Souris

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Infectées de façon répétée par une génotoxine bactérienne, elles subissent des injections, des imageries et des prélèvements de sang étalés sur six à dix-huit mois, pour tenter de démontrer que cette toxine cause un cancer du foie. Le porteur mentionne une perte de poids liée à l'inflammation hépatique et une fatigue liée aux prélèvements répétés. Il justifie l'euthanasie par le prélèvement des organes et affirme qu'il n'existe pas de méthode alternative pour reproduire ce processus.

Objectifs

Nous sommes fréquemment infectés par des bactéries qui produisent des toxines qui endommagent l’ADN de nos cellules et seraient à l’origine de cancers digestifs. Parmi ces toxines, la génotoxine CDT est répandue chez de nombreuses bactéries. L’objectif est de démontrer que cette génotoxine induit le cancer.

Bénéfices attendus

Cette étude devrait permettre de démontrer le rôle direct et causal de la génotoxine dans la transformation maligne, démontrant que l'infection chronique et/ou répétée par des bactéries productrices de cette génotoxine cause le cancer.

Procédures

L'ensemble des gestes sera réalisé sur animaux anesthésiés. Injection dans la circulation sanguine (inférieur à 3 minutes) : une seule fois pour 100 animaux, tous les 2 mois environ pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Imagerie nécessitant une injection dans le péritoine (inférieur à 10 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux). Prélèvement sanguin (inférieur à 3 minutes) : 2 fois par semaine pendant 2 semaines (40 animaux), 1 fois par semaine pendant 1 mois (20 animaux), 2 mois (20 animaux) ou 4 mois (20 animaux), 2 fois par mois pendant 6 mois (40 animaux), 12 mois (60 animaux) ou 18 mois (60 animaux).

Impact sur les animaux

Possible perte de poids liée au développement d’une inflammation au niveau du foie et voir d’une carcinogénèse. Fatigue liée aux prélèvements sanguins répétés, dans ce cas les prélèvements seront davantage espacés.

Devenir

Nous souhaitons faire des analyses sur les prélèvements issus des animaux. Pour cela les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour que leurs organes soient prélevés.

Remplacement

Nous souhaitons voir les effets d’une infection longue et répétée de bactéries productrices de la génotoxine CDT. Notre hypothèse est que la CDT induit le développement de cancer hépatique. L’étude chez la souris est indispensable pour permettre de voir le développement éventuel d’un cancer au niveau hépatique après des mois d’infection constante à la CDT. Il n'existe pas de méthodes alternatives pour mimer ce processus.

Réduction

L'imagerie de bioluminescence nous permet de faire un suivi longitudinal sur un même animal. Nous sommes également capables de réaliser des bilans hépatiques à partir de petits volumes de sang au cours du temps, sur un même animal. Ces 2 procédés nous permettent de réduire le nombre d'animaux. Des analyses seront aussi effectuées sur les tissus récoltés.

Raffinement

Les souris sont hébergées en groupes sociaux avec un enrichissement du milieu (nids de woodwoll). Une mise en place de points limites évalués par une grille de scoring spécifique a été mise en place pour le suivi des souris. Les souris seront pesées 2 fois par semaine, en cas de perte de poids nous mettrons de la nourriture humidifiée dans la litière et les souris seront pesées quotidiennement durant les prochaines 48H. Si la perte de poids persiste les souris seront euthanasiées. Afin de pallier à une éventuelle déshydratation liée aux prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera administré à l’animal après chaque prélèvement.

Choix des espèces

De par notre expérience l’inflammation hépatique provoquée par une infection bactérienne se fait très bien chez la souris. Le modèle souris est également un modèle de choix vis-à-vis de la technique de suivi en imagerie que nous avons mis en place. Nous travaillerons avec des jeunes adultes car nous souhaitons garder les animaux jusqu’à 18 mois suivant les lots. Le cancer touchant les 2 sexes, nous travaillerons avec des mâles ou des femelles.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer un cancer de la prostate, elles subissent une castration chirurgicale et des injections intrapéritonéales répétées d'anticorps, pour étudier la résistance des tumeurs à l'hormonothérapie. Le porteur décrit des douleurs postopératoires "mineures" et une perte de poids transitoire d'environ 10 % chez la majorité des animaux traités. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la complexité des lésions précancéreuses, ce qui rendrait le recours in vivo "nécessaire".

Objectifs

Afin de mieux comprendre la résistance aux androgènes dans le cancer de la prostate (CaP), ce projet vise à étudier les effets de la castration chirurgicale dans plusieurs modèles de souris de cancers prostatiques. En effet, le traitement du cancer de la prostate chez l'homme repose sur la prostatectomie et l'utilisation de de traitement qui bloquent la voie de signalisation des androgènes (hormonothérapie). Malheureusement, après un temps limité de sensibilité aux traitements, 20% des patients développent des résistances à ces traitements et les cancers "résistants à la castration" sont de très mauvais pronostic. Il est donc primordial de mieux comprendre la résistance à la castration, c'est à dire l'échappement des tumeurs à l'hormonothérapie. Les études récentes menées au laboratoire mettent en évidence l'implication forte du facteur de transcription HIF1a induit par l'hypoxie dans le développement de la résistance à la castration. Plus précisément, nous avons démontré que l'inactivation de Pten, un gène suppresseur de tumeur, spécifiquement dans les cellules épithéliales de prostate engendre le développement de tumeurs cancéreuses de prostate qui sont résistantes à la castration et que l'inactivation de HIF1a et Pten, dans les cellules épithéliales de prostate engendre des tumeurs cancéreuses de prostates qui sont sensibles à la castration. Nous voulons étudier le mécanisme moléculaire sous-jacent pour mieux comprendre par quel biais l'inactivation de HIF1a rend ces tumeurs sensibles à la castration. Nos données préliminaires soulignent l'importance jouée par le microenvironnement tumoral dans l'apparition de la résistance. L'objectif est donc de conduire une étude dans laquelle plusieurs manières de bloquer la production de lymphocytes T cytotoxiques seront testées afin de voir la réponse sur la croissance des tumeurs après castration.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si les élements du microenvironnement permettent de rendre les tumeurs de prostate sensibles à la castration dans le cancer de la prostate et par quels mécanismes. Si cela s'avère être le cas, cette étude pourra ouvrir de nouvelles pistes thérapeutiques pour le traitement du cancer de la prostate résistant à la castration qui confère actuellement aux patients un pronostic très sombre avec une durée de vie de moins de 15 mois.

Procédures

Les souris subiront 5 injections intra-péritonéales sur 5 jours, puis une intervention chirurgicale (castration/sham) 3 mois plus tard et les injections péritonéales 1 à 3 fois par semaine pendant 4 semaines.

Impact sur les animaux

Les effets secondaires post chirurgicaux sont principalement des douleurs mineures facilement prévenues par une antalgie post-opératoire systématique. Une infection post-opératoire peut survenir dans de très rares cas. Les anticorps monoclonaux ont été déjà administrés dans de nombreuses études chez la souris et sont administrés en routine par un laboratoire collaborateur sans observation d'effets secondaires. L'administration de ces traitements peut engendrer une perte de poids transitoire d'environ 10% chez 60% des souris traitées dans les 48h suivant l'administration, les souris reprennent habituellement leur poids de départ dans la semaine qui suit l'injection. La croissance des tumeurs de prostate est lente et donc les variations de poids liée à leur croissance ou régression sur 2 semaines est négligeable.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de collecter les organes et de les analyser.

Remplacement

Aucun modèle cellulaire récapitule la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la formation de lésions précancéreuses. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre ce phénomène et identifier d'éventuelles cibles thérapeutiques.

Réduction

Afin de différencier les rôles de différentes molécules pouvant être impliquées dans le développement du cancer de la prostate, l’ensemble du projet va nécessiter l'utilisation de 2 lignées de souris différentes. Afin d'obtenir des résultats signicatifs, de comprendre les mécanismes moléculaires impliqués et en raison de l'hétérogénéité des souris, nous avons réduit au maximum le nombre de souris nécessaires et nous étudierons à la fois les tissus (histologie), les gènes exprimés et les différents sous types de cellules qui composent les tumeurs. Nous comparerons systématiquement les souris mutants versus les contrôles et au sein d'un génotype donné nous comparerons les souris ayant eu une orchiectomie versus pas d'orchiectomie et les groupes traitées avec le composé actif versus traités avec le véhicule. Nous comparons des paramètres quantitatif (expression de gènes, nombre de cellules positives pour certains marqueurs histologiques, taux de prolifération cellulaires, poids des tumeurs, pourcentage de glandes atteinte des tumeurs) et également qualitatifs (expression ou non d'un marqueur au niveau histologique).

Raffinement

Les souris subiront une anesthésie générale et recevront des médicaments antalgiques afin de prévenir l'apparition de douleurs. Elles seront surveillées de manière très rapprochée durant les jours qui suivront la chirurgie. Une attention particulière sera accordée au niveau de la zone d'incision avec surveillance des points de suture, palpation abdominale et inspection à la recherche de signe d'infection locale. Si un point limite est atteint, l'animal sera mis à mort. Pour le bien-être social des animaux, les groupes seront respectés et les animaux seront remis en cage avec leurs partenaires préalables. Aucun animal ne sera laissé isolé dans sa cage.

Choix des espèces

La souris est un animal qui a un système immunitaire largement décrit dans la littérature et qui est proche de l’humain avec une immunité innée et adaptative, ce qui est crucial pour la mise en œuvre de notre projet d’étude sur l’interaction des cellules épithéliales de la prostate avec le microenvironnement tumoral. De plus, les souris qui seront utilisées expriment les mêmes protéines que l’homme, ce qui permet de générer les mutations les plus fréquemment identifiées dans le cancer de la prostate humain. L’ensemble de ces résultats nous permettra d’étudier au plus près l’évolution des lésions de cancer de la prostate afin de développer des stratégies personnalisées de prévention, de surveillance active et/ou de traitement précoce. Les animaux utilisés seront adultes, de 8 semaines, à 6 mois.

228 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pour étudier la prévention de la douleur en cancérologie, elles reçoivent des injections de capsaïcine dans la patte et d'adjuvant inflammatoire, portent des tumeurs et subissent une exérèse chirurgicale et des prélèvements de sang. Le porteur reconnaît que la capsaïcine présente un "risque de douleur" et une sensation de chaleur, et que l'adjuvant provoque une inflammation. Il affirme que la douleur et l'inflammation, "non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier", rendent "indispensable" le recours à l'animal.

Objectifs

i) Démontrer que les découpleurs mitochondriaux (aux propriétés anti-tumorales) possèdent les mêmes propriétés analgésiques et anti-inflammatoires que les anesthésiques locaux ii) Démontrer que la prévention de la douleur, de l'inflammation et du stress glucocorticoïde diminue l'oncogénèse et les récidives

Bénéfices attendus

Nous espérons démontrer que la prévention de la douleur et de l'inflammation (et aussi du contrôle du stress glucocorticoïde) puisse freiner l'évolution tumorale. De tels résultats motiveraient les équipes cliniques à contrôler drastiquement la douleur aiguë et chronique des patients d'oncologie.

Procédures

Iinjection intraplantaire (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute), sur d'autres animaux: injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute); sur d'autres animaux: injection intraveineuse (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute); sur d'autres animaux: injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute), 1 injection intraplantaire tous les 2 jours pendant 7 jours sous anesthésie générale (durée 1 minute), 3 prélèvements sanguins sous anesthésie générale (durée 2 minutes); sur d'autres animaux: injection sous-cutanée (1 fois) sous anesthésie générale (durée 1 minute), 1 injection intraplantaire tous les 2 jours pendant 7 jours (durée 1 minute) et 3 prélèvements sanguins sous anesthésie générale (durée 2 minutes); sur d'autres animaux: 1 injection intra-mammaire sous anesthésie générale (durée 2 minutes), 3 prélèvements sanguins sous anesthésie générale (durée 2 minutes) et 1 exérèse chirurgicale de tumeur sous anesthésie générale (durée 5 minutes).

Impact sur les animaux

Génération de tumeurs (gêne physique) -injection intraplantaire de capsaicin (risque de douleur à l'injection et de sensation de chaleur) et d'adjuvant (inflammation)-injections sous-cutanée, intraveineuse et intra-mammaire (risque de douleur mais réalisée sous anesthésie générale) -prélèvement sanguin (risque de douleur aux prélèvements mais réalisés sous anesthésie générale).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour analyses sur tissus et organes post-mortem.

Remplacement

La douleur et l'inflammation impliquent des processus multiparamétriques impliquant des sécrétions humorales et des répercussions immunitaires non modélisables ailleurs que dans un être vivant entier. Nous ne pouvons les étudier in vitro, il est indispensable d'avoir recours à l'animal de laboratoire. Notre hypothèse est que la prévention de la douleur et de l'inflammation puisse freiner l'évolution tumorale et les récidives grâce à un contrôle du stress glucocorticoïde. L'utilisation d'animaux vivants est indispensable pour étudier cette hypothèse sur la réponse anti-tumorale. La mise en évidence de cette hypothèse et sa compréhension ouvrirait la possibilité de freiner l'évolution tumorale en clinique en contrôlant ddrastiquement toute douleur aiguë et chronique chez les patients.

Réduction

Pour la réalisation de ce projet, nous avons calculé les tailles des groupes selon les procédures pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés. Nous chercherons à regrouper les expériences dans le but de réduire le nombre d'animaux contrôles. Au vu du faible effectif, les données seront analysées par des tests non-paramétriques.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début des expériences puis suivis quotidiennement. Le poids des souris sera mesuré avant le début des traitements, au moins une fois par semaine et avant euthanasie lors de l'expérience de croissance tumorale. Concernant l'enrichissement du milieu, les animaux disposeront de nids (sizzlenests), de tunnels en carton. Le stress des animaux sera évalué quotidiennement par des échelles d'hétéroévaluation. Des mesures seront prises pour limiter le stress: plusieurs souris par cage pour un hébergement social, animaux hébergés au calme. Les interventions chirurgicales seront faites sous anesthésie générale. En cas de besoin, des antalgiques à base de crème d'anesthésiques locaux ou d'anitinflammatoires seront appliqués. En cas de douleur après les exérèses chirurgicales, les souris recevront un analgésique et un anesthésique local si nécessaire. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués.

Choix des espèces

Nous souhaitons prouver que la prévention de la douleur et de l'inflammation diminue l'évolution tumorale et les récidives chez l'homme qui est un mammifère. Avant de passer à des études cliniques, il est absolument nécessaire de réaliser des études pré-cliniques sur le modèle mammifère afin de tester notre hypothèse. Le modèle souris permet de travailler sur un modèle de mammifère suffisamment petit pour en avoir un certain nombre, facile à manipuler, et suffisamment grand pour pouvoir avoir des injections de cellules tumorales. Souris adultes de 6-8 semaines. Les tumeurs murines générées sont des tumeurs survenant chez l'adulte, nous ne réaliserons donc pas le projet sur des souriceaux.

24 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe sous-cutanée d'organoïdes cérébraux humains, puis une ouverture de la cage thoracique et une exsanguination sous anesthésie, avant le prélèvement des greffons. Le porteur avance que valider ces organoïdes vascularisés pourrait à terme "réduire fortement l'utilisation d'animaux" pour l'étude des tumeurs cérébrales, un bénéfice conditionné à la réussite du modèle. Il affirme qu'aucune méthode alternative n'existe pour vérifier la vascularisation, faute de circulation sanguine hors d'un animal vivant.

Objectifs

Les organoïdes cérébraux sont composés de différents types de cellules (neurones et cellules gliales) d’origine humaine constituant le cerveau. Nous développons une nouvelle génération d’organoïdes cérébraux qui sont pourvus également de vaisseaux sanguins, car la vascularisation joue un rôle essentiel dans la physiopathologie du cerveau. En particulier, dans le contexte de tumeurs cérébrales, la vascularisation favorise la survie et la croissance tumorale. Ce projet a pour but de valider que la vascularisation de ces nouveaux organoïdes est fonctionnelle. Cette validation sera obtenue par transplantation des organoïdes à des animaux. Ce nouveau modèle permettra d’étudier les mécanismes de la croissance des tumeurs cérébrales et de développer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de vérifier que notre modèle d’organoïde comporte une vascularisation fonctionnelle. La présence de vascularisation est importante dans le cadre des études des tumeurs cérébrales car elle joue un rôle important dans le développement tumoral. Si la vascularisation des organoïdes est fonctionnelle, de nombreuses expériences sur les cancers cérébraux et, en particulier, les tests des médicaments anticancéreux ne nécessiteront plus l’utilisation d’animaux. Ce modèle réduira donc fortement l’utilisation d’animaux ; en particulier dans le cadre des études sur les tumeurs cérébrales comme le glioblastome.

Procédures

L’opération de greffe sous-cutanée des organoïdes cérébraux comporte 4 étapes (injection d’un antalgique, une anesthésie gazeuse, une incision cutanée et un point de suture) pour une durée totale de moins de 15 min/souris. Un mois après la greffe, un produit fluorescent sera administré sous anesthésie afin de colorer les vaisseaux sanguins. Cette opération comporte 5 étapes (injection d’un antalgique, injection d’anesthésique, ouverture de la cage thoracique, perfusion de la solution fluorescente et exsanguination) cette opération est suivie de la mort de l’animal. L’opération dure 15-20 min (sans compter la période de 30 min après l’injection d’antalgique);

Impact sur les animaux

Les opérations de greffe sous-cutanées ne sont pas très invasives et devraient n’entraîner que des perturbations physiologiques et cliniques mineures. Néanmoins, un stress opératoire et une douleur post-opératoire sont attendus mais cette dernière sera limitée par une pharmacologie adaptée. L’anesthésie pourrait entraîner une détresse respiratoire voire un arrêt cardio-respiratoire et ceux-ci seront surveillés.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour prélever les organoïdes afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

Aucune méthode alternative n’existe pour vérifier que la vascularisation des organoïdes est effective. Les expériences de transplantation permettront à la vascularisation de l’organoïde de se « connecter » à la vascularisation de l’hôte grâce à une néo-vascularisation. En revanche, cette dernière ne peut être obtenue que si l’animal est vivant et permettre une circulation sanguine dans l’organoïde.

Réduction

La procédure sera réalisée sur un total de 6 lots d’animaux afin d’analyser des organoïdes d’âges différents obtenus avec deux lignées de cellules souches pluripotentes. Les analyses histologiques révèlent que la grande majorité des organoïdes que nous avons obtenus à ce jour présentent des structures ressemblant à des vaisseaux dès un mois. Ainsi, nous testerons deux groupes d’âge : organoïdes jeunes (1 mois) et organoïdes âgés (4-6 mois) pour les 2 lignées dont nous disposons. Par ailleurs, nous avons estimé qu’un nombre de quatre animaux par lot d’organoïdes serait suffisant pour appréhender la variabilité expérimentale. Ainsi, un maximum de vingt-quatre souris devra être utilisé pour ce projet (6 lots x 2 ages x 2 lignées). Les expériences seront réalisées de façon séquentielle afin d’arrêter le protocole si cela est suggéré par les premiers résultats.

Raffinement

Un protocole d’anesthésie/analgésie sera mis en place pour les greffes d’organoïdes. Par la suite, une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier l’état clinique des animaux et les critères d’arrêt de souffrance sont prédéfinis.

Choix des espèces

De nombreuses études ont montré la néovascularisation de greffons ou d’organoïdes humains lorsqu’ils sont greffés chez la souris adulte. Les xénogreffes seront réalisées chez des souris adultes âgées de 2 mois. La formation de nouveaux vaisseaux sanguins, ou néovascularisation, est toujours observée chez la souris adulte.

10432 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une partie gardée en vie comme modèles d'étude, les autres tués après l'imagerie pour prélever le cerveau. Ils subissent une à deux chirurgies stéréotaxiques, une anesthésie terminale pouvant durer six heures pour l'imagerie et des microdialyses répétées, afin de développer des techniques de microscopie de l'espace extracellulaire cérébral. Le porteur ramène les atteintes à un "stress de l'anesthésie", des infections de sutures et des douleurs chirurgicales, pour l'un des plus gros effectifs du lot. Il indique que la caractérisation de cet espace "nécessite" des modèles animaux mimant la complexité des maladies humaines.

Objectifs

La recherche sur le cerveau a fait d'énormes progrès au cours des dernières décénnies dans presque tous les domaines à l'exception de l'exploration de l'espace extracellulaire (EEC). C'est pourtant un compartiment élémentaire qui permet la communication entre les cellules cérébrales, grâce aux nombreuses molécules qui y transitent. L'espace extracellulaire est un système de compartiments interconnectés et limités par des membranes cellulaires. Il est composé par le fluide interstitiel et un échanfaudage dynamique connu comme la matrice extracellulaire (MEC). Environ 20% du volume cérébral est occupé par l'espace extracellulaire qui sert de microenvironnement pour le cerveau et forme un canal de communication chimique intercellulaire (appelé transmission de volume). Cette trasmission en volume peut être modulée par les propriétés biophysique de l'EEC, en particulier les paramètres de diffusion. Il a été montré que la structure et la diffusion de l'eec sont hétérogènes et qu'elles dépendent de conditions internes et externes à l'organisme. De plus, l'EEC est un reservoir pour les ions impliqués dans l'activité électrique des neurones et joue un rôle clé dans la transmission de substances neuro-actives entre les cellules. Ainsi, l'EEC n'est pas seulement le siège de toutes sortes d'intercations cellules-cellule, mais peut également jouer un rôle important dans des fonctions neuronales cruciales, telles que la mémorisation ou la formation de circuits neuronaux. Déterminer comment les molécules se déplacent dans l'espace extracellulaire est un défi très important, non résolu, qui freine l'étude des mécanismes cérébraux pathologiques et thérapeutiques. Le manque de connaissances résulte de l'absence de technologies spécifiques, permettant l'étude résolutive in vivo du microenvironnement.

Bénéfices attendus

Nous proposons d’utiliser deux nouvelles approches de microscopie super résolutive développées dans nos laboratoires pour fournir une description détaillée de l’EEC et du réseau structurel de la MEC dans le tissu sain et pathologique : (i) technique de Shadow imaging (SUSHI) qui est une méthode de marquage où un fluorophore est injecté localement dans le cerveau afin de visualiser l’EEC avec une résolution nanométrique, (ii) technique d’imagerie de nano-objets uniques (suivi des nanotubes/nanoparticules de carbone). Ces approches permettront de composer, à une échelle nanométrique, une carte de l’espace extracellulaire et de sa matrice dans les régions d’intérêt. C’est pourquoi, nous proposons à travers cette étude qui regroupe quatre laboratoires phare en neurosciences à Bordeaux, de caractériser l’EEC via des technologies nouvelles et inédites de microscopie de super-résolution

Procédures

Chirurgie stéréotaxique (1h maximum), au maximum deux chirurgies stéréotaxiques pour les modèles pathologiques Anesthésie pendant la chirurgie (1h) et en terminal pour l'imagerie (jusqu'a 6 h), une fois par animal Imagerie (6h) une fois par animal Collecte d'échantillon par microdialyse sur animaux vigiles et non contraints, 4 fois espacées au minimum d'une semaine.

Impact sur les animaux

Ils sont représentés par l’utilisation de la chirurgie : stress de l'anesthésie, infection des points de suture, douleurs chirurgicales, déshydratation, perte de poids.

Devenir

Les animaux issus des procédures représentent la fabrication des modèles d'études seront gardés en vie. Les animaux issus de l'imagerie seront euthanasiés afin de récupérer les cerveaux pour une analyse histologique.

Remplacement

L'étude de l'espace extracellulaire a connu des avancées récentes, grâce au développement de techniques comme la microscopie en super résolution appliquée aux modèles ex vivo. Pour compléter les connaissances sur le sujet il est nécessaire d'obtenir des données sur l'animal sain et pathologique, à travers des modèles animaux réalisés chez le rongeur. Nous souhaitons caractériser l’espace extracellulaire sain et pathologique, nécessitant l’utilisation de modèles animaux pouvant mimer la complexité des maladies chez l’humain.

Réduction

Cette étude concerne un consortium composé de 4 laboratoires français qui à la fin de l’étude récupèreront des échantillons afin d’effectuer des études histologiques, complétant ainsi les études in vivo et ainsi la base de données scientifiques, limitant l’expérimentation animale à cette seule étude.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité.

Choix des espèces

L'utilisation de rongeur dans le développement d'outil de microscopie en super résolution est pertinente dans cette première phase de notre projet. En effet, la taille réduite de l'animal, son cycle de vie court et la disponibilté des modèles pathologiques permettent d'optimiser le développement d'outils pour l'imagerie in vivo de l'environnement extracellulaire. Souris : les animaux seront utilisés à l'âge de 2 mois et jusqu'a 4 mois, pour permettre de travailler avec des animaux sains et pathologiques adultes. Rats : les animaux seront utilisés au stades post nataux de P1 et jusqu'a P60 (2 mois) pour les animaux sains et pathologiques, qui correspond à un stade de jeune adulte, qui est la période où des troubles psychotiques peuvent apparaître

3840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules tumorales sous la peau, puis des vecteurs viraux AAV et des anticorps, avec des prélèvements de sang répétés, pour tester une stratégie censée stimuler une réponse immunitaire contre la tumeur. Le porteur reconnaît que les tumeurs peuvent former des métastases "causant de la souffrance animale" et une perte de poids importante. Il affirme que "seuls les modèles animaux" permettent de tester cette approche et envisage une production des vecteurs pour l'humain.

Objectifs

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succés des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénificiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. Alors que les mécanismes de résistance primaires et secondaires ont été identifiés au cours des dernières années, il est devenu évident que pour les tumeurs faiblement immunogènes et/ou avec un faible infiltrat immunitaire, de nouvelles stratégies ont besoin d'être développées afin de stimuler les réponses immunitaires anti-tumorales. Dans ce contexte, les vecteurs viraux ciblant les cellules tumorales et/ou immunitaires semble être un outil idéal. L'objectif du projet est de développer une approche basée sur l'utilisation de vecteurs viraux de type AAV afin de cibler spécifiquement les cellules tumorales et/ou les cellules suppressives du microenvironnement tumorale afin de stimuler les réponses immunitaires dirigées contre la tumeur. Ces AAV ont montré des résultats intéressants in vitro avec l'induction d'une mort cellulaire et d'une inflammation qui nous semble favorable à l'induction des réponses immunitaires in vivo. Nous pensons que l'injection intratumorale entrainera l'induction d'une réponse immunitaire, ce qui entrainera une diminution de la croissance tumorale, voire un rejet. Avec cette approche, nous introduisons une capacité lytique des cellules tumorales par les différents AAV, qui n'est normalement pas présente naturellement dans les AAV.

Bénéfices attendus

L'immunothérapie apparaît comme une nouvelle stratégie de traitement du cancer, comme en témoigne le succés des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires. Cependant, seuls certains patients bénificiant de ces thérapies en retirent un bénéfice et l'efficacité varie considérablement entre les différents cancers. De nouvelles thérapies innovantes ont donc besoin d'être mise en place. Pour ce faire, nous attendons que l'injection intra-tumorale des AAV codants pour les différentes morts cellulaires immunogéniques (pyroptose et nécroptose) induise un rejet de la croissance tumorale avec l'induction d'une réponse immunitaire permettant l'augmentation de la survie des animaux traités. De plus, l'utilisation de nos vecteurs codants pour les protéines inductrices de mort cellulaire immunogénique seule mais aussi en combinaison de différentes cytokines apporte des effets à long terme chez nos animaux avec la mise en place d'une réponse immunitaire de longue durée permettant le contrôle voire le rejet à long terme des différents modèles tumoraux. L'association avec des immunothérapies connues permettrait d'amplifier ces phénomènes et donc d'obtenir un meilleur contrôle de la croissance tumoral (médié par le système immunitaire). Les vecteurs AAV possèdent de nombreux avantages et ont déjà été approuvés en clinique en Europe et aux états-unis. Il est donc envisageable de produire ces vecteurs pour une utilisation chez l'homme si nos stratégies se montrent convaincantes.

Procédures

Injections de cellules tumorales : injection en sous-cutanée sur le flanc, sur animal anesthésié. Les souris seront injectées deux fois maximum pour les protocoles de vaccination et une seule injection pour les autres protocoles. Chaque injection dure moins de 10 secondes. Prélèvement de sang sur animal anesthésié. Les souris seront prélevées maximum 3 fois à une semaine d'intervalle entre les prélévements et en phase terminale. Les prélevements de sang durent moins de 10 secondes. Injections pour l'administration d'anticorps thérapeutiques : injection en intrapéritonéale (IP) sur animal vigile. Ces injections IP seront répétées 4 fois maximum avec un intervalle d'injection de 2 jours entre les administrations. Les injections durent moins der 10 secondes.

Impact sur les animaux

Il est possible que l'injection en sous-cutanée sois mal réalisée et entraine une injection de cellules tumorales dans des tissus non souhaités. Cependant, ce problème est contrebalancé par l'expérience que nous avons dans le laboratoire sur ce type d'injection. Une fois injectées, les cellules tumorales peuvent former des tumeurs secondaires (métastases) dans différents tissus causant de la souffrance animale. Pour limiter cet ecueil, le nombre des cellules tumorales à injecter est bien documenter dans littérature limitant de ce fait ce phénomène. Les modèles tumoraux peuvent induire aussi une perte de poids importante et un mauvais état global de l'animal. De plus, l'injection d'AAV codant pour des formes de mort inflammatoires pourrait induire une inflammation systèmique si les différents AAV vont transduire différents organes ou tissus de l'animal. Cependant nous limitons cet effet secondaire par une injection intratumorale avec un volume d'injection limité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure, afin de prélever le sang et des organes pour analyse.Aucun animal ne peut donc être replacé, adopté ou réutilisé.

Remplacement

Seuls les modèles animaux permettent de tester la collaboration qui existe entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique ne peut se faire que chez l’animal. Dans ce cadre la souris est utilisée.

Réduction

Afin de limiter le nombre d’animaux, une étude exhaustive de la littérature a été menée pour optimiser les protocoles expérimentaux et s’assurer de la non-obtention de résultats déjà publiés. Le nombre d’animaux utilisés sera déterminé afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. De plus, des étapes de sélection in vitro des meilleurs candidats sera effectuée afin de réduire drastiquement le nombre d'animaux utilisés dans ce projet.

Raffinement

Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée qui peut être limitée en se basant sur une grille d’observation visant à définir des points limites à partir desquels l’expérience sera arrêtée immédiatement. Si les animaux présentent des signes de douleur, un anti-douleur sera utilisé. Un enrichissement est également apporté par des abris de cellulose et des carrés de coton vierge.

Choix des espèces

Dans le domaine de l’immunologie, le modèle murin offre des outils uniques pour la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des populations lymphocytaires et le suivi des réponses immunitaires. Le modèle de souris permet aussi l’utilisation de modèle transgénique, des modèles de Knock-Out qui peuvent être intéressant dans la compréhension des mécanismes impliqués dans le cancer. Le nombre d’animaux utilisé dans chaque expérience tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d’utiliser un nombre suffisant d’animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan de l’analyse statistique. Nous utiliserons de jeunes souris adultes (animaux âgés entre 6 et 8 semaines au début de protocole) afin que le système immunitaire soit mature au moment de l’inoculation de la tumeur et de l’injection intra-tumorale des différents AAV.