Souris

Une puce implantée sous anesthésie à l'arrivée puis retirée par incision à la fin, une injection par jour cinq jours sur sept pendant dix semaines, un jeûne de 12 heures, jusqu'à 48 heures en cage individuelle : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement du sang et des tissus. Nourries d'un régime riche en graisses, elles développent obésité, diabète et résistance à l'insuline, certaines lignées génétiquement modifiées présentant ces troubles dès quatre à cinq semaines. Elles passent aussi des tests de force et de course sur tapis roulant, où le porteur signale de la fatigue et, rarement, une blessure à la patte. Les molécules testées dérivent d'un composé actif in vitro dont les propriétés chimiques interdisent tout essai clinique direct, et le bénéfice annoncé pour les 8,5 millions de personnes obèses en France reste au stade de l'exploration d'une piste.

Objectifs

En 2020, environ 8,5 millions de personnes en France sont touchées par l’obésité, dont 1 million avec une obésité très sévère. Cela représente 17 % de la population. Ce qui inquiète particulièrement, c’est l’augmentation rapide de l’obésité chez les jeunes adultes (18-24 ans). Si cette tendance continue, on risque de voir apparaitre de plus en plus de maladies graves liées à l’obésité. Nos recherches portent sur une protéine, connue pour avoir plusieurs fonctions selon l’endroit où elle se trouve dans la cellule. Elle influence notamment le métabolisme des graisses et des acides aminés. De plus, nous avons montré sur des cultures de cellules qu’en bloquant l’action de cette protéine, on empêche les cellules de stocker la graisse. Ainsi, nous travaillons avec des petites molécules, dérivées d’un composé connu pour détruire spécifiquement la version de notre protéine active in vitro mais dont les propriétés chimiques ne permettent pas d’envisager d’études cliniques directement chez l’humain. Ainsi, ces nouvelles molécules sont conçues pour être plus efficaces, avec une meilleure solubilité et moins de toxicité. Après leur validation in vitro, et afin d’évaluer l’amélioration de leurs propriétés pharmaco biologiques, ces molécules seront testées dans des modèles murins d’obésité dans le but de limiter la prise de poids et in fine de réduire le risque de complications associées à l’obésité chez l’Homme. En résumé, notre projet vise à explorer une nouvelle piste thérapeutique contre l’obésité, en ciblant un acteur clé du stockage des graisses dans les cellules.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à évaluer l’efficacité d’un dégradeur d’une protéine spécifique dans la lutte contre l’obésité et les syndromes métaboliques associés. En inhibant cette protéine chez des animaux obèses ou chez des animaux ayant un régime riche en graisse, nous espérons limiter la prise de poids et montrer son rôle clé dans le stockage et l’utilisation des graisses. L’objectif est d’emmener vers l’utilisation de ces dégradeurs spécifiques comme potentielle thérapie dans la lutte contre l’obésité humaine.

Procédures

A leur arrivée, tous les animaux subiront une implantation de puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) utile pour leurs identifications et leurs pesées. Toute la durée de la procédure, tous les animaux seront pesés 1 fois par semaine. Cette mesure prend moins de 30 sec et sera réalisée sur animaux vigiles. En fin d’expérimentation ces animaux subiront une incision cutanée afin de leur retirer la puce (avec une injection d’analgésique et une anesthésie volatile) en vue d’analyses métaboliques. Tous les animaux seront traités avec 1 injection par jour (piqure 2 secondes) 5 jours sur 7, pendant 10 semaines. Tous les animaux vigiles auront une administration orale d'une solution de glucose (volume et sonde respectant les recommandations / 5 secondes), un prélèvement de sang à la queue (volume et voie respectant les recommandations/ 30 secondes) puis 5 prélèvements d’une goutte de sang espacés sur 4 heures (10 secondes par prélèvement). Une pesée de tous les animaux et une mesure de la composition corporelle seront réalisées pour obtenir le taux de masse maigre (muscle), de masse grasse et d'eau dans le corps de la souris. Ces mesures prennent moins de 2 minutes par souris et sont réalisées sur les animaux vigiles à la fin de chaque procédure. Ces animaux seront aussi soumis à des tests de motricité et de force (3 fois 5 minutes et 3 fois 10 secondes / deux sessions pour tous les animaux) ainsi que des tests de course.

Impact sur les animaux

Les injections répétées peuvent parfois provoquer des hématomes sous la peau. De plus, l’administration de certains traitements par voie orale (à l’aide d’une sonde spécialisée) peut irriter la gorge. Les animaux pourront ressentir un stress léger dû à la manipulation pendant l’administration du traitement, tests non invasifs (analyse de la composition du corps ou des tests de motricité. Un stress un peu plus important est possible lors d’une mise en cage individuelle de moins de 48 heures, nécessaire pour mesurer leur respiration. Pour un test sur la tolérance au sucre, un jeûne de 12 heures peut entraîner une légère perte de poids et l’administration de sucre par la bouche, peut aussi être une source de stress. Pendant un test sur tapis roulant, certains effets indésirables comme de la fatigue ou, très rarement, une blessure à la patte peut survenir. Les animaux sont cependant surveillés pendant cet exercice. Un régime alimentaire riche en gras peut conduire à des troubles similaires à ceux que l’on observe dans des maladies humaines comme l’obésité, le diabète ou une mauvaise réponse à l’insuline. Certains animaux génétiquement modifiés obèses développent ces troubles spontanément dès l’âge de 4 à 5 semaines.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés selon la méthode recommandée pour limiter la souffrance des animaux. Nous prélèverons le sang et différents tissus afin de mener notre étude et analyser les dérégulations métaboliques et l’avancement de l’obésité.

Remplacement

Dans notre laboratoire, nous menons aussi des expériences en utilisant des cellules en culture, plus précisément des cellules qui peuvent devenir des cellules graisseuses. Ces études ont montré que notre protéine d’intérêt joue un rôle important dans la formation et la composition de ces cellules graisseuses. Mais l’obésité est un problème complexe, impliquant plusieurs composantes du corps et l’étudier seulement sur des cellules in vitro ne permet pas de comprendre toutes les interactions qui se produisent entre différents organes et différents types cellulaires. En effet, l’obésité est une maladie métabolique systémique, c’est pourquoi il est nécessaire de faire des expériences sur des animaux, à l’échelle d’un organisme complet. Ces tests sont essentiels si nous voulons, à terme, développer un traitement contre l’obésité. Pour progresser vers des applications chez l’humain, les tests chez l’animal restent donc indispensables.

Réduction

Nos résultats expérimentaux obtenus sur des cellules nous permettent d’anticiper certains résultats et ainsi diminuer le nombre de conditions expérimentales in vivo. Le nombre d’animaux prévu dans le cadre de ce projet a été défini comme le nombre minimal nécessaire pour valider ces approches in vitro et tester l’ensemble de nos molécules pour mettre en évidence le meilleur candidat en vue d’une application chez l’Homme.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par les mêmes membres du personnel. Nous ajouterons dans les cages des briques de peuplier pour éviter les problèmes de malocclusion (absence d’usure des dents à croissance continue) à cause de la nourriture enrichie en graisse qui est très friable. De plus, les animaux seront pesés une fois par semaine. Tout animal présentant des difficultés à se nourrir ou à s’abreuver sera assisté par le dépôt dans la cage d’un gel lui évitant d’aller chercher en hauteur nourriture ou boisson. Nous avons défini préalablement une grille de score en fonction de laquelle nous procéderons à l’arrêt des expérimentations ou à l’euthanasie de l’animal en cas d’atteinte des points limites. Pour le transport de courte durée (inférieure à 10 minutes), les animaux seront placés au dernier moment, en groupes, dans des boites de transport avec litière, nourriture, hydratation et enrichissement de la cage d'origine. La boite sera ensuite placée dans un suremballage afin de limiter le mouvement pendant le transport. Les véhicules utilisés seront climatisés ou chauffés en fonction de la température extérieure. Dès leur arrivée dans le deuxième établissement les souris seront remises en cage d’hébergement. Pour l'implantation et le retrait de la puce d'identification les animaux recevront préalablement une injection d’analgésique et une anesthésie volatile. Dès qu’ils seront endormis, ils seront mis sur tapis chauffant pour éviter le refroidissement. Les animaux seront préalablement habitués à tous les tests de motricité et de course en étant simplement placés sur l’appareil, d’abord sans mouvement, puis à vitesse réduite. De plus, des points limites ont été établis permettant d’éviter l'épuisement et la blessure.

Choix des espèces

La souris est un excellent modèle pour notre projet, disposant d’un génome proche de l’homme. De plus, de nombreux modèles génétiquement modifiés pour les études de l’obésité ont été générés et utilisés dans la recherche scientifique. L’expérimentation sur ces modèles, déjà établis, nous permettra de voir l’efficacité du traitement et de comprendre au mieux l’impact de celui-ci à l’échelle d’un organisme entier. Nous choisirons des souris jeunes sevrées (c’est-à-dire environ 6-8 semaines de vie). Pour notre projet, il est important d’avoir de jeune souris pour suivre au plus tôt le développement de la pathologie (obésité/diabète). Cela nous permettra aussi d’observer au mieux le temps de l’apparition des syndromes métaboliques associées à l’obésité. Nous suivrons le poids des animaux une fois par semaine dès l’âge de 8 semaines jusqu’à l’âge de 23 semaines pour 624 animaux et 33 semaines pour 576 animaux, âge auquel la différence de poids entre animaux traités ou non traités devrait être observable.

Créer une lignée de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau, puis mesurer l'effet de très faibles doses de rayonnements ionisants sur leur apparition : 240 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Un seul des génotypes obtenus par croisement développe des tumeurs cérébrales agressives, avec perte de poids, baisse d'activité, troubles de la coordination et retard de croissance. Les autres serviront surtout à fournir des cellules pour des analyses en laboratoire, et les animaux gardés pour la reproduction sont tués lorsqu'ils franchissent un point limite. Le RNT affirme qu'"en dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique", alors que la tumeur cérébrale est précisément ce que la lignée est construite pour produire.

Objectifs

Nous créons une lignée de souris spécialement modifiée pour étudier les tumeurs du cerveau. Ces modifications n’agissent que dans les cellules nerveuses et permettent de mieux comprendre comment les cancers du cerveau se développent, afin d’aider à trouver de nouveaux traitements.

Bénéfices attendus

L’objectif est de disposer de souris qui développent spontanément des tumeurs du cerveau afin de mieux comprendre pourquoi ces cancers, notamment chez les enfants, sont en augmentation. Le projet étudiera en particulier l’impact de très faibles doses de rayonnements ionisants. Pour cela, différentes conditions d’irradiation seront testées, sur le cerveau ou d’autres parties du corps, afin de mesurer leur influence sur l’apparition des tumeurs cérébrales.

Procédures

Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques qui les rendent susceptibles de développer spontanément des tumeurs du cerveau. Ces tumeurs peuvent apparaître au cours de leur croissance et entraîner progressivement différents signes de maladie, comme une perte de poids, une baisse d’activité, des difficultés de coordination ou un retard de croissance. Ces animaux ne présentent pas de déficience immunitaire particulière, mais le risque principal pour leur bien-être est lié au développement de la tumeur cérébrale, qui peut provoquer des troubles neurologiques. Pour cette raison, ils font l’objet d’une surveillance rapprochée, permettant d’identifier rapidement tout signe d’inconfort ou d’atteinte de leur état général. Des critères d’arrêt stricts sont définis afin d’éviter toute souffrance prolongée. En dehors des effets liés à la tumeur elle-même, ces souris ne ressentent ni douleur ni stress du fait de leur modification génétique. Elles sont élevées dans des conditions standards de bien-être animal, avec des soins adaptés et une manipulation précautionneuse, afin de garantir les meilleures conditions de vie possibles tout au long de l’étude.

Impact sur les animaux

Parmi les différentes catégories de souris obtenues après les croisements, une seule développe des tumeurs cérébrales agressives. Ces animaux peuvent présenter des signes de maladie susceptibles d’affecter leur bien-être, comme un retard de croissance. Les autres groupes ne développent pas de symptômes importants. Ils restent en bonne santé et seront surtout utilisés pour obtenir des cellules destinées aux analyses en laboratoire.

Devenir

Tous les animaux seront gardés soit pour le maintien de la lignée ( hors groupe 3) soit à destination de l'expérimentation. Les animaux mis à mort dans le cadre de cette gestion de lignée sont les animaux qui préseront l'un des points limites cités précédement.

Remplacement

Les effets de certaines mutations sur le développement du cerveau, et en particulier les changements qui apparaissent lorsqu’une tumeur se forme, ne peuvent être compris qu’en observant comment le cerveau évolue dans un organisme vivant. Aujourd’hui, il n’existe pas encore de méthodes uniquement réalisées en laboratoire (in vitro) capables de reproduire toutes les interactions complexes qui se déroulent dans le cerveau. Les neurones, les cellules gliales, les vaisseaux sanguins et même la réaction inflammatoire travaillent ensemble d’une manière très précise, et ces processus sont encore impossibles à recréer complètement dans un modèle artificiel. C’est pour cette raison que l’étude sur l’animal reste nécessaire pour comprendre correctement la formation et la progression des tumeurs cérébrales.

Réduction

Le nombre de souris élevées est calculé avec soin pour répondre exactement aux besoins des projets scientifiques et pour maintenir la lignée, sans produire d’animaux inutiles. La reproduction est planifiée et ajustée en continu selon les demandes réelles. Des outils de suivi permettent d’éviter toute production excessive, et lorsque c’est possible, les animaux sont partagés entre plusieurs projets ayant des besoins similaires. Si des animaux ne sont pas utilisés, les prochaines portées sont réévaluées pour éviter de reproduire inutilement.

Raffinement

Le suivi sanitaire des animaux est réalisé quotidiennement, avec une surveillance renforcée des individus porteurs du génotype 3 (altérations de P53, PTEN et NBS sous le contrôle de Nestin-Cre), susceptibles de développer un phénotype délétère, notamment neurologique et/ou tumoral. Une attention particulière est portée à la détection précoce de toute altération de l’état général (perte de poids, piloérection, modifications du comportement, troubles locomoteurs). Des mesures de raffinement sont mises en œuvre afin de limiter la douleur, la souffrance et le stress. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux stables lorsque leur état le permet, avec enrichissement du milieu (matériaux de nidification, abris). Les manipulations sont limitées au strict nécessaire et réalisées par du personnel formé, afin de réduire le stress lié à la contention. Pour les animaux présentant des signes cliniques, les conditions d’hébergement sont adaptées afin de limiter les contraintes et prévenir toute aggravation : accès facilité à la nourriture et à l’eau (dispositifs abaissés si nécessaire), réduction de la compétition alimentaire et surveillance accrue. Un isolement temporaire peut être réalisé lorsque nécessaire afin de prévenir les interactions délétères, tout en veillant à limiter le stress induit. La durée de maintien des animaux présentant un phénotype altéré est réduite au strict minimum nécessaire. La prise en charge de la douleur et de la souffrance repose sur une détection précoce et une adaptation rapide des conditions d’hébergement. En cas de dégradation de l’état général dépassant le niveau de gravité défini, une mise à mort réglementaire par CO₂ est réalisée conformément à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

La souris permet la modification aisée du patrimoine génétique avec une facilitée et une rapidité de reproduction. Dans ce contexte ce modèle n’est pas remplaçable. Sagissant de reproduction d'animaux, ils seront utilisés à l'âge minimum de 9 semaines de vie. Pour le developpement de tumeurs les souris seront utilisees entre 20 semaines et 52 semaines.

Le fer injecté dans la tumeur est chauffé par impulsions de radiofréquences pour léser le tissu environnant sur environ un millimètre cube, trois jours de suite, chez 258 souris immunodéficientes porteuses d'un glioblastome humain, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe sous anesthésie pour l'injection, quinze minutes d'imagerie, trente minutes d'hyperthermie, puis une IRM de trente minutes une semaine après la dernière séance. Le projet annonce des tumeurs contrôlées entre 150 et 200 mm³ qui "ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité", tout en fixant un point limite à 1 500 mm³, et décrit l'injection des nanoparticules tantôt en intratumoral tantôt en intraveineux. Les souris sont tuées sans reprise de conscience à la fin de l'IRM, pour chercher dans les tissus la nécrose de la tumeur.

Objectifs

Sur la base d'études in vitro réalisés fin 2025, visant à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur à une quantité jugée suffisante pour une efficacité in vivo supplémentaire par activation par hyperthermie magnétique, et d'études in vitro qui sont réalisées fin 2025, des études de preuve d'efficacité de l'hyperthermie seront menées. L’hyperthermie magnétique se base sur une impulsion de radiofréquences ciblée. Ceci permet de faire une hyperthermie localisée augmentant la température autour de l’endroit où il y a présence de fer. Injectant le fer à l’intérieur de la tumeur, cela fait une cible dans le tissu autour de la localisation de fer d’environ 1 mm3. Dans ce sens, l'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. Ainsi, pour atteindre cet objectif, un modèle tumoral humain et une voie d'administration du composé intra tumorale sont envisagés.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus pour le projet global sont de valider une nouvelle nanoparticule en lien avec l’hyperthermie magnétique, approche thérapeutique en plein essor. Ce projet nous aidera à démontrer la bioaccumulation des nanoparticules dans la tumeur en quantité suffisante pour une efficacité in vivo par activation par hyperthermie magnétique. L'hyperthermie est utilisée comme outil afin d'atteindre et léser par augmentation contrôlée de température exclusivement le tissu tumoral. De plus, la robustesse du processus de fabrication de cette molécule d'intérêt pourra être validée également avec un duplicat d'expériences.

Procédures

Les animaux auront une acclimatation à l’animalerie avec marquage et pesées. L’inoculation de la tumeur est prévue 10 jours environ après l’arrivée à l‘animalerie. Deux mesures de poids et de volumes de tumeurs seront faites par semaine avant d’atteindre le volume tumoral ciblé (environ 6 mesures qui se feront avec une légère contention) et réaliser la randomisation des groupes. L’injection intra tumorale des produits d’intérêt sera faite sous anesthésie au gaz et le suivi par imagerie des particules magnétiques et hyperthermie suivra à J0 puis J1 et J2 respectant 30 minutes de repos entre l’injection et imagerie puis hyperthermie. Les pesées et mesures du volume tumoral seront faites encore à J0 ; J2 puis J6 et J9. Une semaine après la dernière séance d’hyperthermie (J9), une IRM sera faite pour vérifier la présence de nécrose tumorale. Sans reprise de conscience, la mise à mort permettra de réaliser des examens post-mortem sur les tissus collectés. Les acquis en imagerie des particules magnétiques dureront environ 15 minutes et se feront sous anesthésie, les séances d’hyperthermie dureront environ 30 minutes et se feront sous anesthésie, la séance d’IRM durera environ 30 minutes et se fera sous anesthésie également ; la mise à mort se fera sans reprise de conscience à la fin de l’IRM.

Impact sur les animaux

D’après l’expérience du laboratoire concernant les procédures expérimentales, nous pouvons imaginer observer une perte de poids et de motricité chez les animaux ayant développé des tumeurs sous-cutanées de volume important. Cette étude vise des tumeurs controlées et réduites, entre 150 et 200mm³ qui ne provoquera pas de perte de poids ou de motricité. Néanmoins, nous prévoyons un point limite si les tumeurs atteignent 1500m³. L’inoculation de la tumeur sous-cutanée peut induire des douleurs juste après l’inoculation. L’injection des nanoparticules véhiculées dans les cellules est prévue en intraveineux. Une gêne autour de la veine de queue utilisée peut apparaître à ce moment. Concernant l'imagerie et l'hyperthermie, elles se dérouleront sous anesthésie générale sur 15 minutes. Nous nous attendons pas de nuisances supplémentaires.

Devenir

Les souris seront toutes mises à mort à la fin des procédures expérimentales afin de pouvoir réaliser des examens post-mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles in vivo permet d’intégrer différentes composantes, indispensables à la compréhension des mécanismes de développement tumoral et de réponses aux traitements. Ce projet a été initié sur des cultures de lignées humaines de cancer afin de déterminer le comportement de ces lignées. Ce projet ne peut cependant pas être intégralement effectué sur ces modèles de remplacement in vitro ou in silico. Le projet par lui même est une deuxième étude sur la base d’études in vitro réalisées fin 2O25 pour valider la biodistribution de la molécule d’intérêt qui traitera in fine des cancers grâce aux effets thérapeutiques associés à l'hyperthermie.

Réduction

Nous avons établi des groupes d’animaux minimaux pour permettre de suivre l’évolution de la tumeur pour l’utilisation thérapeutique des nanoparticules. Une permière partie de validation est prévue et une deuxième partie suivra avec ces groupes minimaux. Des simulations statistiques ont été réalisées à l’aide de données issues de la littérature. Ces simulations ont été faites à l’aide de l’outil en ligne.

Raffinement

À leur arrivée, les animaux seront placés en groupe sociaux de 4 individus par cage, dans des cages standards répondant aux normes européennes. Ils bénéficieront d’un temps d’adaptation avant toute expérimentation de minimum 6 jours et également d’enrichissement dans leur cage (roue d’activité, cartons, coton). Une surveillance étroite des animaux sera effectuée, de leur arrivée à la fin du protocole, par un personnel compétent, afin de déterminer leur état général (mesure du poids, évaluation de l’apparence physique, respiration). Si nécessaire, ce même personnel mettra en place des mesures afin d’améliorer le bien-être animal. Cette évaluation sera faite trois fois par semaine incluant une mesure de poids par balance et mesure des volumes tumoraux au pied à coulisse. Cette surveillance inclut également un scoring avec des paramètres d’interaction sociale, associés à la perte de poids et motricité autour de l’évaluation du point limite. La procédure a été pensée de manière à limiter au maximum la souffrance animale par l’administration d’agents analgésiques et anesthésiques appropriés.

Choix des espèces

Concernant le choix des souris, nous nous intéressons aux souris qui sont immunodéficientes et fréquemment utilisées dans les modèles précliniques de cancérologie, en particulier pour greffes de cellules humaines. L'immunité de la souche choisie est spécifique pour une réponse immunitaire très réduite et une très bonne tolérance, ce que améliore la prise tumorale, indispensable à ce projet. L’ensemble des animaux utilisés dans cette étude seront de jeunes adultes âgés de 7-8 semaines à l'arrivée à l'animalerie. A ce stade, tous les organes sont formés et fonctionnels.

Toutes immunodéprimées pour accepter un greffon humain, 193 souris athymiques reçoivent sous la peau un fragment de tumeur ovarienne prélevé sur des patientes, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. L'implantation se fait sous anesthésie, l'incision refermée par trois agrafes, puis les molécules testées sont injectées dans l'abdomen ou dans une veine, ou administrées par voie orale sur des animaux éveillés, deux à cinq fois par semaine pendant quatre semaines. Le porteur décrit une douleur temporaire, une perte d'équilibre et une perte de poids après l'opération, puis une baisse de mobilité à mesure que la tumeur grossit, et qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" faute d'alternative pertinente. Aucune souris ne sort vivante du protocole, une grille de suivi déclenchant la mise à mort dès qu'un seuil de dégradation est franchi et celles dont la tumeur ne pousse pas au bout de six mois étant tuées aussi.

Objectifs

Les cancers de l’ovaire sont encore très difficiles à soigner, notamment parce qu’ils arrivent souvent à résister aux traitements classiques comme la chimiothérapie. Pour mieux soigner les patientes, il est donc essentiel de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. Cela signifie : identifier de nouvelles “cibles” dans les cellules cancéreuses, tester de nouveaux médicaments capables de les attaquer, repérer des marqueurs permettant de prédire l’efficacité des traitements, et comprendre pourquoi certains cancers deviennent résistants. Des recherches récentes ont mis en évidence deux cibles particulièrement intéressantes, qui agissent sur des mécanismes complémentaires dans les cellules tumorales. Les résultats obtenus jusqu’à présent sont encourageants. Cependant, avant d’envisager de tester cette stratégie chez des patientes, il est indispensable de démontrer qu’elle fonctionne réellement chez l’animal. Pour cela, on utilise des modèles appelés « xénogreffes », qui consistent à implanter chez l’animal des fragments de tumeurs provenant de patientes. Ces modèles reproduisent fidèlement les caractéristiques du cancer d’origine, notamment dans le cas du cancer de l’ovaire. Ils sont aujourd’hui considérés comme une référence, y compris par l’industrie pharmaceutique, pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements anticancéreux. L’étude que nous proposons utilisera deux modèles différents de xénogreffes. Elle a été conçue de manière à répondre à plusieurs questions scientifiques tout en limitant au maximum le nombre d’animaux utilisés, notamment en partageant certains groupes témoins entre les différentes expériences.

Bénéfices attendus

Avec ce projet, nous souhaitons avant tout vérifier si nos hypothèses sont correctes. Celles-ci reposent déjà sur des résultats préliminaires encourageants, obtenus notamment sur des cellules cancéreuses étudiées en laboratoire. L’étape suivante consiste donc à tester notre stratégie chez l’animal. Cette phase est essentielle pour aller plus loin. Elle pourrait permettre : (i) de préparer la mise en place d’un essai clinique chez des patientes atteintes d’un cancer de l’ovaire. Certaines des molécules étudiées sont déjà testées dans d’autres types de cancers. Nous souhaitons notamment déterminer si le niveau naturel d’expression et d’activité de la cible dans la tumeur peut servir d’indicateur pour prédire l’efficacité du traitement. (ii) de renforcer l’intérêt de développer et valider de nouveaux médicaments dirigés contre une seconde cible complémentaire, avec l’objectif qu’ils puissent être utilisés chez l’être humain. À terme, cette approche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles options thérapeutiques pour les cancers de l’ovaire, qui restent aujourd’hui associés à un pronostic souvent défavorable.

Procédures

Un petit fragment de tumeur provenant d’un cancer de l’ovaire sera implanté sous la peau de souris dont le système immunitaire est affaibli. Au maximum, 193 souris seront concernées. L’intervention est réalisée sous anesthésie générale, avec administration d’un antidouleur dérivé de la morphine. La petite incision est ensuite refermée à l’aide de trois agrafes. L’ensemble de la procédure est rapide et dure au maximum cinq minutes. Une fois la tumeur implantée et développée, les souris recevront soit les traitements à tester, soit un produit témoin (sans principe actif). Les médicaments seront administrés selon différentes voies (injection dans l’abdomen, dans une veine, ou par voie orale), en fonction de leurs caractéristiques. Ces injections sont réalisées sur des animaux éveillés et concernent à la fois les groupes traités et les groupes témoins. Dans le premier modèle expérimental, la molécule ciblant notre première protéine d’intérêt sera administrée seule, deux fois par semaine pendant quatre semaines. Dans un second modèle, cette approche sera combinée avec deux autres molécules ciblant une seconde protéine d’intérêt, administrées cinq jours par semaine. Ces traitements seront également testés en association avec un médicament déjà utilisé en cancérologie, l’olaparib, afin d’évaluer si la combinaison améliore l’efficacité globale. L’objectif est de comparer ces différentes stratégies pour identifier celles qui freinent le plus efficacement la croissance tumorale.

Impact sur les animaux

D’après les données disponibles dans la littérature scientifique, les molécules utilisées aux doses prévues dans notre étude n’induisent pas de toxicité apparente. Les effets indésirables que nous anticipons chez les animaux sont donc principalement liés à deux éléments : l’intervention chirurgicale et le développement de la tumeur. Après l’implantation de la tumeur, les souris peuvent ressentir une douleur temporaire, présenter une légère perte d’équilibre ou perdre un peu de poids. Ces effets sont généralement limités à la journée qui suit l’intervention. Par la suite, à mesure que la tumeur se développe, d’autres signes peuvent apparaître, comme une diminution de la mobilité, des troubles de l’équilibre ou une augmentation visible du volume tumoral. Tous ces paramètres seront surveillés attentivement pendant toute la durée de l’étude, qui ne dépassera pas huit semaines. Si un animal atteint un seuil prédéfini indiquant une altération de son état de santé (évalué à l’aide d’une grille de suivi précise), il sera euthanasié avant la fin de l’expérimentation afin d’éviter toute souffrance inutile.

Devenir

Tous les animaux sont gardés en vie jusqu’à l’atteinte d’un point limite ou 8 semaines après le début des traitements. En cas d’absence de pousse tumorale après 6 mois, les animaux sont euthanasiés.

Remplacement

Le recours au modèle animal est indispensable dans le cadre de notre étude puisqu’à l’heure actuelle, il n’existe pas de modèle alternatif pertinent permettant l’évaluation de la toxicité, de la biodistribution et de l’efficacité de traitements anticancéreux innovants.

Réduction

Les molécules (et leurs combinaisons) utilisées pour cette étude ont été présélectionnés en premier lieu sur les organoïdes tumoraux appariés avant de passer chez l’animal pour réduire le nombre de modèles de PDX – et donc d’animaux – utilisés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans une animalerie nude dédiée à raison de 3 souris par cage. Les souris peuvent s’accrocher à la grille de nourriture, aux tétines de biberons, à des balançoires (Bio Services B.V) et grimper sur un rebord dans la cage. Les animaux sont hébergés dans des cages NextGen inséres dans un portoir ventilé IVC NextGen souris (Allentown), permettant le maintien d’un statut sanitaire exempt d’organismes opportunistes et pathogènes et d’éviter l’apparition d’infections. Ces cages contiennent de la litière en copeaux de peuplier à laquelle y est ajoutée des Sizzle-dri (Serlab), des copeaux de litière Alpha-dri plus (Serlab) mettant à disposition des animaux différentes matières pour confectionner un nid. Des batonnets à ronger et des tunnels en cartons (Bio Services B.V) sont également mis à disposition des animaux. Les conditions de cet hébergement répondent aux normes de la directive européenne 2010-63. La surveillance des animaux est réalisée quotidiennement (7J/7) et 2 fois par jour pendant la période critique de 2 jours suite à l’implantation et le jour des injectionsafin de vérifier le comportement de l’animal.

Choix des espèces

L’implantation de cellules tumorales d’origine humaine n’est possible que chez des animaux immunodéprimés ; les souris Athymiques nude Foxn1nu (ENVIGO, France) sont fréquemment utilisées dans ce type d’étude. Nous avons préalablement comparé différentes souches de souris nude et constaté que celle-ci permettait une prise tumorale optimale (en termes de délai de prise tumorale et d’homogénéité entre les animaux). Les animaux sont reçus à l’âge de 4 semaines et utilisés une semaine plus tard pour implantation des cellules tumorales. Notre expérience montre une homogénéité optimale de la prise tumorale chez des animaux âgés de 5 semaines.

Pour vérifier qu'un candidat médicament ne perturbe pas la respiration avant son administration à des personnes, 1 200 rats, 400 souris et 200 cobayes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal passe six heures, jusqu'à dix, enfermé dans une chambre de plexiglas de dix-neuf centimètres de diamètre, et certains subissent d'abord une chirurgie de quinze à trente minutes pour l'implantation d'un cathéter dans la veine jugulaire, puis restent isolés jusqu'à soixante-douze heures pour que leurs congénères n'abîment pas le dispositif. Les administrations peuvent se répéter deux fois par jour pendant un mois. 270 animaux pourront être réutilisés dans d'autres projets, notamment de formation, si la souffrance réelle est restée légère ou modérée, les autres seront tués pour des prélèvements terminaux ou après des effets marqués du produit testé.

Objectifs

Le projet a pour but d’évaluer les effets de différents candidat-médicaments sur les paramètres respiratoires en utilisant la pléthysmographie de corps entier chez le rongeur vigile. Cette technique permet d'évaluer la fonction respiratoire des animaux sans les contraindre (pas d'anesthésie ni contention pendant la réalisation des mesures). Dans la majorité des cas, ce test sera utilisé dans le cadre de la pharmacologie de sécurité pour vérifier que les candidats-médicaments n'ont pas d'impact sur la fonction respiratoire.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont la découverte de nouveaux médicaments présentant un minimum d'effets secondaires. Ce projet permettra de générer des données scientifiques robustes chez l'animal pour pouvoir passer ultérieurement aux premières administrations chez l'homme, étape indispensable dans le processus de développement et de mise sur le marché de nouvelles molécules.

Procédures

Si le candidat médicament doit être administré par voie intraveineuse, les animaux subiront au préalable une chirugie sous anesthésie générale afin d'implanter un cathéter dans la veine jugulaire (durée 15-30min). Les animaux seront tenus afin de pouvoir leur administrer des produits anesthésiques et analgésiques (durée: environ 1-2minutes). Et ces animaux seront ensuite hebergés seuls après la chirurgie afin que leur congénère ne puisse pas altérer le cathéter (maximum 72h). Dans tous les cas, les animaux de ce projet devront séjourner plusieurs heures (généralement 6h, maximum 10h) dans un pléthysmographe (c'est à dire une chambre en plexiglass transparent, de 19cm de diamètre pour 11cm de hauteur) afin de mesurer leurs paramètres respiratoires. Le candidat médicament et le placebo seront administrés aux animaux par différentes voies. Dans la grande majorité des cas, le candidat médicament sera administré une seule fois. S'il doit être administré plusieurs fois, l'administration aura lieu au maximum 2 fois par jour pendant 1 mois. Cette administration nécessitera une contention légère d'environ 1 minutes (non-nécessaire en cas d'administration iv via le cathéter). Des prélèvements sanguins pourront être effectués durant les phases expérimentales sur animal vigile ou anesthésié (durée des prélèvements: moins de 3min, maximum 2 prélèvements par 24h, sur 5 jours d'affilée maximum).

Impact sur les animaux

Certains animaux pourront subir une chirurgie d'implantation de cathéter veineux qui peut induire des douleurs, qui seront réduites au maximum grâce à une anesthésie et un traitement analgésique. Le séjour dans un espace restraint pendant plusieurs heures peut engendrer un stress léger, qui sera réduit par une habituation préalable aux conditions expérimentales. Par ailleurs, les contentions des animaux vigiles pour administrer le candidat-médicament peuvent engendrer un stress mineur. Enfin, peuvent être envisagés en cours d'expérience des prélèvements de sang, qui induisent chez l'animal une douleur de l'ordre d'une piqure d'aiguille.

Devenir

Les animaux seront mis à mort si réalisation de prélèvements terminaux, suite à des effets marqués des produits testés, si non-utilisés pour d’autres projets. Certains animaux (ex: témoins, animaux ne présentant pas d'effets marqués après traitement) pourront être réutilisés pour d'autres projets (ex: formation) si la gravité réelle a été de contrainte légère ou modérée et si les volumes sanguins prélevés et la période de récupération sont respectés.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur la respiration; ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. En effet, l’objectif principal de ce projet est d'évaluer l'impact sur la fonction respiratoire, ce qu'il n’est pas possible de faire sur des cellules en culture ou organes isolés et qui nécessite un organisme entier dont la physiologie est fonctionnelle. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces rongeur qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques (i.e. 8 par groupe).

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement est obtenu principalement pas le recours à une procédure non-invasive sans contrainte de l'animal (pléthysmographie corps-entier). De plus, les animaux sont habitués préalablement aux conditions expérimentales. En cas de chirurgie (nécessaire pour une administration intraveineuse), le raffinement sera mis en place par un protocole anesthésique et analgésique adapté. Des points limites adpatés sont définis et le recours à l'euthanasie se fera lorsque cela s'averera nécessaire.

Choix des espèces

Le rat, la souris et occasionnellement le cobaye sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans le modèle animal de pléthysmographie sur corps entier. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement.

Le virus respiratoire syncytial et le SARS-CoV-2 sont instillés dans le nez des souris, une à deux fois, au cours d'expériences de cinq à dix jours. 176 souris génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain ACE2 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et toutes seront tuées au dioxyde de carbone pour le prélèvement de leurs poumons, de leur liquide broncho-alvéolaire et de leur sang. L'objet est de savoir si une enzyme pulmonaire, la MMP-7, freine l'entrée de ces virus dans les cellules, question déjà abordée en culture cellulaire. Le porteur affirme que les animaux "ne ressentent aucune gêne" et qu'aucune manipulation n'a lieu sur animal conscient, tout en listant une gêne respiratoire pendant un à cinq jours, un isolement et une posture recroquevillée pendant vingt-quatre à soixante-douze heures, et une hypothermie possible après anesthésie.

Objectifs

Ce projet part de l’idée que certaines molécules produites par les cellules des poumons lors d’une infection en particulier une enzyme qui décompose certaines protéines et qui pourraient aider le corps à se défendre contre des virus respiratoires. La molécule est naturellement présente en grande quantité dans les cellules qui tapissent nos voies respiratoires, et elle semble jouer un rôle important dans plusieurs maladies pulmonaires. Nos premières expériences en laboratoire montrent que cette enzyme pourrait empêcher ces virus d’infecter les cellules. Mais il reste à vérifier si elle joue le même rôle dans un organisme vivant. L’objectif du projet est donc de comprendre comment la molécule contribue à la défense immunitaire : -influence-t-elle l’entrée des virus dans les cellules ? -participe-t-elle à activer ou réguler la réponse immunitaire ? -permet-t-elle de réduire la gravité ou la progression de l’infection, y compris lors d’une co-infection par les deux virus ? En bref, ce projet cherche à déterminer si l’enzyme en question est un acteur clé de la protection naturelle des poumons contre ces infections virales.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but d’améliorer notre compréhension du rôle d’une molécule dans l’inflammation des voies respiratoires et dans les problèmes pulmonaires provoqués par les infections virales. En étudiant comment cette molécule influence l’infection et la réaction du corps, nous espérons identifier des mécanismes importants qui pourraient aider, à terme, à mieux prévenir, diagnostiquer ou traiter ces infections chez l’homme. Les observations recueillies permettront de comprendre : -comment les virus se développent dans les poumons, -comment l’organisme réagit (inflammation, substances libérées par le système immunitaire, production de mucus), -et dans quelle mesure la molécule aide à éliminer les virus. Les résultats attendus pourraient ouvrir de nouvelles pistes pour le développement de traitements ou d’outils médicaux destinés aux infections respiratoires. Le modèle utilisé dans ce projet deviendra également un outil précieux pour la recherche future, notamment pour étudier d’autres virus respiratoires ou pour tester de potentielles stratégies vaccinales.

Procédures

Aucune manipulation n’est réalisée sur des animaux conscients. Les virus sont administrés par voie intranasale uniquement lorsque les animaux sont complètement anesthésiés, ce qui évite toute douleur ou stress. L’administration des virus sera réalisée une à deux fois au cours des expérimentations, dont la durée totale est de 5 à 10 jours. Tous les prélèvements nécessaires à l’étude (sang, liquide pulmonaire, poumons) sont effectués uniquement après l’euthanasie, afin que les animaux ne ressentent aucune gêne. Par ailleurs, les animaux ne sont manipulés qu’une seule fois par jour, pour une durée courte de 2 à 3 minutes, afin d’assurer le suivi de leur bien-être. Ainsi, toutes les manipulations pouvant provoquer de l’inconfort sont réalisées sous anesthésie ou après l’euthanasie, et les animaux ne sont jamais vigiles pendant ces procédures.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés dans ce projet pourraient présenter certains effets liés à l’infection expérimentale ou aux procédures nécessaires à l’étude. Ces effets resteront en général modérés et temporaires, et feront l’objet d’une surveillance étroite. Les nuisances possibles sont les suivantes : 1.Gêne respiratoire légère à modérée : Les animaux pourraient respirer plus rapidement ou avec un certain inconfort durant les premiers jours après l’infection (environ 1 à 5 jours). Les signes respiratoires très marqués seront considérés comme un critère d’arrêt immédiat pour protéger l’animal. 2.Changements de comportement : Une baisse d’activité, un isolement ou une posture recroquevillée peuvent apparaître temporairement (24 à 72 heures). Ces réactions sont courantes lors d’infections ou après des interventions légères. 3.Baisse temporaire de la température après anesthésie : Une légère hypothermie peut survenir dans les heures suivant l’anesthésie, mais elle est corrigée rapidement grâce au maintien au chaud. Une hypothermie prolongée serait un critère d’arrêt. 4.Léger inconfort lié aux instillations intranasales : Des éternuements, toux légères ou irritations du nez peuvent apparaître juste après la procédure, mais ces signes sont brefs et disparaissent en quelques minutes ou heures. 5.Diminution transitoire de l’appétit ou de l’hydratation : Certains animaux pourraient manger ou boire un peu moins pendant 1 à 3 jours, entraînant parfois une légère perte de poids. Une perte trop importante ou persistante entraînera l’arrêt de l’expérimentation pour l’animal concerné. 6.Sensibilité accrue des lignées génétiquement modifiées : Les souris utilisées, dont certaines présentent des modifications génétiques, peuvent être plus sensibles aux infections. Elles pourront donc montrer des signes un peu plus marqués, ce qui justifie une surveillance renforcée et des mesures de prise en charge adaptées. Toutes ces nuisances prévues seront limitées au maximum grâce aux pratiques de raffinement, à un suivi rigoureux et à l’application stricte de critères d’arrêt pour garantir le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux ne pourront pas être réutilisés, car le protocole prévoit un prélèvement terminal des poumons, du liquide broncho-alvéolaire et du sang. Ces échantillons ne peuvent être obtenus que post-mortem et justifient que l’euthanasie soit réalisée en fin de procédure, garantissant la qualité et la validité des analyses prévues. Cette approche assure également que la procédure est uniforme et compatible avec le respect du bien-être animal. Les animaux seront euthanasiés à l’aide de dioxyde de carbone (CO₂), conformément aux recommandations réglementaires et éthiques en vigueur. Le gaz est introduit de manière progressive dans une chambre adaptée, ce qui entraîne une perte de conscience rapide. Les animaux sont observés en continu afin de garantir que la procédure se déroule correctement, et le décès est confirmé par l’absence de respiration et de réflexes. Cette méthode est réalisée uniquement par du personnel formé et autorisé. Une méthode secondaire validée peut être utilisée si nécessaire. L’utilisation du CO₂ permet de limiter les manipulations individuelles et d’assurer une procédure uniforme, réalisée dans des conditions contrôlées et compatibles avec le respect du bien-être animal.

Remplacement

Avant d’utiliser des animaux, nous avons d’abord réalisé toutes les études possibles sans modèle animal. Nous avons notamment travaillé sur des cellules cultivées en laboratoire et utilisé des outils informatiques permettant de faire des prédictions. Ces méthodes nous ont permis d’obtenir de nombreuses informations et de réduire autant que possible le recours aux animaux. Cependant, ces approches ne permettent pas de reproduire l’ensemble des réactions d’un organisme vivant, en particulier pour comprendre l’inflammation des poumons et la manière dont le corps réagit à une infection ou une coinfection. C’est pourquoi l’utilisation d’animaux reste nécessaire pour certaines étapes du projet.

Réduction

Le projet est conçu pour utiliser le minimum d’animaux nécessaire afin d’obtenir des résultats fiables. Le nombre de souris est défini en tenant compte de la quantité de données nécessaires pour répondre aux questions scientifiques, tout en évitant les groupes trop nombreux. Chaque animal sera étudié de manière optimale : plusieurs mesures et analyses seront effectuées sur le même animal (ex. analyse des poumons, du sang, observation de l’infection), ce qui permet de réduire le nombre total de souris. Nous utiliserons également des plans expérimentaux optimisés, qui combinent différentes analyses et exploitent au maximum les informations de chaque animal, sans compromettre la qualité des résultats. Cette approche respecte le principe des 3R : réduire le nombre d’animaux tout en obtenant des données fiables et significatives, et limiter les nuisances pour chaque animal.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux sont conçues pour réduire au maximum toute douleur, stress ou inconfort. Elles sont réalisées par du personnel spécialement formé et expérimenté. Des mesures spécifiques seront appliquées pour le bien-être des souris : Les anesthésies seront faites de manière sûre avec un gaz adapté, et la température corporelle sera maintenue pour éviter toute hypothermie. Les yeux seront protégés pendant l’anesthésie, et les animaux seront surveillés de près jusqu’au réveil pour détecter tout signe de malaise. La douleur sera gérée avec des médicaments si nécessaire, et les signes de détresse ou de changement de comportement déclencheront une intervention immédiate. Les animaux disposeront d’un environnement enrichi, avec matériaux de nidification, objets pour explorer et cachettes, pour favoriser leur comportement naturel. Toutes les manipulations seront limitées au strict nécessaire, la durée des expériences sera réduite au maximum, et des critères d’arrêt sont prévus pour interrompre immédiatement toute procédure si un animal montre des signes de souffrance. Ces mesures permettent de garantir le bien-être des animaux tout en recueillant des données scientifiques fiables et pertinentes

Choix des espèces

Les souris (Mus musculus) sont le modèle le plus approprié pour étudier, dans un organisme vivant, les infections respiratoires virales. Elles permettent de mieux comprendre les mécanismes immunitaires et les réactions des voies respiratoires, ce qui n’est pas possible uniquement avec des cellules en laboratoire. Dans ce projet, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour étudier le rôle de la molécule MMP-7 lors d’infections simples ou de co-infections. Ces modèles animaux sont nécessaires pour observer l’ensemble des réponses immunitaires et les interactions complexes entre les différents types de cellules impliquées dans l’infection. Les souris auront entre 5 et 12 semaines, correspondant à de jeunes adultes avec un système immunitaire mature. Cette tranche d’âge permet d’obtenir des résultats fiables tout en limitant la gravité des symptômes et le stress pour les animaux. Elle représente donc un bon compromis entre pertinence scientifique et bien-être animal, conformément aux principes de raffinement.

Une partie des souris utilisées a un système immunitaire volontairement affaibli, ce qui les expose davantage aux infections et impose un hébergement en cages ventilées avec eau et nourriture stériles. 120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et toutes seront tuées pour que leurs tissus soient collectés. Chacune reçoit une injection de cellules de mélanome sous la peau après épilation de la zone, et certaines reçoivent en plus une injection deux fois par semaine pendant quatre semaines, sans anesthésie. Le projet vérifie dans un organisme vivant ce que des cultures cellulaires ont déjà montré sur le rôle de GATA6, et le porteur situe les retombées pour le traitement du mélanome "à terme".

Objectifs

Le mélanome est une forme de cancer de la peau particulièrement agressive. Même s’il est moins fréquent que d’autres cancers cutanés, il est responsable de la majorité des décès liés à ces cancers, car il peut se propager rapidement et s’adapter aux traitements. Ce projet vise à mieux comprendre comment certaines cellules de mélanome changent de comportement et deviennent plus agressives et résistantes aux traitements. Nous étudions en particulier une molécule appelée GATA6, capable de modifier l’activité de nombreux gènes dans les cellules. Des résultats obtenus en laboratoire ont montré qu’un signal du système immunitaire, appelé interféron gamma, peut augmenter la quantité de GATA6 dans les cellules de mélanome. Dans ce cas, les cellules deviennent plus résistantes à certains traitements. À l’inverse, lorsque GATA6 est réduit, les cellules redeviennent sensibles aux traitements. Cela suggère que ce signal immunitaire et GATA6 agissent ensemble pour favoriser la résistance du cancer. Pour vérifier si ces phénomènes existent aussi dans un organisme vivant, nous étudierons la croissance de tumeurs de mélanome de souris. Nous comparerons des tumeurs avec ou sans GATA6 dans des souris ayant un système immunitaire fonctionnel ou affaibli, afin de comprendre comment ces facteurs influencent la progression du cancer. Dans un second temps, si GATA6 joue un rôle important, nous testerons son impact sur l’efficacité d’un traitement d’immunothérapie, qui aide le système immunitaire à combattre le cancer et qui est déjà utilisé chez des patients. L’objectif global de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes qui rendent certains mélanomes plus agressifs ou résistants aux traitements, afin de contribuer à terme à l’amélioration des traitements.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à mieux comprendre le rôle d’une molécule appelée GATA6 dans la progression du mélanome. Nous cherchons à savoir comment elle influence la croissance des tumeurs et leurs interactions avec le système immunitaire. Les expériences réalisées chez l’animal permettront de compléter les résultats déjà obtenus en laboratoire, en observant ces phénomènes dans un organisme vivant. Nous étudierons notamment si GATA6 joue un rôle dans la vitesse de croissance des tumeurs, dans leur agressivité et dans la présence de cellules immunitaires à l’intérieur des tumeurs. Si cette molécule influence la réponse du système immunitaire, nous analyserons aussi son impact sur l’efficacité de certains traitements récents contre le cancer, appelés immunothérapies, qui visent à aider le système immunitaire à mieux combattre les cellules cancéreuses. À terme, ces travaux pourraient contribuer à améliorer les traitements du mélanome.

Procédures

Tous les animaux recevront une injection unique de cellules tumorales sous la peau. Avant cette injection, la zone sera épilée et désinfectée. L’intervention dure moins de deux minutes et est réalisée sous anesthésie. Certaines souris utilisées dans ce projet possèdent un système immunitaire affaibli et peuvent être plus sensibles aux infections. Afin de limiter ce risque, elles seront hébergées dans des conditions sanitaires renforcées (cages ventilées, manipulation sous hotte, nourriture et eau stériles). Certains animaux recevront également un traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, sous forme d’injections rapides (moins d’une minute), réalisées sans anesthésie.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus chez les animaux sont principalement liés à l’implantation de cellules tumorales sous la peau, à la croissance de la tumeur et aux injections répétées. La croissance de la tumeur peut entraîner l’apparition de lésions cutanées au niveau du site d’implantation. Les injections peuvent provoquer un stress temporaire lors des manipulations, ainsi que, plus rarement, une irritation ou une lésion au niveau du site d’injection. Certaines souris utilisées dans ce projet possèdent un système immunitaire affaibli afin de permettre la comparaison entre des animaux avec ou sans réponse immunitaire fonctionnelle. Ces animaux peuvent être plus sensibles aux infections. Afin de limiter ce risque, ils seront hébergés dans des conditions sanitaires renforcées. Les animaux seront surveillés régulièrement afin de détecter rapidement tout signe de souffrance. Des critères d’arrêt stricts seront appliqués pour limiter au maximum les effets indésirables.

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront mis à mort afin de collecter les tissus qui seront utilisés pour des analyses ultérieures.

Remplacement

L’étude des interactions entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire, ainsi que l’évaluation des traitements par immunothérapie, nécessitent de prendre en compte de nombreux types de cellules qui interagissent entre elles dans la tumeur. Les expériences réalisées en laboratoire, en cultivant des cellules entre elles, ne permettent de reproduire qu’une partie de cette complexité, notamment la capacité des cellules cancéreuses à échapper aux défenses de l’organisme. L’utilisation d’animaux avec un système immunitaire fonctionnel est donc nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été soigneusement déterminé pour en utiliser le moins possible tout en obtenant des résultats fiables. Il repose sur des résultats déjà obtenus en laboratoire ainsi que sur l’expérience de l’équipe avec ce type de modèle. Dans une première étape, nous comparerons plusieurs groupes de souris afin d’étudier le rôle de la molécule GATA6 et celui du système immunitaire dans la croissance des tumeurs. Chaque groupe comprendra 15 souris, ce qui permet d’obtenir des résultats solides malgré la variabilité entre individu, tout en limitant le nombre total d’animaux. Dans une seconde étape, nous étudierons l’effet d’un traitement d’immunothérapie sur ces tumeurs, également avec 15 souris par groupe. Cette deuxième phase ne sera réalisée que si les résultats de la première étape le justifient, afin d’éviter toute utilisation inutile d’animaux. Enfin, un maximum d’analyses sera réalisé à partir de chaque animal (analyses des tissus, des cellules, etc.), ce qui permet d’obtenir le plus d’informations possible tout en réduisant le nombre total d’animaux nécessaires.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la douleur, la souffrance et le stress des animaux, le protocole est soigneusement planifié et optimisé à chaque étape. Des critères d’arrêt ont été définis pour interrompre les expériences si nécessaire et éviter toute souffrance excessive. Une anesthésie est utilisée lors des procédures qui le nécessitent afin de réduire le stress et l’inconfort. Les animaux sont observés quotidiennement, et leur état de santé est évalué régulièrement à l’aide d’une grille de suivi. Les souris sont hébergées en groupe de quatre par cage afin de respecter leur comportement social. Afin de limiter le risque d’infection, les souris possédant système immunitaire affaibli auront des conditions sanitaires renforcées (nourriture et eau stériles en plus des cages ventilées et de la manipulation sous hotte). Avant le début des expériences, elles bénéficient d’une période d’adaptation de deux semaines, incluant quelques jours sans manipulation puis une habituation progressive aux manipulations, afin de limiter le stress.

Choix des espèces

Les souris sont de petits mammifères dont le système immunitaire fonctionne de manière similaire à celui de l’être humain, ce qui en fait un modèle pertinent pour étudier le cancer. L’injection de cellules murines de mélanome chez des souris avec un système immunitaire fonctionnel permet d’observer comment l’organisme réagit face aux cellules tumorales, comment celles-ci parviennent parfois à échapper aux défenses naturelles et comment l’immunothérapie peut contrer ces mécanismes. Un groupe de comparaison sera composé de souris dont le système immunitaire est défaillant, afin de mieux comprendre l’implication de ce dernier dans la progression des tumeurs. Les souris seront utilisées à l’âge de 6 semaines. Avant cela, elles seront maintenues pendant deux semaines pour s’adapter à leur nouvel environnement. À cet âge, leur système immunitaire est mature pleinement fonctionnel, ce qui permet d’obtenir des résultats fiables et comparables entre les animaux.

Toutes tuées pour que leurs organes soient prélevés et analysés, 1 680 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une irradiation de 90 secondes, une injection de cellules leucémiques dans la veine de la queue, des prélèvements de sang à la joue environ une fois par semaine et des ponctions de moelle osseuse dans le tibia environ une fois par mois, auxquelles s'ajoute pour certaines une implantation chirurgicale sous la peau. La leucémie qui se développe peut leur faire perdre du poids, réduire leur activité, modifier leur pelage et provoquer des difficultés respiratoires aux stades avancés. Sur la réduction, le porteur écrit en une phrase avoir utilisé "des logiciels de calcul statistique" pour arrêter ce nombre de 1 680.

Objectifs

La leucémie aiguë myéloïde est un cancer grave du sang qui se développe dans la moelle osseuse, où des cellules anormales appelées blastes se multiplient de manière anarchique, perturbant la production normale des globules rouges, des globules blancs et des plaquettes. Dans ce contexte, les cellules leucémiques interagissent étroitement avec leur environnement, qui joue un rôle clé dans leur survie et leur résistance aux traitements, notamment en les protégeant des chimiothérapies. L’objectif de ce projet est d’identifier et de caractériser les interactions entre les cellules leucémiques et leur microenvironnement, afin de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces travaux visent à mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression de la maladie et la résistance aux traitements, dans le but ultime de développer des stratégies thérapeutiques plus efficaces permettant d’éliminer les cellules leucémiques tout en préservant les cellules saines.

Bénéfices attendus

À ce jour, les modèles disponibles en laboratoire ne reproduisent pas fidèlement les interactions entre les cellules leucémiques et leur microenvironnement dans la moelle osseuse humaine, limitant la compréhension des mécanismes de résistance aux traitements. Ce projet vise à mieux reproduire ces interactions afin d’identifier des vulnérabilités spécifiques de la leucémie aiguë myéloïde. L’objectif est de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques et de développer des stratégies de traitement innovantes, potentiellement combinées aux chimiothérapies existantes, capables d’agir à la fois sur les cellules leucémiques et sur leur environnement protecteur. L’enjeu est d’améliorer l’efficacité des traitements en s’attaquant aux mécanismes impliqués dans la résistance thérapeutique.

Procédures

Une première étape consiste en une préparation préalable de l’organisme par une exposition courte et contrôlée à des rayonnements, réalisée en une seule fois (durée: 90s). Cette intervention est brève et les animaux retournent ensuite rapidement à leur cage sous surveillance. Des cellules leucémiques sont ensuite introduites dans l’organisme afin de permettre l’installation et le développement de la maladie (injection dans la veine de la queue; souris non anesthésiées, durée: 1 min). Au cours du suivi, des prélèvements de sang au niveau de la veine de la joue seront réalisés sur animaux non anesthésiés afin de contrôler l’évolution de la leucémie. Ces prélèvements sont rapides (quelques minutes) et effectués de manière limitée, généralement à raison d’environ une fois par semaine. Des prélèvements de moelle osseuse (au niveau du tibia) pourront également être réalisés environ une fois par mois afin de suivre plus précisément l’évolution de la maladie. Ces prélèvements sont effectués sous anesthésie générale et anti-douleur (durée: 3 min). Par ailleurs, des interventions réalisées sous anesthésie et traitement antibiotique (dans l'eau de boisson) seront effectuées sur une partie des animaux. Elles incluent des gestes chirurgicaux simples visant à implanter sous la peau (au niveau du dos) des structures en trois dimensions permettant de mimer l'environnement des cellules leucémiques lors de leur développement et multiplication. Ces procédures durent quelques minutes, avec une surveillance jusqu’au réveil. Ces souris seront ensuite traitées avec des traitements pharmacologiques contre la leucémie et/ou soumises à des régimes alimentaires spéciaux permettant d'empêcher l'expression de certains gènes au niveau de la tumeur. L'administration des traitements sera réalisée sur souris non anesthésiées soit dans la cavité abdominale (durée: 10s), soit dans la veine (durée: 1 min), soit par gavage (durée: 30s). Au total, chaque animal sera soumis à un nombre limité d’interventions (environ 4 à 6 au maximum) réparties sur la durée de l’étude, avec une surveillance régulière tout au long du protocole afin de garantir son bien-être.

Impact sur les animaux

Les animaux sont susceptibles de présenter des effets liés au développement de la maladie ainsi qu’aux procédures expérimentales. Au cours de la progression de la leucémie, certains signes généraux peuvent apparaître, tels qu’une diminution progressive de l’activité, une perte de poids, une modification de l’aspect du pelage, ainsi qu’une altération de l’état général. Une augmentation de la fatigue ou des difficultés respiratoires peuvent également être observées à des stades avancés de la maladie. Les procédures réalisées dans le cadre de l’étude (prélèvements biologiques, interventions sous anesthésie, manipulations) peuvent entraîner des effets transitoires tels qu’un inconfort local, une réaction au site d’intervention ou un stress lié à la manipulation. Des réactions locales temporaires peuvent également être observées au niveau des sites où des procédures spécifiques sont réalisées ainsi qu'une irritation/inflammation au niveau de la suture.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et des études seront réalisés sur des organes prélevés en post-mortem pour compléter nos analyses.

Remplacement

Les modèles de culture en laboratoire, comme les cultures en trois dimensions, ne permettent pas de reproduire complètement la complexité des interactions entre les cellules leucémiques et leur environnement dans la moelle osseuse. Ils ne reflètent pas fidèlement les conditions réelles présentes dans l’organisme, notamment l’apport en oxygène, en nutriments, la présence de vaisseaux sanguins et les interactions avec l’ensemble des types cellulaires. C’est pourquoi des modèles plus proches de la situation réelle sont nécessaires pour étudier ces interactions, valider les hypothèses et identifier des cibles thérapeutiques exploitables. Il est donc indispensable d'avoir recours à l'utilisation d'un modèle animal entier dans notre projet.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs avec le nombre de souris minimum. Nous avons pour cela utilisé des logiciels de calcul statistique.

Raffinement

Toutes les expériences et manipulations des animaux seront réalisées dans le respect du bien-être animal. Les animaux bénéficieront d’un hébergement adapté avec un accès libre à la nourriture et à l’eau, ainsi que d’un environnement enrichi. Une période d’acclimatation sera prévue avant toute manipulation. En plus de l'observation quotidienne des souris, un suivi hebdomadaire de l’état de santé des animaux sera effectué à l’aide d’une grille d’évaluation portant sur l’apparence générale, le comportement et l’évolution de la maladie. En cas de signes de souffrance ou de dégradation de l’état général, l’animal sera immédiatement euthanasié conformément aux points limites établis.

Choix des espèces

Le modèle souris est à la base de la compréhension du développement du cancer chez l’homme. Du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise de greffe.