Souris

Pesées chaque jour ou chaque semaine pendant trois à quatre semaines, traitées six jours sur sept dans l'eau de boisson ou directement dans la bouche, soumises à un ou deux prélèvements de sang sous anesthésie, 168 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 96 d'entre elles et modéré pour 72. Les souris porteuses de la mutation reproduisent une myopathie congénitale qui réduit leur masse et leur force musculaires, et le médicament testé peut leur provoquer une douleur musculaire légère à modérée. L'étude porte sur l'innocuité du produit, avec huit animaux par groupe et le raisonnement qu'aucune atteinte sur huit animaux vaut absence d'effet indésirable dans ce contexte génétique. 48 souris seront gardées comme reproductrices, les autres tuées pour les analyses qui doivent valider la sécurité du médicament.

Objectifs

La myopathie que nous étudions est une maladie très rare qui affecte les enfants dès leur naissance et qui se caractérise par une réduction de la masse et de la force musculaire. Les enfants atteints nécessitent souvent une alimentation par sonde au cours des premiers mois puis présentent de gros retards à l’acquisition de la marche puis une intolérance à l’effort les empêchant de courir. Cette maladie est actuellement orpheline de tout traitement. Grâce à notre expertise sur un modèle de souris que nous avons développé pour cette myopathie, nous avons pu identifier des mécanismes mis en jeu et identifié un défaut de fonctionnement spécifique des cellules musculaires. A l’aide d’études in vitro sur des levures et des cellules musculaires en culture, nous avons pu sélectionner des médicaments candidats pour le traitement de cette myopathie. Cette étude vise à valider l’absence de toxicité de la famille la plus prometteuse dans ce contexte génétique précis.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier la sécurité d’une famille de médicaments pour une myopathie congénitale rare, orpheline de tout traitement, chez des souris modèles de cette myopathie. Si cette bonne tolérance est confirmée, ces résultats ouvriront la voie à l’étude de l’efficacité de ces traitements sur la fonction musculaire de ces souris. En cas de résultats positifs, ce traitement pourrait constituer une avancée majeure dans la prise en charge des nourrissons et des enfants atteints de cette myopathie, avec un médicament très peu cher et utilisable à domicile par voie orale.

Procédures

Les animaux seront pesés tous les jours ou toutes les semaines selon les stades, pendant 3 à 4 semaines (30s par pesée). Ils subiront un ou deux prélèvements de sang sous analgésie et anesthésie (30 min au total par prélèvement, moins d’1 min pour le prélèvement en tant que tel). Certains animaux recevront le traitement dans l’eau de boisson pendant 4 semaines et d’autres le recevront directement dans la bouche pendant 3 semaines (6j/semaine, moins de 5 min par prise).

Impact sur les animaux

Les souris connaitront des stress légers dus aux pesées et une douleur et un stress légers liés au marquage à l’oreille et aux prélèvements de sang. Les animaux qui recevront le traitement directement dans la bouche subiront un stress léger lors de cette manipulation. En cas d’effet indésirable du traitement, les animaux pourraient connaitre une douleur musculaire légère à modérée.

Devenir

Une partie des animaux pourra être utilisée comme reproducteurs. Les autres animaux seront mis à mort pour la réalisation de multiples analyses qui permettront de valider la sécurité du médicament testé.

Remplacement

Nous avons réalisé une recherche de candidats médicaments sur des cellules modèles pour cette myopathie et obtenu des résultats prometteurs. Il nous faut maintenant valider la sécurité de cette famille pharmacologique chez des souris mutantes car les effets indésirables que nous voulons exclure ne se manifestent qu’à l’échelle de l’animal après plusieurs semaines de traitement. Ces études in vitro et in vivo seront donc complémentaires pour valider l’intérêt de ce traitement.

Réduction

Cette étude vise à vérifier l’absence d’effet indésirable d’un candidat médicament dans le contexte génétique de la myopathie que nous étudions. A ce titre, si un animal sur 8 ou plus subit une atteinte musculaire, le traitement ne devra pas être utilisé, à cette dose, dans ce contexte génétique. A l’inverse, si aucun événement grave ne survient sur 8 animaux, c’est qu’il n’existe pas d’effet indésirable de cette famille pharmacologique dans cette maladie et qu’un test d’efficacité pourra être testé. Nous traiterons donc avec le candidat médicament 8 animaux mutants en les comparant à 8 animaux sains également traités, ainsi qu’à 8 animaux sains et 8 mutants non traités, pour disposer de tous les contrôles nécessaires pour interpréter les résultats obtenus. Chaque groupe comprendra 4 mâles et 4 femelles pour ne pas passer à côté d’une interaction avec le sexe des animaux. L’effectif sera donc de 8 x 4 groupes, soit 32 animaux. En cas de problème musculaire à la dose testée, une demi-dose sera testée dans les mêmes conditions (8 x 4 groupes, soit 32 animaux). Nous testerons ensuite le médicament chez des souriceaux, avec les mêmes effectifs de 8 x 4 animaux. Afin d’obtenir les 16 animaux mutants et 16 animaux sains nécessaires ici, nous réaliserons des croisements qui feront naitre environ 32 animaux supplémentaires (porteurs sains de la mutation), soit 64 souriceaux au total. Les distributions n’étant jamais exactes, il est possible que nous ayons besoin de faire naître jusqu’à 80 souriceaux pour constituer ces groupes. Enfin, nous poursuivrons l’étude des anomalies musculaires liées à cette maladie sur un maximum de 12 mâles et 12 femelles mutants et leurs frères et sœurs sains correspondants, uniquement sur des prélèvements post-mortem. Ce projet utilisera donc au maximum un total de 168 animaux.

Raffinement

Le risque associé au médicament testé correspond à une atteinte musculaire donc nous assurerons une surveillance rapprochée des animaux pour détecter au plus vite l’apparition d’une douleur à la marche. Le cas échéant, une injection d’analgésique permettra de soulager l’animal. En cas de persistance de la douleur, l’animal concerné sera rapidement mis à mort et les prélèvements réalisés seront utilisés dans les conclusions du projet. Les adultes recevront la molécule dans l’eau de boisson, aussi nous surveillerons très attentivement au cours de la première semaine que les animaux s’hydratent bien, sans quoi nous leur proposerons de l’eau gélifiée le temps de la transition. Pour les souriceaux, la molécule sera administrée une fois par jour, si possible par prise spontanée d’un mélange à base de lait concentré sucré. Un gavage ne sera réalisé qu’en cas d’échec de la prise spontanée. Dès l’obtention de l’identité des souriceaux, seuls les souriceaux mutants et sains continueront à être traités (nous cesserons de traiter les porteurs sains de la mutation). Cette approche épargnera un traitement inutile plus longtemps à ces animaux. Par ailleurs, l’ensemble des animaux sera manipulé avec douceur pour leur bien-être et éviter toute lésion musculaire. Les prélèvements de sang seront réalisés avec une analgésie et une anesthésie de la manière la moins invasive possible pour préserver là encore les muscles de toute lésion et assurer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Les souris mutantes et leurs frères et sœurs de portée seront utilisés ici car elles représentent un très bon modèle de la myopathie que nous étudions, dont la reproduction rapide, la petite taille et la durée de vie courte sont compatibles avec des études robustes. Les données issues de cette étude seront donc très pertinentes pour les médecins soignant les enfants atteints de cette maladie. Nous utiliserons de jeunes souris, autour de 2 mois, afin de pouvoir tester la sécurité du traitement à un stade mature du muscle et dans des conditions facilitées d’administration dans l’eau de boisson. En cas de succès, nous vérifierons la sécurité du traitement au cours du développement musculaire chez des souriceaux . Ces études seront complémentaires pour orienter ensuite vers la meilleure phase de traitement pour cette myopathie. Enfin, nous étudierons des adultes entre 2 et 8 mois, en phase de maturité musculaire et avant l’entrée dans le vieillissement.

Les souriceaux chez qui apparaît un phénotype jugé dommageable sont mis à mort aussitôt, et la lignée entière peut l'être. 594 souris vont être utilisées, 522 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 72 d'un niveau léger, pour tester une injection d'ARN messager dans l'ovaire censée restaurer la fertilité. Les mâles subissent une vasectomie de trente minutes puis sont utilisés pendant un an pour rendre des femelles pseudo-gestantes, les femelles reçoivent deux injections hormonales puis une chirurgie de vingt minutes pour la réimplantation d'embryons, ou une chirurgie de trente minutes pour l'injection intra-ovarienne. Le porteur affirme que "l'infertilité en elle-même n'entraîne pas d'effet indésirable pour les animaux", alors que les femelles sont tuées pour la récupération de leurs ovocytes et que les ovaires sont prélevés pour vérifier la restauration. Une partie des souris pseudo-gestantes est gardée en vie pour l'allaitement ou pour des tests menés par d'autres utilisateurs.

Objectifs

La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.

Bénéfices attendus

Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.

Procédures

Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).

Devenir

La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.

Remplacement

L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.

Raffinement

Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique

Choix des espèces

Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.

2 020 souris vont être utilisées, toutes tuées pour analyser les cellules immunitaires qui infiltrent leur cerveau, dont 300 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de lymphocytes T dans une veine sous anesthésie, jusqu'à neuf injections dans l'abdomen sur trois semaines sans anesthésie, et un traitement oral quotidien pendant trois semaines. Le modèle détruit une partie des neurones à orexine de l'hypothalamus, ce qui provoque de légers troubles du sommeil que le porteur dit sans autre conséquence sur le comportement. Il présente cette faible sévérité comme un argument de raffinement, et retient la souris pour ses "faibles coûts", ses cycles de reproduction courts et sa facilité de manipulation.

Objectifs

La narcolepsie de type 1 est un trouble du sommeil handicapant caractérisé par une somnolence diurne, des épisodes de perte brutale totale ou partielle du tonus musculaire allant de quelques secondes à quelques minutes ainsi que des paralysies du sommeil. Cette maladie a un fort impact sur la vie quotidienne des patients. La narcolepsie est causée par la perte sélective d’une population de neurones situés dans l’hypothalamus, produisant un neurotransmetteur appelé orexine. Si les mécanismes menant à cette destruction ne sont pas connus, des éléments pointent vers une origine auto-immune. Le projet vise à mieux comprendre la biologie d’une population de lymphocytes T, appelée lymphocytes T résidents mémoires, impliquée dans des maladies inflammatoires chroniques, notamment dans le système nerveux central. Pour cela, nous utiliserons un modèle murin de narcolepsie afin de mimer la pathologie humaine et ainsi de comprendre les mécanismes moléculaires permettant le maintien de ces lymphocytes T au sein du système nerveux central, ce qui permettra d’interférer avec ceux-ci dans un but thérapeutique. Les implications, y compris cliniques, de ces travaux sont réelles.

Bénéfices attendus

L’utilisation d’une double approche basée sur (i) des molécules candidates suggérée par nos travaux antérieurs et (ii) une approche plus large sur des bases de la littérature scientifique permettra d’identifier plusieurs molécules favorisant la pathogénicité des lymphocytes T résidents mémoires dans le système nerveux central. Ceci conduira à tester les molécules les plus prometteuse dans notre modèle murin de narcolepsie. Les avancées dans la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à l’accumulation des lymphocytes T résidents mémoires dans le système nerveux central, et par ce biais le caractère chronique de la pathologie, auront des implications à la fois physiopathologiques et thérapeutiques. De façon remarquable, une densité accrue de lymphocytes T résidents mémoires a été tout récemment détectée chez les patients atteints de narcolepsie soulignant la pertinence clinique de nos travaux sur ce modèle animal.

Procédures

Une injection unique de lymphocytes T par voie intraveineuse sous anesthésie. Maximum de 9 injections par voie intra-péritonéale réparties sur 3 semaines avec un maximum de 3 injections par semaine sans anesthésie. Traitement quotidien par voie orale pendant 3 semaines sans anesthésie.

Impact sur les animaux

Dans le cadre de notre modèle murin de narcolepsie, peu de nuisances sont attendues sur les animaux : une légère perte de poids (transitoire) peut subvenir dans les 2-3 jours suivant l’injection cellules immunitaires ainsi qu’une légère douleur liée à l’injection. Pour les gestes réalisés sur animal vigile, un leger inconfort, du stress et des douleurs légères sont à prévoir selon le type de manipulation. Chez ces animaux, la perte partielle des neurones orexinergiques peut entrainer de légers troubles du sommeil, sans autre manifestation neurologique ni conséquence sur le comportement des animaux.

Devenir

L’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des procédures afin d’analyser les cellules immunitaires infiltrant le cerveau dans notre modèle de narcolepsie murine.

Remplacement

Le système nerveux central est un organe particulièrement complexe qu'aucun modèle in vitro ne peut reproduire à ce jour, nécessitant donc l'utilisation de modèles animaux pour ce projet. La capacité des cellules immunitaire à atteindre le système nerveux central, leur interaction avec l'environnement et l'ensemble des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant à la mise en place et au maintien de la narcolepsie chez l'humain nécessitent l'utilisation de modèles animaux. Le modèle de narcolepsie que nous avons développé chez la souris permet d'étudier les cellules d'intérêt (lymphocytes T résidents mémoires) tout en limitant 1) la sévérité de la pathologie chez l'animal (très peu de signes cliniques) et 2) le temps d'expérimentation (30 jours maximum), permettant ainsi de limiter la souffrance animale.

Réduction

La reproductibilité du modèle de narcolepsie que nous avons développé chez la souris nous permet de limiter le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation. De plus, nous ne nous intéresserons qu’aux seules molécules ayant un effet marqué sur la présence des lymphocytes T pathogéniques dans le système nerveux central, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour démontrer un effet statistiquement significatif. Nos expériences seront répétées 2 à 3 fois afin de s’assurer de leur reproductibilité et de la robustesse des résultats obtenus. Le nombre d’animaux nécessaires a été calculé sur la base de nos expériences précédentes étant donné que ce modèle est désormais bien caractérisé.

Raffinement

Dans notre modèle murin de narcolepsie, l'inflammation du système nerveux central reste localisée dans une zone précise du cerveau (hypothalamus), n'entrainant donc ni inflammation cérébrale massive, ni douleur, ni déficit moteur ou sensitif (à l’instar de ce qui est observé dans la narcolepsie chez l’humain), permettant ainsi de minimiser la souffrance animale. Des objets d’enrichissement, incluant du coton, de l’essuie-tout et des rouleaux en carton, seront mis à disposition afin de réduire le stress des souris. De plus, la présence permanente d’une maisonnette dans la cage offre un abri aux animaux tout en permettant leur observation par l’utilisateur. Les points d’arrêt et critères d’arrêt anticipé de la procédure ont été prédéfinis pour faire face à tout résultat imprévu ayant des conséquences sur le bien-être des souris expérimentales. Toutes les procédures invasives (injections intraveineuses ou autres) hormis les intra-péritonéales seront réalisées sous anesthésie. Les procédures d’euthanasie seront réalisées après anesthésie.

Choix des espèces

L’espèce animale utilisée dans ce projet (souris) offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant de multiples pathologies humaines comme en témoigne les nombreuses références bibliographiques. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, lignées génétiquement modifiées, ...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Pour l'étude des cellules du système immunitaire mature, nous avons besoin de souris adultes, donc âgées de plus de 6 semaines, mais pas plus de 16 semaines afin d'eviter des variations de la réponse du système immunitaire liées aux différences d'âge.

Les souris qui développent un phénotype dommageable pendant la création des lignées sont tuées immédiatement, et le porteur prévoit de supprimer la lignée entière le cas échéant. 594 souris vont être utilisées pour mettre au point une injection d'ARN messager dans l'ovaire, censée restaurer la fertilité de femmes dépourvues d'ovocytes, dont 522 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les femelles reçoivent deux injections hormonales, une chirurgie de vingt minutes pour recevoir des embryons ou de trente minutes pour l'injection intra-ovarienne, et des mâles sont vasectomisés en trente minutes d'opération. Une partie est tuée pour prélever ovocytes ou ovaires, quelques femelles restent en vie pour allaiter ou pour d'autres tests, et les animaux circulent entre deux établissements.

Objectifs

La totalité du projet est réalisé dans l'EU1. Certaines procédures expérimentales seront réalisées également dans l'EU2 ; ainsi, une partie des animaux générés dans l'EU1 est transférée dans l'EU2. Le nombre total d’animaux reste identique et aucun animal n’est dupliqué. Les protocoles expérimentaux sont identiques dans les deux sites et le transfert est réalisé conformément aux normes de bien-être animal et aux exigences réglementaires. L’infertilité est un problème de santé majeur qui concerne un couple sur sept. Dans environ 50 % des cas, la femme est impliquée dans l'infertilité du couple. L’une des causes de cette stérilité est une déficience au niveau des gamètes de cause génétique. A l’heure actuelle, des solutions sont apportées aux couples souffrant d’infertilité grâce au développement des techniques de Procréation Médicalement Assistée (PMA). Néanmoins, ces approches ne s’appliquent pas aux patients n’ayant pas d’ovocytes. L’objectif de notre étude est donc de générer des animaux déficients pour ces gènes en reproduisant les mutations identifiées afin de développer de nouvelles approches pour ces femmes infertiles qui ne peuvent pas être traités par la PMA. Il s’agit de réintroduire dans les cellules germinales, le message génétique capable de produire la protéine manquante. Il ne s’agit pas de thérapie génique, car il n’y a pas d’intégration dans le génome des cellules germinales, ce dernier ne sera donc pas modifié. Le traitement, sera injecté au niveau des ovaires. Le message génétique ainsi introduit permettra ensuite aux cellules de produire la protéine manquante et de restaurer la fertilité. Il s’agit d’un projet multi-sites impliquant 2 établissements.

Bénéfices attendus

Ce projet pré-clinique pourrait conduire à la mise au point d’une technique innovante de prise en charge de femme génétiquement infertiles avec une thérapie ciblée.

Procédures

Pour les mâles vasectomisés (utilisé dans l'UE1): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour la génération embryons 2-cells (réalisée dans l'UE1 et l'UE 2) : Injection pour les stimulations hormonales (5-10 secondes par injection), 2 injections par souris femelles à 48 h d'intervalle. Pour la réimplantation d’embryons dans femelles pseudogestantes (réalisé dans l'UE1): Chirurgie de 20 minutes par souris pour la réimplantation embryonnaire dans les femelles pseudo-gestantes, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour le phénotypage (réalisé dans l'UE1) : Risque éventuelle de phénotype dommageable durant la création de lignée, mise à mort directement si c’est le cas. Pour l'Injection intra-ovaire ARNm (réalisé dans l'UE1 et l’UE2): 30 minutes de chirurgie par souris, 1 seule chirurgie sous anesthésie générale. Pour l'idnetification et le genotypage:L'intervention est une contention de l'animal (5sec) 1 seule fois pour l'identification et un prélèvement de tissu d'une biopsie d'oreille avec du matériel stérile et adapté (5sec) 1 seule fois. L'anesthésie par inhalation d'isoflurane est utilisée lors du tatouage et la biopsie d'oreille pour les animaux âgés de plus de 14 jours ainsi que les rats nouveaux nés.

Impact sur les animaux

Les différentes manipulations réalisées sur les animaux peuvent entraîner des effets indésirables généralement légers et de courte durée. La manipulation des animaux, notamment lors de leur prise en main pour l’anesthésie, peut provoquer un stress passager. Celui-ci peut se traduire par une agitation brève ou une augmentation temporaire du rythme cardiaque et respiratoire, mais ces effets disparaissent rapidement. Les injections hormonales chez les femelles peuvent également entraîner un léger stress. Les interventions chirurgicales peuvent occasionner une perte de poids temporaire ainsi qu’une diminution de la mobilité pendant quelques jours. Une inflammation au niveau de la zone opérée peut également apparaître, mais cela reste peu fréquent et fait l’objet d’une surveillance adaptée. Chez les mâles vasectomisés et les femelles ayant subi une intervention, une perte de poids peut être observée, généralement transitoire. Lors de la création de nouvelles lignées génétiques, il existe un faible risque d’apparition de modifications affectant l’état général des animaux. Celles-ci peuvent se traduire, par exemple, par une perte de poids, une diminution de la mobilité ou des troubles du développement. Ces situations restent rares. Car l'’infertilité en elle-même n’entraîne pas d’effet indésirable pour les animaux. L’ensemble de ces effets fait l’objet d’une surveillance attentive afin de limiter au maximum l’inconfort et d’assurer le bien-être des animaux.Lors de l’identification, la contention peut engendrer un stress ainsi que de légères douleurs au moment du tatouage et du prélèvement de tissu (biopsie d’oreille).

Devenir

La récupération des gamètes pour l'injection intra-cytoplasmiques de sperme nécessite la mise à mort des femelles. Après vasectomisation, les males sont utilisés pendant plusieurs mois. Suite à l'implantation embryonnaire, les souris pseudo-gestantes donnent naissance aux petits avant d'etre mises à mort ou gardés en vie pour allaitement ou test par les utilisateurs. Si des animaux présentent un phénotype dommageable, nous déciderons d’euthanasier la lignée. Pour les chirurgies intra-ovaire, les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, le sovaires seront prélevés pour réaliser des coupes histologiques. Ce qui nous permettra de vérifier la qualité de la restauration de l’infertilité.

Remplacement

L’étude des mécanismes de l’ovogenèse, ainsi que de l’infertilité nécessite l’utilisation des animaux car ces processus ne sont pas reproductibles in vitro. En effet, il n’existe pas de système de culture cellulaire permettant d’obtenir des gamètes viables et matures qui sont essentiels à la fécondation. L’étude des phénotypes d’infertilité humaine requiert donc des animaux présentant les mêmes défauts que ceux observés chez les patients. Par ailleurs, aucun modèle alternatif à celui du modèle murin ne permet encore de reproduire en globalité la complexité de la gamétogenèse et l’impact sur la fertilité. En conclusion, nous ne pouvons pas remplacer l’animal vivant par un modèle cellulaire ou de simulation informatique.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux sera utilisé dans chaque procédure tout en garantissant une étude statistique correcte. Les ovocytes pourront être utilisés pour différentes expériences permettant de réduire le nombre d'animaux utilisés. Chaque ovaire de souris sera injecté afin de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’ovaire gauche sera injecté avec une solution saline (control) et l’ovaire droit sera injecté avec nos traitements. Les gamètes femelles utilisées pour l'injection intra-cytoplasmique de spermatozoide sont récupérées suite à la stimulation hormonale des souris, ce qui permet de récupérer un grand nombre d'ovocytes, et donc de réduire le nombre de souris femelles. Les males vasectomisés seront utilisés pour générer des femelles peudo-gestantes pendant 1 an. A partir des données que nous disposons au laboratoire concernant des analyses sur des souris mâles pour ce type d’injection et non femelles, la taille d’effet, avec un écart type convenable minimal varie entre 3 à 6 souris.

Raffinement

Les interventions chirurgicales sont réalisées sous anesthésie afin que les animaux ne ressentent pas de douleur. Des médicaments contre la douleur sont également administrés. Pendant l’opération, les animaux sont maintenus au chaud, et leurs yeux sont protégés pour éviter le dessèchement. Après l’intervention, ils sont surveillés régulièrement jusqu’à leur réveil complet. Dans les jours qui suivent, les animaux sont observés quotidiennement afin de vérifier leur état de santé. Une alimentation adaptée, plus facile à consommer, est mise à leur disposition. Si des signes d’inflammation ou d’infection apparaissent, un traitement approprié est administré. Des critères précis sont définis pour évaluer l’état des animaux. Si leur état de santé se dégrade au-delà de ces limites, ils sont retirés de l’étude et euthanasiés afin d’éviter toute souffrance inutile. Certaines mesures sont mises en place pour limiter le stress et prévenir les blessures. Par exemple, les mâles vasectomisés sont hébergés individuellement, avec des aménagements et de la compagnie pour améliorer leur bien-être. Les procédures de mise à mort sont réalisées dans un environnement séparé afin de ne pas perturber les autres animaux. Le projet se déroule sur deux établissements. Le transport des animaux est réalisé par du personnel formé, dans des conditions adaptées (conteneurs sécurisés, litière, ventilation), afin de limiter le stress. La durée de transport est réduite au minimum. À leur arrivée, les animaux disposent d’une période de repos d’au moins 48 heures avant toute manipulation, avec une surveillance régulière.Lors de l’identification, nous veillerons à réaliser le tatouage d'identification et la biopsie de génotypage de manière rapide et précise. Ces gestes seront réalisés par du personnel dûment formé, ayant suivi un tutorat spécifique à cette procédure technique

Choix des espèces

Grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation, entre l’homme et la souris, de la majorité des gènes impliqués dans la gamétogenèse et la fécondation, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les causes génétiques de l’infertilité. L'utilisation du modèle de souris est incontournable car il n'existe à l'heure actuelle aucune technique permettant la production de spermatozoïdes ou d’ovocytes in vitro. Trois modèles de souris transgéniques seront utilisés pour les besoins de cette étude. Toutes les lignées de souris utilisées constituent des modèles d’inactivation génique ou de transgenèse additive qui ne concerneront que des gènes impliqués dans la fonction de reproduction. Les femelles pseudo-gestantes devront avoir eu une portée avant utilisation, donc entre 5 et 12 semaines. Les souris males seront vasectomisés à maturité sexuelle vers 9-10 semaines. Les souris femelles pour les chirurgies seront âgées au minimum de 6 semaines pour avoir une ovogenèse fonctionnelle et être matures sexuellement.