Souris

448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intra-péritonéales puis une instillation de bléomycine dans le nez, une substance qui déclenche l'inflammation puis la fibrose du poumon, avant d'être mises à mort le jour même de l'administration. Le projet cherche à montrer qu'un récepteur qu'elles expriment, une fois activé, réduit la fibrose pulmonaire, dans l'espoir lointain d'une nouvelle approche thérapeutique. Le porteur indique que les cultures de cellules ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo et juge "nécessaire" le recours à la souris.

Objectifs

De nombreuses maladies pulmonaires interstitielles pouvant évoluer vers la fibrose pulmonaire existe chez l’homme et actuellement il n’existe pas de traitement permettant de guérir la fibrose ; Seuls 2 traitements sont utilisés et ils permettent uniquement de ralentir la progression de la maladie. Nous avons identifié un récepteur exprimé par toutes les cellules dont l'activation permet la mise en place de réponses immunitaires anti inflammatoires et développé une molécule qui active ce récepteur. L'objectif de ce projet est de démontrer que c'est bien l'activation de notre récepteur d'intérêt qui conduit à la diminution de la fibrose pulmonaire chez la souris. Ceci permettrait à terme de développer une nouvelle approche thérapeutique pour traiter les fibroses pulmonaires.

Bénéfices attendus

Ce projet amènera une preuve importante certifiant que l’activation de notre récepteur dans des pathologies inflammatoires et fibrotiques peut être bénéfique, contrairement à ce qui est connu à ce jour. La mise au point de cette nouvelle technique d’étude de l’activation de notre récepteur pourrait être utilisée dans plusieurs autres pathologies pulmonaires, mais aussi être adaptée à d’autres organes. Cette technique permettrait de détecter réellement et efficacement l’activation de notre récepteur in vivo. En effet, aujourd’hui seules les voies de signalisation en aval du récepteur d’intérêt sont étudiées, or ces voies sont communes à l’activation de nombreux récepteurs cellulaires.

Procédures

Les animaux anesthésiés (diminution du stress) seront soumis à une injection par voie intranasale de petits volumes de solution. Ces solutions sont indolores pour l'animal et le geste ne dure pas plus d'une minute. 192 animaux recevront 2 injections intrapéritonéales (ip) à 30 minutes d’intervalle (1 ip flanc droit, 1 ip flanc gauche) suivi d’une instillation par voie intranasale (25 ul narine droite, 25 ul narine gauche). 256 animaux recevront 1 injection intrapéritonéale suivie d’une instillation par voie intranasale (25 ul narine droite, 25 ul narine gauche). Ces injections et instillations sont très bien supportées par les animaux et le geste technique dure une dizaine de seconde à chaque fois.

Impact sur les animaux

L’administration par voie intranasale de petits volumes (25ul par narine) de liquide est certainement désagréable, mais non létale. La littérature montre que l’administration de bléomycine induit une inflammation marquée du poumon qui précède la fibrose (visible à partir du 14ème jour) et que cette dernière est associée à une mortalité de l’ordre de 30% (Jiang D, 2005 PMID 16244651). Néanmoins, malgré ce taux de mortalité élevé, ce modèle reste le modèle de choix pour étudier l’incidence de l’intensité inflammatoire sur l’apparition des fibroses pulmonaires. Dans ce projet, les souris seront mises à mort le même jour que l’administration de la bléomycine, s’affranchissant ainsi des effets létaux et sévères de la bléomycine sur le bien-être animal.

Devenir

tous les animaux sont mis à mort à la fin de chacune des deux procédures

Remplacement

Nous avons utilisé des cellules en culture pour définir les concentrations actives de nos molécules. Néanmoins l'utilisation de cellules en culture ne permet pas de mimer la complexité des interactions cellulaires et moléculaires nécessaire à la caractérisation de l'activation de notre récepteur.

Réduction

Une étude de la littérature a été menée pour s'assurer de la non-reproduction de résultats. L’étude statistique prévisionnelle nous permet de prédire le nombre minimal d’animaux qu’il faut inclure par groupe expérimental.

Raffinement

Nous avons montré l’absence de toxicité de nos composés et de leur véhicule sur des cellules en culture et sur des animaux vigiles. Nous utilisons une technique basée sur l’instillation de bléomycine par voie intranasale, cette technique évite une chirurgie. L’instillation est réalisée sur des souris anesthésiées pour diminuer leur stress et nous utilisons un tapis chauffant pour reverser l’hypothermie associée à l’anesthésie. Pour limiter au maximum la souffrance des souris nous avons établi une grille d’observation qui liste les mesures prises pour assurer le bien-être et nous avons défini des points limites à partir desquels les mesures sont prises pour limiter la souffrance de l’animal ou arrêter l’expérience.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur la souris car l’instillation de la bléomycine chez la souris mime l’état inflammatoire et fibrotique des patients atteints de fibrose pulmonaire. Ayant montré dans le cadre d'un projet antérieur que les modulateurs positifs de notre récepteur d'interet inhibent la fibrose pulmonaire, il est important de démontrer son activation dans les mêmes conditions. Les souris mâles seront mises en expérimentation à un âge de 8 semaines. A cet âge, le système immunitaire des souris est mature et les souris développent une inflammation et une fibrose pulmonaire après l’exposition à la bléomycine .

270 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour surexprimer la télomérase et développer une maladie rénale, elles reçoivent de la doxycycline dans l'eau de boisson puis des injections intra-péritonéales quotidiennes d'un inhibiteur pendant sept à vingt et un jours, avant mise à mort pour prélever les reins. Le projet cherche à savoir si une protéine, le TGF-b, intervient dans l'effet d'une autre cible sur la progression de la maladie, les retombées pour les patients restant renvoyées au conditionnel et au long terme. Le porteur affirme que la complexité de la maladie interdit une étude sur cellules et conclut que l'objectif "nécessite le recours à l'expérimentation animale".

Objectifs

La hyalinose segmentaire et focale (HSF) est une maladie rénale chronique très agressive, de progression rapide et associée à un mauvais pronostique. Il n’existe actuellement aucun traitement spécifique pour cette pathologie rénale, et les patients souffrant de HSF suivent par défaut les mêmes protocoles thérapeutiques que ceux utilisés pour traiter les autres maladies rénales chroniques. Toutefois, les patients atteints de HSF présentent une faible réponse à ces traitements, leur fonction rénale ne s’améliore pas, et la grande majorité d’entre eux développent une insuffisance rénale terminale les obligeant à subir des dialyses puis des greffes de rein pour pouvoir survivre. Les causes de la HSF sont inconnues, mais des facteurs génétiques et cliniques sont associés au développement de cette maladie, tels qu’une inflammation anormalement maintenue, la consommation de médicaments, et un large spectre d’infections virales incluant le VIH. Aussi, les évènements moléculaires associés à l’initiation et à la progression de cette maladie restent méconnus. Toutefois, des études précédentes ont montré qu’une voie de signalisation importante pour la physiopathologie de la HSF impliquait la télomérase. En effet, l’augmentation anormale de l’expression de la télomérase chez la souris provoque un dysfonctionnement de la fonction de filtration rein qui montre alors les caractéristiques histologiques de la HSF. Ces souris permettant de surexprimer la télomérase représentent donc un modèle robuste de la HSF. Aussi, l’étude de ces souris a montré que le ciblage pharmaceutique de la protéine X (pX) permet de limiter les effets néfastes de la télomérase sur le rein. Cet effet bénéfique de la modulation de pX sur la progression de la HSF apparaît être associée à une stimulation du processus de sénescence dans le rein et à une augmentation du facteur de croissance transformant-b (TGF-b). TGF-b est une molécule décrite comme une cible de pX qui augmente la sénescence dans différents organes. Dans ce projet, nous allons déterminer si l’augmentation de TGF-b est nécessaire pour l’effet thérapeutique observé lors de la diminution de pX chez les souris surexprimant la télomérase. Pour ce faire, nous allons tester l’effet de deux inhibiteurs de TGF-b sur la progression de la HSF chez des souris invalidées pour pX et surexprimant la télomérase. Ce travail permettra de mettre en évidence de nouvelles stratégies pour le traitement des patients atteints de HSF.

Bénéfices attendus

La télomérase est surexprimée dans le rein des patients souffrant de la hyalinose segmentaire et focale, une pathologie rénale aboutissant à une insuffisance rénale terminale, et caractérisée par la reprogrammation des cellules rénales responsables de la filtration du sang, les podocytes, en cellules dédifférenciées et prolifératives. Nos résultats montrent que l’invalidation ou l’inhibition pharmaceutique de pX permet de restreindre les fonctions non-canoniques de la télomérase et ainsi d’empêcher la dérégulation des podocytes induite par la surexpression de la télomérase chez la souris adulte. Le projet présenté dans ce PEA permettra de déterminer si la modulation de pX réfrène la progression de la hyalinose segmentaire et focale via une stimulation de TGF-b dans ce contexte. Ce travail permettra d'ouvrir de nouvelles perspectives pour le développement de stratégies thérapeutiques visant à inhiber l'activité́ pro-proliférative de la télomérase dans une pathologie rénale associée à la prolifération des podocytes.

Procédures

Les animaux vont être taités à la doxycycline dans l’eau de boisson. Cette eau de boisson est additionnée de sucre afin d'atténuer le goût amer de la doxycycline et de favoriser l’hydratation des animaux. Les animaux vigiles recevront une injection intra-péritonéale d’inibiteur de TGF-b toutes les 24h dès le début du traitement à la doxycycline. Les injections seront effectuées alternativement à droite et à gauche de la ligne médiane abdominale. Les animaux seront injectés avec l’inhibiteur pendant 7 jours, 14 jours ou 21 jours. A l’issue de ces injections, les animaux seront sacrifiés et les reins seront collectés pour réaliser des analyses histologiques et moléculaires.

Impact sur les animaux

La protéine pX est exprimée dans toutes les cellules du corps, mais avec des niveaux différents en fonction des organes ainsi qu’en fonction des types cellulaires au sein d’un même organe. L’organe montrant la plus forte expression de pX est le testicule. Ainsi, les souris mâles qui n’ont plus de protéine pX montrent des performances de reproduction amoindris. Cependant, aucun phénotype dommageable n’est observé chez ces animaux qui n’ont plus de protéine pX (femelles et mâles). Deux caractéristiques physiologiques observables sont associées à l’augmentation de l’expression de la télomérase chez la souris adulte : 1) La pousse accélérée des poils, suivi par leur perte. Ce phénotype n’a aucun impact sur le bien-être des animaux, et l’hébergement des animaux en groupes de 2 à 4 souris par cages favorise le maintien de la température corporelle des souris malgré la diminution de la densité des poils. Aussi, l’ajout systématique de carrés de coton dans les cages permet aux animaux de faire un nid, et ainsi favorise le maintien de la température corporelle. 2) La perturbation des cellules du rein, associée à un dysfonctionnement de la filtration rénale et au développement de la HSF.

Devenir

La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de cette procédure expérimentale afin de permettre l'analyse histologique et moléculaire de leurs reins.

Remplacement

Ce projet d’expérimentation animale s’appuie sur des études préalables réalisées in vitro décrivant les processus moléculaires associant pX, TGF-b et le processus de sénescence cellulaire. Cependant, la HSF est un processus pathologique complexe, et l’étude du rôle de TGF-b sur la progression de cette maladie ne peut pas être réalisé sur des cellules en culture. Ainsi, par définition, cet objectif scientifique nécessite le recours à l’expérimentation animale.

Réduction

En tenant compte des exigences de réduction imposées par la législation, nous avons choisi d’utiliser un nombre minimum de souris par groupe expérimental qui nous permet d’obtenir des résultats statistiquement exploitables. Deux groupes de souris témoins (génotype sauvage et génotype i-TERTci) sont prévus afin d’évaluer les potentiels effets secondaires des inhibiteurs utilisés. Nous commencerons par réaliser le protocole sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Le protocole expérimental ne sera réalisé sur ces groupes que si nous notons un effet significatif des inhibiteurs employés sur les souris pX-KO/KO ;i-TERTci. Ainsi, pour réaliser ce projet, nous utiliserons un minimum de 90 animaux, et un maximum de 270 animaux.

Raffinement

L’évolution de la pathologie rénale sera surveillée étroitement dès le début des procédures. Aussi, dans le but de limiter l'impact de l’expression forte de la télomérase sur l’état général des animaux, et conformément à la réglementation éthique en vigueur qui impose de mettre en place les mesures permettant d’augmenter autant que possible le bien-être des animaux de laboratoire, nous avons mis en place un suivi strict et régulier de la douleur et du stress potentiellement engendrés par les procédures expérimentales décrites dans ce projet grâce à l’utilisation d’une grilles de score. Si un problème est détecté sur un animal lors de ces observations, la complétion de la grille permettra de déterminer de façon objective le devenir de l’animal (suivi rapproché, euthanasie).

Choix des espèces

Le modèle murin i-TERTci utilisé dans ce projet, est un modèle de souris génétiquement modifiées déjà disponible au sein de notre animalerie qui présente les caractéristiques de la hyalinose segmentaire et focale (HSF) décrite chez l’Homme. Ce modèle est croisé avec des souris invalidée pour pX, et nos résultats montrent que cette invalidation restreint l’initiation et la progression de la HSF chez les souris i-TERTci. Les souris représentent un modèle de choix du fait des nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiées déjà générées dans les différents laboratoires mondiaux permettant de répondre aux questions scientifiques posées dans le présent projet. Pour ce PEA, nous allons utiliser des animaux jeunes (2 à 6 mois). En effet, d’après nos résultats préliminaires, c’est dans cette classe d’âge que la pénétrance du phénotype chez les souris i-TERTci est la plus élevée.

2 556 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par des mycobactéries, Mycobacterium avium ou abscessus, par voie intranasale ou intratrachéale, puis traitées jusqu'à deux mois par de nouveaux antibiotiques, avant d'être tuées à différents temps. Le porteur indique qu'une perte de poids atteignant 20 % déclenche la mise à mort, tout en présentant une perte de poids continue comme "non préjudiciable" en deçà de ce seuil. Il qualifie le modèle murin d'"indispensable" et de préalable à un essai chez l'humain "incluant le moins de patients possible".

Objectifs

Mycobacterium abscessus (Mabs) et Mycobacterium avium (Mavi) sont des mycobactéries pathogènes opportunistes responsables d'infections pulmonaires chroniques. La physiopathologie et le terrain prédisposant ces infections ne sont pas bien connus. Pour mieux comprendre l'impact de l'hôte, des modèles précliniques sont indispensables. Actuellement, une infection par voie intraveinseuse de souris immunodéprimées est la seule méthode permettant d'évaluer de nouveaux traitements antibiotiques car il existe une clairance spontanée de l'infection chez les animaux immunocompétents. Cette clairance, qui est aussi retrouvée dans d'autres modèles murins d'infection bactérienne (par exemple Pseudomonas aeruginosa), a été contournée par l'infection des animaux par des bactéries encapsulées dans des billes d'alginate. Cet artifice va permettre de créer une infection chronique ressemblant à celle observée chez les patients. Le modèle actuel d'infection à Mabs et Mavi étant très éloigné de la physiopathologie de la maladie bronchique humaine, nous souhaitons dans la première partie de notre projet mettre au point un modèle d'infection chronique chez la souris immunocompétente. Pour ce faire nous effectuerons une infection des souris par des Mabs et Mavi encapsulées dans des billes d'alginate via deux voies d'infection différentes: intranasale et intratrachéale.

Bénéfices attendus

Le modèle actuel d'infection à Mabs et Mavi étant très éloigné de la physiopathologie de la maladie bronchique humaine, nous souhaitons dans la première partie de notre projet mettre au point un modèle d'infection chronique chez la souris immunocompétente.

Procédures

Les animaux seront infectées par voie intranasale ou intratrachéale par Mycobacterium avium ou Mycobacterium abscessus (n=2376) puis traités par voie orale ou sous cutanée pendant un maximum de 2 mois par de nouvelles molécules afin d'évaluer l'efficacité des traitements (n=1800). Un prélèvement sanguin à la veine mandibullaire sur 24 animaux par molécule sera réalisé; seules les 4 molécules les plus actives seront testées soit un maximum de 96 animaux prélevés. Les animaux ne seront prélevés qu'une seule fois.

Impact sur les animaux

L'infection chronique par Mabs ou Mavi peut entrainer une perte de poids modérée mais sans mortalité. Le poids sera donc surveillé de manière hebdomadaire. En cas de perte de poids supérieur à 20%, l'animal sera euthanasié par élongation cervicale.La valeur de référence sera le poids initial des souris le jour de l’inoculation. Le point limite est fixé à une perte de poids de 20% ; cette perte n’interviendra pas du jour au lendemain mais pourra effectivement être continue pour les animaux concernés. Si aucun autre signe évoquant la souffrance n’est associé (animal prostré, poil piqué, animal ne se nourrissant plus), une perte de poids continue n’est pas préjudiciable aux animaux dans la limite du point limite fixé.

Devenir

Fin de procédure 1: les 180 animaux utilisés pour la mise au point du modèle seront euthanasiés 1 jour, 2 semaines et 1 mois après infection. Les témoins non traités des expériences d’étude de la dose minimale effective (360 souris) et ceux de l’expérience d’étude de l’activité des molécules en associations (36 souris) seront euthanasiés le jour du début des traitements (J0), 1 mois et 2 mois après le début du traitement. Fin de procédure 2: les 180 animaux utilisés pour la mise au point du modèle seront euthanasiés 1 jour, 2 semaines et 1 mois après infection. Les témoins non traités des expériences d’étude de la dose minimale effective (360 souris) et ceux de l’expérience d’étude de l’activité des molécules en associations (36 souris) seront euthanasiés le jour du début des traitements (J0), 1 mois et 2 mois après le début du traitement. Fin de procédure 3: les 1440 animaux traités lors de la détermination de la dose minimale effective de 10 molécules test seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Les 360 animaux traités lors de l’évaluation de l’activité bactéricide des nouveaux composés en association seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Il s'agit ici du nombre maximum d'animaux pouvant entrer dans la procédure. En effet, en fonction du mode d'administration des molécules, les animaux pourront être répartis entre la procédure 3 et la procédure 4, sans dépasser l'effectif total du projet. Fin de procédure 4: les 1440 animaux traités lors de la détermination de la dose minimale effective de 10 molécules test seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Les 360 animaux traités lors de l’évaluation de l’activité bactéricide des nouveaux composés en association seront euthanasiés après 1 et 2 mois de traitement. Il s'agit ici du nombre maximum d'animaux pouvant entrer dans la procédure. En effet, en fonction du mode d'administration des molécules, les animaux pourront être répartis entre la procédure 3 et la procédure 4, sans dépasser l'effectif total du projet.

Remplacement

Les études dans le modèle murin sont un prérequis indispensable à la compréhension de la maladie humaine. Il s'agit d'une étape indispensable pour pouvoir affiner au mieux les stratégies thérapeutiques qui seront évaluées chez l'homme dans un essai incluant le moins de patients possible. Notre projet s'inscrit en amont des études d'activités d'antibiotiques chez l'homme et le modèle animal ne peut être remplacé.

Réduction

Le nombre d'animaux a été réduit au minimum afin de nous permettre d'obtenir une puissance statistique suffisante pour que les résultats soient interprétables ; si notre mise au point de modèle n'était pas concluante, la deuxième partie du modèle ne serait pas mise en oeuvre et une partie des souris prévue ne serait pas utilisée.

Raffinement

Il sera assuré par l'utilisation d'anesthésiques adéquates ainsi que par l'enrichissement mis à disposition des animaux. La surveillance quotidienne des animaux par des personnes compétentes, permettra de détecter un changement de comportement pouvant indiquer une éventuelle souffrance. L’infection par Mycobacterium avium ou abscessus est susceptible d’engendrer une perte de poids chez l’animal. En cas d’atteinte des points limites fixés préalablement (perte de poids supérieur à 20%) l’animal sera euthanasié par une personne compétente. Un enrichissement sous forme de copeaux de cellulose permettant de faire des nids et mis à disposition des animaux.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle utilisé pour l'évaluation des antibiotiques dans les infections à mycobactéries avant évaluation chez l'homme. Il est nécessaire de garder le même modèle pour obtenir des résultats reproductibles. Les animaux auront 4 semaines à leur arrivée et entreront en procédure à 5 semaines après avoir observés une semaine d'acclimatation. Dans la littérature, les animaux utilisés dans d’autres infections mycobactériennes ont habituellement 4 semaines, c’est pourquoi nous utiliserons des animaux de cet âge afin de pouvoir comparer nos résultats à ceux de la littérature et d’être reproductibles.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent quatre à sept injections intrapéritonéales d'un inhibiteur d'enzyme (BAPN) ou d'un placebo, avant d'être tuées pour prélever la cornée sur tissu frais. Le porteur précise que cette expérience répond à une demande d'examinateurs pour finaliser la publication de travaux déjà réalisés. Il n'anticipe "pas de souffrance ou de douleur" sur la courte durée des injections et présente la souris comme "essentielle" pour étudier le devenir des cellules souches in vivo.

Objectifs

Le but de ce projet est de mesurer l’impact de la rigidité matricielle de la niche du limbe de la cornée sur le destin des cellules souches. L’expérience proposée ici est une demande d'examinateurs afin de finaliser la publication de nos travaux . L’effet fonctionnel a déjà été évalué sur des limbes de cornée prélevés sur souris wild type. Il faut maintenant évaluer la rigidité du tissu en question (mesure par microscopie à force atomique). Pour cela, il s’agit de répéter la modulation de la rigidité du limbe par injection intrapéritonéale d’un inhibiteur d'une enzyme de modification de la matrice extracellulaire (lysyl oxidase LOX) et d'effectuer un prélèvement d’organe après sacrifice. La mesure AFM doit effectivement etre realisé sur tissu frais.

Bénéfices attendus

Le destin des cellules souches de s'autorenouveler ou de se différencier dépend en grande partie de l'environnement extracellulaire, en particulier de l'élasticité de leur niche. Néanmoins, le rôle de la rigidité de la matrice dans la formation de cette niche et dans les fonctions souches in vivo est mal connu. Nos données montrent que la rigidité matricielle du stroma module ce destin en générant des compartiments fonctionnels différents. Ce projet vise à mesurer la rigidité de la matrice du stroma du limbe par microscopie à force atomique AFM, comme demandé par les examinateurs. En effet, nous avons montré, dans ce manuscrit, de manière fonctionnelle que c’est en compartimentalisant l’environnement que la matrice contrôle le destin souche.

Procédures

Les animaux seront soumis soit à 4 traitements par injection intrapéritonéale (lot 1 BAPN et lot 2 PBS ) soit à 7 traitements par injection intrapéritonéale (lot 3 BAPN et lot 4 PBS). Une injection intrapéritonéale prend environ 2 minutes par souris à réaliser (soit un total de 2minutes x 4= 8 minutes maximum réparti sur 5 jours pour les lots 1 et 2, et 2minutes x 7= 14 minutes maximum réparti sur 7 jours pour les lots 3 et 4).

Impact sur les animaux

Sur la base de l'expérience antérieure de nos collaborateurs avec les injections de BAPN ou le gavage oral, nous n'anticipons pas de souffrance ou de douleur chez les animaux. Le BAPN est un inhibiteur des enzymes LOX et devrait atténuer la rigidité tissulaire. Ce n'est qu'après des traitements plus longs (comme un mois, i.e. beaucoup plus long que les 4 ou 7 jours max. d'injection proposé ici) que des phénotypes dommageables peuvent apparaitre.

Devenir

La totalité des animaux sera sacrifiée à l’issue de l'unique procédure expérimentale de ce projet. En effet, la mise à mort est nécessaire pour le prélèvement d'organes prévu pour répondre à la question scientifique posée.

Remplacement

Une importante partie de ces travaux a été réalisée in vitro sur cellules en culture, en particulier l’aspect des mécanismes moléculaires impliqués. Cependant, l’étude de l’impact de l’environnement matriciel sur le destin fonctionnel des cellules souches n'est que limitée sur des cellules en culture, et c’est pour cela qu’il est essentiel de réaliser cette expérimentation sur la souris.

Réduction

Chaque souris ayant deux yeux, le nombre de prélèvements pourra être légèrement réduit. De même, les mâles et les femelles seront utilisés limitant donc le nombre de portée et d’animaux générés (début procédure à P13). Néanmoins, afin de préserver la qualité statistique des données, 12 souris par groupe et par traitement sont prévues.

Raffinement

Afin de reduire le risque potentiel de perforation des organes fixes ou de consistance plus dure (estomac, cæcum, foie...) par l'injection intrapéritopneale, le site d'injection choisi est le quadrant abdominal inférieur droit de la cavité péritonéale de l’animal en regard de la cuisse (c'est à dire autour des anses intestinales, organes lâches, qui se rétractent sous l’injection). De même, afin de réduire la douleur, l'aiguille utilisée est de très petit diamètre et le volume injecté de moins de 50 microlitres. Bien entendu, une fiche de score avec point limite bien défini (site d'injection, état général et comportement de l'animal) sera utilisée.

Choix des espèces

La réalisation du projet présenté permettra d’acquérir des connaissances fondamentales sur les processus biologiques régulant le devenir des cellules souches in vivo. La souris apparaît comme un excellent modèle pour étudier ces mécanismes car le modèle est parfaitement décrit et déjà utilisé et le traitement BAPN a déjà été testé, validé et partiellement publié par un membre de la collaboration. De plus, nous proposons ce projet dans le cadre du manuscrit en cours de révision pour lequel notre collaborateur a utilisé un modèle de souris génétiquement modifiées (LOXOE, enzyme LOX OverExpressed). Ainsi, en utilisant des souris, nous pourrons comparer nos données sur souris wild type injectées au BAPN et les données sur souris transgéniques. Ce projet sera développé dans le cadre de réponse aux reviewers sur des expériences déjà réalisées. Ainsi, la procédure sera réalisée sur des souris jeunes P13 uniquement.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur osseuse leur est greffée par injection paratibiale, avec des prélèvements sanguins rétro-orbitaires puis un prélèvement intracardiaque avant la mise à mort. Le porteur indique que la croissance tumorale peut être douloureuse et provoquer une gêne à la marche et des difficultés respiratoires liées aux métastases pulmonaires, du paracétamol étant ajouté à l'eau de boisson. Il décrit un ostéosarcome touchant surtout enfants et adolescents et juge "indispensable" de tester ces combinaisons d'immunothérapies chez l'animal avant la clinique.

Objectifs

L’ostéosarcome est la tumeur osseuse la plus fréquente, touchant essentiellement des enfants et des adolescents. Le traitement de l’ostéosarcome repose sur l’association de polychimiothérapies à la résection complète de la tumeur, mais l’augmentation des chimiorésistances nécessite le développement de nouvelles thérapies. Des études montrent que la composition de l’infiltrat immunitaire de l’ostéosarcome est corrélée avec la progression tumorale (chez l’homme et dans des modèles animaux) : l’immunothérapie semble donc être applicable, mais a montré des résultats limités dans les essais cliniques. Ce projet vise à valider des combinaisons thérapeutiques induisant une meilleure réponse aux immunothérapies dans l’ostéosarcome. Il doit nécessairement se faire dans un modèle in vivo qui intègre la complexité de l’environnement immunitaire et osseux de cette tumeur.

Bénéfices attendus

Au final ce projet permettra de valider des approches immunomodulatrices en combinaison pour le traitement de l’ostéosarcome, ce qui a un potentiel très important en santé humaine, sur des indications où il y a très peu d’options thérapeutiques, et où celles dont nous disposons sont loin d’être idéales. Le nombre d’animaux par groupe est calculé de manière à permettre de détecter une différence d’approximativement 25% (cliniquement significatif) avec un écart type commun de 20%.

Procédures

Les tumeurs seront induites par injection de suspension cellulaire en position paratibiale. Cette injection a lieu une fois et est pratiquée sous anesthésie générale pour une duré total de 5 min. Deux prélèvement rétro-orbitaire de sang, un avant traitement (J0) puis un 10 jours post début du traitement seont réalisés. Ce prélèvement sera effectué après application d’un colyre anesthésique (durée du prélèvement : 5 min maximum). Un prélèvement sanguin intracardiaque de sang sera effectué sur chaque souris juste avant la mise à mort des animaux. Pour cela, les souris seront placées sous anesthésie profonde (isoflurane 5% / air 1.5%).

Impact sur les animaux

L'ostéosarcome est une tumeur osseuse ; le modèle utilisé est implanté en position paratibiale (entre l'os et le muscle) et est métastatique. De ce fait la croissance tumorale peut etre douloureuse c'est pourquoi du paracétamol est ajouté dans l'eau de boisson dès avant l'implantation des cellules et pour toute la durée de l'expérimentation. Une gène à la marche peut survenir qui est surveilléeet un point limite Et du fait des possibles métastases pulmonaires des dyspnées peuvent survenir. La survenue d'une gène respiratoire est d'ailleurs un point limite de l'expérience.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mot à l'issue de chaque procédure même en cas de non atteinte de point limite

Remplacement

Des études in vitro on été réalisées et ont montré l’intérêt de ces combinaisons thérapeutiques sur des modèles cellulaires. Cette approche in vitro a permis de remplacer des études in vivo. Maintenant afin de pouvoir valider la ou les meilleures combinaisons et les amener en clinique il est indispensable de tester ces approches dans un modèle animal mimant la clinique humaine.

Réduction

Dans ce projet, au maximum 280 souris seront utilisées et réparties dans 2 procédures expérimentales. Des tests in vitro préliminaires ont été réalisés et on déjà permis de repousser le passage chez l’animal et de réduire le nombre d’animaux à inclure. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum mais dans des mesures satisfaisantes pour pouvoir conclure de façon statistiquement significative à l’efficacité des médicaments. Ce nombre se justifie par le nombre de combinaisons de médicaments testées et par lx, les répétitions ne concernant que les groupes ayant montré un effet antitumoral (répétition faite pour confirmer effet antitumoral, groupe pas effet pas refait.

Raffinement

Tout au court de ce projet, les précautions seront prises pour ne pas stresser l’animal. Le projet se déroule en 2 temps : Temps 1 : raffinement du modèle animal et temps 2 test des combinaisons. Toutes les injections de cellules seront effectuées sous anesthésie générale et après administration d’un analgésique. Afin de limiter le nombre d’injection faite à la souris, les composés suffisamment stables dans l’eau seront administrés dans l’eau de boisson, les autres administrés par voie IP. Afin de prévenir la douleur liée à la progression de la tumeur du paracétamol est ajouté dans l'eau de boisson 48h avant l'innoculation des cellules et est maintenu tout au cours de l'expérimentation. De l'enrichissement est ajouté dans les cages (nids, croquettes déposées au fond de la cage pour pallier aux difficultés d'accès à la grille de croquettes si boiteries. L'administration d'anesthésique, d'analgésique et d'antalgique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être (perte de poids, claudication, gêne respiratoire) permettent de limiter au maximum la souffrance animale.

Choix des espèces

L’utilisation d’anti PD1 est très bien décrite dans des modèles murins, ce qui n’est pas le cas dans les modèles de rats. Dans le modèle murin proposé, les cellules greffées sont de la même espèce que l’animal greffé ; ce modèle peut donc être établi sur un animal immunocompétent, condition nécessaire pour le test d’immunothérapies. Des modèles de xénogreffes établis chez les souris immunodéficientes ne permettraient pas d’évaluer l’effet du système immunitaire sur la progression tumorale. La lignée POS-1 et K7M2 sont dérivées de souris C57BL/6j et BALB/c. Les souris sont âgées de 7 semaines au moment de l’injection de cellules tumorales en position paratibiale. Cet âge est retenu car à un âge plus précoce, il est très difficile de greffer au niveau de ce site.

91 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales, par voie sous-cutanée ou intraveineuse, censée provoquer un développement tumoral avec métastases cérébrales, avant d'être disséquées pour récupérer ces métastases. Le projet cherche à préciser le rôle d'un gène candidat dans la formation des métastases cérébrales, un processus que le porteur juge "difficilement modélisable in-vitro". Des points limites sont annoncés mais le résumé ne détaille pas les signes cliniques suivis.

Objectifs

Les métastases cérébrales surviennent chez environ 20% des patients atteints de cancers métastatiques. Leur survenue est de mauvais pronostic puisque moins de 10% des patients survivent au-delà de 2 ans. Le traitement de ces atteintes par chimiothérapie reste difficile en raison de la faible perméabilité du cerveau à de la plupart des molécules actuelles, par l’existence d’une barrière hémato-encéphalique entourant et protégeant le système nerveux central. Notre postulat est qu’il existe probablement une signature moléculaire propre liée à l’implantation des cellules tumorales sur le site métastatique cérébral. L’objectif est d’identifier, parmi cette signature, des gènes candidats potentiels que nous pourrions utiliser comme cible thérapeutique. A partir de prélèvements de patients, nous avons réalisé une étude comparative des gènes exprimés au niveau des métastases cérébrales et des métastases non-cérébrales. Ce travail a permis de mettre en évidence des gènes qui pourraient avoir un rôle dans le passage de la barrière hémato-encéphalique et/ou l’implantation des cellules tumorales dans le cerveau. Parmi ces gènes, l’un d’eux pourrait constituer une cible prometteuse de par les fonctions qui lui sont prêtées dans la littérature. L’objectif de cette demande est de déterminer le rôle fonctionnel de cette cible potentielle dans le processus métastatique cérébral.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus de ce projet sont la validation de l’intérêt fonctionnel du gène identifié par l’analyse génomique et bibliographique dans le processus de métastase cérébrale ainsi qu’une meilleure compréhension du processus métastatique vers cet organe.

Procédures

Nous disposons de 2 lignées tumorales murines connues pour induire des métastases cérébrales chez la souris et qui expriment notre gène d’intérêt. Les animaux subiront une seule procédure d'injection des cellules tumorales. En fonction des types cellulaires, les injections se feront soit en sous cutané, soit en intraveineuse. Ce sont des actes peu douloureux qui ne nécessitent pas de sédation. Seule l'injection sous cutanée se fera sous anesthésie générale pour des raison techniques d'accès au site d'injection.

Impact sur les animaux

L'injection des cellules devrait conduire à un développent tumoral avec une possibilité de métastases cérébrales. Pour limiter au maximum les nuisances sur les animaux, un suivi quotidien et l'évaluation des signes clinique doivent nous permettre de suivre le développement tumoral dans le respect des points limtes fixés et de prévenir les domages aux animaux.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, tous les animaux seront euthanasiés pour permettre leur dissection et la récupération des métastases cérébrales et non-cérébrales. Les cellules issues de ces métastases seront ensuite utiliéses pour des analyses moléculaires et fonctionnelles in-vitro.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale est indispensable à la poursuite de notre projet. Le phénomène métastatique est un phénomène plastique qui fait appel à des mécanismes complexes difficilement modélisables in-vitro. Si nous souhaitons mettre en évidence des différences fonctionnelles entre les cellules ayant envahis le cerveau et celle n’ayant pas envahis le cerveau, il est impératif que nous puissions les récupérer sur le site de la métastase.

Réduction

Le nombre d'animaux est calculé pour nécessiter le moins d'animaux possible tout en atteignant les objectifs scientifiques fixés. Pour ce projet, nous avons prévu 91 souris Balb/c Ann. Nous injecterons 2 lignées tumorales murines décrites pour induire des métastases cérébrales. Lors des dissections, nous récupèrerons les cellules tumorales de métastases cérébrales et des métastases non cérébrales pour effectuer des tests moléculaires et fonctionnels in-vitro. Une analyse informatique nous a permis de déterminer le nombre d'individus nécessaires sur la base d'une comparaison de 2 moyennes d'échantillons non appariés. L'évaluation des résultats obtenus se fera par la comparaison de 2 moyennes de groupes d'échantillons non appariés par un test de Mann withney.

Raffinement

Pour le raffinement, les animaux sont suivis quotidiennement par les animaliers et les expérimentateurs. Si les points limites sont atteints avant la fin de l'expérimentation, l'animal sera euthanasié. Une période d'acclimatation de 7 jours sera observée à réception des animaux. Un enrichissement des cages sera systématiquement proposé. pour les souris, nous disposerons dans les cages des abris et des fagots en carton.

Choix des espèces

Nous avons choisi de travailler sur des modèles murins car c’est un modèle pour lequel nous disposons de lignées cellulaires dont il a déjà été décrit qu’elles avaient un tropisme pour le système nerveux central. Nous utiliserons des souris Balb/c car il s’agit d’un modèle syngénique (H2d) pour les lignées utilisées, limitant les rejets des cellules tumorales. Souris adultes de 6 semaines. Les animaux sont identifiés par baguage à l’oreille. L’identification est réalisée 7 jours après leur arrivée. L’âge des animaux n’influe pas sur les capacités de développement tumorales et il n’est pas non plus rapporté d’influence de l’âge sur l’apparition des métastases cérébrales pour ces modèles. Aussi, nous choisirons des animaux adultes jeunes.

8 400 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une inflammation de l'intestin leur est provoquée par un agent chimique, par gavage d'une bactérie ou par injection de cellules inflammatoires, puis des composés leur sont administrés par gavage. Le porteur indique que les animaux développeront les signes des maladies inflammatoires de l'intestin, diarrhée, sang dans les selles et perte de poids. Il qualifie le recours aux modèles animaux d'"indispensable" pour tester des molécules déjà "testées et validées in vitro", les bénéfices pour les patients restant renvoyés au conditionnel et au long terme.

Objectifs

Les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique, sont des troubles caractérisés par une inflammation de la paroi d’une partie du tube digestif, source de lésions destructrices. Ces maladies sont caractérisées par une forte migration de cellules inflammatoires de types granulocytes au niveau de la paroi du tube digestif. L’augmentation et la dérégulation du recrutement des granulocytes et leur sur-activation contribuent à la chronicité et à l’amplification de la maladie. Notre programme de recherche vise à découvrir des molécules qui agissent via des mécanismes d’action innovants et qui peuvent ainsi représenter des options thérapeutiques pour tous les patients atteints de MICI. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et approuvées in vitro. L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro

Bénéfices attendus

A terme, ce projet permettra de de tester et développer de nouvelles approches thérapeutiques innovantes ayant le potentiel d’améliorer la prise en charge thérapeutique des patients atteints de MICI.

Procédures

Dans ce projet, nous utiliserons des modèles d’inflammation de l’intestin chez le rat et la souris afin de tester l’efficacité de nos composés. Ces modèles seront induits par un agent chimique ou par le gavage d’une bactérie ou par l’injection de cellules inflammatoires. Certains de ces modèles utiliserons des souris génétiquement modifiées ne présentant pas de phénotype dommageable.. Les composés seront administrés par gavage. Un prélévement sanguin sera également éffectué pour suivre la pharmacocinétique des composés testés.

Impact sur les animaux

Les animaux developperont les signes cliniques des MICI qui se caractérisent par une diahrée, du sang dans les fèces et de la perte de poids.

Devenir

Tous les animaux dans les procédures recevront une sédation préalable par inhalation d’isoflurane et seront mis à mort avec la méthode adaptées à l'espèce. Le réalisateur s’assurera de la mort effective de l’animal avant l’élimination du cadavre. Les tissus seront collectés pour analyse de l'impacte de nos composés sur la physiopathologie de la maladie.

Remplacement

L’utilisation de modèles animaux est indispensable pour comprendre les mécanismes pathogéniques, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, tester l’efficacité et la toxicité de thérapies anti-inflammatoires et immunomodulatrices innovantes. L’ensemble de nos molécules ont préalablement été testées et validées in vitro. L'utilisation de modèles animals est indispensable pour avoir une vue globale de la physiopathologie de la maladie ainsi que la pharmacocinétique des composées sur l'ensemble des organes ce que ne permet pas les modèles in vitro.

Réduction

Nous utilisons des modèles établis dans la littérature que nous utilisons en routine dans notre établissement utilisateur depuis 5 ans. Une analyse statistique rétrospective a permis de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe pour obtenir pour chaque paramètre étudié. Afin de générer des résultats reproductibles et de limiter la variabilité intergroupe au seul effet du paramètre testé, nous veillerons à travailler sur des groupes les plus homogènes possibles au moment de leur inclusion dans l’étude.

Raffinement

Afin de réduire le stress, une acclimatation d’au moins 5 jours sera réalisée avant l'entrée en étude et leur environnement sera enrichi avec des aspens, igloos, et feuilles de cellulose à déchirer ou du sizzle-dry. Afin de pallier l'inconfort lié aux procédures, un programme d'anesthésie et d'analagésie sera envisagé. Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, une surveillance journalière et des points limites précoces et spécifiques aux modèles ont été établis conduisant à l’arrêt temporaire des traitements ou au sacrifice anticipé de l’animal

Choix des espèces

Les espèces animales utilisées dans le cadre de ces recherches sont la souris et le rat. Les différents modèles seront mis au point, sur la base de la littérature existante et en s’appuyant sur l’expertise du fournisseur. Nous avons souhaité nous appuyer sur de la bibliographie solide et sur des modèles déjà bien documentés afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour les mises au point. En accord avec la littérature pour les différents modèles, les animaux seront utilisés au stade adulte afin d’évaluer les composés à visée anti-inflammatoire, sur un système immunitaire mature