Souris
Modèle préclinique pour l’induction du syndrome d’ovaire polykystique associée à l’obésité
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système urogénital
Hamsters dorés : 1500
Quarante heures en cage individuelle sans enrichissement, répétées trois fois, et jusqu'à 52 semaines de régime hypercalorique : 1 400 souris et 1 500 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à la fin. Les souris femelles reçoivent chaque jour un dérivé de la testostérone qui supprime leur cycle, les hamsters femelles sont privées de leurs ovaires par chirurgie, et l'ensemble subit frottis vaginaux quotidiens pendant quatorze jours, prises de sang après jeûne, tests de tolérance au glucose, épilation sous anesthésie et échocardiographie. Le porteur écrit qu'aucun effet douloureux n'est attendu de ces mesures. L'objectif est de construire des modèles de syndrome des ovaires polykystiques associé à l'obésité pour y tester des composés, aucun modèle in vitro ou ex vivo de présélection n'existant selon lui.
Objectifs
Le syndrome d’ovaires polykystiques (SOPK) touche 6 à 13% des femmes en âge de procréer. Elle se traduit par un désordre hormonal menant à l’anovulation et à l’infertilité. Outre le fait que le syndrome impacte la vie sexuelle des femmes atteintes, il peut induire un désordre métabolique et un risque cardiovasculaire important : ces femmes sont plus susceptibles de développer un surpoids/une obésité, de l’hypertension artérielle, de l’hyperlipidémie, un diabète de type 2. Aujourd’hui les traitements anti-obésité et anti-diabète ne sont pas compatibles avec le souhait de procréation et d’enfanter et il est donc nécessaire de trouver une stratégie thérapeutique efficace pour traiter les atteintes métaboliques de ses femmes sans pour autant les empêcher de procréer. Pour ce faire, il faut donc développer des modèles précliniques atteints de syndrome d’ovaires polykystiques et d’obésité permettant de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques adaptées à cette population de patientes.
Bénéfices attendus
L'intérêt de ce projet est le développement de modèles SOPK associé à l’obésité mimant ce qui est observé chez les femmes atteintes. Ils permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques associée à la SOPK et ainsi de tester et valider de nouvelles thérapies.
Procédures
Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en sucre seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 52 semaines pour les hamsters). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeûn 6h maximum avant le prélèvement. Des frottis vaginaux seront réalisés à plusieurs reprises au cours du projet (quotidiennement pendant 14 jours et jusqu’à 4 fois durant le projet, sur animal vigile, quelques secondes). Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à un taux normal de sucre dans le sang. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. Pour mesurer la force musculaire, nous testerons l’agrippement sur grille (2 minutes en fin de période de traitement). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes.
Impact sur les animaux
-Le traitement quotidien avec un dérivé de la testostérone induit l’absence de cycle menstruel chez la souris femelle. -L’ovariectomie (retrait des ovaires) induit l’absence de cycle œstral chez le hamster femelle. -Obésité induite par l’ingestion d’un régime gras : Le maintien de l’animal sous régime gras favorise sa prise de poids et limite ses capacités de mouvements. -Les mesures réalisées et les traitements : aucun effet douloureux n’est attendu après ces mesures cependant, il peut arriver qu’un animal supporte mal l’anesthésie ou soit stressé par certains gestes techniques. -Les mesures de dépenses énergétiques nécessitent un isolement pendant 40 heures (16 heures d’acclimatation puis 24 heures de mesure). Cela peut induire un stress.
Devenir
Nous devons collecter les organes cibles (foie, système génital, tissus adipeux, muscles, cœur, tibia a minima) donc tous les animaux seront mis à mort en fin de projet.
Remplacement
Le dérèglement associé à la SOPK et l’obésité est un dérèglement multi organique, qui se passe de façon séquentielle dans un ordre bien précis lors du développement de la maladie. Pour trouver un traitement efficace ciblant ces deux comorbidités, l'utilisation d'un modèle animal est nécessaire pour mimer à la fois l'atteinte multi-organique et l'évolution de la pathologie au cours du temps. Il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo de préscreening. La SOPK est une maladie combinant dérégulation du cycle hormonal et dérégulation métabolique. Ces dérégulations ciblent de multiples organes de l’appareil reproducteur et du système métaboliques (foie, tissu adipeux, muscle, pancréas, …). Aujourd’hui il n’existe pas de modèle in vitro ou ex vivo mimant l’ensemble de ces dérégulations.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation de la pathologie, de ses comorbidités ou sa résolution, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.
Raffinement
Lors de la mise sous régime et lors du traitement pharmacologique, l’état physique des animaux est monitoré et scoré 1 fois par jour tous les jours de l’étude. Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des animaux peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une absence de comportement de toilettage, entraineront un examen clinique poussé par la structure du bien-être animal (SBEA). Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites, ce dernier serait mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être sera placé en armoire chauffante. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage individuelle (dépense énergétique) se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les animaux peuvent voir leur congénère à proximité. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés par la SBEA avec du cicalfate crème et du cicalfate lotion 2/jour jusqu'à l'apparition des croutes. L'utilisation des antibiotiques type acide fusidique sera validé avec le vétérinaire désigné.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu pour l'étude du diabète car suffisamment caractérisé et publié. Le hamster est un modèle bien connu pour avoir un métabolisme des lipides (cholestérol et triglycérides) et des lipoprotéines, comparable à l’homme. En outre, nous avons caractérisé et publié plusieurs modèles nutritionnels de hamster, y compris celui utilisé dans le présent projet, en utilisant des mâles. En conséquence la connaissance acquise sur ces espèces permet de limiter le nombre d'animaux utilisé. Les souris sont utilisées à partir de 4 semaines d’âge et les hamsters sont utilisés à partir de 13 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine où la SOPK se met en place au moment de la puberté.
Evaluation de l’efficacité de 2 nouveaux peptides comparé à la colistine administrés par nébulisation dans un modèle d’infection pulmonaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
Rendues neutropéniques par deux injections intrapéritonéales, puis infectées par une bactérie multirésistante déposée dans leur nez sous anesthésie, 70 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Deux heures après l'infection, elles passent dix à vingt minutes dans un nébuliseur, maintenues dans un tube de contention, pour recevoir l'un des deux peptides testés, la colistine ou du solvant. Toutes sont tuées par ponction cardiaque afin de mesurer la charge bactérienne dans leur sang et leurs poumons. Le projet est classé en gravité sévère, mais le RNT décrit ces mêmes procédures comme entraînant des "nuisances modérées", une gêne "transitoire" et des douleurs "légères".
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de deux nouveaux peptides administrés par nébulisation dans un modèle murin d’infection pulmonaire aiguë à Acinetobacter baumannii, en comparaison avec la colistine, antibiotique de référence utilisé dans le traitement des infections à bactéries multirésistantes. Acinetobacter baumannii est un pathogène opportuniste responsable d’infections pulmonaires sévères, notamment chez les patients immunodéprimés ou hospitalisés en soins intensifs. L’augmentation des résistances aux antibiotiques rend nécessaire le développement de nouvelles approches thérapeutiques. Le projet vise à déterminer si les peptides testés permettent de réduire la charge bactérienne pulmonaire et systémique après infection pulmonaire chez la souris neutropénique.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus permettront d’améliorer les connaissances sur l’efficacité de nouveaux peptides antimicrobiens administrés par voie inhalée dans le traitement des infections pulmonaires bactériennes. Ce projet pourrait contribuer au développement de nouvelles alternatives thérapeutiques contre les infections à Acinetobacter baumannii, notamment dans un contexte de résistance croissante aux antibiotiques conventionnels. L’administration par nébulisation présente également un intérêt potentiel pour cibler directement le site de l’infection pulmonaire, limiter l’exposition systémique et réduire les effets indésirables associés aux traitements antibiotiques classiques.
Procédures
Les animaux seront soumis à plusieurs interventions expérimentales non chirurgicales au cours de l’étude. - Induction de l’immunosuppressiona neutropénie : 2 injections intra-péritonéale de 10 secondes - Une administration intranasale unique de la suspension bactérienne. Cette procédure sera réalisée sous anesthésie légère àgazeuse l’isoflurane afin de limiter le stress et d’assurer une administration correcte de l’inoculum. La durée de la procédure sera d’environ de 5 à 10 minutes par animal, incluant l’induction anesthésique et la récupération immédiate. - Deux heures après l’infection, une administration unique du traitement expérimental (peptides, colistine ou PBS) sera réalisée par nébulisation. La durée de l’exposition à la nébulisation sera d’environ 10 à 20 minutes selon les paramètres techniques utilisés pour l’aérosolisation, incluant la phase de préparation des animaux dans le nébuliseur, l’administration du composé et la récupération de l’animal. - Une anesthésie fixe par voie IP de 10 secondes - Un prélèvement intra cardiaque sous anesthésie fixe d’environ 1 minute et mise à mort.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à plusieurs procédures susceptibles d’entraîner des nuisances modérées : • Induction de neutropénie pouvant entraîner une fragilité immunitaire transitoire, l’administration peut provoquer une douleur légère transitoire au site d’injection. • Administration intranasale de la suspension bactérienne sous anesthésie • Développement d’une infection pulmonaire aiguë pouvant provoquer une altération de l’état général, une diminution de l’activité ou une gêne respiratoire ; surtout dans la phase pilote, ces effets ne sont pas recherchés pour la phase d’efficacité • Administration des traitements par nébulisation pourra provoquer une gène transitoire car la souris sera dans un tube de contention souple le temps de l’administration. • Prélèvements terminaux sanguins sous anesthésie pouvant provoquer une douleur légère au site d’injection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour évaluer la charge bactérienne dans le sang et dans les poumons.
Remplacement
Le recours à l’expérimentation animale est nécessaire dans ce projet car les interactions complexes entre l’hôte, le pathogène et le traitement administré par voie inhalée ne peuvent pas être reproduites de manière satisfaisante par des méthodes alternatives in vitro ou in silico. L’évaluation de l’efficacité thérapeutique nécessite notamment l’étude de la diffusion pulmonaire des composés, de la réponse à l’infection bactérienne et de la dissémination systémique, qui dépendent d’un organisme vivant entier. Toutefois, les données disponibles issues d’études préalables in vitro sur l’activité antibactérienne des peptides ont permis de sélectionner les candidats les plus pertinents avant le recours au modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été limité au minimum nécessaire permettant d’obtenir des résultats scientifiquement exploitables et statistiquement interprétables. Les effectifs ont été définis sur la base de l’expérience acquise avec ce type de modèle infectieux et du nombre de groupes nécessaires à la comparaison des traitements expérimentaux avec les groupes contrôle. Une phase pilote restreinte permettra d’optimiser l’inoculum bactérien avant l’étude principale, afin d’éviter la répétition d’expériences inutiles.
Raffinement
Toutes les procédures seront réalisées par du personnel formé et compétent afin de limiter le stress et la souffrance des animaux. Les animaux seront hébergés dans des conditions adaptées à leurs besoins physiologiques et comportementaux par cage de 10 avec des frisottis ou des jeux et avec une surveillance quotidienne renforcée durant les phases critiques de l’étude. L’état clinique sera suivi régulièrement afin d’identifier précocement tout signe de souffrance. Des points limites seront appliqués et tout animal présentant une altération sévère de l’état général sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance prolongée.
Choix des espèces
Les souris représentent classiquement un des modèles de choix pour l’évaluation de la charge bactérienne en particulier dans les modèles d’infection pulmonaire déjà développés au sein du laboratoire. Souris de 8 semaines de façon à avoir un poids corporel d’environ 30-35g (même poids que pour les précédentes études).
Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Biopsiées à l'oreille vers une semaine de vie, testées cinq fois avant trois semaines d'âge, les mêmes souris enchaînent treize tests entre dix et dix-neuf semaines, répartis sur dix semaines avec trois à sept jours de repos entre chacun. Certains se déroulent dans l'eau, d'autres mesurent la force musculaire ou la mémoire, et un sous-groupe reçoit une injection déclenchant des crises d'épilepsie. 768 souris sont utilisées dans ce second volet, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau et les muscles.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d’étude car elle présente de nombreuses similitudes avec l’être humain. Bien que la surface de son cerveau soit plus simple que celle de l’homme, la grande majorité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. De plus, une part très importante des mécanismes biologiques est partagée, ce qui permet d’étudier de manière pertinente l’origine de certaines maladies affectant le cerveau et les muscles. La souris est également un modèle particulièrement adapté pour l’étude des comportements. Elle permet d’analyser des fonctions complexes telles que les capacités de mouvement, certaines formes de mémoire ou les interactions sociales, qui ne peuvent pas être étudiées de manière fiable avec des modèles non animaux. Par ailleurs, ce modèle permet d’étudier séparément les mâles et les femelles, un point essentiel car certaines maladies du cerveau touchent différemment les deux sexes et sont plus fréquentes chez les garçons. Les animaux seront étudiés à plusieurs stades clés de leur développement afin de mieux comprendre l’apparition et l’évolution des maladies. Une première phase concernera la période précoce après la naissance, jusqu’à la troisième semaine de vie. À ce stade, le système nerveux et les muscles sont encore en cours de maturation. L’étude de cette période permet de détecter d’éventuels retards ou anomalies du développement moteur dès leur apparition. Une seconde phase sera réalisée chez les mêmes animaux à l’âge adulte, lorsque le cerveau et les muscles ont atteint leur maturité. Cette étape est indispensable pour évaluer de manière fiable les capacités motrices, musculaires et certaines fonctions cognitives, et pour comprendre comment les anomalies observées précocement évoluent au cours du temps.
Évaluations précliniques de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les infections multirésistantes bactériennes, fongiques ou virales MODIFICATION
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 1500
Quatre-vingt-dix études prévues sur cinq ans mobilisent 5 250 souris et 1 500 rats, tous tués à l'issue, dont 3 600 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Les animaux sont infectés une fois par un virus, une bactérie ou un champignon, puis traités une à quatre fois par jour pendant dix jours, avec pesées quotidiennes et prélèvements de sang hebdomadaires sous anesthésie. Selon les protocoles, ils reçoivent un cathéter intra-urétral, une administration intranasale ou une lésion cutanée provoquée, et développent fièvre, perte de poids, détresse respiratoire et mobilité réduite. Le rat est retenu parce que sa taille permet des prélèvements de sang répétés plus abondants, la souris parce que les lignées transgéniques y sont nombreuses.
Objectifs
Le projet propose l’évaluation préclinique de composés anti-infectieux pour déterminer leur efficacité contre des agents pathogènes, incluant des virus, des bactéries et des champignons. L’objectif principal est d’explorer le potentiel thérapeutique de ces traitements pour la diminution de la résistance aux antibiotiques et la découverte de traitement contre les infections virales et fongiques dans les secteurs de la santé humaine et animale. Le nombre d'étude envisagées sur 5 ans est 90. L'efficacité des traitements sera mesurée à travers des tests biologiques et cliniques sur les modèles animaux, en évaluant leur capacité à éliminer ou inhiber la prolifération des agents infectieux, tout en favorisant une réponse immunitaire appropriée. Ce projet s’inscrit dans une démarche de développement de nouvelles solutions thérapeutiques, dans une perspective de prévention et de traitement des infections.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet sont multiples avec un impact significatif sur la santé humaine et animales. En développant des composés anti-infectieux, le projet vise à répondre à des besoins non satisfaits dans la lutte contre les infections virales, bactériennes et fongiques, en particulier face à la résistance antimicrobienne et aux effets secondaires des traitements existants. Le projet permettra de concevoir de nouveaux traitements ciblant plus efficacement les infections, en particulier dans les contextes où les thérapies actuelles échouent. Cette innovation pourrait améliorer la gestion des infections résistantes et des maladies difficiles à traiter. Les résultats du projet auront un impact direct sur la santé humaine et animale, en réduisant la prévalence des infections et la résistance aux traitements, contribuant ainsi à améliorer la santé publique. A court terme, ce projet permettra l'identification rapide de composés prometteurs ayant une activité anti-infectieuse spécifique et une compréhension fine de la physiopathologie infectieuse, en particulier les interactions hôte-pathogène et les réponses immunitaires induites. A long terme, ces recherches autoriseront le développement de nouvelles approches thérapeutiques pour des infections graves ou résistantes alternatives aux antibiotiques. La réduction de la mortalité et de la morbidité associées aux infections bactériennes, fongiques ou virales, en particulier dans les populations à risque (immunodéprimés, enfants, patients hospitalisés), favorisera l'amélioration de la préparation face aux pandémies par la mise au point de traitements adaptables à différents pathogènes et des avancées scientifiques transversales profitant à d’autres domaines (cancérologie, immunologie, microbiome, médecine personnalisée).
Procédures
Le projet implique une seule administration des virus, bactéries ou champignons pour l'ensemble des protocoles. Cette procédure n'excède pas 15 secondes pour chaque animal et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les traitements avec les composés testés sont de 1 à 4 fois par jour pendant 10 jours maximum. Ce geste n'excède pas 10 secondes par animal. Pour l'ensemble des protocoles, des pesées journalières sont réalisées ; pour chaque souris, une contention de 20 secondes maximum est nécessaire pour cette mesure. Enfin, des prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse (pendant 1 minute) sont pratiqués pour la mesure des paramètres inflammatoires. En prenant en compte le temps de récupération des souris, le nombre maximum de prélèvement est de 1 fois par semaine pour l'ensemble des procédures. 30 minutes avant le prélèvement, un traitement avec un analgésique est pratiqué pour réduire la douleur ; ce traitement est également réalisé pour les installations de cathéters et la génération de lésions cutanées.
Impact sur les animaux
Les nuisances principales concernent la douleur et l'inconfort induits par les injections, les inflammations et l'infection. Des efforts sont faits pour limiter ces impacts en suivant des protocoles de réduction de la douleur et du stress. L'anesthésie avec l'isoflurane induit un stress de courte durée (15 secondes). Les piqûres d’aiguille pour infecter ou traiter les animaux entraînent une douleur légère de courte durée (2 secondes). Lors d'infection urinaire l'installation d’un cathéter intraurétral peut induire une inflammation locale de la vessie, causant un léger inconfort temporaire (1 minute). L'administration par voie intranasale de molécules peut entraîner une inflammation : douleur modérée (10 secondes). La génération de lésion cutanée (modèle cicatrisation) induit une douleur importante de 2minutes ; cet effet indésirable majeur sera contrôlé par analgésique et anesthésie. L'infection par des agents pathogènes induit la pathologie avec des symptômes attendus comme la fièvre, la perte de poids, la diminution de la prise alimentaire et hydrique, détresse respiratoire et une mobilité réduite. Ces symptômes sont causés par la maladie elle-même, ce qui constitue une altération de l'état général de l'animal. La préhension répétée, bien que de courte durée (20 secondes), peut être perturbant pour les animaux et induit un stress, mais il est géré en limitant la fréquence et la durée de ces manipulations. Ceci peut affecter le bien-être psychologique des animaux pendant la durée de la manipulation. UNE PRIVATION DE NOURRITURE DE PLUSIEURS HEURES PROVOQUE UN STRESS MÉTABOLIQUE MARQUÉ PAR UNE CHUTE DE LA GLYCÉMIE ET UNE HAUSSE DES HORMONES DU STRESS. CET ÉTAT DÉCLENCHE UNE ALTÉRATION COMPORTEMENTALE, OSCILLANT ENTRE UNE AGITATION ANXIEUSE ET UNE LÉTHARGIE. LES SOURIS AYANT DES MALADIES METABOLIQUES AURONT PLUS DE NUISANCE, COMME L'ETAT GENERAL ET LA MOBILITE. LES NUISANCES ATTENDUES SONT LES SIGNES CLINIQUES DETAILLE DANS L'ANNEXE 1.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux sont mis à mort et des prélèvements d'organes et de sang sont réalisés pour des mesures de charge microbienne, de paramètres inflammatoires et des études d'histologie.
Remplacement
Préalablement à toute utilisation d'animal, nous intègrons dans nos projets des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Il existe plusieurs alternatives non animales dans la recherche sur les maladies infectieuses et inflammatoires, mais elles ne peuvent pas remplacer totalement les tests sur les animaux utilisés dans ce projet. 1. Modèles in vitro : Les cultures cellulaires humaines ou animales permettent d’étudier des interactions cellulaires et les réponses inflammatoires. Cependant, elles ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment les interactions multicellulaires complexes et la réponse immunitaire systémique. 2. Modèles ex vivo : Les tissus humains ou animaux (biopsies, organes) permettent d’étudier des processus biologiques en conditions plus réalistes, mais il manque des interactions entre plusieurs systèmes organiques, essentiels pour comprendre les maladies infectieuses et inflammatoires. 3. Modèles organoïdes et organes sur puce : Ces systèmes imitent des organes comme les poumons ou les reins pour étudier les réponses biologiques. Cependant, ils ne peuvent pas reproduire la réponse systémique d'un organisme complet. 4. Modélisation informatique : Les simulations informatiques peuvent modéliser certaines interactions pathogènes et immunitaires, mais elles ne peuvent pas simuler toutes les réactions biologiques complexes d'un organisme vivant. Ces alternatives ne peuvent pas complètement remplacer les animaux, pour les raisons suivantes : • Complexité biologique : Les modèles non animaux ne peuvent pas reproduire la complexité d’un organisme vivant complet, limitant leur capacité à simuler des réponses biologiques globales. • Interactions systémiques : Les maladies infectieuses et inflammatoires nécessitent l'étude des interactions complexes entre les systèmes biologiques, ce qui ne peut être simulé sans un modèle vivant.
Réduction
Nous intègrons dans notre projet des modèles in vitro, tissulaires et des organoïdes, afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et d’optimiser les essais précliniques. Les modèles in vitro et tissulaires permettent de tester les composés anti-infectieux et immunomodulateurs sur des cultures cellulaires et tissulaires, évaluant leur efficacité, leur innocuité et leurs mécanismes d’action avant tout essai in vivo. Les organoïdes reproduisent des structures d’organes spécifiques, comme les poumons, la vessie et les reins, permettant d’étudier la réponse des tissus aux infections et traitements dans un environnement plus réaliste. En combinant ces approches, nous contribuons à la réduction des expérimentations animales, tout en garantissant la précision des résultats. Cette approche permet d'identifier les composés les plus prometteurs et de maximiser l'efficacité des traitements contre les infections virales, bactériennes et fongiques. De façon systématique des analyses statistiques sont effectuées pour déterminer le nombre d’animaux optimal afin de produire des résultats robustes pour chaque end point: généralement la charge virale, bactérienne ou fongique dans les organes ciblés, analyse de la survie, mesure de biomarqueurs (exemple: biomarqeur hépatique) et évaluation de l'inflammation.
Raffinement
Dans les expérimentations pour les maladies infectieuses et inflammatoires, la fréquence de surveillance des animaux est essentielle pour garantir leur bien-être. Les signes de détérioration de l’état de santé, sont particulièrement surveillés par l'observation de points limites en raison des effets des infections et inflammations. Après l'infection ou l'administration de traitements, une surveillance plus rapprochée (toutes les 2 à 4 heures) est mise en place dans les premières 12 heures, pour détecter rapidement des signes de détresse. Des critères d'arrêt stricts sont définis pour éviter la souffrance excessive des animaux. L’objectif est de garantir que l’état de l’animal est constamment suivi et que des soins vétérinaires sont fournis dès que nécessaire. La prévention du stress est intégrée au protocole expérimental par l'utilisation d'une anesthésie gazeuse et administration d'analgésique au préalable des gestes douloureux (injection par piqure...).
Choix des espèces
En infectiologie, les souris sont le modèle le plus documenté pour les infections bactériennes, fongiques et virales. Leur système immunitaire, bien caractérisé et très proche de celui de l’humain, permet l’analyse fine de la réponse hôte. Il y a une grande disponibilité de lignées transgéniques, utiles pour étudier des voies spécifiques des défenses immunitaires. Les rats ont une taille corporelle supérieure à celle de la souris, permettant des prélèvements répétés de sang en quantité suffisante pour des dosages biochimiques, hématologiques ou pharmacocinétiques. Ils présentent une meilleure tolérance aux manipulations, ce qui les rend adaptés aux études de suivi prolongé, à administration chronique. Les modèles infectieux bien établis pour certaines pathologies spécifiques, comme les infections pulmonaires et urinaires, sont parfois plus représentatifs chez le rat que chez la souris. Les animaux utilisés dans le cadre des modèles de pathologies infectieuses sont des jeunes adultes, âgées de minimum de 6 à 10 semaines. Ce stade de développement correspond à une maturité immunologique, métabolique et physiologique optimale, ce qui en fait un modèle préclinique pertinent et standardisé pour l’étude des maladies infectieuses et inflammatoires humaines. A partir de la 6e semaine, les animaux présentent un système immunitaire complet (réponses innée et adaptative), permettant une réponse fiable aux agents pathogènes étudiés (bactéries, virus, champignons). Les animaux sont sevrés, stabilisés, et moins sujets aux fluctuations hormonales ou de croissance rapides, ce qui renforce la reproductibilité expérimentale. La morphologie permet des manipulations techniques précises (voies d’infection, prélèvements sanguins, administration de traitements). La majorité des publications scientifiques et des recommandations réglementaires utilisent ce stade pour modéliser des infections systémiques, respiratoires, digestives ou cutanées.
Utilisation d’animaux dans le cadre de la formation et du perfectionnement des expérimentateurs aux gestes techniques et aux techniques chirurgicales chez les rongeurs
- Formation professionnelle
Rats : 500
Former le personnel de l'établissement aux gestes techniques, y compris pour répondre aux demandes de clients, justifie l'utilisation de 500 souris et 500 rats, tous tués à l'issue. 200 d'entre eux sont opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil, les autres relevant de procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque animal peut subir jusqu'à trois gestes différents par semaine pendant quatre semaines consécutives, injections, prélèvements de sang, d'urine ou de liquide synovial, ou chirurgie avec réveil. Le remplacement "ne peut pas être assuré" et le recours à des animaux vivants est "nécessaire et indispensable", écrit le porteur, qui précise par ailleurs que les sutures s'apprennent sur peau artificielle et les chirurgies sur cadavres décongelés.
Objectifs
Les recherches menées au sein de notre laboratoire, ainsi que les demandes faites par les clients vont nous amener à former notre personnel sur des techniques d’expérimentation animale. L’objectif du projet est d’avoir du personnel formé mais également que chaque expérimentateur conserve son niveau technique tout au long de l’année. Quel que soit le geste, une injection ou une technique de chirurgie invasive, la formation et l’entraînement des expérimentateurs est très importante. En effet, un expérimentateur formé et entraîné sera confiant, moins stressé, ce qui limitera/induira moins de stress chez les animaux et permettra par ailleurs une meilleure homogénéité des gestes et techniques ainsi qu’une meilleure reproductivité. Les animaux utilisés seront des rats et des souris âgés de 0 à 2 ans mâles ou femelles. Tous ces critères seront choisis en fonction du geste technique à effectuer et du protocole pour lequel l’entraînement ou la formation sera attribué. Cette saisine comprend 3 procédures : Procédure 1 : Formation en expérimentation animale avec une sévérité de classe légère. Cette procédure concernera essentiellement les formations et entraînements qui n’auront pas ou peu d’impact sur le bien-être des animaux. A titre d’exemple, les gestes techniques pourront être des administrations de solvant, des prélèvements de sang, d’urine, de liquide synovial. Procédure 2 (sans réveil) et Procédure 3 (avec réveil) : Formation en expérimentation animale avec une sévérité de classe modérée. Cette procédure concernera toutes les formations et entraînement qui auront au maximum un impact modéré et surtout réversible sur les animaux. A titre d’exemple, cette procédure sera utilisée pour les formations et entrainement aux chirurgies pour lesquelles une douleur post-opératoire transitoire sera présente.
Bénéfices attendus
Ce projet, prévue sur 5 ans, permettra de former les expérimentateurs, de les entraîner et de maintenir et développer leurs compétences/niveau d’expertise sur nos techniques d’expérimentations animales. Ces formations permettent aux expérimentateurs d’acquérir des gestes techniques parfaitement maîtrisés. Ceux-ci visent à limiter au maximum l’inconfort et l’anxiété de l’animal pendant l’expérimentation. De plus, la qualité des résultats expérimentaux obtenus dans les études sera améliorée par la maîtrise de ces gestes et permettra de ne pas réaliser ces expérimentations sur un plus grand nombre d’animaux que nécessaire (réduction du nombre d’animaux utilisés).
Procédures
Selon la procédure à laquelle est affecté l'animal, les interventions pourront être : - des administrations de solvant sur animal vigile ou anesthésié (Procédure 1), 2 fois maximum par semaine, - des prélèvements de sang, d'urine ou de liquide synovial sur animal vigile ou anesthésié (Procédure 1), 1 fois maximum par semaine et dans le respect des volumes maximum recommandés, - un geste chirurgical sans réveil (Procédure 2) ou avec réveil (Procédure 3) sur animal anesthésié et avec une prise en charge de la douleur et un suivi post-opératoire adaptés à la chirurgie pratiquée.
Impact sur les animaux
Les gestes ou actions expérimentales effectuées par une personne peu expérimentée peuvent générer du stress, un inconfort ou une douleur locale. Des effets indésirables attendus liées au geste chirurgical, seront suivis avec rigueur. Plus précisément, nous surveillerons l'état général et clinique des animaux pour estimer une éventuelle gêne ou douleur occasionnée par l’acte chirurgical, tel qu’un traumatisme et une inflammation au niveau de la zone opérée. Aucun signe clinique n’est attendu suite à l’administration de solvant ou le prélèvement de sang sauf un petit hématome au point d’injection ou de prélèvement qui ne doit pas persister sur du long terme.
Devenir
Les mêmes animaux utilisés pour la formation de l’administration peuvent être également utilisés pour les formations de prélèvement. Un maximum de 3 gestes (différents) par semaine, par animal et sur un maximum de 4 semaines consécutives ne sera pas dépassé. Dans la mesure de possible, les animaux sont utilisés pour collecter des organes ou du plasma à la fin de l’ensemble des procédures. A l’issue de chaque procédure tous les animaux seront humainement mis à mort et autopsiés minutieusement. Les organes d'intérêts, dont les pièces osseuses, seront prélevés. Les prélèvements sanguins et urinaires pourront être utilisés pour doser un marqueur en lien avec le modèle/la chirurgie. Une analyse macroscopique des organes sera réalisée et différents tissus et organes pourront être prélevés en vue de réaliser des analyses histologiques, des analyses par imagerie micro-CT, et/ou des analyses moléculaires.
Remplacement
Le remplacement ne peut pas être assuré car nous avons besoin des animaux vivants pour pouvoir les manipuler et réaliser le geste (chirurgical ou non), faire un suivi post-opératoire et anticiper toute réaction de l’animal lors de nos protocoles par la suite. Aucune méthode alternative ne permet actuellement de reproduire tous les paramètres physiologiques qui sont liés à un individu dans sa globalité. L'utilisation de modèles animaux vivants est donc nécessaire et indispensable.
Réduction
Pour la mise en place de la Procédure 2 (sans réveil) et de la Procédure 3 (avec réveil), le personnel s’entraîne au préalable sur du cadavre animal décongelé ou sur de la peau artificielle (sutures). Le nombre d’animaux est choisi en tenant compte du nombre nécessaire et suffisant pour avoir du personnel formé, compétent et sûr de lui. Le nombre d’animaux vivants est réduit au maximum (en effet tout ce qui peut être réalisé sur cadavre ou sur peau artificielle (comme les sutures) est mis en œuvre) afin d’avoir des expérimentateurs suffisamment entraînés et en maîtrise des gestes techniques (chirurgies, administrations et prélèvements), permettant la mise en place de gestes standardisés et reproductibles dans les études, permettant d’éviter tout éventuel risque de surmortalité pendant les phases d’anesthésie, de chirurgie et d’administration.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des locaux adaptés permettant leur maintien dans un environnement adéquat et induisant le minimum de stress. Des mesures spécifiques et adaptées aux douleurs éventuelles occasionnées par les différents gestes pour éviter toute souffrance inutile et prolongée seront mises en place. Les conditions d’hébergement seront optimisées : les animaux seront hébergés en groupe (au maximum 4 rats ou au maximum 5 souris par cage avec de la litière en chips spécifique) avec un enrichissement du milieu (tunnel en PVC transparents rouge, carré de cellulose, bâton de bois ou billes de bois, kraft), un accès facilité à la nourriture (quand nécessaire) et/ou ajout de nourriture appétente, et seront surveillés bi-quotidiennement les jours ouvrés et quotidiennement les week-end et jours fériés. Les formations seront données par du personnel expert afin d’assurer au mieux les contentions, les manipulations et les gestes techniques afin d’éviter tout stress et limiter toute souffrance pour l’animal. Par ailleurs, l’acquisition des gestes chirurgicaux sera en priorité acquis initialement sur des cadavres d’animaux décongelés et maîtrisés sur des animaux anesthésiés sans réveil avant une validation finale sur des animaux avec réveil et suivi post-opératoire. Pour tous nos protocoles, y compris les animaux de formation, une grille de points limites est mise en place. La mise en place d’un traitement analgésique et/ou anti-inflammatoire préventif et/ou curatif seront également mis en place en fonction du type d’entraînement. Les animaux seront maintenus le minimum de temps dans une situation d’inconfort et de douleur. Un suivi sera mis en place afin d’avoir l’historique des gestes effectués sur chaque animal tout au long de sa vie dans notre animalerie. Cela nous permettra de nous assurer qu’un temps de récupération nécessaire a été respecté entre deux gestes effectués sur un même animal (respect du délai entre deux prélèvements de sang, entre deux administrations…).
Choix des espèces
Sous le couvert de la réglementation française, le stade de développement des animaux sera défini avant chaque type d’entraînement sur des animaux âgés de 0 à 2 ans. Les besoins de formation et d’entraînement au sein de notre établissement sont sur les espèces de rat et de souris.
Traitements innovants des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Rats : 2400
7 720 souris et 2 400 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une colite est provoquée chez chaque animal, avec perte de poids puis diarrhées et baisse d'activité, avant d'appliquer une lumière UV dans le colon, d'injecter des leurres apoptotiques synthétiques ou d'administrer des nanovecteurs. Aucun analgésique ne leur est donné, le porteur indiquant que les anti-inflammatoires modifieraient la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire étudiés. Les animaux dont le score clinique passe en sévère sortent de l'étude et sont mis à mort, une quantité importante de sang étant prélevée sur les autres au moment de leur propre mise à mort.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI) touchent un nombre croissant de patients en France et dans le monde. Elles ont un impact important sur la qualité de vie tant sur le plan physique que psychologique et social. L’apparition des MICI chez l’Homme est très souvent due à une dérégulation du système immunitaire. Lors d’une agression pathogène physique ou chimique, une inflammation va se créer au niveau de l’intestin. Dans certain cas, cette inflammation va persister et ainsi provoquer une inflammation chronique. L'objectif de ce projet consiste à évaluer de nouvelles approches thérapeutiques ayant déjà montré un intérêt après évaluation dans des modèles simplifiés in vitro. Une première approche consiste à appliquer une lumière UV in situ au niveau de la lésion du colon. Cette exposition va permettre d’induire une mort cellulaire programmée, nommée apoptose, de certaines cellules sur le site de l’inflammation et ainsi de ré-engager la résolution de l’inflammation ainsi que la réparation tissulaire. Des premiers résultats encourageants montrent une amélioration du score clinique des animaux après traitement. Il est donc essentiel de continuer ces travaux pour comprendre afin d’améliorer, et rendre cette thérapie accessible aux patients. La deuxième approche consiste à appliquer des particules imitant les cellules en mort programmée pour ré-engager la résolution et la réparation tissulaire. Pour cela différentes formulations des leurres apoptotiques synthétiques devront être testées afin de se rapprocher au mieux de la cellule apoptotique physiologique. La troisième partie est orientée sur la formulation de substances actives pour en améliorer leur efficacité et leur tolérance. Pour cela, différents nanovecteurs seront développées afin de renforcer l’activité de l’actif thérapeutique par le biais d’un meilleur ciblage de la lésion inflammatoire permettant ainsi de pouvoir administrer des médicaments.
Bénéfices attendus
Les MICI touchent un nombre croissant de patient en France (+ de 300000 patients) et dans le monde. Aujourd’hui des traitements symptomatiques efficaces existent : anti-inflammatoires, corticoïdes, biothérapies. Malgré tout cet arsenal, 50% des patients doivent subir une chirurgie lourde à 10 ans. Il est donc nécessaire de développer de nouvelles alternatives thérapeutiques pour palier à ces pathologies. Dans ce projet, nous développons des thérapies qui visent, les symptômes de la maladie tout en en réduisant les effets secondaires, mais aussi les causes en venant moduler et rééduquer le système immunitaire. A échéance courte, ce projet permettra de proposer de nouvelles formes médicamenteuses spécifiques de ces maladies et apportera des connaissances cruciales quant aux mécanismes cellulaires et immunologiques responsables de la pathologie. Cela permettra de promouvoir de nouvelles stratégies thérapeutiques accessibles aux patients à plus long terme. De plus, ces traitements, que nous évaluons dans ces modèles de MICI, ne sont pas spécifiques de ces pathologies mais pourront ensuite être testés et adaptés à une grande majorité des maladies inflammatoires chroniques tels que la polyarthrite rhumatoïde, la sclérose en plaque…
Procédures
Les traitements seront administrés sous anesthésie. Pharmacocinétique : les prélèvements de sang se feront au niveau de la veine caudale grâce à un catheter.
Impact sur les animaux
Dans cette étude, les animaux vont développer différentes formes des maladies chroniques de l’intestin. Ces pathologies sont caractérisées et évaluées sur différents critères relevant des nuisances causées aux animaux. Un des premiers signes est la perte de poids. Ensuite apparaissent des diarrhées. L’activité des animaux va alors être impactée. Ces nuisances apparaissent généralement quelques jours après le début de l’induction.
Devenir
Une quantité impotante de sang sera prélévé au moment de la mise à mort et différents organes seront prélevés pour évaluer l'efficacité des traitements. Des analyses de biodistribution seront réalisées.
Remplacement
Un modèle animal, et plus précisément mammifère doté d’un système immunitaire complexe, est nécessaire pour étudier les acteurs des réponses immunes dans les pathologies inflammatoires chroniques. En plus des éléments apportés par les expériences réalisées préalablement à l’aide de modèles de culture cellulaire, le modèle vivant est essentiel à la preuve d’efficacité des thérapeutiques développées dans ce projet. Les études de délivrance et de biodistribution nécessitent forcément d’avoir recours à l’expérimentation animale. Il n’est pas possible de créer in vitro la complexité du système immunitaire ou celle des barrières épithéliales avec tous les acteurs cellulaires entrant en jeu.
Réduction
Le nombre d’animaux est calculé au plus juste afin de détecter une différence de 20-30% sur les scores clinique, histologique et marquers de l'inflammation avec une puissance statistique de 80% et un risque alpha de 0,05 soit des des groupes de 6-10 individus pour les souris et 5-8 pour les rats. Ces paramètres ont été consolidés par le passé grâce à nos expériences réalisées sur ces mêmes modèles.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages stériles pour les études impliquant une action directe sur le système immunitaire afin de ne pas entrainer de biais sur les expériences. Pour les études concernant la formulation d’actifs thérapeutiques, elles seront réalisées dans des cages non stériles. L’intensité de la pathologie est contrôlée lors de l’induction afin de ne pas induire une pathologie trop intense avec une trop grande souffrance des animaux. Les animaux seront suivis quotidiennement afin d’évaluer les nuisances causées ainsi que la sévérité de la pathologie. En cas de score estimé sévère sur l’état général de l’évaluation clinique, les animaux seront exclus de l’étude et mis à mort car l’utilisation d’anti-inflammatoire n’est pas envisageable en raison de la pathologie inflammatoire induite et des modifications induites sur la motilité intestinale et le mécanisme inflammatoire par les analgésiques. En cas de réduction d’activité, les animaux recevront de la nourriture et/ou de l’eau sous une forme plus accessible dans la cage.
Choix des espèces
La souris ainsi que le rat présentent un système immuno-physiologique très proche de celui de l’humain, idéal pour l’évaluation des thérapeutiques. Les modèles utilisés dans ce projet sont les modèles de références unanimement validés par la communauté scientifique internationale. La souris présente également l’avantage d’être disponible avec différentes mutations génétiques permettant d’étudier plus profondément certains mécanismes cellulaires. Souris agées de 3 à 8 semaines seront utilisées Rats agés de 5-6 semaines
Etude des causes génétiques des maladies affectant le cerveau et le muscle dans des modèles de souris transgéniques (EU 1/2)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Génétiquement modifiées pour porter des mutations trouvées chez des enfants atteints à la fois de maladies du cerveau et de faiblesse musculaire, 768 souris vont être utilisées, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Un morceau d'oreille leur est prélevé vers 7 à 10 jours de vie pour le génotypage, puis cinq tests de motricité leur sont appliqués entre une et trois semaines d'âge. Un sous-groupe reçoit une injection destinée à déclencher des crises d'épilepsie, avec vingt minutes d'observation ensuite. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et muscles, la comparaison de ces deux organes étant l'objet même du projet.
Objectifs
Les maladies du cerveau représentent un enjeu majeur de santé publique. Malgré les progrès récents de la génétique, près d’un patient sur deux ne bénéficie toujours pas d’un diagnostic génétique précis. Cette situation est souvent liée au fait que les gènes impliqués sont encore mal compris, ce qui entraîne des délais prolongés avant que les enfants concernés puissent recevoir un diagnostic. Ces maladies sont très diverses sur le plan génétique. A ce jour, plus de 2 000 gènes sont impliqués dans les maladies du cerveau. De plus, les atteintes du cerveau sont fréquemment associées à des problèmes musculaires, tels que des difficultés de mouvement, de coordination ou une faiblesse musculaire. Ce lien suggère que certains gènes jouent un rôle commun dans le fonctionnement du cerveau et des muscles. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre le rôle de plusieurs gènes récemment identifiés chez des patients présentant à la fois des maladies du cerveau et des atteintes musculaires. Ces gènes ont été choisis car ils sont systématiquement associés à ces deux types de symptômes, ce qui en fait des gènes candidats particulièrement pertinents pour étudier les liens entre cerveau et muscle. Pour atteindre cet objectif, nous utiliserons des modèles de souris génétiquement modifiées afin d’analyser le développement moteur, les capacités de mouvement et certaines fonctions cognitives, comme la mémoire, à différents stades de la vie. L’étude portera à la fois sur des stades précoces du développement et sur l’âge adulte, afin d’identifier le moment où apparaissent les anomalies et leur évolution dans le temps. Ce projet qui sera realisé sur deux établissements (EU 1/2 et EU 2/2), vise à améliorer la compréhension des maladies touchant à la fois le cerveau et les muscles chez les patients, souvent des enfants, afin de contribuer au développement futur de meilleures stratégies diagnostiques et, à terme, thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Dans de nombreuses maladies du cerveau, les premiers signes apparaissent d’abord au niveau des muscles, peu de temps après la naissance et avant l’apparition des atteintes cognitives. Ainsi, étudier précocement le développement moteur permettrait de détecter très tôt les signes cliniques qui sont parfois invisibles à l’âge adulte, soit parce qu’elles sont corrigées par l’organisme, soit parce qu’elles s’aggravent avec le temps. Ce projet va permettre d’identifier précisément quand apparaissent les premiers signes de la maladie, d’améliorer la compréhension de son évolution et de disposer d’indicateurs précoces utiles pour mieux orienter le diagnostic et la prise en charge des patients, tout en évitant des méthodes plus invasives.
Procédures
Les souris utilisées dans ce projet seront soumises à des interventions sans chirurgie qui sont basées sur l’observation de leur comportement et de leurs capacités de mouvement. Dans un premier temps, un très petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille de chaque souris afin de caractériser leurs gènes. Ce geste est réalisé une seule fois et dure quelques secondes. Chez les jeunes souris, des observations seront réalisées pour suivre le développement des mouvements, comme la capacité à se déplacer, à se retourner ou à utiliser leurs pattes. Ces tests sont courts et durent moins d’une minute. Le nombre total de tests effectués au stade précoce (entre 1 et 3 semaines d’âge) dans l’EU 1/2 est de cinq, pour une durée totale maximale d’environ cinq minutes, les tests étant réalisés successivement. À l’âge adulte, les mêmes souris participeront à différents tests permettant d’évaluer leur comportement, leur mémoire et leurs capacités physiques. Ces tests consistent principalement à observer leurs déplacements, l’exploration d’un environnement ou la force musculaire. Chaque test dure quelques minutes et les animaux bénéficient de périodes de repos entre les séances. Le nombre total de tests effectués à l’âge adulte dans l’EU 2/2 est de treize. Ils seront répartis sur une période de 10 semaines avec des périodes de repos de 3 à 7 jours entre les tests. Les animaux auront alors entre 10 et 19 semaines d’âge. Pour un nombre limité de souris adultes (un sous-groupe), un test spécifique permettra d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie à l’aide d’une injection unique. Les animaux seront ensuite surveillés en continu pendant 20 minutes après l’injection. Cette étape est importante car, dans de nombreux cas, les crises d’épilepsie représentent un symptôme majeur qui aggrave fortement la maladie et la qualité de vie des patients. Étudier ces crises chez la souris permet donc de mieux comprendre leur origine et leur lien avec les autres symptômes observés. À la fin du projet, les souris seront mises à mort afin de permettre le prélèvement et l’analyse de certains organes, dont le cerveau et les muscles. Ces analyses sont indispensables pour mieux comprendre les maladies qui touchent à la fois le cerveau et les muscles chez les enfants malades.
Impact sur les animaux
À l’âge d’environ une semaine, un petit prélèvement sera réalisé sur l’oreille des souris afin d’analyser leurs gènes. Ce geste peut provoquer une douleur légère et de courte durée, ainsi qu’un léger stress lié à la manipulation. Le risque de saignement est très faible. Tout au long du projet, chez les souris jeunes et adultes, différents tests seront réalisés pour observer leurs mouvements et leur comportement. Ces manipulations peuvent entraîner un stress temporaire, notamment lors de la prise en main ou de l’exposition à un nouvel environnement. Les tests sont courts, espacés dans le temps et les animaux sont habitués au matériel et à la salle d’expérimentation afin de limiter ces effets. Lors de certains tests, notamment ceux réalisés dans l’eau, les souris peuvent ressentir un inconfort passager lié au contact avec l’eau. Ces effets sont limités par une durée d’exposition courte de quelques minutes, une température de l’eau contrôlée, une surveillance continue et un séchage immédiat après chaque session. Pour un nombre limité de souris adultes, un test permettant d’évaluer la sensibilité aux crises d’épilepsie sera réalisé à l’aide d’une injection unique. Cette injection peut entraîner une douleur légère et transitoire au point d’injection, ainsi que l’apparition temporaire de crises convulsives. Les animaux seront surveillés en continu pendant une période maximale de 20 minutes. Si des signes de détresse sévère apparaissent, le test sera immédiatement interrompu et l’animal pris en charge. Enfin, une lignée de souris particulière peut développer des tumeurs à partir de l’âge de 6 mois. Les animaux utilisés pour les tests seront mis à mort bien avant cet âge. Les animaux conservés en élevage seront également mis à mort avant l’âge limite de 6 mois.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement des muscles et du cerveau. Ces prélèvements sont nécessaires pour réaliser des analyses anatomiques et moléculaires, permettant d’étudier les similitudes et les différences entre ces deux organes et de mieux comprendre les maladies associées.
Remplacement
Les maladies du cerveau font intervenir des mécanismes complexes qui touchent à la fois le cerveau, les muscles et le comportement. Ces interactions ne peuvent pas être étudiées à l’aide de modèles simplifiés, comme des cellules cultivées en laboratoire ou des simulations informatiques. Même si les études sur cellules permettent de mieux comprendre certains mécanismes biologiques de base, elles ne permettent pas d’observer comment les gènes influencent le développement du cerveau, les capacités de mouvement ou les comportements dans un organisme vivant. Or, ces aspects sont essentiels pour comprendre les maladies étudiées dans ce projet. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable. La souris est particulièrement adaptée, car son fonctionnement biologique présente de nombreuses similitudes avec celui de l’être humain. De plus, il existe déjà un grand nombre de modèles de souris génétiquement modifiées, développés dans le cadre de collaborations internationales, ce qui permet d’étudier de manière ciblée le rôle de nombreux gènes impliqués dans ces maladies. Enfin, ces maladies étant rares et touchant souvent des enfants, il est très difficile de réaliser ce type d’études directement chez l’être humain. Le recours à la souris est donc nécessaire pour améliorer la compréhension de ces maladies et préparer le développement de futures approches diagnostiques et thérapeutiques.
Réduction
Le nombre de souris utilisées dans ce projet a été calculé au plus juste afin d’obtenir des résultats fiables, tout en limitant au maximum le recours aux animaux. Les effectifs ont été déterminés à partir de données issues d’études précédentes et de méthodes statistiques, de manière à utiliser uniquement le nombre de souris strictement nécessaire. Afin de réduire le nombre total d’animaux, les mêmes souris sont suivies tout au long du projet, depuis les premières étapes du développement jusqu’à l’âge adulte. Cette approche permet de recueillir plusieurs types d’informations chez les mêmes animaux, évitant ainsi de multiplier les groupes expérimentaux. Ce suivi sur la durée permet également de mieux comprendre l’évolution des maladies étudiées, en observant comment les symptômes apparaissent et évoluent avec le temps. Chez la souris, l’âge adulte atteint en fin de projet correspond approximativement à un âge avancé chez l’humain, ce qui rend cette approche particulièrement pertinente pour étudier l’évolution des maladies du cerveau associées à des atteintes musculaires. Les analyses des résultats seront réalisées à l’aide de méthodes statistiques adaptées, ce qui permet d’obtenir des conclusions solides sans avoir recours à des animaux supplémentaires. Les souris témoins sont issues des mêmes portées que les souris génétiquement modifiées, afin de limiter la production d’animaux en excès. Au total, ce projet nécessitera un maximum de 768 souris, incluant des mâles et des femelles. Ce nombre correspond au strict nécessaire pour atteindre les objectifs scientifiques, conformément au principe de réduction.
Raffinement
Pour réduire le stress lié aux manipulations, les souris seront habituées à la présence des zootechniciens et des expérimentateurs et au contact avant le début de chaque procédure. Un petit tunnel sera utilisé pour transférer les souris d’une cage à l’autre. Les biopsies d’oreille, nécessaires pour identifier les souris porteuses de la maladie, seront réalisées entre 7 et 10jours après la naissance, à un âge où le système nerveux est pas encore complètement développé. Pour éviter que la mère rejette ses petits à cause de l’odeur humaine, l’expérimentateur frottera ses gants avec de la litière souillée. Le transport des animaux entre les deux établissements utilisateurs sera limité à une seule fois. Il sera réalisé sur une courte distance de moins de 1 km dans des conditions adaptées, en conservant les cages d’origine, la litière et les élèments d’enrichissement habituel afin de maintenir un environnement familier. À leur arrivée, les animaux bénéficieront d’une période d’adaptation suffisante avant toute nouvelle manipulation expérimentale. Chez les souris adultes, une phase d’habituation sera mise en place avant le début des tests afin de réduire l’anxiété liée à la nouveauté. Les animaux seront familiarisés avec les dispositifs utilisés et la présence des expérimentateurs. Les évaluations seront organisées de manière progressive, en commençant par les moins contraignantes, avec des périodes de repos suffisantes entre chaque étape pour permettre une récupération complète. Certaines évaluations pouvant entraîner un inconfort temporaire feront l’objet de mesures spécifiques. Lors des tests impliquant une exposition à l’eau, les conditions seront strictement contrôlées, la durée d’exposition sera limitée, et les animaux seront immédiatement séchés et maintenus au chaud après chaque session afin d’éviter toute gêne. Tout au long des manipulations, les animaux bénéficieront d’un environnement enrichi comprenant des abris et des matériaux adaptés, afin de favoriser les comportements naturels et de limiter le stress. Les animaux seront surveillés régulièrement, avec un suivi du poids et de l’état général, afin de détecter précocement tout signe de mal-être, de souffrance ou de détérioration de leur état de santé. Des points limites adaptés permettront d’interrompre la participation d’un animal au projet si nécessaire. En cas de dégradation de l’état général ou de souffrance persistante, l’animal sera mis à mort sans délai afin d’éviter toute souffrance inutile.
Choix des espèces
Sur le plan anatomique, même si la surface du cerveau de la souris adulte présente moins de circonvolutions que celle de l’homme, la quasi-totalité des structures cérébrales est commune aux deux espèces. Sur le plan génétique, environ 90% des gènes sont conservés entre la souris et l’homme, ce qui rend les études génétiques particulièrement pertinentes dans ce modèle. Sur le plan comportemental, la souris présente un excellent compromis entre complexité comportementale et proximité phylogénétique, permettant la modélisation de pathologies associées à des comportements complexes tels que la reconnaissance sociale ou la reconnaissance d’objets. Et enfin, contrairement à certains autres modèles expérimentaux, la souris permet également d’étudier les différences liées au sexe, un paramètre particulièrement important dans les troubles du neurodéveloppement, qui présentent une prévalence plus élevée chez les garçons. Les souris seront utilisées à différents stades de développement.
Comprendre et traiter les maladies qui affectent la transmission de la vision entre l’œil et le cerveau
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
Une injection dans le vitré, deux minutes par œil, abîme volontairement le nerf optique de 266 souris utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus. Elles sont ensuite anesthésiées dix minutes pour mesurer l'activité de leur rétine, et testées éveillées cinq minutes devant des stimuli visuels contrastés. Le RNT qualifie ces tests d'indolores et couramment pratiqués en ophtalmologie humaine, tout en énumérant comme effets attendus une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation et un comportement anxieux. L'équipe affirme que ce modèle constitue le seul moyen d'explorer la maladie et de tester des traitements sur la rétine, alors qu'elle écarte ses propres souris génétiquement modifiées au motif que leur neuropathie apparaît trop tard.
Objectifs
Les objectifs du projet sont d’identifier des traitements capables de protéger le nerf optique dans les neuropathies optiques. Le projet porte sur les neuropathies optiques, une maladie qui entraine une perte de la vision progressive due à une perte de la fonction du nerf optique qui permet de relier l’œil au cerveau. Il n’existe actuellement pas de traitement pour traiter cette maladie. Nous proposons de générer un modèle animal pour reproduire la maladie et tester des traitements. Ce modèle animal reproduira fidèlement les symptômes retrouvés chez les patients. Il est important de noter que ce modèle représentera le seul moyen d'explorer les mécanismes responsables de la maladie. Ce modèle est également le seul modèle qui puisse être utilisé pour tester des traitements sur la rétine. Nous développerons un axe de recherche sur les animaux vivants, auxquels nous injecterons une protéine ayant une fonction de protection de la rétine. Nous mesurerons le bénéfice de cette thérapie sur la fonction visuelle des animaux au cours du temps.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mettre en évidence si notre traitement est capable de protéger la vision des animaux. A long terme, ce projet permettra de proposer un traitement chez les patients atteints de perte de vision.
Procédures
266 animaux seront anesthésiés pendant 10 minutes pour mesurer l’activité de la rétine. Ces animaux auront reçu dans leur vitré soit le composé induisant une atteinte de la vision, soit une solution contrôle. L’injection dure 2 minutes par œil. L’acuité visuelle sera mesurée sur ces animaux éveillés soumis à des stimuli visuels de différents contrastes. La mesure de l’acuité visuelle dure 5 minutes par souris.
Impact sur les animaux
Les tests pour mesurer la vision sont indolores et pratiqués couramment en ophtalmologie humaine. L’injection dans le vitré peut induire une courte douleur (moins de 2 min). Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. Les effets indésirables liés aux tests peuvent provoquer à court terme, une démarche instable, des tremblements, une incapacité à grimper, une désorientation, un comportement anxieux.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvement de tissus post-mortem.
Remplacement
Nous réalisons déjà des expériences en laboratoire sur des cellules (issues de patients ou de modèles animaux), ce qui permet de répondre à certaines questions sans utiliser d’animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas d’étudier entièrement les maladies du nerf optique, car celles-ci impliquent le fonctionnement global de l’organisme, notamment les interactions entre l’œil et le cerveau. Par ailleurs, avant de pouvoir tester une nouvelle thérapie chez l’être humain, la réglementation impose de démontrer son efficacité et sa sécurité dans un organisme vivant. L’utilisation d’un modèle de souris reproduisant les caractéristiques de la maladie observée chez les patients constitue aujourd’hui l’approche la plus adaptée. Elle permet d’évaluer de manière fiable les effets d’une thérapie, tout en tenant compte des contraintes scientifiques, techniques et éthiques.
Réduction
Notre projet étudie toutes les souris qu’elles soient mâles ou femelles, car la maladie touche les 2 sexes. Les effectifs ont été ramenés au minimum permettant d’avoir un effet statistique significatif.
Raffinement
Toutes les mesures biologiques pour étudier la vision sont effectuées sur l’animal éveillé ou sous anesthésie. Les animaux sont placés sur une couverture chauffante (37°C) jusqu'au réveil. Après toutes analyses, les souris seront observées quotidiennement. Si des animaux montrent des signes de douleurs ou de souffrances, nous évaluerons cette souffrance et nous prendrons les décisions nécessaires afin de réduire la durée et l’intensité de la souffrance pour y mettre fin.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris adulte, car c’est le modèle mammifère de référence pour étudier l’impact d’une maladie sur l’organisme. Le stade adulte est utilisé pour s’assurer que la rétine est mature. Nous utilisons ce modèle car la neuropathie optique apparait rapidement permettant de tester plus efficacement des approches thérapeutiques alors que les modèles génétiquement modifiés que nous avons, développent une neuropathie optique légère ou très tardives. La souris est donc un très bon modèle animal pour tester des traitements.
Analyse de l’effet de traitements ciblant les cellules sénescentes sur la survie et l’environnement tumoral de modèles murins de glioblastome
- Recherche fondamentale
- Oncologie
3 320 souris vont être utilisées dans ce projet sur le glioblastome, chacune pouvant passer par une chirurgie intracérébrale de 30 à 40 minutes, cinq injections quotidiennes consécutives, jusqu'à cinq cycles de traitement renouvelés toutes les deux semaines, deux séances d'imagerie par bioluminescence par semaine et quatre prélèvements sanguins, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. La tumeur cérébrale provoque perte de masse musculaire, prostration, déshydratation et lésions cutanées, et les souris immunodéprimées utilisées courent un risque accru d'infection. Toutes sont tuées pour prélever le cerveau, la voûte crânienne et les ganglions lymphatiques. Le porteur travaille en parallèle sur des organoïdes de glioblastome intégrant microglie et monocytes, et conditionne le remplacement d'une partie des expériences in vivo aux résultats de ce projet collaboratif.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont d’étudier les modifications du microenvironnement tumoral après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans trois modèles murins de glioblastome (GBM). Ces modèles complémentaires récapitulent les altérations moléculaires identifiées dans un sous-type de GBM de patients dit mésenchymateux. Ce projet comprend trois volets : (1) Évaluation de l’effet de nouvelles drogues ciblant les cellules sénescentes ou leur activité sur la survie des souris après avoir vérifier que ces molécules sont perméables à la barrière hémato-encéphalique ; (2) Analyse en 3D des réseaux vasculaires sanguin et lymphatique méningé au niveau du cerveau entier et de la voûte crânienne, après marquage des protéines des vaisseaux par des anticorps fluorescents ; (3) Analyse du compartiment immunitaire de la tumeur en utilisant 4 approches : (i) analyse de l'expression des protéines et des ARN messagers (intermédiaires en le gène et la protéine) sur coupes de tissus ; (ii) analyse de l'expression des ARN messagers de cellules dissociées de la tumeur ; (iii) trie de cellules dissociées après marquages fluorescents spécifiques de type cellulaires, de la tumeur, des ganglions lymphatiques cervicaux et des méninges ; (iv) étude de l’action combinée de sénothérapie et d’immunothérapie (thérapie stimulant le système immunitaire).
Bénéfices attendus
Le glioblastome (GBM) est la tumeur cérébrale adulte primitive la plus fréquente et agressive avec une médiane de survie des patients inférieure à 15 mois après diagnostique. Les résultats issus de ce projet permettront de comprendre les mécanismes sous-jacents de l’action bénéfique d’une sénothérapie en étudiant les compartiments immunitaire et vasculaire, au sein de la tumeur et en périphérie. Selon nos résultats, notre projet pourrait proposer une nouvelle approche thérapeutique en combinant une sénothérapie (traitement diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules) et une immunothérapie (traitement stimulant le système immunitaire). Cette dernière de donnant pas à ce jour, de résultats positifs dans la vaste majorité des GBM.
Procédures
La procédure expérimentale sera réalisée sur des souris adultes agées de 6-8 semaines et comprend 7 actes techniques incluant une injection pré-opératoire, une injection au niveau du cerveau de virus ou de cellules tumorales nécessitant un acte chirurgical, une série d'injections, un suivi de la croissance tumorale par utilisation d’imagerie par bioluminescence, des traitements, des prélèvements sanguins puis finalement une euthanasie. L'ensemble de ces 7 actes techniques ne sera pas effectué sur la totalité des animaux du projet. L'injection unique pré-opératoire sera d'une durée de 10-20 secondes. La chirurgie prendra environ 30-40min sur animal anesthésié (anesthésie générale et locale) et analgésié en pré et post-opératoire. Les injections d'une durée de 10-20 secondes, seront réalisées 1 fois par jour pendant 5 jours consécutifs sur animal vigil. La quantification de bioluminescence sera réalisée deux fois par semaine, toutes les semaines sur animal anesthésié. Cette mesure est indolore et dure selon l'intensité de la bioluminescence entre 1 et 4 min. Les traitements d'une durée de 10-20 secondes, seront administrés sur souris vigiles pendant 5 jours consécutifs et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines. Les animaux recevront au maximum 5 cycles de traitement. L'administration d'anticorps bloquants se fera en 4 injections espacées de deux jours et ce cycle sera renouvelé toutes les deux semaines sur souris vigile. Des prélèvements de sang seront réalisés sur animal vigil (durée de quelques secondes, 4 fois par animal).
Impact sur les animaux
Ce projet comporte deux étapes majeures où des effets indésirables sont attendus sur les animaux, la procédure chirurgicale et la charge tumorale. La procédure chirurgicale consiste en une injection de virus ou de cellules tumorales dans des zones précises du cerveau. Ces injections sont effectuées sous anesthésie/analgésie qui peut entraîner des nuisances, par exemple des risques anesthésiques, des douleurs post-opératoires ou des risques infectieux. De plus, lors de cette étape comme lors de l'imagerie par bioluminescence des risques d'hypothermie et de détresse cardiorespiratoire sont possibles. Concernant la charge tumorale, les nuisances sont une variation du poids corporel notamment une perte de masse musculaire, le développement d'une masse tumorale gênant les fonctions normales de l'animal, une dégradation de l'état général de l'animal (signes cliniques généraux parmi lesquels posture et état de vigilance, prostration, déshydratation, lésions cutanées). En outre, les traitements par injections peuvent engendrer une douleur de courte durée, un risque d'irritation du tube digestif et un risque d’inflammation du péritoine. De même, une douleur légère de courte durée pourrait être ressentie lors des prélèvements sanguins. Dans de très rares cas un hématome ou une perte de sang hémorragique pourrait être observée. Par ailleurs, nous utiliserons des souris immunodéprimées qui présentent un risque acru d'infections
Devenir
Toutes les souris de ce projet seront euthanasiées en fin de procédure. En effet, l'euthanasie des animaux est nécessaire afin de prélever le cerveau des souris contenant une tumeur, la voute crânienne et les ganglions lymphatiques afin de les analyser au niveau moléculaire, histologique et cellulaire.
Remplacement
En parallèle de ce projet in vivo, nous caractérisons des prélèvements chirurgicaux de glioblastomes de patients collectés avant et après traitement. Ce matériel est rare et est obtenu grâce à la collaboration avec des neurochirurgiens et des neuropathologistes. Cette étude fondamentale demeure néanmoins descriptive ; pour avancer dans le développement de nouveaux traitements nous devons réaliser des études fonctionnelles dans des modèles animaux précliniques. Dans un souci de remplacement et réduction, nous avons initié la génération des tumoroides (ou explants de tissus en suspension) à partir de glioblastomes de patient afin de tester de nouveaux traitements in vitro. Cependant, l'environnement tumoral, et notamment le système immunitaire et le réseau vasculaire, est essentiel à la réponse aux traitements et à ce jour, il n'existe pas encore de modèle de tumoroides conservant de façon fidèle la présence et l’activité du microenvironnement. Un projet collaboratif vise à générer des organoides de glioblastome incluant de la microglie et des monocytes infiltrants. Selon les résultats obtenus sur ce projet, nous pourrons remplacer une partie de nos expériences in vivo par des expériences réalisées sur ces organoides.
Réduction
Nous veillerons à utiliser le moins d’animaux possible pour l’ensemble de nos expériences, nous utiliserons dans ce projet 3320 souris. Nous utiliserons pour chaque type d’expérience 10-18 animaux par groupe. Ce nombre, qui peut paraître élevé, est nécessaire pour l’obtention de résultats reproductibles et statistiquement significatifs car les gliomes sont par nature très hétérogènes. Pour cette raison, nous visons à obtenir des résultats robustes en utilisant plusieurs modèles murins de glioblastome complémentaires. Afin d'éviter l'euthanasie séquentielle d’animaux au cours du temps pour évaluer l’apparition de la tumeur, son volume et sa croissance, nous utiliserons la méthode de suivi in vivo par bioluminescence grâce à l'expression de la luciférase dans les cellules tumorales. A chaque euthanasie des animaux afin d'éviter tout double emploi des animaux, nous collecterons divers tissus sur un même animal (cerveau, voute crânienne, ganglions lymphatiques, rate, sang). De plus, la tumeur fluorescente localisée dans le cerveau sera disséquée à la loupe binoculaire. Nous réaliserons plusieurs types d'analyses sur chaque tumeur. Dans certains cas, immédiatement après son prélèvement, la tumeur sera séparée en deux parties, une pour les analyses histologiques et immunologiques et une autre pour les analyses moléculaires et biochimiques.
Raffinement
Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum et les animaux sont vérifiés quotidiennement. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Pour réduire le stress post-opératoire, les animaux seront logés par groupes pendant une période d'acclimatation de 7 jours minimum avant la procédure chirurgicale. Les animaux seront analgésiés et anesthésiés avant et pendant toute la procédure chirurgicale. Pendant la chirurgie, les animaux seront placés sur un tapis chauffant afin de prévenir l'hypothermie, un gel ophtalmique sera appliqué pour éviter leur déshydratation. Post-chirurgie, les animaux seront placés dans une salle de réveil chauffée, la qualité du réveil sera observée. Pendant 48 heures post-chirurgie, nous administrerons un analgésique. Les animaux seront surveillés quotidiennement et euthanasiés dès que les points limites seront atteints. Nous analyserons la croissance tumorale par bioluminescence et le poids des animaux deux fois par semaine. En fin de processus d’expérimentation, si une souris femelle est isolée nous regrouperons cet animal avec des animaux sujets au même traitement et lorsque cela ne sera pas possible nous regrouperons cet animal avec un animal de compagnie. Pour les mâles isolées (modèle 3), nous rajouterons un enrichissement (maison en carton) et nous notifierons sur la cage ‘animal isolé’. Lors des prélèvements sanguins, si le saignement ne stoppe pas rapidement, une compression plus longue avec un papier essuie tout propre sera directement effectuée sur le point de prélèvement. En cas d'apparition de prostration et de difficulté à récupérer (anomalie cardiorespiratoire), l'animal sera pris en main pour effectuer des frictions afin de le stimuler. De la nourriture hydratée sera déposée à côté de lui dans la cage. Si cet état perdure plus de quelques minutes, l'animal sera euthanasié. Pour les souris immunodéprimées la litière et les aliments seront irradiés, les enrichissements seront autoclavés, et ils boiront de l'eau osmosée afin de réduire les risques d'infections qui sont élevés dans ces modèles.
Choix des espèces
Les nombreux outils génétiques développés et caractérisés chez la souris font de cette espèce un modèle de choix pour l’étude in vivo des tumeurs. De plus, les modèles les plus représentatifs de la biologie et de la génétique des tumeurs humaines sont établis chez la souris. Aussi, de nombreuses données de multiomics réalisées à partir de modèles murins de glioblastome sont disponibles et nous aideront à comprendre et analyser nos propres résultats. Les lignées de souris génétiquement modifiées utilisées pour ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Nous utiliserons des souris adultes de 6-8 semaines pour générer des glioblastomes car cette tumeur se développe chez l’adulte à partir de 30 ans. Ce projet qui vise à évaluer les modifications du microenvironnement tumoral (système immunitaire et architecture des vaisseaux sanguins et lymphatiques) après l’administration de traitements diminuant soit le nombre de cellules sénescentes, soit l’activité de ces cellules (type de traitement appelé sénothérapie) dans des modèles murins de glioblastome utilisera des souris mâles et femelles. En effet, de nombreuses études ont montré que l’activité du système immunitaire varie selon le sexe.
Modèles expérimentaux d’allergie oculaire.
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles sensoriels
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
Rats : 1440
Sensibilisés à l'ovalbumine ou au pollen d'ambroisie puis exposés à l'allergène dans l'œil, 3 600 souris et rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Gonflement de la conjonctive, rougeur et larmoiement sont les effets attendus, auxquels s'ajoutent des nodules sous-cutanés au site d'immunisation, des injections péri-oculaires sous anesthésie légère et des prélèvements sanguins. Le porteur souligne que les examens ophtalmologiques employés se pratiquent chez l'être humain en cabinet et chez les autres animaux en clinique vétérinaire, sans anesthésie ni hospitalisation. Environ 360 animaux écartés du protocole pour un défaut anatomique de l'œil détecté avant l'induction de la maladie pourront être réutilisés ailleurs, les 3 240 autres sont tués pour analyses.
Objectifs
Comme l’allergie respiratoire, l’allergie oculaire est associée à une hypersensibilité allergique de type immédiat. Elle concerne essentiellement les conjonctivites allergiques bégnines c’est-à-dire la conjonctivite allergique saisonnière et la conjonctivite allergique péri-annuelle. Cette hypersensibilité concerne aussi pour partie les conjonctivites sévères compliquées de kératite comme la kératite conjonctivale vernale et la kératite conjonctivale atopique. Les allergènes responsables sont des pneumallergènes, aussi responsables de symptômes respiratoires, tels que les acariens ou les pollens ainsi que des trophallergènes comme l’arachide ou le blanc d’œuf. Ce projet a pour but de contribuer au développement de nouveaux traitements médicaux en permettant d’identifier et de tester l’efficacité de substances thérapeutiques visant à diminuer l’effet des allergènes dans la conjonctivite allergique. Dans ce cadre, nous proposons de mettre en place un protocole de sensibilisation à deux antigènes (l’ovalbumine et le pollen d’ambroisie) chez la souris ou le rat. Dans un second temps, nous testerons différents types de traitements.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu du projet est de proposer des modèles expérimentaux qui permettront d'évaluer l'efficacité de nouveaux traitements. La recherche de traitements est en constante évolution et nécessite de pouvoir les tester dans les meilleures conditions possibles et dans le plus grand respect du bien-être animal.
Procédures
Les nuisances attendues se manifesteront au niveau local après le challenge par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Les procédures expérimentales nécessitent l'administration de différents produits par instillations (gouttes oculaires), par voie sous cutanée, intramusculaire ou intrapéritonéale (pour administrer les anesthésies également). Ces procédures ne durent que quelques secondes. Les examens ophtalmologiques se feront à l'aide de techniques non invasives (imagerie, observations au biomicroscope). Ces examens sont réalisés chez l’homme en cabinet médical par un ophtalmologiste sans anesthésie et sans hospitalisation. Ils le sont également chez l’animal en clinique vétérinaire. Ces examens pourront se faire pour une partie sur animaux vigiles mais certains qui nécessitent l’immobilisation complète de l'animal seront pratiqués sous anesthésie légère, ce type d'examen ne dure que quelques minutes. Des prélèvements de sang pourront être réalisés au cours des procédures expérimentales afin de doser le principe actif ou tout autre marqueur d'intérêt. Ces prélèvements de sang se feront par ponction et dureront quelques minutes.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues se manifesteront au niveau local après le challenge par un gonflement de la conjonctive accompagné d'une hyperémie et d'un larmoiement. Au niveau du site d'immunisation, une réaction inflammatoire avec potentiellement la présence de nodules sous-cutanés peut être observée. Les examens et administrations nécessitent une contention brève, pouvant induire un stress ponctuel de quelques minutes, puis l’animal est replacé dans sa cage d’hébergement. Des mesures spécifiques (habituation, manipulation douce, environnement calme) seront mises en place pour limiter cet impact. Les procédures plus invasives, telles que les injections péri-oculaires ou les examens nécessitant une immobilisation prolongée, seront réalisées sous anesthésie légère afin de garantir le confort de l’animal. Ces anesthésies peuvent occasionner une gêne transitoire mais ne présentent pas de risque significatif à long terme. En dehors de ces périodes d’examen ou d’administration de traitement, l’animal est libre de ses mouvements, avec un accès à l’eau et à la nourriture. Lors des prélèvements de sang, le volume sera adapté au minimum pour ne pas nuire à l’animal. Le stress dû au maintien de l'animal, à la piqûre de l'aiguille, une rougeur peut apparaitre au site de prélèvement, ne doit pas impacter le mode de vie de l'animal une fois l'action finie.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés de manière éthique et réglementée, pour réaliser des analyses ex vivo nécessaires à la validation des résultats (analyses histologiques, dosages biochimiques, études moléculaires, etc.). Cependant, les animaux n’ayant pas été inclus dans la totalité de la procédure — estimés à environ 10 %, hors exclusions liées aux points limites — pourront être réutilisés dans d’autres protocoles expérimentaux compatibles, sous réserve de l’avis favorable du vétérinaire responsable. Ces animaux sont généralement exclus en raison d’un défaut anatomique ou physiologique détecté lors des examens de baseline, notamment au niveau de l’œil, avant le début de l’induction de la pathologie. Ces individus n’auront reçu ni induction de l'allergie (immunisation et/ou challenge), ni administration de traitement, mais auront uniquement été soumis à des examens non invalidants, parfois réalisés sous anesthésie légère. Leur réutilisation, lorsqu’elle est possible, s’inscrit dans une démarche de réduction du nombre d’animaux utilisés, conformément aux principes des 3R, tout en garantissant le respect du bien-être animal et des exigences scientifiques.
Remplacement
L’œil est un organe complexe. Il est composé de plusieurs tissus anatomiquement et physiologiquement très différents. Il est de plus soumis à d'importantes variations environnementales mécaniques et physicochimiques, ainsi qu'à d’importantes interactions biologiques avec les tissus et organes voisins. A ce jour, aucune méthode alternative tels que les modèles in vitro (2D, 3D, organoïdes) ne permet de mimer l’œil dans sa globalité fonctionnelle et environnementale. L’allergie oculaire est une pathologie systémique impliquants plusieurs acteurs biologiques qui ne sont pas simultanément présents ou fonctionnels in vitro. C'est pour cela que l’utilisation d’animaux vivants dans ces procédures expérimentales sont nécessaires pour atteindre les objectifs de ce projet.
Réduction
Le nombre maximum d’animaux prévu pour ce projet a été déterminé en fonction de la distribution théorique rencontrée dans les données bibliographiques et historiques de l'établissement, du nombre d'études estimées et tient compte des variations du métabolisme, de la robustesse des mesures et de notre expérience. Ce nombre limité doit nous permettre de conclure sur l’efficacité ou non d’un traitement. L'effet d'un traitement sera évalué à chaque moment à l'aide de tests statistiques; chaque groupe traité sera comparé à celui du groupe témoin. Un calcul de l’effectif sera réalisé avant chaque étape afin d’ajuster et de revoir à la baisse si possible le nombre d’animaux à inclure dans les procédures. De plus, dès que les procédures expérimentales le permettront, des évaluations non invasives seront choisies tout au long du projet pour améliorer la condition animale et éviter la mise à mort inutile des animaux. De même, l'analyse des deux yeux sera privilégiée autant que possible afin de réduire le nombre d'animaux utilisé.
Raffinement
Un suivi quotidien des animaux sera effectué afin de minimiser au maximum l’impact des procédures sur leur bien-être. Les rongeurs seront placés en groupe dans des cages d’hébergement contenant nourriture et boisson ad libitum et enrichissement à ronger et un abri. Les examens non invasifs choisis pour évaluer les signes cliniques de la maladie sont semblables à ceux pratiqués chez l'homme en cabinet ophtalmologique ou chez l’animal en clinique vétérinaire. Les examens de l'œil qui requièrent l’immobilité de l'animal pourront être réalisés pour son confort sous anesthésie. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces permettent de limiter une éventuelle douleur à son minimum.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies ont une physiologie, une anatomie et un métabolisme largement décrits dans la bibliographie scientifique. L’extrapolation à l’homme des effets sur l’œil en est d’autant plus facilitée. De plus, les modèles expérimentaux concernant cette pathologie sont largement utilisés et décrits sur ces espèces dont les publications de référence sur laquelle le projet est basé. Pour ce projet, des souris et des rats ont été retenus pour tenir compte des particularités anatomiques et physiologiques de chaque espèce afin d’augmenter les chances de mener ce projet à terme. Les rongeurs ont minimum 6 semaines au début de l’étude correspondant à de jeunes adultes conformément aux publications de référence qui servent de base aux modèles et qui correspond à la maturité visuelle chez ces animaux. Ils observeront ensuite une période d’acclimatation de 5 jours minimum avant leur entrée dans les procédures expérimentales.
Evaluation de l’efficacité thérapeutique d’un anti-Fn14 dans un modèle murin de myopathie
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
Le protocole s'arrête quand une souris atteint le score 2, soit une baisse d'activité des pattes arrière et une courbure du dos marquée, le score 3 correspondant à la paralysie du train arrière. 33 souris immunodéficientes vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles reçoivent des anticorps prélevés sur des malades atteints de myopathie nécrosante auto-immune, une injection par jour pendant dix-sept jours, quatre microprélèvements sanguins et trois tests de préhension, avant que leur muscle gastrocnémien soit prélevé. Le porteur affirme que l'atteinte musculaire n'a pas de répercussion visible en termes de souffrance, et attend de ce protocole qu'il ouvre la voie à de nouvelles thérapies ciblées et à des essais chez l'être humain.
Objectifs
L'objectif général de notre programme est de tester l'efficacité thérapeutique d’une molécule antagoniste d’une protéine appelée Fn14 (anti-Fn14) dans un modèle murin de myopathie nécrosante autoimmune (MNAI). Ce modèle est obtenu par le transfert d'anticorps de malades souffrant de MNAI. Nous utiliserons des souris immunodéficientes supplémentées avec du complément humain pour ne pas rejeter les composants humains que nous leur injectons, ce qui nous permet d’évaluer correctement le rôle curatif de la molécule anti-Fn14. Plus précisément, nous comparerons trois groupes de souris : 1) des souris non malades (transfert d’anticorps de sujet sain dès J0) ; 2) des souris malades (transfert d’anticorps de malade MNAI dès J0) ; 3) des souris malades et traitées avec l’anti-Fn14 à partir de J8. L’étude des animaux se fera par (i) une observation clinique (suivi du poids), (ii) une mesure de la force musculaire chez l’animal anesthésié et (iii) par une analyse sanguine et des tissus musculaires. L’objectif final est de voir si le médicament peut améliorer la force musculaire chez ces souris.
Bénéfices attendus
La mise en évidence d’un effet bénéfique de la molécule anti-Fn14 ouvrira la voie à l’étude de nouveaux mécanismes d’action des autoanticorps et au développement de nouvelles thérapies ciblées ainsi que d’essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
Les animaux vigiles seront soumis à 4 microprélèvements de sang, d'une durée de moins de 5 secondes chacun. Les souris seront injectées quotidiennement en IP durant 17 jours soit 17 injections d'une durée de moins de 10 secondes chacune. 3 grip test seront réalisés pour chacune des souris, durée moins de 1 minute. Les muscles gastrocnémiens de tous les animaux seront prélevés sur les souris euthanasiées en fin de protocole.
Impact sur les animaux
L'injection d'anticorps de malades atteints de MNAI chez la souris entraine l'apparition d'une myopathie se traduisant par une diminution de la force musculaire. L’expérience acquise lors de précédents protocoles expérimentaux avec ce modèle animal a montré que l'atteinte musculaire n'avait pas de répercution visible chez l'animal en terme de souffrance ou de perte de poids. Lors des injections IP les souris pourront ressentir un peu de stress du à la contention et l'injection en elle même, mais qui sera de très courte durée. Pour les souris de l'étude qui développeront une myopathie consécutive à l'action pathogéne des anticorps testés une gêne dans la mobilité du train arrière pourra être observée.
Devenir
Le prélèvement du muscle gastrocnémien (postérieurement à la mesure de la force in situ) pour analyse histologique ne permettra pas de maintenir les animaux en vie.
Remplacement
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable pour l'évaluation de la pathogénicité des anticorps de malades dans une perspective d’approche à visée thérapeutique. Il n’existe actuellement pas de modèles in vitro pour une telle étude combinée de la réponse humorale et de la physiologie du muscle. Ce projet ne peut donc être réalisé que chez l'animal.
Réduction
Le nombre de souris par groupe a été réduit à son minimum (n=11) grâce l'expérience acquise lors d'autres protocoles expérimentaux utilisant ce modèle murin de myopathie par transfert d'aAcs chez la souris. L'analyse rétrospective des résultats obtenus a permis par un calcul de puissance de déterminer exactement les effectifs nécessaires. Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum en tenant compte également de la variabilité des mesures de la force musculaire, ainsi que de la variabilité des réponses notamment immunologiques obervées lors de ces protocoles. Les résultats obtenus seront analysés statistiquement par les test adaptés.
Raffinement
L'ensemble des expériences sera réalisé dans une animalerie agréée, où les conditions d’hébergement sont contrôlées quotidiennement : température (23°C), hygrométrie (50%), cycle jour/nuit (12/12), change et nourriture. Les souris seront élevées en communauté dans des cages avec enrichissements. L’ensemble des procédures sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Une échelle de gravité des symptômes observés a été établie et permet de déterminer un point limite (score 2) dans l’ensemble des expériences. Cette échelle est définie de la façon suivante : Score 0 : condition physiologique (pas de signe clinique) ; Score 1 : faiblesse du train arrière, queue trainante ; Score 2 : diminution de l’activité locomotrice des pattes arrières, courbure du dos significative ; Score 3 : paralysie du train arrière. Une évaluation quotidienne de la douleur par deux personnes indépendantes sera également mise en place par une observation des changements des expressions faciales des animaux et l’apparition de signes comme le léchage et le grattage d’une zone douloureuse, l’automutilation, la déshydratation, l’agressivité, les yeux clos, les postures anormales (dos vouté…), l’activité réduite, la diminution du toilettage, la respiration anormale, ou encore la perte de poids (mesurée par pesée). Un traitement préventif quotidien de la douleur sera mis en place 24 heures avant la première injection d''anticorps pour les animaux de tous les lots. Lorsque le score 1 de l’échelle de gravité des symptômes sera atteint ou que le traitement préventif ne sera plus suffisant, un anti-douleur sera administré jusqu'à disparition de la douleur. Le protocole sera arrêté lorsque le score 2 ou le point limite qui a été défini seront atteints. De plus, lors de la mesure de la force musculaire in situ, un analgésique (buprénorphine) sera administré 30 minutes avant le début de l’intervention ; l’injection se fera en s.c. à une dose de 0,05 mg/kg.
Choix des espèces
Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris offre également la possibilité d’utiliser des modèles transgéniques largement éprouvés. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Il permet également de n'utiliser que de faibles quantités d'anticorps purifiés à partir de plasmaphérèses de malades qui sont difficiles à obtenir. Animaux âgés de 8 semaines, âge requis pour que le système immunitaire soit totalement mature.
Acclimatement et désacclimatement au stress induit par l’oxygène hyperbare, en plongée chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
Placées dans un caisson hyperbare jusqu'à des pressions de 5 ou 6 atmosphères d'oxygène pur pendant deux heures au maximum, 156 souris vont subir des crises convulsives, dans des procédures classées au niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du sang et des tissus. Trois groupes reçoivent en plus une injection intrapéritonéale quotidienne pendant cinq jours, et l'ensemble des animaux passe par un prélèvement sanguin au sinus rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur classe le déclenchement de la crise convulsive en "gravité légère ?", point d'interrogation compris, en avançant que "l'expérience humaine nous apprend qu'elles sont indolores", alors que le projet entier est déclaré en gravité sévère. La finalité est militaire, permettre aux nageurs de combat de l'armée française de plonger à l'oxygène pur sans compromettre leur mission.
Objectifs
Dans le cadre de ses opérations, l’armée française demande à ses nageurs de combat d’effectuer des plongées à l’oxygène pur, or ce gaz lorsque respiré à une pression supérieure à 1.7 atmosphère peut provoquer des crises hyperoxiques susceptibles de compromettre la mission et faisant courir un risque de noyade au plongeur. Les effets neurologiques de l’oxygène hyperbare sont connus depuis la fin du XIX siècle et les travaux de Paul Bert ; ils se traduisent par l’apparition de convulsions similaires à celles observées lors de crises épileptiques. Ces crises, indolores, se résolvent rapidement si la pression d’oxygène est réduite. Elles ont été caractérisées chez l’homme et l’animal (sans que le mécanisme en soit clairement identifié) mais la question de l’acclimatement à de fortes pressions d’oxygène reste non étudiée. L‘hypothèse d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare a été suggérée dans quelques articles scientifiques sans qu’aucune étude n’ait encore permis de le confirmer. Si elle s’avérait fondée, elle pourrait constituer une avancée pour améliorer la sécurité des nageurs de combat. La présente étude a pour objectif de déterminer, chez la souris : 1- si un acclimatement à l’oxygène hyperbare est possible et 2- d’étudier les mécanismes physiologiques à l’origine des crises hyperoxiques.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus permettront de vérifier l’existence d’un acclimatement à l’oxygène hyperbare ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la crise hyperoxique. Ces travaux pourront être bénéfiques pour les forces armées françaises dans le cadre opérationnel de la plongée à l’oxygène pur. Il aura aussi un intérêt en santé humaine dans le cadre de l’oxygénothérapie hyperbare utilisée en clinique humaine. L’oxygénothérapie hyperbare consiste à faire respirer de l’oxygène pur à un patient placé dans une chambre où la pression est supérieure à celle atmosphérique normale (généralement entre 2 et 3 ATA). Dans ces conditions, il existe un risque de déclenchement de crise hyperoxique chez le patient, or l’oxygénothérapie hyperbare est indiquée dans de nombreuses pathologies (intoxication au monoxyde de carbone, gangrène gazeuse, infections nécrosantes des tissus mous, ulcères et plaies rebêles à la cicatrisation, surdité idiopathique, prise de lambeaux de greffe …). Une meilleure compréhension du déclenchement de la crise hyperoxique permettrait une meilleure prise en charge de ces patients.
Procédures
Les souris seront contentionnées une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Dans le cadre de la procédure 2, deux semaines après, ils seront acclimatés à l’oxygène en étant placés dans le caisson hyperbare pour des durées de 30 à 110 minutes à des pressions partielles d’oxygène comprises entre 0.21 et 3.5 atmosphères selon les groupes expérimentaux. Dans le cadre de la procédure 4, trois groupes d’animaux seront injecté quotidiennement sur une période de 5 jours par voie intrapéritonéale (1 à 2 min). Les groupes de souris seront soumis à une plongée simulée en oxygène pur jusqu’à des pressions de 5 ou 6 atmosphères, pour une durée maximale de 120 minutes.
Impact sur les animaux
nces ou effets indésirables attendus sur les animaux Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée), (2) : le stress lié à la réalisation des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro-orbitaire (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 1-2 minutes, réalisé 1 fois sur l’ensemble du projet à l’âge de 10 semaines) (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée simulée (acte de gravité légère, d’une durée totale maximale de 2h30 correspondant au temps de l’exposition hyperbare) (4) : le stress induit par le déclenchement d’une crise convulsive (gravité légère ? ces nuisances très brèves, moins de 1 minute, et l’expérience humaine nous apprend qu’elles sont indolores).
Devenir
Les 156 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Notre travail porte sur l’étude des effets de fortes pressions partielles de gaz. Le manque de connaissances sur les mécanismes à l’origine de la crise hyperoxique et l’absence de marqueurs prédictifs de ces crises ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé en s’appuyant sur les données disponibles dans la littérature. Les effectifs de chaque groupe correspondent ainsi au nombre minimal d’animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement exploitables.
Raffinement
Tout au long des procédures, le remplissage quotidien d’une grille de score et l’identification de points limites prédictifs et spécifiques au projet permettront de satisfaire au bien-être de l’animal. Toute la procédure expérimentale sera réalisée par des personnes formées et habituées à travailler sur des protocoles de plongée simulée chez la souris. Après le prélèvement sanguin, un suivi quotidien des animaux sera réalisé avec une grille de score adaptée. Le protocole utilisé limite au maximum la durée des crises hyperoxiques en décomprimant les animaux rapidement.
Choix des espèces
La souris est un modèle très utilisé pour l’étude des effets de l’oxygène hyperbare. De ce fait, nous disposons d’un certain nombre de données, nous permettant de cibler les pressions et temps d’exposition et ainsi de réduire le nombre de groupes utilisés. Nous possédons en outre des données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ces résultats. Le contexte de cette étude est le maintien opérationnel des nageurs de combat en condition de plongée à l’oxygène pur. Les plongeurs concernés sont de jeunes adultes. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.