Souris

Les doses testées, les voies d'administration et le calendrier suivent les besoins du développement d'un médicament, jusqu'à la prédiction des doses cliniques chez l'être humain. 940 souris vont être utilisées pour cela, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules cancéreuses leur sont injectées directement dans le cerveau au cours d'une chirurgie de 45 minutes, ou par voie intraveineuse et intracardiaque, avant jusqu'à trois séances d'imagerie par semaine pendant huit semaines et des gavages ou injections répétés jusqu'à deux fois par jour. Le porteur reconnaît que les tumeurs cérébrales peuvent provoquer tremblements et convulsions, et prévoit de réutiliser dans un autre projet les 100 souris qui n'auront pas développé la tumeur attendue, les autres étant tuées pour prélèvement d'organes.

Objectifs

Ce projet consiste à évaluer chez la souris de nouveaux traitements pour les cancers du cerveau et/ou les métastases cérébrales, dont les besoins thérapeutiques sont non satisfaits. Pour ces modèles, des lignées cellulaires cancéreuses du cerveau, soit d’origine murine (syngénique) soit d’origine humaine (xénogreffe) seront inoculées directement dans le cerveau des souris par injection intracrânienne ou injectées par voie intraveineuse ou intracardiaque pour mimer le processus métastatique (modèle disséminé). En fonction des cellules injectées, des souris immunocompétentes, immunodéficientes ou humanisées pour le système immunitaire seront utilisées. Les études consistent à administrer des traitements à potentiel thérapeutique à des souris porteuses de tumeur ou de métastases cérébrales, puis à mesurer les niveaux de biomarqueurs, les concentrations sanguines ou tissulaires du composé d’intérêt et/ou la croissance tumorale. Les mesures de concentrations permettront d’établir un modèle entre la pharmacodynamie et la pharmacocinétique du composé, indispensable pour la détermination des doses à utiliser dans les études d’efficacité préclinique, de toxicologie réglementaire et enfin pour prédire les doses en développement clinique chez l’homme.

Bénéfices attendus

Chaque année, environ 5 900 nouveaux cas de cancer du cerveau sont diagnostiqués en France dont 500 chez les enfants. Il est la première cause de décès par cancer chez les enfants, adolescents et jeunes adultes. Les métastases cérébrales, quant à elles, concernent environ 20% des patients adultes atteints de cancer tout confondu. La prise en charge des cancers du cerveau combine chirurgie, radiothérapie et chimiothérapie en fonction de son stade de développement, du type de tumeur identifié, de sa localisation et de son agressivité. Lorsque cela est possible, la première phase du traitement d’un cancer du cerveau consiste à utiliser la neurochirurgie pour retirer le maximum de tissu tumoral, sans provoquer de handicap. Il en est de même pour les métastases cérébrales. Contrairement aux tumeurs localisées ailleurs dans l’organisme, le neurochirurgien ne peut se permettre de retirer du tissu sain autour de la tumeur cérébrale pour éviter d’éventuelles récidives, sous peine de séquelles neurologiques graves et irréversibles. En parallèle de la chirurgie, la radiothérapie est un traitement très largement utilisé pour soigner les cancers du cerveau et métastases cérébrales. Elle consiste à délivrer une forte dose de rayons ionisants pour cibler les cellules tumorales tout en limitant les dommages aux tissus sains. Cependant ce type de traitements entraînent des effets secondaires importants et parfois à long-terme. Enfin, la chimiothérapie vise quant à elle à détruire les cellules tumorales avec des médicaments. Elle peut être utilisée seule ou combinée avec la radiothérapie, avant ou après une chirurgie, pour réduire la taille des tumeurs ou éliminer les cellules cancéreuses résiduelles. L’efficacité de ces traitements peut cependant être limitée par plusieurs facteurs, en particulier par la barrière hématoencéphalique qui protège le cerveau en empêchant certains médicaments d’atteindre les tumeurs. Au regard des limitations des traitements actuels pour le cancer du cerveau et des métastases cérébrales, il est primordial de développer de nouvelles thérapies. Les procédures qui constituent ce projet s’inscrivent dans le cadre du développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. A court terme, elles permettront de prédire l’efficacité de nouveaux candidats médicaments. A plus long terme, ces procédures constitueront la base pour un traitement applicable à l’Homme en déterminant les doses efficaces qui pourraient être administrées chez les patients.

Procédures

1) Les gestes techniques concernent tous les animaux : • Pesées : durée 30 secondes sur animal vigile, jusqu’à une fois par jour sur la durée des études. • Greffe des cellules tumorales par voie intracrânienne : chirurgie d’une durée de 45 minutes incluant l’anesthésie jusqu’à la période de réveil, 1 seule fois pendant l’étude. OU • Greffe des cellules tumorales par voie systémique : administration IV ou intracardiaque unique de maximum 5 min sous anesthésie gazeuse, 1 seule fois pendant l’étude. • Mesure des tumeurs avec l’appareil de bioluminescence : durée 15 minutes sous anesthésie gazeuse maximum 3 fois par semaine pendant max 8 semaines. • Administration de luciférine pour imagerie de bioluminescence par voie intrapéritonéale : durée 30 secondes sur animaux vigiles (maximum 3 fois par semaine pendant une à plusieurs semaines selon la procédure réalisée, max 8 semaines). • Administrations des composés à potentiel thérapeutique o par voie orale (gavage à l'aide d'une sonde gastrique, (max2xjour), intrapéritonéale (max2xjour), sous-cutanée (max2xjour), intramusculaire (max2xjour) ou intradermique (1 injection/jour) : durée 30 secondes sur animaux vigiles, d’un seul traitement à plusieurs semaines de traitement selon la procédure réalisée. OU o par voie intraveineuse à la veine caudale : durée 2 minutes sur animaux vigiles, maximum 2 fois par jour pendant 3-4 jours (dépendant des veines de l’animal). L’installation d’un cathéter sera nécessaire pour des administrations plus longues. • Traitement par irradiation pendant maximum 5 min une seule fois pendant l'étude dans certaines études demandées par le client. 2) Les gestes techniques concernant tous les animaux ou en partie (dépendra des demandes clients) : • Prélèvements de sang sur animal vigile o via la veine saphène : durée 30 secondes (max 2xjour) o via la veine faciale : durée 30 secondes (max 2xjour) o via une incision de la veine latérale de la queue (1 seule incision d’environ 2 mm réalisée pour la totalité des prélèvements) durée 1 min (max 10xjour).

Impact sur les animaux

Effets indésirables : ces procédures peuvent engendrer une dégradation de l'état de santé de l'animal pouvant se traduire par une perte de poids, une hypo- ou hyperthermie, un comportement anormal (animal prostré, ne répondant pas aux stimuli), des vocalisations. Les animaux étant opérés du cerveau ou ayant des métastases cérébrales, il est possible que les animaux présentent des signes d’origine neurologique comme des tremblements et/ou des convulsions. Ces effets seront très limités dans le temps par la mise en place de critères d'arrêt anticipés et de suivi très rigoureux des animaux. Les animaux sont observés quotidiennement à minima et jusqu’à 2 fois par jour lors des traitements pour réagir au plus vite à l’inconfort des animaux et y apporter des solutions (arrêt des traitements, réhydratation, raffinement).

Devenir

Les animaux sont mis en mort en fin de procédure pour prélèvements d’organes/de sang, sauf si les animaux n’ont pas développé les modèles tumoraux escomptés et pourraient être ré-utilisés dans un autre projet dans le cadre de la Réduction du nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques.

Remplacement

Deux approches sont principalement utilisées pour mimer les événements biologiques associés aux processus de cancer : une approche in vitro, basé sur l’utilisation de lignées cellulaires ou de cellules cancéreuses isolées et des approches in vivo, basées sur l’utilisation d’animaux à des fins scientifiques, chez lesquels des cellules cancéreuses sont inoculées. Les modèles in vitro ne recréent ni la diversité de l’environnement des tumeurs, ni la difficulté pour une molécule testée d’atteindre les cellules cibles. Ces limitations rendent incontournables le recours à l’expérimentation animale pour tester l’efficacité de nouvelles molécules antitumorale. De plus, à notre connaissance, il n’existe pas de modèles in silico ou in vitro qui permettent de modéliser la relation pharmacodynamique et pharmacocinétique dans un contexte tumoral. L’écosystème nécessaire pour la pharmacodynamie et la pharmacocinétique intègre de nombreux tissus et organes : système digestif, système circulatoire, système rénal, système immunitaire intégral, système nerveux périphérique et central. Seul un modèle animal peut permettre d’étudier les interactions entre des composés à potentiel thérapeutique et ces différents systèmes biologiques très complexes.

Réduction

Si le modèle le permet, la croissance tumorale sera suivie au cours du temps par imagerie de bioluminescence. L’utilisation de cette technique non-invasive permet d’observer au cours du temps un seul animal simplement anesthésié, là où l’information devait être obtenue par euthanasie et autopsie de multiples individus à chaque stade d’une seule étude permettant ainsi de réduire sensiblement le nombre d’animaux. De plus, d’une manière générale, les composés auront préalablement été évalués de manière extensive sur une batterie de tests in silico et in vitro. Ces tests permettent de prédire le profil pharmacocinétique du composé (ex : lipophilie, absorption, distribution, métabolisme) et de déterminer les caractéristiques d’interaction du composé avec la cible d’intérêt (ex : un récepteur, une enzyme). De nombreux composés auront donc été éliminés du fait de leur faible performance sur ces tests. La probabilité d’observer une activité sur les modèles de ce projet sera par conséquent élevée. Le nombre d’animaux prévu pour ce projet se base sur les données de la littérature et les données de mise en place des modèles, notamment des analyses de puissance statistique et de détermination de la taille des groupes expérimentaux. Nous évaluons à 940 le nombre de souris maximal utilisé pour ce projet. Les animaux de la procédure 1 ou 2 pourront parfois basculées en procédure 3 ou 4 ce qui réduira le nombre d’animaux total du projet.

Raffinement

Les locaux d’hébergement font l’objet de surveillance sanitaire régulière par le biais de contrôles environnementaux, des systèmes d’hébergement et d’animaux sentinelles. Les animaux seront groupés dans des cages de 5 animaux contenant de l’enrichissement et des matériaux spécialisés pour faciliter la nidification. Le nombre de manipulations sur l’animal sera réduit au strict nécessaire. Les procédures générant douleur, inconfort ou stress se feront systématiquement sous anesthésie. Pour les anesthésies longues (instillation des cellules tumorales ou traitement des animaux) les animaux seront placés sur un tapis chauffant avec contrôle de la température corporelle pour éviter toute hypothermie. A noter qu’afin de protéger la sécheresse oculaire durant la phase d’anesthésie, du gel ophtalmique type Lacryvisc est déposé sur les yeux de l’animal à l’aide d’un coton-tige. Pour éviter l’apparition de potentielle douleur lors de l’instillation des cellules cancéreuses, une injection en sous-cutanée d’analgésique sera réalisée 30 minutes avant l’instillation des cellules. Cette injection sera répétée en cas d’apparition de signe de douleur. Les animaux feront l’objet d’une surveillance clinique et sanitaire journalière sur la durée de la procédure. Elle permet d’établir un score pour évaluer l’état général de l’animal et en fonction du total des scores des mesures sont appliquées (voir annexe page 39). En fonction de l’état des animaux la surveillance sera renforcée à 2 fois par jour si besoin. Ainsi, à partir d’un total de 4, les animaux seront observés par un vétérinaire et à partir d’un total de 6, l’animal sera euthanasié. De plus, si un animal atteint un des points limites établi, il sera immédiatement euthanasié. Par ailleurs, les souris immunodéficientes utilisées sont hébergées dans des locaux isolés des souris immunocompétentes avec renforcement des équipements de protection individuelle pour éviter qu’elles soient contaminées par des opportunistes.

Choix des espèces

La grande majorité des modèles et techniques utilisés dans la recherche médicale et pharmaceutique ont été décrits chez le rongeur. De nombreuses données sur les modèles de cancer du cerveau/métastases cérébrales chez la souris existent déjà dans la littérature et peuvent être utilisées pour la mise en place des modèles et aider à l’avancement des projets (doses de cellules, effets de molécules de références etc.). La souris est un modèle d’étude de choix car : 1) sa petite taille facilite la manipulation en particulier pour le suivi de croissance tumorale avec l’imagerie in vivo (ou plusieurs souris peuvent être placées en même temps dans l’appareil d’imagerie), et 2) la biodisponibilité des souris immunodéficientes (nécessaires pour l’utilisation de cellules humaines). Les données de la littérature indiquent clairement que les rongeurs adultes représentent des modèles fiables pour l’évaluation de l’efficacité de composés dans le domaine du cancer, c’est pour cela que nous utiliserons des souris adultes.

Anesthésiées, la peau et les tissus incisés pour dégager la trachée, les souris reçoivent une injection unique d'une molécule qui déclenche une fibrose pulmonaire, puis la plaie est suturée. Deux semaines plus tard, une seconde intubation sous anesthésie leur inocule des particules virales qui déclenchent un cancer du poumon. 640 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec des difficultés respiratoires, une posture de repli et une perte de poids possibles. Toutes sont tuées à trois échéances différentes, l'établissement indiquant que leur mise à mort est "nécessaire" au prélèvement des poumons.

Objectifs

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie chronique grave, entrainant la mort en 3 à 5 ans. La fibrose est la formation d'une quantité anormalement abondante de tissu cicatriciel. La cause et les mécanismes qui sous-tendent le développement et l’évolution de cette maladie dans le poumon sont inconnus. Elle se manifeste par une perte d’élasticité du tissu de soutien pulmonaire, résultant en une altération des échanges entre les alvéoles contenant l’oxygène et les vaisseaux sanguins. Le poumon devient progressivement trop abimé pour assurer l'oxygénation du sang et le patient développe une insuffisance respiratoire chronique conduisant au décès. Les médicaments disponibles sont uniquement capables d’en ralentir la progression. Ces traitements permettent d'augmenter la survie de ces patients mais on peut craindre l’apparition de cancer du poumon. En effet, les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus susceptibles de développer des cancers du poumon. Avec l'émergence de nouveaux traitements prometteurs contre la fibrose pulmonaire, il est donc crucial de mieux comprendre les mécanismes favorisant la survenue de ces cancers, menaçant potentiellement les patients atteints de fibrose pulmonaire. Les mécanismes conduisant à l'apparition du cancer chez les patients FPI sont encore mal connus. Notre hypothèse est que la fibrose va favoriser la croissance des cancers chez ces patients atteint de fibrose pulmonaire. Nous étudierons des souris génétiquement modifiées pour modéliser le développement du cancer pulmonaire dans le contexte de la fibrose pulmonaire. Ainsi, nous utiliserons des modèles de fibrose pulmonaire établis chez la souris, impliquant une injection au niveau de la trachée sous anesthésie générale de différentes molécules favorisant le développement de la fibrose pulmonaire.

Bénéfices attendus

Les patients atteints de fibrose pulmonaire sont plus enclins à développer des cancers du poumon (une des formes de cancers les plus courantes et mortelles dans le monde). Nos travaux de recherche permettront d’identifier le rôle de la fibrose sur le développement de ces cancers afin 1) d'identifier de nouvelles thérapies potentielles et 2) de permettre une meilleure prise en charge de ces patients fragiles.

Procédures

En début de procédure, les souris recevront, sous anesthésie générale, une injection unique d'une molécule induisant la fibrose pulmonaire. Cette molécule sera injectée directement au niveau de la trachée chez les souris endormies, après dissection de la peau et des tissus sous cutanés : la visualisation directe de la trachée permet une meilleure chance de succès de la procédure. Après injection, la lésion sera suturée par un ou deux points de suture (la totalité de la procédure de l’incision de la peau à la suture durera de 5 à 7 minutes) : la souris recevra un antalgique au cours de la procédure, et qui pourra être répétée. Deux semaines plus tard, les souris recevront une injection unique de particules virales qui activera la formation du cancer du poumon. L’injection se fera via la trachée, après intubation, sous anesthésie générale gazeuse (durée de la procédure: 5 minutes) avec des suites post-opératoires similaires à l’injection du produit fibrosant. A l'issue de la procédure, les souris seront euthanasiées à 3 temps différents après anesthésie profonde, après quoi un prélèvement de sang sera réalisé ainsi que le recueil des poumons sur l'animal euthanasié.

Impact sur les animaux

Il faut noter que l'induction de la fibrose pulmonaire et d'éventuelle lésions cancéreuses chez les animaux peut déclencher des difficultés respiratoires et une possible altération de l'état général (posture de repli...) avec perte de poids. Un risque d'irritation au niveau de la cicatrice suite aux procédures est également possible et constitue un point de surveillance en post-opératoire.

Devenir

L'ensemble des animaux seront euthanasiés en fin de procédure en suivant une méthode réglementaire. L'euthanasie de l'animal est nécessaire pour le prélèvement des poumons. Ces prélèvements sont nécessaires pour l’analyse des tissus afin d'étudier et de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des cancers associés à la fibrose pulmonaire.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, nous utilisons des modèles alternatifs comme des cultures d'alvéoles pulmonaires reconstituées en laboratoire ou de tranches de poumon. Cependant, ces méthodes alternatives ne permettent pas de modéliser la réponse d’un organe entier vivant dans le cas du développement de la fibrose pulmonaire et du cancer du poumon.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique, tout en tenant compte du risque de mortalité si les points limites sont atteints. De plus, les prélèvements obtenus grâce à une seule souris permettent de mener de multiples mesures.

Raffinement

1) Surveillance quotidienne: nous veillerons à ce qu'il n'y ait pas d'animaux isolés dans les cages durant les expériences afin de préserver les groupes sociaux. L'enrichissement consistera en la mise en place de coton dans les cages, et d'une nourriture facile à ingérer en cours de protocole. Les souris auront un accès permanent à de la nourriture et de la boisson. 2) Surveillance clinique en lien avec les procédures: les animaux seront anesthésiés lors des procédures et recevront des antalgiques systématiquement en préopératoire. Une surveillance visuelle quotidienne des animaux est effectuée par l'expérimentateur et permettra de détecter une éventuelle souffrance. Selon la grille de surveillance mise en place, la douleur sera prise en charge par l'administration d'antalgiques si nécessaire. La fréquence de surveillance des animaux pourra être augmentée selon l'état général des animaux et leur poids. En post-opératoire, la douleur et la cicatrice seront également suivies de manière rapprochée. En cas de douleur et d'atteinte d'un point limite, les animaux seront euthanasiés (des antalgiques seront administrés avant l’euthanasie).

Choix des espèces

Les modèles de fibroses pulmonaires chez la souris sont largement décrits dans la littérature. Les souris offrent la possibilité de travailler sur des organismes génétiquement modifiés. Des animaux adultes d'au moins 8 semaines seront utilisés car la fibrose pulmonaire est une pathologie du sujet adulte. Le modèle murin est pertinent du fait de son système respiratoire très similaire à celui de l’Homme.

Des injections provoquent une colite aiguë ou chronique chez 1 200 souris, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec douleurs abdominales, perte de poids et changements de comportement. Une nouvelle molécule anti-inflammatoire leur est ensuite administrée, seule ou combinée à d'autres, l'étude durant d'une à quatre semaines selon le protocole. Toutes sont tuées pour analyser la réponse de leur système immunitaire, ce que la rubrique consacrée au devenir ramène à "certains animaux" mis à mort "de manière réglementaire". Le RNT ne nomme ni le produit qui déclenche la colite, ni les tests de suivi, ni les seuils des scores cliniques annoncés, et indique que l'anesthésie ne sera utilisée "que si la situation l'exige".

Objectifs

Certaines cellules du système immunitaire jouent un rôle clé dans l’inflammation, qu’elle soit aiguë ou chronique. Lors de maladies inflammatoires, un déséquilibre entre différents types de cellules immunitaires contribue à entretenir et aggraver l’inflammation. Nous cherchons donc à tester de nouvelles molécules capables d’agir spécifiquement sur ces cellules afin de rétablir l’équilibre. En laboratoire, ces molécules ont déjà montré qu’elles réduisent les substances responsables de l’inflammation et augmentent celles qui la freinent. L’objectif est maintenant d’évaluer leur efficacité dans différents modèles de maladies inflammatoires et d’estimer leur potentiel comme futurs traitements

Bénéfices attendus

Ce projet vise à tester une nouvelle molécule qui agit sur un mécanisme précis du système immunitaire afin de réduire l’inflammation. Son efficacité sera comparée à celle des traitements déjà existants pour vérifier son intérêt. L’étude permettra aussi de mieux comprendre comment cette molécule agit sur le fonctionnement des cellules immunitaires. Enfin, nous évaluerons des traitements combinant plusieurs cibles du système immunitaire. Ces approches pourraient être plus efficaces que les traitements actuels ou que l’utilisation d’une seule molécule.

Procédures

Les animaux recevront des injections pour provoquer la maladie étudiée et pour administrer les traitements. Des prises de sang pourront également être réalisées si nécessaire, sous anesthésie afin de limiter tout inconfort. Chaque intervention sera courte et l’ensemble de l’étude se déroulera sur une période allant d’une à quatre semaines, selon le protocole prévu.

Impact sur les animaux

La colite, qu’elle soit aiguë ou chronique, peut provoquer des douleurs abdominales, une perte de poids et des changements de comportement chez les animaux. Afin de suivre leur état de santé et de limiter ces effets, des évaluations régulières basées sur des scores cliniques et pathologiques seront mises en place. Ces outils permettront de surveiller au mieux l’évolution de la maladie et le bien‑être des animaux.

Devenir

Après les injections, les animaux seront replacés dans leur cage. À la fin de certaines étapes de l’étude, certains animaux seront mis à mort de manière réglementaire afin d’analyser la réponse du système immunitaire et mieux comprendre les effets des traitements.

Remplacement

Il n’existe pas aujourd’hui de méthode capable de reproduire entièrement le fonctionnement du système immunitaire en dehors d’un organisme vivant. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux est nécessaire pour cette étude. Des essais réalisés auparavant en laboratoire sur des cellules ont montré que la molécule testée avait un effet biologique. Ces résultats ont permis de mieux préparer l’étude chez l’animal et de choisir les éléments à observer pour évaluer son efficacité.

Réduction

Tous les animaux prévus ne seront pas forcément utilisés. Des études supplémentaires ne seront réalisées que si un effet du traitement est observé. Dans ce cas, des analyses seront menées pour mieux comprendre comment le traitement agit, en examinant certains animaux à différents moments de l’évolution de la maladie, avant l’apparition de signes sévères. Afin d’obtenir des résultats fiables tout en limitant l’utilisation d’animaux, le nombre a été fixé à 10 animaux par groupe, ce qui permet une analyse statistique pertinente avec un nombre réduit d’animaux.

Raffinement

L’objectif principal est de comparer le niveau d’inflammation observé entre différents groupes de souris afin d’identifier des effets clairs et fiables des traitements testés. Une attention particulière sera portée au bien‑être des animaux : leur état de santé sera surveillé régulièrement et des mesures seront prises pour limiter autant que possible la douleur et la souffrance. Si l’état d’un animal se dégrade au‑delà d’un certain seuil, il sera retiré de l’étude et pris en charge de manière appropriée. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées, avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, un rythme jour/nuit équilibré et un environnement enrichi pour réduire le stress. Le nombre d’animaux par cage sera limité afin d’éviter la surpopulation, et des ajustements seront faits en cas de comportements agressifs. Les procédures ont été conçues pour minimiser le stress et la douleur tout en permettant une évaluation scientifique fiable. Des traitements contre la douleur seront administrés lorsque nécessaire, et l’anesthésie ne sera utilisée que si la situation l’exige.

Choix des espèces

La souris est un modèle couramment utilisé en recherche, notamment pour les études fondamentales et précliniques, car elle est bien connue et dispose de nombreux outils permettant d’analyser le fonctionnement du système immunitaire. Les modèles d’inflammation développés chez la souris reproduisent de manière satisfaisante ce qui est observé chez l’être humain. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes âgées de 8 à 10 semaines. À cet âge, les réponses inflammatoires sont plus homogènes et reproductibles que chez des animaux plus jeunes ou plus âgés, dont le système immunitaire fonctionne différemment. Cela permet d’obtenir des résultats plus fiables et comparables entre les groupes étudiés.

80 souris issues du croisement de deux modèles de maladies neuromusculaires vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À 8 ou 9 semaines, chacune passe 22 heures seule en cage d'actimétrie, court sur un tapis roulant et reste suspendue à une grille retournée pendant une minute au maximum, un effort que le porteur reconnaît susceptible de surcharger des muscles déjà myopathiques. La série se termine par une mesure de force sur le muscle tibial antérieur, jusqu'à une heure, sous anesthésie profonde et sans réveil. Le RNT justifie ce sort en notant que les prélèvements ont lieu après la mise à mort, "ce qui évite toute douleur supplémentaire".

Objectifs

La myopathie centronucléaire (Myopathie Centro Nucléaire) BIN1-CNM est une maladie héréditaire du muscle squelettique, caractérisée par une faiblesse musculaire progressive et un handicap moteur. Les mutations perturbent l'organisation membranaire et le couplage excitation-contraction, entraînant des noyaux centraux dans les fibres musculaires. Aucune thérapie curative n'existe à ce jour. Des études récentes montrent qu'une surexpression d'une protéine associée aggrave plusieurs formes de CNM. Notre équipe a démontré qu'une réduction fonctionnelle de cette protéine corrige partiellement les phénotypes d'un modèle murin MTM1-CNM. Nous testons donc si sa diminution atténue les altérations du modèle BIN1-CNM (Myopathie Centro Nucléaire) par croisement avec un modèle CMT (Charcot Marie Tooth) à perte partielle de fonction. Ce projet évalue le potentiel thérapeutique de cette modulation pour corriger les anomalies musculaires et élucide les mécanismes communs aux CNM.

Bénéfices attendus

Ce projet explore les mécanismes physiopathologiques communs aux myopathies centronucléaires (Myopathie Centro Nucléaire) et aux neuropathies périphériques, notamment la maladie de Charcot-Marie-Tooth (Charcot Marie Tooth). En combinant un modèle murin de myopathie centronucléaire avec un modèle de perte partielle de fonction protéique, il vise à identifier des cibles moléculaires modulant la gravité de la maladie. Les bénéfices attendus consistent à déterminer si une réduction de cette protéine prévient ou atténue les manifestations de la myopathie centronucléaire, tout en éclairant les mécanismes communs entre myopathie centronucléaire et Charcot-Marie-Tooth, ouvrant des perspectives thérapeutiques ciblées.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions, à 8-9 semaines d’âge, avec une durée globale limitée et des procédures répétées uniquement lorsque cela est scientifiquement justifié. Phénotypage comportemental et locomoteur non invasif : tests d’activité locomotrice spontanée (actimétrie), de locomotion fine (tapis roulant) de force musculaire (grille retournée), réalisés chez l’animal vigile, sans anesthésie. L’activité locomotrice spontanée de l’animal sera acquise pendant 22 h au maximum, période au cours de laquelle les animaux seront hébergés individuellement, sans toutefois subir un isolement sensoriel (pas d’isolement olfactif ni auditif). Le test de locomotion fine (tapis roulant) et de grille retournée ont chacun une durée maximale de 1 minute avec un maximum 1 test par jour pour limiter le stress. Mesures de force musculaire in situ : intervention chirurgicale mineure sous anesthésie générale profonde et anti douleur dont l’administration ne durera pas plus de 5 secondes. Chaque séance dure maximum une heure et est réalisée une seule fois par animal, sans réveil, en fin de procédure (8 semaines). Ces interventions sont conçues pour être aussi brèves et peu répétées que possible, tout en permettant la collecte des données nécessaires à la caractérisation complète du phénotype musculaire et à l’analyse moléculaire et histologique.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux dans ce projet découlent des manipulations expérimentales (génétique, tests comportementaux, chirurgie, anesthésie, euthanasie) : 1. Tests fonctionnels et comportementaux: Test de la grille retournée (hanging test): Stress aigu dû à la sensation de chute imminente et à la contrainte physique (maintien en suspension). Risque minime de chute sur une surface constitué de 5 cm de litière, pouvant une anxiété transitoire. Effort musculaire intense mais bref (≤ 60 s), sans lésion musculaire attendue chez des animaux sains, mais surcharge possible chez les souris déjà myopathiques. Analyse de la démarche (tapis roulant/Digigait): Stress léger à modéré lié à la nouveauté de l’environnement et à la contrainte de marche forcée. Fatigue musculaire transitoire sans lésion durable attendue. Actimétrie (cages avec capteurs): Stress modéré lié au changement de cage, à l’isolement partiel et à l’enregistrement prolongé (22 h), mais sans manipulation directe. Perturbation possible des rythmes circadiens ou du comportement d’exploration en raison de l’environnement artificiel. 2. Mesure de force musculaire in situ sur le tibial antérieur: Les souris peuvent présenter, de manière transitoire, une gêne ou une douleur légère à modérée liée aux procédures chirurgicales, mais cette douleur est prévenue et traitée par une anesthésie générale et une analgésie adaptée. Les injections intrapéritonéales nécessaires à l’induction de l’anesthésie générale peuvent provoquer un stress et une gêne transitoires (manipulation, douleur ponctuelle à l’injection). La contention de l’animal pour l’injection est brève, d’une durée maximale de 15 secondes, réalisée par du personnel formé, avec une prise en charge rapide par l’anesthésie, ce qui limite la durée de ces effets.

Devenir

Le sort prévu pour tous les animaux, consiste en leur mise à mort pour la collecte de tissus. La collecte terminale de muscles et d’organes est nécessaire pour corréler phénotype fonctionnel et analyses moléculaires/histologiques/ ultrastructurales. Les prélèvements sont réalisés après la mise à mort, ce qui évite toute douleur supplémentaire.

Remplacement

Dans ce projet, le Remplacement n’est pas possible car l’objectif est d’évaluer l’effet d’une réduction fonctionnelle protéique sur les phénotypes musculaires dans un modèle de myopathie centronucléaire, ce qui nécessite de reproduire la pathologie musculaire in vivo, avec toute sa complexité tissulaire, mécanique et systémique. Les modèles cellulaires (myotubes, lignées musculaires) ou organoides ne permettent pas de recréer la fonction intégrée du muscle squelettique, ni les interactions nerf-muscle, ni les réponses comportementales et locomotrices mesurées ici. De même, les approches in silico ou in vitro ne suffisent pas à tester les paramètres fonctionnels tels que les tests comportementaux, la force musculaire in situ ou les analyses histologiques et ultrastructurales, qui exigent un organisme vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés a été déterminé de manière à respecter le principe de Réduction tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour répondre aux objectifs scientifiques. Pour chaque groupe expérimental, un effectif de 10 animaux par sexe (soit 20 souris/groupe) a été retenu après calcul de puissance préalable, basé sur les données de variabilité observées dans les modèles murins de myopathies et de neuropathies, afin d’éviter tout suréchantillonnage. Ce nombre repose également sur notre expertise préalable dans la caractérisation de modèles murins de myopathies et de tests de force musculaire. La distribution des données sera évaluée (Shapiro–Wilk ou Kolmogorov–Smirnov), puis des analyses adaptées appliquées : ANOVA (ou Kruskal–Wallis si non normale), tests post hoc (Tukey/Dunn), et t/Mann–Whitney pour comparaisons ponctuelles. Le plan maximise l’information par animal (phénotypage fonctionnel complet, analyses histologiques/moléculaires), limitant le total à 80 animaux. Les procédures sans réveil et la standardisation rigoureuse réduisent les répétitions expérimentales. La cohérence des groupes (contrôle, mutation protéique, modèle pathologique, modèle combiné avec une amélioration du phénotype attendue) optimise les conclusions sans multiplier les conditions.

Raffinement

Les moyens de raffinement mis en œuvre dans ce projet visent à minimiser la douleur, le stress et l’inconfort des souris tout au long de l’expérimentation. Les animaux sont logés en groupe, dans des conditions de température, d’hygrométrie et d’éclairage contrôlées, avec litière et abris adaptés, et bénéficient d’un enrichissement environnemental (tunnels et matériel de nidification) pour favoriser le bien être et limiter les comportements stéréotypés. Une manipulation douce et progressive, ainsi qu’une phase d’habituation aux dispositifs de tests (grille retournée, tapis roulant, cage d’actimétrie), sont mises en place pour réduire l’anxiété liée aux manipulations et à la nouveauté. Les protocoles comportementaux sont courts et espacés, avec des temps de repos suffisants, afin d’éviter la fatigue et la surcharge musculaire. Pour la chirurgie in situ (mesure de force musculaire), des anesthésiques et analgésiques adaptés sont utilisés, et l’intervention est conduite sous anesthésie profonde dans le cadre d’une procédure sans réveil, ce qui évite toute douleur post opératoire. Une surveillance clinique régulière (poids, état général, locomotion, alimentation, hydratation) est assurée, avec des critères de mise à mort précoce clairement définis pour interrompre l’expérimentation en cas de souffrance manifeste. Les critères de points limites de Morton & Griffiths sont appliqués systématiquement, avec une mise à mort immédiate en cas de perte de poids >15% sur une semaine, de prostration prolongée ou de paralysie sévère, et en cas de mortalité postnatale importante. Enfin, les protocoles sont standardisés (heure de test, conditions environnementales, manipulateurs formés) et les méthodes non ou moins invasives (tests comportementaux, actimétrie) sont privilégiées, ce qui réduit la variabilité et limite le besoin de répéter les expériences sur de nouveaux animaux, tout en préservant la qualité scientifique des données.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris) est retenue comme modèle de référence pour l’étude des myopathies et neuropathies périphériques, grâce à sa physiologie musculaire et neuromusculaire hautement conservée avec l’humain. Elle permet de reproduire fidèlement les phénotypes fonctionnels (faiblesse progressive, altérations locomotrices, atrophie), absents chez les invertébrés ou poissons zèbres. Les animaux sont utilisés du stade juvénile (8-9 semaines) à adulte jeune, correspondant à l’installation complète du phénotype pathologique sans progression excessive. À 8 semaines (équivalent ~20 ans humain), la faiblesse musculaire est pleinement exprimée, idéale pour les tests comportementaux (grille retournée, tapis roulant, actimétrie) et la force in situ sur tibial antérieur. Ce stade évite les biais néonataux (variabilité élevée) ou âgés (comorbidités), maximisant la pertinence scientifique et le respect des 3R.

Faute de modèle animal existant pour une complication cutanée tardive de la maladie de Lyme, ce projet en construit un avec 105 souris sans poils, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes tuées pour prélever leurs organes. Le geste infligé tient en une seule injection de Borrelia afzelii sous la peau, de quelques secondes, sur animal éveillé. La souffrance attendue vient donc de l'infection elle-même, réaction inflammatoire locale puis arthrite possible, et non de l'acte. Le porteur écrit que l'absence de douleur au point d'injection dispense d'analgésie, sans indiquer combien de temps les souris seront gardées infectées, alors que la lésion visée survient chez l'humain des années après la piqûre de tique.

Objectifs

L'Acrodermatite Chronique Atrophiante (ACA) est une manifestation cutanée tardive de la borréliose de Lyme européenne due quasi-exclusivement à l’espèce Borrelia afzelii. Elle représente 3 à 5% des cas de borréliose de Lyme et survient des années voire parfois des décennies après un érythème migrant (EM) non traité, souvent au même site anatomique, ce qui suggère que cette bactérie a à la fois une capacité notable à persister pendant une longue durée dans la peau humaine sans être détectée et le potentiel d'induire une inflammation destructrice chronique tout en résistant à l'éradication par le système immunitaire. Il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle animal d’ACA qui pourrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Les souris utilisées comme modèle d’étude sont des souris sans poil non consanguines utilisées en cancérologie et dermatologie car les lésions cutanées sont plus facilement observables. Aucune étude des conséquences cutanées d’une infection de ces souris par des souches de Borrelia afzelii provenant de patient ayant présenté une ACA n’a été réalisée à ce jour. L’objectif principal de ce projet de recherche est de mettre au point un modèle d’infection cutanée de souris sans poil par des souches pathogènes de Borrelia afzelii afin de permettre l’étude des mécanismes impliqués dans l’ACA. L’objectif secondaire de ce projet est de caractériser l’infection chez cette souris : dissémination, séroconversion (apparition d’anticorps anti Borrelia).

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mettre au point un modèle murin d’acrodermatite chronique atrophiante afin de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie, encore très peu connue, notamment dû à l’absence de modèle existant. La mise en place d’un modèle murin d’ACA pourrait dans un second temps permettre de décrire les facteurs d’hôte (par exemple système immunitaire) et bactériens expliquant la persistance de Borrelia afzelii dans la peau et l’inflammation tardive de ce tissu.

Procédures

Injection, 1 seule fois par souris, sur souris vigile, quelques secondes

Impact sur les animaux

Dans les suites de l’injection intradermique de Borrelia une faible réaction locale inflammatoire peut apparaitre. Dans un second temps, une arthrite peut potentiellement se manifester. Un léger stress peut être ressenti par la souris lors des manipulations

Devenir

Les souris ne peuvent être réutilisées, puisque le prélèvement de leurs organes est nécessaire à l’expérimentation. Elles seront donc mises à mort.

Remplacement

Les explants de peau ou les organoïdes ne sont pas utilisables pour répondre à la question scientifique pour 2 principales raisons : -Ils ne permettent pas d’observer des lésions cutanées tardives (maintien en culture de l’explant a une durée limitée de 10-15 jours) -Ils ne permettent pas d’étudier la dissémination de la bactérie (autres zones cutanées, autres organes) et les effecteurs du système immunitaires recrutés à partir du sang dans le tissu cutané.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé pour ce protocole a été calculé au minimum des exigences de publications internationales. Cependant, dans un but de réduction, le nombre de contrôle a été réduit à son maximum.

Raffinement

Concernant le bien être général des souris, elles disposeront d'un tunnel, d'un barreau à ronger, de coton et du carton ciselé pour réaliser un nid et seront regroupées en groupes sociaux. Après le sevrage et avant la procédure, les souris s'acclimatent à une manipulation douce selon, visant à réduire le stress via des interactions et des caresses. Concernant : - L’inoculation intradermique : l'absence de douleur au point d'injection élimine le besoin d'analgésiques, même si un inconfort lié à l’inflammation de la piqûre peut être observé à la suite de celle-ci. En cas de réaction inflammatoire qui serait trop importante un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - L’apparition d’une d’arthrite. Si une gêne douloureuse de la souris est observée, un suivi sera réalisé et un médicament anti-inflammatoire sera administré et un avis vétérinaire sera pris si l’évolution est défavorable. - Les souris sans poil étudiées possèdent des vibrisses, mais les cils sont soit extrêmement rudimentaires, soit totalement absents. Une attention particulière sera portée sur l’observation des yeux et l’apparition d’une éventuelle conjonctivite. De plus, l’enrichissement utilisé ne produit pas particulièrement de poussière. Les souris sont mises à mort à 1 mois, 6 mois ou à 1 an selon leur groupe ou si elles présentent des lésions évocatrices d’une ACA. Pendant toute la durée expérimentale, l’état des souris est évalué quotidiennement, des points limites ont été déterminés afin de soustraire les animaux à toute douleur ou souffrance inutile.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les hôtes naturels des larves et des nymphes de tiques. Les souris « contrôle » sont sensibles à l’infection par Borrelia sl et sont classiquement utilisées en recherche scientifique sur ce sujet. Les souris étudiées dans notre protocole sont sensibles à l’infection par Borrelia afzelii, et constituent le meilleur modèle d’observation d’une éventuelle pathologie cutanée en raison de leur absence de poil. Des animaux sevrés à partir de 3 à 4 semaines seront utilisés. Pour le bon développement des souris, il est important qu’elles soient sevrées avant d’être séparée de leur mère. Il semble dans la littérature que l’inoculation des souris jeunes par Borrelia permet des manifestations cliniques plus marquée par rapport à une inoculation à 12 semaines.

Porteuses de mutations qui leur font développer un syndrome de Sjögren, 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent du clopidogrel ou des anticorps qui détruisent leurs plaquettes, par gavage et par injection intraveineuse, avec des prises de sang pratiquées sur animaux éveillés. Les contraintes subies sont "faibles" et les traitements plaquettaires "ne relatent pas de mal-être animal", affirme le porteur, dont l'étude repose sur le vieillissement d'animaux construits pour tomber malades. Il conclut qu'aucune méthode alternative n'existe, la cytométrie en flux exigeant selon lui un grand nombre de cellules prélevées dans les organes immunitaires.

Objectifs

Dans ce projet, nous souhaitons explorer le rôle des plaquettes dans la syndrome du Sjögren (SjS). Le syndrome de SjS est une maladie rare, touchant entre 0,01% et 0,3% de la population adulte (selon les critères historique « AECG » de 2002), mais reste la maladie auto-immune systémique la plus fréquente après la polyarthrite rhumatoïde (PR). Cette pathologie inflammatoire systémique affecte majoritairement les glandes salivaires, lacrymales et les muqueuses, lié à une infiltration des glandes correspondantes par des cellules immunitaires, essentiellement des lymphocytes T et B. L’activation lymphocytaire B est un élément central de la maladie, comme en atteste la production de nombreux auto-anticorps (en particulier les anti-Ro60/TROVE2/SSA, anti-Ro52/TRIM21/SSA et anti-La/SSB, présents chez 2/3 des malades et associés à des formes plus sévères. Cependant, ex vivo, après analyse d’une cohorte de plus de 100 patients, ils s’avèrent que d’autres cellules seraient activées pendant la maladie et notamment les plaquettes. Or les plaquettes sont aussi des cellules immunitaires en plus d’être des cellules hémostatiques. Il est donc important d’évaluer leur impact et de choisir le bon modèle murin. Il existe plusieurs modèles murins mimant le SjD, les souris TgIL14 (mime la physiopathologie du SjD, modèle cellules T dependant) et les souris MRL/lpr (présence d'autoanticorps du SJD, modèle cellule B dépendant) Axe 1. Evaluation de l’implication des plaquettes dans le modèle TgIL14 Axe 2. Evaluation de l’implication des plaquettes dans le modèle MRL/lpr

Bénéfices attendus

Le choix d’utiliser le modèle de Sjogren TgIL14 et le modèle MRL/lpr a été basé sur la littérature, la présence d’autoanticorps (modèle MRL/lpr), la physiologie de la pathologie (TgIL14). Par ailleurs, le modèle MRL/lpr est « T-dépendant » alors que le modèle « IL14 » est « B-dépendant » ce qui permet de récapituler les principaux éléments de la physiopathologie du syndrome de Sjögren. Afin d’étudier le rôle des plaquettes dans la physiologie du syndrome de Sjogren, nous avons décider d’inhiber les fonctions plaquettaires en utilisant le clopidogrel mais aussi de depleter le système des plaquettes avec un anticorps deplétant. Une étude a été réalisée in vitro avec le clopidogrel et donne de bon résultat, mais n’intègre pas la diversité des cellules d’un organisme. Par ailleurs, il est complexe de modéliser les interactions de toutes les cellules circulantes en enlevant les plaquettes, dans des essaies in vitro. C’est pourquoi l’axe 1 et 2 de cette demande éthique permettra d’évaluer dans un modèle murin, l’implication des plaquettes dans le syndrome de Sjogren.

Procédures

prélèvèments sur animaux vigiles, injections intraveineuse, gavage tous les animaux de l'étude

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que les animaux peuvent ressentir seront liés aux manipulations lors des gavages et injections. Ces 2 gestes seront effectués par du personnel compétent. Cependant, les modèles utilisant le clopidogrel ou les anticorps depletant ne relatent pas de mal-être animal, dans des souris de type wild type. Une attention particulière et un monitoring sera effectué sur les souris TgIL14 et MRL/lpr qui subiront l’un ou l’autre des traitements plaquettaires.

Devenir

tous les animaux de la procédure 1 et 2 seront mis a mort

Remplacement

Pour ce type de projet, il n’existe actuellement aucune méthode alternative à l’expérimentation animale. L’implication des plaquettes dans une pathologie nécessite l’évaluation sur un modèle vivant.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé afin de garantir une puissance nécessaire et suffisant. Nous avons au préalable évaluer in vitro le statut d’activation des plaquettes chez l’homme (cohorte de patient atteint de Sjogren et de donneur sain). Afin de réduire le protocole, une étude pilote commune à l'axe 1 et 2, dont les résultats seront utilisés. Cette étude pilote utilisera 40 souris afin d’optimiser d’évaluer le traitement clopidogrel et d’anticorps depletant dans l’animalerie. Dans l’étude principalede l’axe 1 et 2, un groupe contrôle ainsi que 3 groupes de souris permettront par la suite de répondre à l’hypothèse de travail, le détail des groupes est abordé. Considérant une variance hypothétique maximale de 16%, le nombre minimal d’animaux nécessaire a l’observation d’une difference significative pour une mesure unique, si elle existe, est de 6 par groupe experimentale . Un test statistique approprié sera appliqué en fonction des comparaisons effectuées entre les différentes mesures/groupes. Ainsi, lorsque la condition de normalité de la distribution de valeurs est remplie, un test T de student sera appliqué entre les moyennes. Lors d’analyse longitudinale, les corrections pour mesures apportées ou des tests tolérants à la non independance des données seront appliquées de façon appropriée. La bonne approche statistique permettra de réduire le nombre d’animaux dans le cadre de ce projet de recherche.

Raffinement

Le bien-être animal est au cœur de cette étude. Nous veillerions à ce que l’hébergement des animaux leur permettent d’avoir un enrichissement (avec paille, bois, coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les contraintes subites par les animaux sont faibles. Il s’agit d’une étude de vieillissement avec une manipulation réduite des animaux (prise de sang en veine saphène ou caudale et/ ou injection de médiateurs lipidiques en intrapéritonéale). Les souris seront observées quotidiennement et lorsqu’une souris atteint un point limite, elle sera mise à mort. Dans notre étude nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique puisque nous étudions les médiateurs lipidiques dont l’expression est modulée par ces produits.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de référence pour l’évaluation de l’impact physiopathologique de pathologie inflammatoire comme le syndrome de Sjögren. Il n’existe pas de méthodes alternatives in vitro pour étudier notre hypothèse de travail. Qui plus est, plusieurs de nos analyses reposent techniquement sur la cytométrie en flux, méthodologie qui requière un nombre conséquent de cellules issues d’organes immunitaires. Ce type d’expériences rend impossible l’utilisation d’organismes comme le poisson zèbre ou la drosophile. Bien qu’il existe certaines différences entre l’immunologie murine et humaine, d’innombrables découvertes faites chez la souris s’avèrent transposables chez l’humain. Ce modèle est donc adapté à l’étude de dérégulations hémostatiques humaines. Les souris utilisées seront de 6 mois. Elles ont toutes un stade de développement complet.

Importée des États-Unis puis élevée sur place pour réduire les coûts d'achat, la lignée MMTV-PyMT fournit les 2 040 souris de ce projet, utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit à 21 jours l'amputation d'un millimètre de queue sous anesthésie, pour le génotypage. Les femelles porteuses du transgène développent des tumeurs mammaires à croissance rapide, avec métastases pulmonaires chez 80 à 90 % d'entre elles, ulcération possible de la tumeur, gêne mécanique et détresse respiratoire, avant d'être tuées pour prélever tumeurs et métastases. Les mâles sans transgène sont tués faute d'usage, les mâles porteurs et les femelles sans transgène restant en vie pour la reproduction.

Objectifs

Maintien de lignées génétiquement altérées pour développer des tumeurs mammaires spontanées pour l’étude de la formation des métastases des cancers du sein luminaux et caractérisation génétique de ces dernières par une méthode invasive. La biopsie sera utilisée afin d’extraire l’ADN de la souris et de réaliser un génotypage nous informant de l’altération génétique ou non des souris.

Bénéfices attendus

La lignée MMTV-PyMT est disponible commercialement mais l’obtention des animaux est couteuse car elle nécessite une importation des États-Unis. L’élevage permet donc de réduire les coûts et d’avoir des animaux vivants disponibles pour mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la formation des métastases des cancers du sein luminaux. Le génotypage permet la caractérisation génétique de ces lignées pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour le prélèvement de tumeurs.

Procédures

Prélèvement de la queue (1mm) pour biopsie 1 fois sous anesthésie générale à l’isoflurane, durée inférieure à 5 minutes.

Impact sur les animaux

La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal. Le modèle MMTV-PyMT est un modèle de cancer mammaire montrant une croissance tumorale rapide et souvent métastatique (80 à 90% des animaux développent des métastases pulmonaires spontanées). La croissance de la ou des tumeurs primaires peut provoquer des effets indésirables sur les animaux. Particulièrement, l’animal peut subir une nuisance mécanique de la tumeur par son volume pouvant compliquer sa mobilité et son activité. La tumeur primaire, par sa croissance rapide, peut montrer une nécrose (mort cellulaire) et être associée à la formation d’ulcère entraînant une douleur pour l’animal. Les métastases pulmonaires peuvent entraîner de la dyspnée, de la polypnée, une respiration abdominale marquée et de la détresse respiratoire. De manière plus générale, l’animal peut être touché par des signes plus généraux de mauvais état général comme la perte de poids et d’appétit. Des observations et examens cliniques seront réalisés tous les deux à trois jours afin de mettre en lumière les animaux montrant des signes cliniques. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront alors surveillés tous les jours afin de leur administrer un analgésique en cas de signes de douleur (opioïdes) ou procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Devenir

Les animaux de sexe masculin n'exprimant pas le transgène seront euthanasiés. Les mâles exprimant le transgène et les femelles sauvages seront gardés en vie pour le maintien des lignées (reproduction). Les femelles exprimant le transgène seront mise à mort pour prélever le tissus tumoral et métastatique.

Remplacement

Génotypage : pas de remplacement possible sur le projet de prélèvement de tissu. Les souris générées dans ce projet permettront l’étude des mécanismes de la colonisation métastatique des cancers du sein luminaux. Il est très compliqué de mimer in vitro la formation de métastases. Une étape in vivo est donc nécessaire pour se rapprocher au plus près des conditions de clinique humaine, afin d’observer finement les mécanismes d’action des cellules tumorales au niveau de l’organe métastatique. De plus, il est compliqué de maintenir in vitro l’hétérogénéité des cellules cancéreuses observée in vivo. L’élevage des lignées MMTV-PyMT permet de générer des tumeurs de cancer du sein luminal en conservant l’hétérogénéité des cellules cancéreuses et du stroma. Les cellules cancéreuses seront isolées et étudiées ex vivo avec des essais se rapprochant le plus des conditions in vivo comme la culture en 3 dimensions de tumoroïdes. Notamment, afin d’étudier le rôle de gènes d’intérêt, l’effet de l’amplification ou la délétion de ces gènes sera évalué ex vivo afin d’éliminer les gènes n’ayant pas d’effet sur les cellules cancéreuses. Les poumons prélevés serviront à étudier les métastases pulmonaires afin d’étudier l’environnement immunitaire mais également la présence de protéines d’intérêt impliquées dans la formation de celles-ci par immunofluorescence.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombres d’animaux utilisés, un nombre minimum de deux cages de reproduction seront utilisés pour le maintien des lignées murines. Comme le croisement des souris MMTV-PyMT se fait avec un male hémizygote pour le transgène et une femelle sans transgène, seule la moitié des souris issue du croisement exprimeront le transgène. Parmi ces souris, seule la moitié sera de sexe féminin et développera une tumeur mammaire utilisée pour notre étude. D’après notre expérience, ces souris génèrent 8 souriceaux toutes les 3-4 semaines ce qui correspond à 2 souris avec le bon phénotype (femelle MMTV-PyMT). Avec deux cages, on estime obtenir 4 souris toutes les 3 semaines. Ces souris sont utilisées au laboratoire pour toutes nos expériences ex vivo. Ce nombre de cages nous permettra de réaliser 3 à 4 expériences par mois. Le nombre de cage sera réduit si nos besoins diminuent.

Raffinement

Génotypage : La biopsie de queue des animaux est réalisée lors du baguage soit en vigile soit sous anesthésie générale à l’isoflurane (induction 5%, 1.5L d’air) en fonction de l’aisance du personnel. Cette méthode est approuvée, précise, rapide et standardisée, ce qui limite les effets indésirables stress/douleurs. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal. Le prélèvement est ensuite stocké au congélateur jusqu’à utilisation pour le génotypage. Lignée à phénotype dommageable : les souris femelles développent des tumeurs mammaires à partir de 53 jours. Le suivi tumoral se fera 2 fois par semaines avec un pied à coulisse puis quotidiennement lorsque les tumeurs atteignent environ 10 mm de diamètre. Si des signes cliniques sont détectés, les animaux seront surveillés tous les jours afin de procéder à une mise à mort anticipée en cas d’atteinte de points limites.

Choix des espèces

La souris est l’espèce de choix pour ces essais : - Le modèle MMTV-PyMT de cancer du sein décrit précisément dans la bibliographie et concorde avec les observations cliniques chez les femmes atteintes de cancer du sein luminal (S. Attalla et al. 2020). - Similitudes de la physiologie et de la taille du génome entre la souris et l'homme - L'organisme évolue rapidement (courte durée de vie) et permet des analyses compatibles avec les impératifs de progrès thérapeutiques à apporter en clinique humaine Les animaux seront génotypé à 21 jours. Les souris MMTV-PyMT développent des tumeurs spontanées à partir de 53 jours avec des tumeurs d’environ 17 mm de diamètre (1500 mm3, point limite) aux alentours de 10-12 semaines. Afin de récupérer un maximum de tissu cancéreux, les souris seront utilisées lorsqu’elles présenteront une tumeur de 17 mm de diamètre (environ 1500 mm3), sauf si un point limite est atteint avant.