Souris

Une chirurgie de 60 minutes pour insérer un caillot dans une veine du cerveau, puis trois à huit injections destinées à modifier plaquettes et globules blancs : 804 souris porteuses d'une mutation reproduisant un cancer du sang vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles risquent des saignements du fait de la mutation, de l'aspirine et de la baisse des plaquettes, et des infections du fait de la baisse des globules blancs. Toutes sont tuées pour prélever leurs tissus cérébraux. Les effets déclarés mentionnent des tests comportementaux provoquant anxiété et stress, alors que la description des procédures n'en fait état nulle part.

Objectifs

Ce projet vise à comprendre pourquoi certains patients atteints de cancer du sang présentent un risque accru de développer un caillot dans les veines du cerveau. Des études récentes suggèrent que certaines cellules sanguines, notamment les globules blancs et les plaquettes, pourraient favoriser à la fois la coagulation et l’inflammation, contribuant ainsi à la formation et à la gravité de ces caillots. L’objectif est de mieux comprendre ces mécanismes afin d’identifier de nouvelles pistes thérapeutiques et d’améliorer la prise en charge des patients.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’améliorer les connaissances sur les liens entre inflammation, coagulation et formation de caillots dans le cerveau chez les patients avec cancer du sang. Les résultats obtenus pourraient conduire au développement de nouvelles stratégies de prévention et de traitement, ainsi qu’à l’identification de marqueurs prédictifs permettant une prise en charge plus précoce et plus personnalisée des patients à risque.

Procédures

Pour reproduire la maladie étudiée, un caillot sera inséré dans une veine du cerveau chez des souris présentant une anomalie génétique reproduisant certaines caractéristiques d’un cancer du sang observé chez l’être humain. Cette procédure chirurgicale d’environ 60 minutes sera réalisée sous anesthésie générale et avec un traitement contre la douleur. Afin de comprendre le rôle de certaines cellules sanguines dans la gravité de ce caillot, les animaux recevront différents traitements permettant de modifier le nombre ou l’activité des plaquettes et des globules blancs. Chaque animal recevra entre 3 et 8 injections de produits modifiant les cellules étudiées (plaquettes et globules blancs). Les produits sont injectés dans le ventre, sous la peau ou dans une veine (traitement et anesthésie profonde) à l’aide d’une aiguille très fine et parfois sous anesthésie gazeuse. Un des traitements est donné directement dans l’estomac. L’administration de ces traitements dure en moyenne 10 secondes. Deux prélèvements sanguins (avant et après la chirurgie) ne dépassant pas 2 minutes seront réalisés afin d’étudier les modifications des cellules du sang et d’identifier des marqueurs de la maladie. Enfin une imagerie (procédure non invasive) du cerveau réalisée sous anesthésie durera environ 15-30 min sans jamais excéder 2 heures afin de visualiser et quantifier les conséquences du caillot et l’effet des traitements testés.

Impact sur les animaux

Le modèle de souris présentant une mutation dans les cellules du sang permet de reproduire les caractéristiques observées chez les patients atteints du cancer du sang, avec une augmentation des globules rouges. Elles peuvent présenter un risque de saignement en cas de blessure ou de chirurgie mais pas spontanément. Les injections dans le ventre, sous la peau ou dans une veine des différents traitements sont responsables d’un stress et d’une légère douleur de courte durée. Les prélèvements sanguins sont également responsables d’un stress et d’une légère douleur de courte durée. La procédure chirurgicale comporte un risque de saignement et peut provoquer une douleur pouvant entrainer une posture en dos courbé de la souris. La diminution des globules blancs peut induire un risque infectieux. La prise d’aspirine et la réduction du nombre de plaquettes peuvent induire un risque de saignement. Les tests comportementaux induisent un stress, de l’anxiété ou un stress modéré de courte durée. L’imagerie peut induire un stress de courte durée au moment de l’anesthésie de l’animal.

Devenir

Les souris seront mises à mort afin de prélever les tissus cérébraux pour des analyses biologiques.

Remplacement

Le modèle de formation d’un caillot pour boucher une veine du cerveau chez la souris permet une reproduction fiable du spectre des lésions cérébrales observées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est justifiée par le fait que le modèle décrit dans ce projet inclut l’évaluation des paramètres neurologiques (moteurs) et la recherche de saignement qui se produisent dans des organismes vivants. Il n’existe pas d’alternatives, hors organismes vivant, pour réaliser cette étude.

Réduction

Les groupes ont été conçus de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux. Le calcul du nombre de souris est basé sur les résultats antérieurs obtenus avec ce modèle et sur une étude statistique. De plus, le modèle de thrombose veineuse cérébrale que nous utilisons est bien maîtrisé par notre équipe, ce qui nous permet de mener nos recherches de façon rigoureuse et éthique. Pour analyser les résultats, nous appliquerons des méthodes statistiques adaptées, garantissant une interprétation fiable des données tout en respectant notre engagement à réduire l’usage des animaux.

Raffinement

Leur suivi sera assuré par une équipe qualifiée : un soigneur spécialisé s’occupera d’eux chaque jour, et un chercheur expérimenté effectuera un contrôle approfondi deux fois par semaine. Les souris seront hébergées par groupes de cinq dans des cages ventilées, équipées de matériel pour leur permettre de construire des nids et d’améliorer leur confort. Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement antalgique en pré et post-opératoire de manière systématique jusqu’à 24h après chirurgie. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée. La chirurgie est par ailleurs réalisée par une anesthésie adaptée (anesthésie gazeuse). En post-chirurgie nous surveillerons attentivement leur état de santé grâce à une grille d’évaluation précise, prenant en compte des points limites stricts et adaptés au projet. Cette méthode permettra de détecter rapidement toute souffrance et d’y remédier. En cas de douleur, un traitement adapté sera administré, et si nécessaire, une euthanasie sera réalisée.

Choix des espèces

L’espèce utilisée sera la souris sur laquelle toutes les techniques décrites ont déjà été validées dans la littérature. De plus, le modèle de thrombose étudiée ici et recréé chez la souris est le seul permettant une reproduction fidèle de ce qui est observé en clinique. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (14 à 18 semaines). C'est à cet âge que les modèles utilisés sont validés.

Pour entretenir des lignées de souris développant spontanément un diabète de type 1, 9 000 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les actes décrits se limitent à un prélèvement de tissu à l'oreille et à une goutte d'urine par semaine, l'hyperglycémie venant de la maladie que les animaux portent par construction. Une partie est gardée en vie pour renouveler les reproducteurs, les autres étant tuées pour analyse du pancréas, du foie, des intestins, de la rate et des ganglions. Le porteur juge le recours aux souris "indispensable" au motif qu'il faut observer l'"organisme entier", pour un projet qui consiste à maintenir des colonies.

Objectifs

Le diabète de type 1 est une maladie dans laquelle le système immunitaire détruit les cellules du pancréas qui produisent de l’insuline. En l'absence d'insuline, l'organisme est incapable de réguler correctement la glycémie, c'est-à-dire le taux de sucre dans le sang. Pour mieux comprendre les mécanismes de cette maladie, le laboratoire utilise des modèles de souris développant spontanément un diabète de type 1 dont certaines sont génétiquement modifiées. Ce projet a pour objectif d’assurer le maintien de ces lignées murines présentant un diabète de type 1.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes d'action par lesquels les cellules immunitaires participent à l'apparition du diabète de type 1 chez la souris.

Procédures

Prélèvement d'un petit bout de tissu à l’oreille (1 fois, 3 secondes), d'une goutte d'urine (1 fois/semaine, 2 secondes)

Impact sur les animaux

Les souris peuvent développer une hyperglycémie modérée. Le prélèvement d'urine peut induire un stress de courte durée.

Devenir

Certains animaux seront gardés en vie pour renouveler les reproducteurs nécessaires à l'entretien des colonies. Les autres animaux seront mis à mort pour les analyses de tissus (pancréas, foie, intestins, rate et ganglions)

Remplacement

Le recours à l'animal est indispensable car les cellules immunitaires étudiées dans ce contexte sont localisées essentiellement dans les muqueuses comme l’intestin et dans le pancréas. Pour comprendre comment ces cellules interagissent dans l’organisme au moment du développement du diabète, il faut observer l’organisme entier. Ce type d’interactions complexes ne peut pas être reproduit correctement sur des cellules en culture. Néanmoins ce projet est associé à ces approches alternatives afin de limiter le recours aux animaux.

Réduction

La production des souris génétiquement altérées est planifiée. Un schéma d’accouplement optimisé est mis en place répondant au maintien des élevages.

Raffinement

Les petits prélèvements de tissus pour analyser les gènes des souris sont effectuées par du personnel expérimenté, formé à faire des gestes rapides et précis afin de limiter l'inconfort des animaux. Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi et des critères de surveillances ont été définis pour repérer rapidement toute souffrance éventuelle et y remédier. Enfin, pour le suivi du diabète de type 1, les animaux sont surveillés afin de détecter rapidement une augmentation du taux de sucre. Cela permet de prendre des mesures adaptées le plus tôt possible et de limiter les complications.

Choix des espèces

Le modèle de souris est adapté à l’étude immunitaire de cette maladie - Il permet d’avoir accès à de multiples modèles génétiquement modifiés pour permettre d’isoler des paramètres biologiques importants dans le développement du diabète. -Le système immunitaire de la souris est très proche de celui de l’homme, ce qui est important pour l’étude d’une maladie auto-immune et également facile à étudier par diverses techniques cellulaires ou biochimiques. Les animaux seront utilisés à partir de 3 semaines d’âge (jeune adulte).

1 536 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur pose des implants hormonaux sous anesthésie, on leur injecte des substances dans l'abdomen pendant quinze jours, on incise l'extrémité de leur queue pour cinq mesures de glycémie après six heures de jeûne. Une partie porte un phénotype transgénique dommageable qui réduit ses comportements exploratoires et sociaux et accroît sa sensibilité au stress, l'hébergement individuel et les restrictions alimentaires ajoutant isolement, baisse d'appétit et perte de poids. Le projet annonce des biomarqueurs précoces et des stratégies thérapeutiques contre le déclin cognitif après la ménopause, retombées situées bien au-delà de la première année, quand la mise à mort des 1 536 souris est acquise dès le départ.

Objectifs

Les femmes sont plus touchées que les hommes par certaines maladies du cerveau, comme la maladie d'Alzheimer, notamment après la ménopause. Cette période de la vie s'accompagne de changements importants dans l'organisme : le cerveau, le système de défense de l'organisme et le métabolisme sont tous affectés. La diminution de certaines hormones perturbe le fonctionnement du cerveau et peut, avec le temps, entraîner des dommages neurologiques durables. En parallèle, l'organisme développe un état inflammatoire plus marqué. Cette combinaison, perturbation cérébrale et inflammation, pourrait expliquer en partie pourquoi le risque de développer la maladie d'Alzheimer augmente après la ménopause. Notre projet vise à mieux comprendre ces mécanismes en étudiant comment le système immunitaire se modifie au fil des étapes de la ménopause chez la souris. Nous souhaitons également examiner le lien entre ces modifications et des paramètres tels que le poids et l'alimentation. Enfin, nous cherchons à déterminer si et comment les cellules du système immunitaire jouent un rôle dans le fonctionnement du cerveau durant cette période.

Bénéfices attendus

Identifier les mécanismes clés qui relient ménopause et déclin cognitif. Déterminer le rôle précis des cellules immunitaires dans l’apparition ou l’aggravation des symptômes. Révéler des biomarqueurs précoces, utiles pour le diagnostic ou la prévention, avant l’apparition des pertes de mémoire. Ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques, ciblant spécifiquement les processus immunitaires déclenchés par la ménopause. Prévenir la maladie pour éviter de devoir traiter des symptômes cognitifs aggravés. Les premiers résultats de ce projet peuvent être accessibles dès la 1re année de réalisation du projet.

Procédures

Injections abdominales de substances pendant 15 jours (animal vigil). Incisions de la queue pour collecter une goutte de sang et injection pour le test de tolérance au glucose et à l’insuline (animal vigil) : mesurer la glycémie à 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après injection (1 intervention d’1 minute par point temporel). Jeûne de 6 h (début tôt le matin pour limiter le stress). Tests comportementaux (animal vigil) : 10 min par session pour étudier les capacités cognitives des souris (1 session par test). La durée réduite de chaque test (inférieure à 1 h), sans manipulation et sans perte de poids attendue. Pose d’implants hormonaux : 5 min d’intervention, 1 fois (animal endormi). Injections cervicales : 30 min d’intervention, 1 fois (animal endormi).

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux induisent un stress léger limité à la durée des tests, inférieure à une heure, sans manipulation invasive ni perte de poids attendue. L’hébergement individuel peut entraîner un stress modéré lié à l’isolement social, pouvant se traduire par une diminution transitoire de l’activité ou de l’appétit. Les interventions chirurgicales nécessaires à la pose d’implants entraînent une douleur post-opératoire transitoire. Une perte de poids peut être observée transitoirement lors des périodes de restriction alimentaire nécessaires à certaines tâches comportementales. L’incision de l’extrémité de la queue pour le prélèvement d’une goutte de sang provoque une douleur légère et de courte durée ainsi qu’une irritation locale transitoire. Le phénotype dommageable du modèle transgénique peut conduire à une réduction des comportements exploratoires et sociaux des souris transgéniques ainsi qu’à une sensibilité accrue au stress. Les injections aabdominales répétées peuvent provoquer un stress léger ainsi qu’une gêne transitoire au moment de la contention et de l’injection. Les injections cervicales nécessitent une anesthésie générale de l'animal (30 minutes d'intervention). Les souris seront donc contrôlées pendant plusieurs jours après la chirurgie .

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de cette procédure expérimentale. Cette étape est indispensable afin de pouvoir prélever les tissus cérébraux nécessaires aux analyses scientifiques prévues dans ce projet. Ces analyses biologiques ne peuvent pas être réalisées autrement et sont essentielles pour répondre aux objectifs de recherche.

Remplacement

Les liens entre la ménopause, l’immunité, le métabolisme et le fonctionnement du cerveau sont très complexes, car ils impliquent de nombreux organes et systèmes qui interagissent en permanence dans l’organisme. À ce jour, aucune méthode utilisant uniquement des cellules en culture, des organoïdes ou des simulations informatiques ne permet de reproduire l’ensemble de ces interactions dans un organisme vivant. Seules les études réalisées chez l’animal permettent d’observer en même temps l’évolution du comportement, des hormones, du métabolisme, du système immunitaire et du cerveau chez un même individu au cours du temps. Les méthodes alternatives apportent des informations utiles, mais elles ne permettent pas d’évaluer le comportement ni de comprendre les réponses globales de l’organisme nécessaires pour étudier cette période de vulnérabilité liée à la ménopause. Dans l’état actuel des connaissances, l’utilisation de l’animal reste donc nécessaire pour répondre aux objectifs de ce projet.

Réduction

Pour obtenir des souris génétiquement modifiées de manière efficace, nous sélectionnons uniquement celles dont les gènes correspondent à nos besoins. Ensuite, nous comparons les résultats entre différents groupes d’animaux à l’aide de méthodes statistiques adaptées : pour deux groupes, un test simple vérifie s’il y a une différence significative entre eux ; pour plus de deux groupes, une analyse plus poussée est réalisée. Nous avons calculé le nombre idéal de souris par groupe pour obtenir des résultats fiables, en tenant compte de la variabilité naturelle, pour détecter toutes différences entre les groupes. Résultat : il faut environ 10 souris par groupe.

Raffinement

Nous avons défini différents points de raffinement tout au long de l’étude : Période d’habituation avant utilisation en expérimentation d’une semaine minimum. La surveillance des animaux sera renforcée durant les périodes expérimentales et en cas de constat de dégradation du bien-être / souffrance des animaux. L’évaluation de la prise alimentaire nécessite parfois l’hébergement des animaux en cages individuelles. Pour compenser le manque d’interactions sociales, les cages, transparentes et enrichies, seront rapprochées au maximum les unes des autres. Notre étude nécessite des chirurgies qui seront réalisées sous anesthésie générale avec un protocole analgésique adapté ainsi que des mesures de maintien du bien-être animal. Des points limites précoces et terminaux appropriés ont été définis avec l’utilisation d’un tableau (arbre décisionnel pour chaque composante étudiée, anatomique, physiologique, comportementale). Si le bien-être animal venait à se dégrader, il sera mis en place des mesures conservatoires et des critères d’arrêt des souffrances, en accord avec notre vétérinaire.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier le cerveau et le système nerveux chez les vertébrés. L’organisation de son système nerveux est, à bien des égards, proche de celle de l’être humain, tant sur le plan de la structure que du fonctionnement. Cela permet aux scientifiques de mieux comprendre certains mécanismes cellulaires et comportements, avec des résultats souvent pertinents pour l’humain. Plus largement, les caractéristiques du cerveau de la souris sont similaires à celles des autres mammifères, ce qui rend les connaissances obtenues utiles pour la recherche médicale. Dans ce projet, nous nous intéressons à des cellules du cerveau appelées microglies, qui jouent un rôle important dans la défense immunitaire du système nerveux. Pour les observer, nous utilisons des souris génétiquement modifiées, chez lesquelles ces cellules émettent une lumière visible au microscope. Cela permet de mieux les repérer et d’analyser leur comportement dans le tissu cérébral. Nous étudions également des souris présentant des caractéristiques proches de la maladie d’Alzheimer, afin de mieux comprendre comment le système immunitaire du cerveau évolue dans cette maladie. Les tests biologiques, biochimiques et comportementaux sont effectués sur les souris à partir du moment où elles deviennent adultes sur le plan reproductif et jusqu’au début de l’âge adulte. Cette période correspond à un organisme déjà mature, mais encore peu affecté par le vieillissement. Cela permet d’étudier les effets des manipulations sur un système hormonal fonctionnel, tout en limitant les effets liés à l’âge et en assurant de bonnes conditions de tolérance pour les animaux.

Tuées à l'issue parce qu'aucune, porteuse d'une tumeur mammaire et traitée par chimiothérapie, ne pourra être adoptée ni réutilisée, 320 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un tatouage à la pince dans les coussinets des phalanges, un rasage du flanc, une greffe de cellules d'un cancer du sein triple négatif, puis des injections de chimiothérapie et d'un donneur de monoxyde d'azote deux fois par semaine pendant quatre semaines. La tumeur gêne la patte arrière et réduit la mobilité, la mesure au pied à coulisse ayant lieu trois fois par semaine. Le sang est prélevé par ponction intracardiaque sous anesthésie, juste avant la mise à mort.

Objectifs

Le traitement du cancer est très difficile. Il faut donc trouver de nouvelles solutions pour améliorer la vie des patients. L’objectif principal de ce projet est d’améliorer l’efficacité des traitements utilisés pour un type de cancer du sein. Ce type de cancer du sein, appelé cancer du sein triple négatif CSTN, se développe très vite et est souvent associé à de moins bonnes chances de guérison. Nous proposons de combiner des traitements de chimiothérapies déjà utilisés en médecine avec un autre médicament qui libère une substance appelée « monoxyde d’azote (NO). Des expériences en laboratoire ont montré que cette combinaison pourrait freiner le développement de la maladie. En effet, le NO peut aider à tuer les cellules cancéreuses, surtout quand d’autres substances (appelées cytokines) sont présentes. Ces cytokines sont produites par les cellules cancéreuses et aussi par certaines cellules du corps, comme les cellules du système immunitaire. Certaines chimiothérapies augmentent la quantité de ces cytokines. Dans cas, quand on ajoute un médicament qui libère du NO et qu’il y a beaucoup de cytokines, les cellules cancéreuses se développent moins vite. L’étude sera divisée en 3 parties dont l’objectif sera (1) trouver les bonnes doses de chimiothérapies à utiliser en combinaison ; (2) déterminer à quel moment après le traitement par chimiothérapies les cytokines sont produites ; (3) d’étudier si la combinaison chimiothérapies et du médicament qui libère le NO peut ralentir le développement du cancer, au bon moment où les cytokines sont présentes. Ce projet vise à démontrer que donner un médicament qui libère du NO après les chimiothérapies peut améliorer le traitement de ce type de cancer du sein.

Bénéfices attendus

Le modèle d’étude du CSTN chez la souris que nous proposons d’utiliser dans ce projet permettra d’étudier la croissance tumorale. Grâce à ce modèle murin d’étude in vivo, nous nous attendons à valider l’hypothèse de notre stratégie de traitement qui repose sur l’administration du médicament donneur de NO sur la base d’une augmentation de cytokine faisant suite au traitement par des chimiothérapies dans le CSTN. Nous avons déjà réalisé précédemment une étude similaire dans le cancer colorectal. Ainsi, au travers de ce projet nous nous attendons à démontrer 1) le rôle clé de l’utilisation du médicament donneur de NO en association avec des chimiothérapies et 2) à démontrer que cette stratégie de traitement peut être transposée au CSTN. A long terme ce projet a pour bénéfice d’améliorer l’efficacité thérapeutique des chimiothérapies standards utilisées chez les patients atteints de CSTN. Ce projet s’inscrit dans le développement d’une nouvelle combinaison de traitement.

Procédures

Anesthésie générale Inhalation d’anesthésiant pendant 5 minutes. Microtatouage Un microtatouage sera réalisé à l’aide d’une pince en 2 secondes au niveau des coussinets de phalanges sous anesthésie générale, une seule fois au début de l’expérience. Rasage Le flanc droit de l’ensemble des souris sera rasé à l’aide d’un rasoir vétérinaire pour injecter les cellules tumorales et mesurer le volume tumoral au cours du temps. L’intervention durera environ 1 minute et sera réalisée une seule fois sur souris vigile au début de l’expérience. Injection des cellules tumorales Les cellules resuspendues dans du sérum physiologique seront injectées sur le flanc droit de l’ensemble des souris sous anesthésie générale. L’injection des souris durera environ 5 secondes et sera réalisée une seule fois au début de l’expérience. Injection des médicaments/sérum physiologique Les injections de chimiothérapies ou sérum physiologique seront injectés individuellement. Les injections seront réalisées sur souris vigile et dureront environ 3 secondes.Le médicament donneur de NO/sérum physiologique seront injectés en sous-cutané au niveau du cou. Une seule injection de 3 secondes sera réalisée deux fois par semaine en vigile pendant environ 4 semaines. Mesure des tumeurs Un suivi de la croissance tumorale sera réalisé 3 fois par semaine pendant 4 semaines environ en vigile à l’aide d’un pied à coulisse. L’intervention durera environ 1 minute par souris. Prélèvement de sang en intra-cardiaque Le sang sera prélevé en intra-cardiaque (sans thoracotomie) après anesthésie générale. Les souris seront maintenues endormies à l’aide d’un masque libérant l’anesthésiant pendant tout le temps du prélèvement. Le prélèvement durera environ 5 minutes par souris. Ce prélèvement sanguin entrainera la mort de l’animal. Mise à mort des souris Les souris seront mises à mort après anesthésie générale. L’intervention durera 3 secondes par souris et sera suivi du prélèvement des tumeurs

Impact sur les animaux

Nuisances dues à l’anesthésie générale pour le microtatouage et l’injection des cellules tumorales : - Stress au moment de l’endormissement dans la boite d’anesthésie - Diminution de la chaleur corporelle Nuisances dues au microtatouage des coussinets des phalanges pour l’identification des animaux : - Stress de la manipulation et de la piqure avec la pince ARAMIS enduite d’encre - Douleur au point piqué Nuisances dues aux injections des chimiothérapies et du médicament donneur de NO : - Stress de la manipulation et de l’injection - Douleur au point d’injection - Effets indésirables dus aux traitements (perte de poids éventuelle) Nuisances dues au suivi de la croissance tumorale : - Stress de la manipulation lors de la mesure du volume tumoral Gêne occasionnée par la tumeur (gêne au niveau de la patte arrière, perte de mobilité)

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les animaux seront anesthésiés avec un anesthésiant pendant 5 minutes puis euthanasiés. En effet, tous les animaux étant porteurs de tumeurs mammaires, aucun ne pourra être réutilisés, replacés ou adoptés. De plus, même en cas de guérison, l’ensemble des souris auront reçu des traitements (chimiothérapies et/ou médicament) ce qui pourrait altérer leur état général en cas d’adoption ou les résultats de nouvelles expériences en cas de réutilisation.

Remplacement

Nous avons préalablement développé des modèles de culture tridimensionnelle (3D) afin de mimer l’architecture tumorale. Néanmoins, ce modèle de culture cellulaire in vitro ne permet pas de reproduire fidèlement la complexité d’un microenvironnement tumoral. Ainsi ce modèle d’étude in vitro ne peut pas se substituer totalement aux expérimentations in vivo étant donné que nous cherchons à étudier l’impact des traitements, d’une part sur le taux de cytokines issues de l’hétérogénéité du microenvironnement tumoral et d’autre part sur la croissance des cellules cancéreuses au sein de leur microenvironnement.

Réduction

Ce projet nécessitera l’utilisation de 320 souris sur une période de 3 ans. La maîtrise du modèle animal chez la souris au laboratoire permet de réduire le nombre d’animaux utilisé au minimum nécessaire pour les expérimentations envisagées afin d’obtenir des résultats statistiquement fiables. Des études préliminaires ont été réalisées afin de définir les conditions de traitement et les doses de Nitronal à utiliser. De plus, les expériences seront réalisées sur des groupes de souris randomisés pour limiter au maximum les biais expérimentaux et éviter de recommencer les expériences plus de fois que nécessaire. Par condition de traitement, 10 seront utilisées pour les expériences de croissance tumorale (Procédures n°1 et n°3) et 5 souris pour les expériences de dosage in vitro des cytokines sériques et tumorales au cours du temps (Procédure n°2) afin de pouvoir effectuer des analyses statistiques de type Two-way ANOVA sur l’ensemble des expériences réalisées.

Raffinement

Pour limiter au maximum les nuisances causées aux animaux et détecter le plus précocement possible toute forme de souffrance ou de mal-être potentiel, les animaux seront observés quotidiennement de façon à vérifier leur bien-être (absence de perte de poids, d’appétit, de déshydratation ou d’immobilité). Les animaux seront toujours hébergés en petits groupes pour limiter l’angoisse/le stress. De plus un enrichissement sera ajouté (matériel de nidification, petit récipient en verre) visant à améliorer la zone de confort tout au long de leur hébergement. Les manipulations (microtatouage, injections des cellules) pouvant générer un inconfort pour l’animal seront réalisées sous anesthésie générale. Une grille de score regroupant les point limites est décrite ci-dessous de manière à déterminer les actions à mettre en place (surveillance, prise en charge ou mise à mort). Chaque paramètre est évalué séparément selon plusieurs niveaux et reçoit un score en fonction (0 à 4). Le score global est obtenu par addition des scores de tous les paramètres, ce qui permet d’estimer l’état général de l’animal et de définir les actions à mettre en place. Dans tous les cas, un animal sera anesthésié à l’aide de 2.5% d’isoflurane pendant 5 minutes puis mis à mort par dislocation cervicale si 1) le volume tumoral atteint 1500 mm3, 2) s’il présente une baisse de la masse corporelle ≥ 20% de la masse de référence au cours de l’étude (la masse corporelle sera mesurée avant le début de la procédure pour établir une valeur de référence, puis 3 fois par semaine pendant toute la durée de l’étude. Une perte de masse corporelle comprise entre 10 et 15% par rapport au poids de référence conduira à une surveillance renforcée, pesée plus fréquente et dépôt de croquettes humidifiées au fond de la cage et/ou de morceaux de pomme) ou des signes (comportementaux/posture) indiquant une souffrance ou une douleur significative qui ne peut pas être supprimée, 3) si l’aspect de la tumeur est nécrosant ou présente une large plaie ouverte. Si la plaie/nécrose de la tumeur est très limitée (< 2 mm), un pansement antimicrobien (pansement en spray cicatrisant à base d’aluminium) sera utilisé pour favoriser la cicatrisation.

Choix des espèces

Les expériences que nous avons préalablement réalisées in vitro ont été menées sur des lignées cellulaires (cancéreuses) de souris. Nous avons utilisé tout particulièrement la lignée 4T1 dérivée de la souris Balb/c. Le modèle de souris Balb/c, syngénique porteur de tumeurs de CSTN est parfaitement maîtrisé au laboratoire et nous permettra d’étudier la combinaison des chimiothérapies avec le Nitronal. Les souris Balb/c seront âgées d’environ 8 semaines de manière à ce qu’elles aient un système immunitaire suffisamment mature pour étudier l’impact de la production de cytokines en réponse au traitement.

Une neurochirurgie de 90 minutes sous anesthésie générale pour 1 472 souris, dix jours d'hébergement individuel en cage hermétique avec passage à 33 °C puis à 4 °C pendant 24 heures pour 1 312 autres : 2 732 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent aussi jusqu'à quatre immobilisations de cinq minutes en position fœtale dans un tube, des gavages quotidiens, des injections abdominales pendant deux semaines et six mesures de glycémie après sept heures de jeûne. Toutes sont tuées pour prélever cerveau et tissu gras. Le projet porte sur les mécanismes de la reprise de poids après un régime, sans que l'effectif de 2 732 souris soit rapporté à une justification chiffrée.

Objectifs

Le poids de notre corps reste assez stable tout au long de la vie adulte grâce à un mécanisme que l'on appelle le "set-point", qui correspond à un poids de référence que notre organisme cherchera à conserver Ce mécanisme est contrôlé par le cerveau, en particulier par une région appelée l'hypothalamus, qui communique avec les graisses du corps pour gérer l'énergie disponible en modifiant le comportement alimentaire, le stockage et l’utilisation des calories ingérées. Cependant, des facteurs biologiques et environnementaux peuvent modifier le set-point du poids corporel comme c’est le cas dans la maladie de l'obésité. Lorsqu'une personne prend du poids, le corps met en place des mécanismes pour le maintenir, ce qui rend difficile de perdre du poids de manière durable. Cela explique pourquoi 80 % des personnes qui ont suivi un régime ou ont recours à une thérapie de l’obésité reprennent du poids rapidement après l'avoir perdu. De récentes recherches scientifiques suggèrent que les altérations du système nerveux et des cellules du système immunitaire du cerveau, appelées microglie, puissent jouer un rôle dans le set-point du poids. Elles pourraient expliquer pourquoi le corps "se souvient" de l'obésité, ce qui facilite la reprise de poids. Ici nous proposons d’étudier leur rôle dans le maintien et dans la reprise du poids. NOUS ETUDIERONS EGALEMENT COMMENT CETTE “MEMOIRE DE L’OBESITE” PEUT IMPACTER LA MEMOIRE, L’ANXIETE ET L’ETAT EMOTIONNEL, AFIN DE COMPRENDRE LES CONSEQUENCES COGNITIVES ET EMOTIONNELLES DE CES ALTERATIONS CEREBRALES LIEES AU POIDS.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle, l’Organisation Mondiale de la Santé estime à plus d’1 milliard le nombre de personnes souffrant d’obésité à travers le monde, ce qui représente un problème de santé publique de la plus haute importance. Malgré l’existence de thérapies pour la réduction du poids, la plupart des patients reprennent du poids. Cette reprise de poids et l’incapacité de maintenir dans le temps le poids perdu sont de vraies urgences clinques pour la gestion de l’obésité. Il est donc crucial d’approfondir nos connaissances sur les mécanismes biologiques participant au changement du set-point du poids corporel, dans l’espoir de fournir à l’avenir de meilleurs traitements aux personnes affectées. À court terme, notre projet apportera des informations nouvelles sur les mécanismes biologiques concernant l’altération du set-point du poids corporel, qui contribue au maintien de l’obésité et des comorbidités associées. À plus long terme, ce projet pourrait ainsi conduire à la mise au point de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’obésité

Procédures

1) ANALYSE DE COMPOSITION CORPORELLE (2732 SOURIS) MAINTIEN 5 MINUTES EN POSITION FŒTALE DANS UN TUBE VENTILÉ, SANS ANESTHÉSIE. JUSQU’À 4 ANALYSES PAR ANIMAL. 2) NEUROCHIRURGIE (1472 SOURIS) INJECTION INTRACÉRÉBRALE SOUS ANESTHÉSIE GÉNÉRALE PENDANT ENVIRON 90 MINUTES. UNE INJECTION ANTALGIQUE 30 MINUTES AVANT, PUIS UNE PAR JOUR PENDANT 2 JOURS. PENDANT L’ANESTHÉSIE : DEUX INJECTIONS D’ANESTHÉSIQUES LOCAUX, UNE INJECTION ANTALGIQUE ET DEUX INJECTIONS DE RÉHYDRATATION. UNE SEULE CHIRURGIE PAR SOURIS. 3) INJECTIONS ABDOMINALES (2624 SOURIS) 1152 SOURIS : INJECTIONS ABDOMINALES SANS ANESTHÉSIE PENDANT UN MAXIMUM DE 2 SEMAINES. 2560 SOURIS : EUTHANASIE PAR INJECTION ABDOMINALE SOUS SÉDATION, APRÈS INJECTION SOUS-CUTANÉE D’UN SÉDATIF. 4) GAVAGE ORAL (1472 SOURIS) GAVAGE QUOTIDIEN PENDANT 5 JOURS, SANS ANESTHÉSIE. 5) CAGES MÉTABOLIQUES POUR L’ÉTUDE DE LA DÉPENSE ÉNERGÉTIQUE (1312 SOURIS) HÉBERGEMENT INDIVIDUEL EN CAGES HERMÉTIQUES PENDANT 10 JOURS. TEMPÉRATURE MODIFIÉE À 33 DEGRÉS CELSIUS PENDANT 24 HEURES, PUIS À 4 DEGRÉS CELSIUS PENDANT 24 HEURES, AVEC DEUX JOURS DE RÉCUPÉRATION À 22 DEGRÉS CELSIUS ENTRE LES DEUX. CETTE PROCÉDURE EST RÉALISÉE UNE SEULE FOIS. 6) APRÈS 7 HEURES DE JEÛNE INJECTION ABDOMINALE SUIVIE DE 6 MESURES DE GLYCÉMIE PAR PRÉLÈVEMENT DE SANG À L’EXTRÉMITÉ DE LA QUEUE, SANS ANESTHÉSIE. DURÉE MAXIMALE : 120 MINUTES. RÉALISÉ UNE SEULE FOIS. 7) PRÉLÈVEMENTS SANGUINS EN RÉPONSE AU STRESS (108 SOURIS) PRÉLÈVEMENTS À L’EXTRÉMITÉ DE LA QUEUE, ZONE NON INNERVÉE. MAXIMUM 4 PRÉLÈVEMENTS DE 15 MICROLITRES PAR ANIMAL, SOIT 60 MICROLITRES AU TOTAL, CORRESPONDANT À ENVIRON 4 POUR CENT DU VOLUME SANGUIN. 8) TESTS COMPORTEMENTAUX (108 SOURIS) OBJECTIF : ÉVALUER L’IMPACT DES MANIPULATIONS EXPÉRIMENTALES SUR L’ANXIÉTÉ, LA MÉMOIRE, L’APPRENTISSAGE, LA MOTIVATION ET L’ÉTAT ÉMOTIONNEL. HÉBERGEMENT INDIVIDUEL PENDANT UN MAXIMUM DE 6 SEMAINES DANS DES CAGES TRANSPARENTES, ENRICHIES ET RAPPROCHÉES. TESTS RÉALISÉS : OPEN FIELD (10 MINUTES, UNE FOIS) POUR L’ACTIVITÉ ET L’ANXIÉTÉ ; LIGHT DARK TEST (5 MINUTES, UNE FOIS) ET ELEVATED PLUS MAZE (5 MINUTES, UNE FOIS) POUR L’ANXIÉTÉ ET LA PRISE DE RISQUE ; WATER MAZE (5 MINUTES, 16 RÉPÉTITIONS) POUR LA MÉMOIRE SPATIALE ET L’APPRENTISSAGE ; TAIL SUSPENSION TEST (6 MINUTES, UNE FOIS) POUR LA MOTIVATION ET L’ÉTAT ÉMOTIONNEL. TEST DE PRÉFÉRENCE POUR LE SUCRE : 48 HEURES AVEC DEUX BOUTEILLES D’EAU, PUIS 48 HEURES AVEC EAU ET SOLUTION SUCRÉE À 4 POUR CENT, POUR ÉVALUER L’INTÉRÊT POUR UNE RÉCOMPENSE AGRÉABLE.

Impact sur les animaux

Les différents tests utilisés dans ce projet permettent un hébergement en cage collective tout le long de l’expérience, EXCEPTE POUR LES TESTS DE COMPORTEMENTS OU NOUS DEVONT PLACER LES SOURIS DANS DES CAGES INDIVIDUELLES DEUX SEMAINES AVANT LE DEBUT DES TESTS ET CE JUSQU’A LA FIN DE LA PROCEDURE, POUR UNE DUREE MAXIMALE DE 6 SEMAINES, AFIN DE LIMITER LES BIAIS SOCIAUX. EGALEMENT, pour les tests de dépense énergétique au sein de cages hermétiquement fermées, les souris adultes devront être hébergées de manière individuelle pendant 10 jours maximum, empêchant ainsi les interactions sociales. Au cours de ces 10 jours, la température des cages sera ponctuellement changée à 33°C pendant 24 h, puis à 4°C pendant 24 h, avec deux jours de récupération à 22°C entre ces deux changements. Une légère perte de poids est possible à la suite de ces changements de température.Pour l’ensemble des procédures, les souris subiront un stress d’immobilisation d’une durée de 5 minutes au maximum lors de l’analyse de composition corporelle, qui nécessite l’insertion de la souris dans un tube en plastique afin de pouvoir faire l’analyse, avec des trous pour le passage d’air. Les souris sous régime alimentaire gras vont prendre du poids de manière significative. La prise de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser 200% du poids initial. Les souris qui passeront les tests de tolérance au glucose et à l’insuline peuvent perdre du poids après le jeûne, d’une durée totale de 7 h. La perte de poids estimée (basée sur nos études antérieures) ne devrait pas dépasser -10% du poids mesuré le jour précédent. LES SOURIS QUI PASSERONT LES TESTS COMPORTEMENTAUX PEUVENT DEVELOPPER UN STRESS PSYCHOLOGIQUE TRANSITOIRE, SE MANIFESTANT PAR DE L’ANXIETE, DES REPONSES DE PEUR OU UNE IMMOBILITE PROLONGEE. CES EFFETS SONT REVERSIBLES ET DE COURTE DUREE, CAR LES TESTS SONT REALISES DE MANIERE LIMITEE ET CONTROLEE, AVEC DES PROCEDURES RAPIDES ET ADAPTEES. DES MESURES SONT PREVUES POUR REDUIRE AU MAXIMUM L’INCONFORT, NOTAMMENT DES MANIPULATIONS DOUCES ET DES PERIODES DE RECUPERATION SUFFISANTES ENTRE LES TESTS. Enfin, des douleurs post-opératoires sont possibles pour les souris ayant une neurochirurgie. Il est possible d’observer une perte de poids/appétit lors de la période post-opératoire. La reprise de poids est attendue dès le deuxième à troisième jour post-opératoire (basée sur nos études antérieures).

Devenir

Tous les animaux de ce projet seront euthanasiés et certains de leurs organes seront récupérés (cerveaux, tissu gras, autres) pour des études réalisées post-mortem.

Remplacement

Le but de ce projet est de comprendre le rôle du système nerveux et des cellules immunitaires du cerveau dans la reprise de poids et l’obésité. Dans ce contexte, la région cérébrale que nous étudions n’est pas isolée, et communique avec d’autres structures du cerveau mais également avec des organes périphériques (foie, pancréas, tissu gras…). Les effets que nous étudions sont donc la résultante de ce dialogue entre le cerveau et différents organes. Des interactions aussi complexes ne peuvent être modélisées in vitro, et certains des effets étudiés comme le comportement alimentaire, le changement du poids, la dépense énergétique, nécessitent un animal vivant. De même, il n’existe aucun modèle informatique qui pourrait remplacer l’animal dans le cadre de cette étude.

Réduction

Nous avons utilisé un test statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables statistiquement. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous avons conçu nos expériences de manière à obtenir un maximum d’information à partir des mêmes animaux. En particulier, l’analyse de la composition corporelle est réalisée dans un appareil qui ne nécessite pas la mise à mort des animaux. Cela nous permet ainsi de réaliser plusieurs mesures à des temps différents sur les mêmes animaux, au lieu d’avoir recours à des lots différents. Le nombre d’animaux que nous demandons est le nombre maximum dont nous estimons avoir besoin durant les 5 ans que durera ce projet. Si nous nous rendons compte en cours de projet que ce nombre peut encore être réduit, il le sera (par exemple en regroupant les mâles et les femelles dans nos analyses, si nous constatons que le sexe n’influence pas les résultats de nos tests).

Raffinement

1) LES ANIMAUX ARRIVERONT À 4 SEMAINES ET SERONT HABITUÉS À L’HÉBERGEMENT PENDANT AU MOINS 1 SEMAINE. L’HÉBERGEMENT INDIVIDUEL SERA LIMITÉ AUX TESTS COMPORTEMENTAUX POUR UNE DURÉE MAXIMALE DE 6 SEMAINES, AVEC DES CAGES TRANSPARENTES ET ENRICHIES RAPPROCHÉES POUR LIMITER L’ISOLEMENT.Toutes les expériences seront réalisées par du personnel formé et entraîné. 2) L’enrichissement des cages inclut l’utilisation de carrés de cellulose pour nidifier, de bâtonnets en bois pour ronger et de tunnels en carton, qui permettront aux souris de se cacher. En outre, nous utiliserons les tunnels pour manipuler les souris, qui est la méthode de manipulation la moins stressante pour ces animaux. 3) Environnement sonore : une radio est installée dans la pièce d’hébergement afin d’atténuer l'impact des bruits extérieurs qui pourraient se produire accidentellement. 4) Notre étude nécessite une neurochirurgie, qui sera réalisée sous anesthésie générale. La prise en charge de la douleur est assurée par un protocole associant morphinique, anesthésique local et traitement anti-inflammatoire. Durant la chirurgie, dès le début de l’anesthésie, les souris seront maintenues sur tapis chauffant et leur réveil s’effectuera en couveuse, pour prévenir le risque d’hypothermie. Leurs yeux seront également protégés de la sécheresse oculaire par application d’un gel ophtalmique. Le risque de déshydratation post-opératoire est prévenu par injection sous-cutanée d’une solution de réhydratation. Enfin, le traitement anti-inflammatoire se poursuivra dans les 2 jours suivant la chirurgie, avec un suivi renforcé des souris durant cette période pour s’assurer de leur récupération. 5) Des points limites précoces et terminaux appropries ont été́ définis : ces critères prennent en compte l'apparence, l'évolution du poids, le comportement, les signes cliniques (température et respiration) et l'aspect de la plaie/suture (le cas échéant). Des mesures conservatoires sont prévues pour chaque critère, afin de prendre en charge promptement toute modification de l’état de l’animal. Lorsqu’un point limite précoce est atteint, nous demanderons un avis vétérinaire afin d’envisager la mise en place de soins personnalisés compatibles avec le maintien de l’animal dans l’étude. En cas d’échec ou si un point limite terminal est atteint, l’animal sera immédiatement retiré de l’étude et euthanasié, pour lui éviter toute souffrance que nous ne pourrions soulager.

Choix des espèces

La régulation du poids corporel et du comportement alimentaire est depuis longtemps étudiée chez la souris, qui représente donc une espèce adaptée à̀ ce type d’études. En effet, la forte proximité́ biologique entre l’Homme et la souris en ce qui concerne le contrôle de la prise alimentaire et du poids corporel fait de cette espèce un bon modèle prédictif. En particulier, dans le cadre de notre étude, la réaction inflammatoire induite par un régime alimentaire riche en graisses est retrouvée à la fois chez la souris et chez l’Homme, ce qui rend d’autant plus pertinent l’étude de ce phénomène chez cette espèce. Enfin, les lignées transgéniques dont nous avons besoin pour mener à bien ce projet ont été créées chez la souris. Toutes les souris de cette étude arriveront à 4 semaines d’âge dans notre animalerie. Cet âge a été choisi car il est important que le début du régime riche en graisses commence avant l'âge adulte. En effet, des scientifiques ont montré que les effets de l'obésité sont plus marqués lorsqu'ils sont induits avant l'âge adulte.

2 200 souris vont être utilisées, dont 920 nourries seize semaines au régime gras, 280 isolées 48 heures en cage métabolique et 240 placées à 5 °C pendant six heures ou dix jours, avec mesure de la température rectale. 560 d'entre elles subissent trois tests métaboliques comportant sept piqûres sanguines chacun, 640 une injection quotidienne pendant sept jours, et 1 560 un prélèvement à la veine temporale juste avant leur mise à mort. Le niveau de souffrance déclaré est modéré et toutes sont tuées pour récupérer organes et sang. L'objectif affiché est d'identifier une enzyme des macrophages comme cible future de médicaments contre l'obésité, perspective renvoyée à d'éventuels développements ultérieurs.

Objectifs

Dans notre organisme, il existe deux grands types de cellules graisseuses, appelées adipocytes. Les adipocytes blancs stockent les graisses issues de notre alimentation, tandis que les adipocytes bruns et beiges les brûlent pour produire de la chaleur. Cette combustion joue un rôle essentiel pour maintenir la température du corps lorsqu’il fait froid, mais aussi pour éliminer l’excès de calories après un repas. Chez les personnes souffrant d’obésité, ces adipocytes « brûleurs de graisse » fonctionnent moins efficacement. Mieux comprendre les mécanismes responsables de cette défaillance pourrait donc ouvrir la voie à de nouvelles stratégies pour restaurer leur activité et favoriser la perte de poids. Des travaux scientifiques ont montré que certaines cellules immunitaires, appelées macrophages, présentes dans les tissus adipeux, participent au bon fonctionnement de ces adipocytes grâce à un dialogue étroit entre cellules. Cependant, en situation d’obésité, ces macrophages changent de comportement et se mettent à produire des substances qui freinent l’activité des adipocytes brûleurs de graisse. L’une de ces substances pourrait être un dérivé lipidique fabriquée par les macrophages grâce à une enzyme spécifique. L’objectif de ce projet est donc de déterminer si et comment, la production de ce dérivé lipidique par cette enzyme des macrophages contribue au dysfonctionnement des adipocytes bruns et beiges.

Bénéfices attendus

L'ensemble des expériences décrites dans ce projet permettront de mieux comprendre le rôle de ce dérivé lipidique produit par les macrophages dans la dysfonction des adipocytes bruns et beiges bruleurs de graisse et ainsi pourrait permettre de proposer l'enzyme le synthètisant comme une future cible pour des médicaments visant à augmenter la fonction et/ou le nombre de ces adipocytes bruleurs de graisse. Cela permettra de favoriser la dépense énergétique et de réduire la masse grasse et ainsi lutter contre l’obésité et ses complications métaboliques comme le diabète de type 2 ou les maladies cardiovasculaires.

Procédures

Des souris (920) seront soumises à un régime riche en lipides pendant 16 semaines. La masse maigre et la masse grasse sera mesurée sur des souris vigiles (1200) par un appareil à raisonnance magnetique nucléaire (RMN) qui est une procédure non invasive un peu comme un scanner, la mesure dure 2 min/souris. Pour les mesures en cage métabolique, les souris (280) seront en hébergement individuel pendant 48 h. Des souris vigiles (560) recevront seront soumises à 3 tests d’explorations métaboliques nécessitant une injection par test. Pour ces 3 tests, ces souris seront soumises à 7 prélèvements d’une goutte sang d'environ 1µl (soit environ 7µL de sang prélevé par test) pour mesurer la glycémie. Les tests seront espacés de 2 semaines. Un prélevement de sang à la veine temporale sera également réalisé sur certaines souris (1560) avant la mise à mort dans certaines procédures. Des souris vigiles (640) recevront une injection et des souris vigiles (640) recevront une injection par jours pendant 7 jours. Des souris (920) seront hébergées à thermoneutralité (30 °C) pendant 18 semaines maximimum. Pour les expériences d'adaptation au froid par mesure de la température rectale, les souris seront hébérgées à 5°C pendant 6h (120 souris) ou 10 jours (120 souris). 7 mesures espacée d'1h seront faites sur les souris hébérgées à 5°C pendant 6h et 1 mesure par jour sera faite sur les souris hébérgées à 5°C pendant 10 jours. 2 mesures espacées de 10 j seront faites sur des souris hébergées à 21 C °(120 souris).

Impact sur les animaux

Les injections sur animaux vigile entrainent une douleur légère et de courte durée. Le prélevement d'une goutte de sang lors des tests d'exploration métabolique peut engendrer une légère douleur de courte durée. Le prélevement de sang à la veine temporale immédiatement avant la mise à mort entraine une douleur légère et de courte durée. La mesure de la masse grasse/maigre nécessite une contention de l’animal d’environ 2 minutes, pouvant induire un stress modéré et transitoire. La mesure de la dépense energétique en cage métabolique nécessite que les souris soient en hébergement individuel pouvant induire un stress modéré qui sera atténué par une augmentation de l'enrichissement de l'environnement. L'exposition au froid dans les conditions que nous utiliserons induit un stress modéré et une baisse d'environ 2-2.5 °C de la température corporelle mais sans entrainer d'hypothermie sevère car les souris comme tous les animaux à sang chaud (homéothermes) sont capables de mettre en jeux différents processus pour maitenir leur température corporelle interne stable, dans certaines limites, indépendamment de la température extérieure. La mesure de la température rectale s’effectue à l’aide d’une sonde de petit diamètre mais son insertion dans l'anus de la souris vigile peut être inconfortable pour l’animal et donc susceptible de générer un stress supplémentaire en plus de celui lié à la contention.

Devenir

Mise à mort pour récuperer des organes et du sang pour différentes analyses moléculaires

Remplacement

Pour satisfaire au remplacement nous avons fait des études cellulaires qui ont montré que ce dérivé lipidique inhibe le développement/fonction des adipocytes thermogéniques qui participent au contrôle de la prise de poids et à la thermorégulation. Cependant, les mécanismes du developpement de l’obésité et de ses complications métaboliques ainsi que de la thermorégulation et de la régulation de la dépense energétique sont complexes, faisant intervenir un dialogue entre différentes cellules et organes. Il n’est pas possible pour l’instant d’utiliser des systèmes cellulaires reproduisant cette complexité biologique. Il nous est donc nécessaire maintenant d’étudier le rôle de la production ce dérivé lipidique par les macrophages sur la fonction des adipocytes bruns et beiges au sein d’un organisme entier car aucune méthode alternative n’existe.

Réduction

Pour satisfaire à la réduction, une gestion éthique de l’élevage nous permettra de ne pas générer des animaux en excès. Les protocoles utilisés sont bien maitrisés par les participants au projet . Cette expertise permet de définir pour chaque procédure un nombre d’animaux minimum pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Nous avons utilisé un logiciel dédié pour calculer le nombre d'animaux minimum nécessaire permettant d'avoir un effet statistiquement significatif en utilisant des données préliminaires qui permettent de prendre en compte la variabilité de l'effet étudié. Une des procédures est dépendantes du résultat de deux autres et ne sera réalisée uniquement si ces procédures donnent des résultats montrant une différence significative entre les génotypes, afin de réduire le nombre de souris utilisées dans ce projet.

Raffinement

L'environnement est amélioré pour minimiser le stress (igloo, tige de coton, buchette de bois). Cet environnement a été adapté selon les conditions experimentales pour favoriser le bien-être des souris et des comportements naturels. L'observation quotidienne des animaux permettra d'identifier rapidement des souris souffrantes et de prendre les mesures correctives nécessaires en fonction des points limites définis adaptés à chaque procédure. Une grille d'observation avec conduite à tenir adaptée à chaque procédure a été mise en place afin de prendre les mesures appropriées. Avec le recul que nous avons sur les experiences proposées, nous ne prévoyons pas de complications pour les animaux pour les différentes procédures mais dans l’éventualité d’apparitions de points limites définis, les mesures retenues seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

L'utilisation de souris se justifie par le fait que cette espèce a un tissu adipeux brun très développé qui contribue à leur dépense énergétique et constitue donc un modèle de choix pour identifier de nouveaux mécanismes régulant la fonction thermogénique de ce tissu et la dépense énergétique. Cette espèce est aussi très utilisée dans les études sur le développement de l'obésité et de ses complications métaboliques car lorsqu'elle est nourrie avec un régime riche en lipide, elle devient rapidement obèse. Ce temps relativement court par rapport à d'autres espèces permet d'étudier facilement l'impact de modifications génétiques ou de composés pharmacologiques sur l'obésité. L'obésité des souris est assez proche de celle de l'Homme permettant de tirer des informations pertinentes pour l'obésité humaine. Enfin, la souris est l'espèce de mammifère de choix pour réaliser des modifications génétiques (surexpression ou invalidation d'une protéine, globale ou ciblée dans un tissu). Les animaux seront étudiés au stade adulte (age 12-23 semaines selon les procédures).