atteinte de potentiels points limites qui sont malgré tout très peu probables.
Choix des espèces
Les espèces qui seront utilisées dans ce projet correspondent aux espèces cibles, c'est à dire aux espèces du module complémentaire de la formation règlementaire en expérimentation animale. Ce sont les espèces dont les stagiaires auront besoin pour leurs futures activités de recherche. Les animaux seront des animaux matures de six semaines au moins. Nous utilisons ces stades car les animaux adultes correspondent aux animaux utilisés classiquement pour les tests de comportement prévus. Ce sont par ailleurs des stades où les animaux sont facilement manipulables pour les travaux pratiques (sachant que nous choisissons des souches d'animaux connus pour être calmes).
Traitement de la cholestase hépatique par ciblage des protéines de jonctions serrées
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un régime enrichi en DDC leur provoque une cholestase du foie, puis elles reçoivent sept injections intra-péritonéales hebdomadaires et subissent sept prélèvements sanguins par voie rétro-orbitaire sous anesthésie, avant un prélèvement terminal par ponction cardiaque. Le projet teste un anticorps pour élargir les indications d'un traitement déjà en développement clinique. Le porteur affirme qu'aucun test sur cellules ne reproduit la fibrose du foie et que les maladies hépatiques "ne sont pas douloureuses".
Objectifs
L'objectif du projet est d'étudier le potentiel thérapeutique d'un anticorps monoclonal ciblant la protéine de jonctions serrées Claudine-1 pour le traitement des cholestases hépatiques.
Bénéfices attendus
Ce projet doit nous permettre de démontrer l'eeficacité de notre anticorps anti-Claudine 1 dans les cas de fibrose induits suite au développement d'une cholestase hépatique. Cet anticorps étant déja en développement clinique pour le traitement de la fibrose dans les cas de stéato-hépatite non alcoolique et pour le traitement du carcinome hépatocellulaire, cette étude nous permettrait d'envisager une extension des indications thérapeutiques afin de faire bénificier un maximum de patients de cette option de traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis à une injection IP hebdomadaire sur animal vigile pendant 7 semaines, soit 7 injections. Les animaux subiront un prélèvement sanguin hebdomadaire, sur animal anesthésié à l'isoflurane et ayant reçu une analgésie locale à la tétracaïne 1% en collyrepar, voie rétro-orbitaire pendant 7 semaines, soit 7 prélèvements. Un prélèvement de sang terminal sera effectué en fin de protocole, sur animal anesthésié à l'isoflurane, par ponction intracardiaque trans-thoracique.
Impact sur les animaux
Les animaux qui seront sous nourriture + DDC pendant 8 semaines, vont développer une cholestase hépatique rapide en 2 à 4 semaines. Les maladies hépatiques ne sont pas douloureuses est sont compatibles avec une vie normale, sauf en cas extrême de décompensation des fonctions hépatiques, ce qui ne sera pas le cas avec le protocole adopté dans ce projet. Les animaux recevront un total de 7 injections IP d'anticorps ou de véhicule, soit 1 par semaine pendant 7 semaines, ce qui ne devrait engendrer aucune douleur ni souffrance sur la durée du protocole.
Devenir
Afin d'analyser l'effet thérapeutique de notre anticorps sur la fibrose hépatique, tous les animaux de chaque groupe devront être sacrifié afin de procéder à la collecte du foie et à un prélèvement sanguin terminal. Ces prélèvement nous permettront d'analyser les fonction hépatiques (sérum) et le niveu de fibrose hépatique suite au traitement (marquage histochimique du foie).
Remplacement
Il n’existe actuellement aucun test in vitro capable de récapituler la complexité du développement de la fibrose hépatique, notamment dans les cas de cholestases hépatiques qui impliquent l’obstruction des voies biliaires. Ainsi l’évaluation thérapeutique de nouvelles approches pour ces maladies hépatiques ne peut se passer de l’utilisation d’animaux.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’activité anti fibrotique de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. Nous utiliserons un total de 60 animaux répartis en 3 groupes, traité anticorps spécifique, anticorps isotypique et non traité.
Raffinement
Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi (souris + nourriture 0,1% DDC) permet de récapituler au plus proche les caractéristiques histologiques des cholestases hépatiques humaines en 4 à 8 semaines. Hormis le modèle de ligature du canal biliaire, beaucoup plus invasif, c’est actuellement le modèle le plus pertinent en termes d’homogénéité et de reproductibilité dont nous disposons pour étudier le développement de la fibrose suite à une cholestase hépatique. Les animaux seront utilisés à un âge de 8 semaines afin d’induire une cholestase hépatique adulte.
Evaluation de nouvelles molécules thérapeutiques pour le traitement des maladies inflammatoires cutanées chez le rongeur
- Recherche appliquée
- Troubles sensoriels
7 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées d'un niveau de souffrance léger. On leur provoque une dermatite atopique, un psoriasis ou une dermatite de contact par des agents chimiques ou biologiques, ce qui déclenche démangeaisons intenses, rougeurs et lésions cutanées, puis on leur administre des composés par gavage. Le projet, mené par une entreprise pharmaceutique, sert à sélectionner des candidats médicaments issus d'un criblage sur cellules. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours aux modèles animaux pour avoir une vue globale de la maladie et de la diffusion des composés.
Objectifs
Les maladies inflammatoires cutanées chroniques dont les plus fréquentes sont la dermatite atopique (DA) et le psoriasis (Pso) touchent entre 10 et 20% d’enfants en France et entre 2-3% de la population française, respectivement. Ces maladies se manifestent en poussées qui se caractérisent par des démangeaisons persistantes intenses, des rougeurs et des lésions cutanées récurrentes pouvant aller jusqu'à des surinfections impactant directement la qualité de vie des patients. Les origines de ces maladies restent complexes et multifactorielles (immunologiques, génétiques, environnementaux, infection bactérienne). D'autre part La dermatite de contact (DC) est une inflammation de la peau provoquée par le contact direct avec des irritants ou des allergènes. Les symptômes comprennent un prurit et parfois une douleur à type de brûlure. Les modifications cutanées comprennent un érythème, une desquamation, un gonflement de la peau et parfois des bulles et des ulcérations. Les traitements pour ces dermatites reposent sur des émollients et corticoïdes en application topique, des anti histaminergiques ainsi que la Puvathérapie. Cependant, ces traitements ne permettent pas de stopper la maladie mais de soulager les symptômes. D’où l’intérêt actuel de se focaliser sur de nouvelles thérapies avec le développement d’anticorps monoclonaux et de petites molécules inhibitrices. Galapagos a mis au point plusieurs tests in vitro permettant d’induire différentes voies de signalisation dans des cellules humaines ou murines. Grâce à la miniaturisation, nous avons pu mener plusieurs campagnes de criblage à haut débit qui ont permis d’identifier des molécules chimiques ou des cibles biologiques capables de bloquer ces voies de signalisation in vitro. Ces molécules vont être optimisées dans le but d’en faire des médicaments. Dans le cadre de ce projet, les candidats-médicaments qui auront montré un potentiel significatif d’inhibition des voies de signalisation ciblées dans les différentes pathologies seront retenus pour être évalués in vivo sur des modèles animaux. Ce programme de découverte de médicaments sera mené avec plusieurs séries chimiques agissant via des modes d’action moléculaires différents, mais tous pertinents dans l’objectif de diminuer les symptômes des différentes pathologies d’intérêt. Des combinaisons entre ces modes d’actions seront envisagées au cours de ce programme et testées sur les modèles animaux.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients.
Procédures
Dans ce projet, nous utiliserons des modèles de dermatite atopique, psoriasis et de dermatite de contact chez la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par des agents chimiques et/ou molécules biologiques en injection intradermique ou en application topique. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.
Impact sur les animaux
Les animaux developperont les signes cliniques des du psoriasis et de la dematites atopique et dermatite de contacte qui se caractérisent par des démangeaisons persistantes intenses, des rougeurs et des lésions cutanées récurrentes.
Devenir
Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.
Remplacement
L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.
Réduction
Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie sera envisagé par inhalation d’isoflurane (induction 4%, maintien 2%). De la buprénorphine à 0,01-0,2 mg/kg/8h en sous cutanée sera utilisée en cas de signes de douleur. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal
Choix des espèces
Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature