Souris

150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal sodique cardiaque, elles subissent l'implantation chirurgicale de capteurs de télémétrie et trois échocardiographies sous sédation avant que leur cœur ne soit prélevé. Le porteur qualifie ses investigations d'"indolores et non-invasives" tout en décrivant une étape chirurgicale de 25 minutes et un isolement de dix jours en cage individuelle. Il affirme que la progression de la maladie ne peut s'étudier que dans un "organisme entier" et conclut qu'aucune méthode de substitution n'existe.

Objectifs

Le projet consiste à étudier une pathologie : la cardiomyopathie dilatée, liée à une mutation d’un canal ionique (sodique) cardiaque. Le mécanisme induit par la mutation est nouveau. Les investigations in-vivo sont essentielles pour comprendre le développement de la pathologie et permettre de nouvelles approches thérapeutiques. Il s’agira de caractériser, de manière non-invasive, les effets de la mutation sur différents paramètres cardiaques clés d’un modèle murin (souris) porteur de la mutation.

Bénéfices attendus

Des données cliniques humaines associent la mutation étudiée ici à une cardiomyopathie dilatée. La mutation d'un canal ionique est le plus souvent accompagné par le développement d'un phénotype remarquable in-vivo, pouvant se traduire par des effets sur l'électrocardiogramme (ECG), avec la survenue d'arythmies très souvent létales, et des modifications de la structure, de la morphologie et de la fonction du cœur. L'étude in-vivo est incontournable pour valider le concept du lien entre la mutation et la cardiomyopathie dilatée, étudier la relation gène-phénotype complexe (parfois contre-intuitive), et évaluer le potentiel thérapeutique de molécules visant, soit directement la cible d'intérêt, soit indirectement le remodelage cardiaque pathologique. A notre connaissance, il n'y a aucune étude équivalente à l'heure actuelle.

Procédures

Les investigations in-vivo sont indolores et non-invasives. On notera une étape chirurgicale légère, unique, d'une durée de 25 minutes qui consiste à implanter les capteurs de signaux en amont des enregistrements d’ECG en télémétrie. Les capteurs sont retirés après le sacrifice des animaux. Les enregistrements ECG sont complètement neutres pour l’animal (pas de présence humaine, pas de stress, réalisés en ambulatoire comme chez l’homme). Trois échocardiographies seront réalisées avec des anesthésies légères et un stress limité à une manipulation pendant 10 minutes.

Impact sur les animaux

La lignée murine utilisée, génétiquement modifiée, est établie depuis plusieurs générations avec une transmission de la modification génétique stable. Ni dans le laboratoire qui l’a établie, ni dans notre étude pilote, il n’a été noté de phénotype dommageable. Le phénotype est purement cardiaque (comme attendu) avec une insuffisance cardiaque, modérée et stable, et des troubles du rythme ne conduisant pas à la mort subite. L’échocardiographie est une méthode de choix pour l’exploration indolore de la morphologie et de la fonction cardiaque in-vivo. Sa nature non invasive permet des études longitudinales avec un suivi des animaux au cours du temps. Elle permettra de caractériser la fonction cardiaque in-vivo (3 investigations). Le stress subi se limite à la manipulation pendant une période courte (10 min/animal). Une sédation légère permet l’obtention d’images échocardiographiques de qualité (rythme cardiaque proche de la physiologie). Concernant l'enregistrement des ECG par télémétrie en ambulatoire, le bénéfice expérimental inclut l’absence d’interférence liée à une anesthésie, sans limitation de la durée d’observation, avec un accès aux périodes diurnes et nocturnes, une qualité supérieure du signal. La nuisance liée à l'implantation chirurgicale des capteurs (25 minutes) est limitée. Après l’implantation, les aninaux sont maintenus en cage unique pendant 10 jours pour : (i) éviter des blessures au niveau des cicatrices chirurgicales par les congénères (risque d’inflammation ; modification des conditions expérimentales) et, (ii) respecter la nécessité technique d’avoir un seul animal par plaque (qui est le receveur des signaux) d'enregistrement de l'ECG.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour prélever le coeur à des fins d'études in vitro (électrophysiologie, biochimie, histologie).

Remplacement

Le projet, dans sa globalité fait appel à des approches in-vitro et in-vivo. Les approches in-vitro concernent la caractérisation des effets moléculaires et cellulaires de la mutation. Elles permettent de comprendre les mécanismes de base, sans utilisation d’animaux. Pourtant, la validation des effets dans un modèle expérimental in-vivo est indispensable pour évaluer l’impact de la mutation sur la fonction cardiaque intégrée. Il n'existe actuellement aucune méthode (in-vitro ou in-silico) de substitution. Le cœur est un organe complexe, en interaction forte avec de nombreux autres systèmes. La progression de la maladie et les nombreux effets qui découlent de la mutation ne peuvent être étudiés que dans un organisme « entier ». La validation du modèle et les connaissances acquises permettront cependant d’évoluer vers l’utilisation de cellules cardiaques dérivées de cellules souches de patients en se basant en partie sur les connaissances acquises in-vivo.

Réduction

Pour réduire le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des informations fiables et robustes, nous utiliserons deux techniques de choix dérivées d’approches couramment utilisées chez l’homme en clinique ; à savoir : (i) l’électrocardiograhie (ECG par télémétrie) et (ii) l’échocardiographie. Elles permettent toutes les deux un suivi de l’animal au cours du temps ; ce qui permet d’augmenter la puissance statistique et de limiter le nombre d’animaux utilisés dans le cas d’une pathologie évolutive comme la cardiomyopathie. Les animaux peuvent ainsi faire l’objet d’investigations répétées (chaque animal étant son propre témoin), au lieu d’être sacrifiés à chaque stade de la pathologie. Le protocole expérimental a été conçu à partir d'études similaires. Notre expérience permet, pour chacun des paramètres étudiés, de définir de manière pratique, le nombre minimum, mais scientifiquement nécessaire, d'animaux dans chaque groupe. Il est à noter que le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu; ce qui simplifie et fiabilise les interprétations scientifique, et réduit ainsi le nombre d'animaux nécessaire.Nous avons évalué le nombre d’animaux nécessaires par une étude statistique, établi à un minimum de 10 par groupe (échocardiographie, ECG). Dans un souci de Réduction, chaque animal sera également utilisé pour mesurer plusieurs autres caractéristiques (physiologiques, histologiques, biochimiques et moléculaires).

Raffinement

Nous réaliserons des approches in-vivo non invasives (électrocardiographie, échocardiographie) pour comparer le phénotype murin pathologique avec la pathologie humaine afin de transférer les résultats et les connaissances acquises vers la clinique. Nous veillerons à maintenir les meilleures conditions de vie possibles pour les animaux tout au long du protocole, ce qui garantira aussi la qualité et la pertinence des résultats scientifiques. Cela inclut la réduction des contraintes pour les animaux, en matière de stress (ex : période de « repos » après le transport), de douleurs éventuelles (soins adéquats avant, pendant et après l’implantation des capteurs de télémétrie ; anesthésie/analgésie), d’enrichissement du milieu (jouets, tunnel, etc…), de détresse, de points limites et d’arrêt anticipé des procédures expérimentales. Une grille d’évaluation avec différents scores a été établie pour mesurer, réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse, et pour définir précisément des points limites et l’arrêt anticipé de la procédure.

Choix des espèces

Les animaux transgéniques sont principalement des modèles murins (souris). Les rongeurs sont effectivement le modèle le plus couramment utilisé en laboratoire. Ceci est particulièrement vrai pour l’étude du phénotype pathologique résultant de mutations humaines (comme décrit ici). Le phénotype cardiaque murin normal est parfaitement connu, à la fois au laboratoire et via une bibliographie abondante ; ce qui simplifie et fiabilise les analyses et les interprétations scientifique. Cela réduit aussi le nombre d'animaux nécessaire pour maitriser le modèle. Les animaux seront réceptionnés au stade jeune adulte, entre 4 et 8 mois. Ils seront utilisés après une période d'adaptation dans l'animalerie. Le stade choisi rend plus faciles et précises les investigations échocardiographiques et l'implantation des capteurs de télémétrie pour l'ECG (taille de l'animal). Il s’agit également d’un stade approprié pour l’étude de la progression de la cardiomyopathie.

6500 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Rendus porteurs de tumeurs disséminées de type leucémie ou métastases, souvent après xénogreffe de cellules humaines chez des animaux immunodéprimés, ils subissent irradiations, administrations répétées, prélèvements de sang et de moelle osseuse et séances d'imagerie, pour évaluer des candidats médicaments avant leur passage chez l'humain. Le porteur indique que le développement tumoral induit une perte de poids et des difficultés locomotrices, et prévoit une trentaine d'études par an. Il décrit les modèles de reconstruction en 3D comme "marginaux" et aux résultats "difficilement transposables à l'homme", concluant au caractère "indispensable" du recours aux rongeurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux. En 2020, quelques 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de cancer disséminés déjà mis en place ou bien d’en développer de nouveaux chez les rongeurs (rats ou souris), les plus prédictifs possible afin de refléter la maladie humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour les traiter. Ces modèles permettront d’étudier des nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques chez l’homme, à établir une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers disséminés de type leucémie ou bien le développement des métastases chez l’homme. Grace à ces modèles de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques sur des leucémies ou des métastases. Pour cela, les expériences chez l’animal, qui représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera ainsi possible d’étudier dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme : -les mécanismes de dissémination des métastases, -les mécanismes d’évolution des leucémies, -les mécanismes de résistance à des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.

Procédures

Un système d’identification sera mis en place sur tous les animaux, sous anesthésie générale (moins de 1 minute, une seule fois). Induction tumorale de tous les animaux sous anesthésie (moins de 1 minute, généralement unique, mais pourra être répétée pour vérifier que la thérapie administrée peut empêcher des récidives). Si necessaire,en fonction de des cellules tumorales : transport vers le site où est réalisée l’irradiation (une seule fois, 2 heures). Pose d’un implant Sous Cutané (une seule fois, 1 minute) Test de composés chimiques, biologiques ou traitement par rayons ionisant administrés sous anesthésie générale (moins de 1 minute). Administration orale, intraveineuse, intrapéritonéale et sous cutanée sous contention sans anesthésie (moins de 1 minute). Ces administrations peuvent être uniques ou répétées, comme peut l’être la prise de médicament chez le patient. Pesée des animaux (moins de 1 minute) Prélèvements de sang potentiellement répétés en respectant les volumes maximum tolérés : - Prélèvements peu invasifs sous anesthésie générale (moins de 1 minute). -Prélèvement par piqûre à la veine caudale et marginale de la patte sous anesthésie, possible sous contention (moins de 3 minutes). -Prélèvements potentiellement répétés de moelle osseuse sous anesthésie (moins de 5 minutes). -Recueil d’urine individuel (potentiellement répété, avec isolement (moins d’une heure)). Technique d’imagerie, potentiellement répétée: sous anesthésie générale entre 10 et 45 minutes (en fonction des techniques).

Impact sur les animaux

Les gestes techniques suivants induiront un stress léger à l’animal: -Identification des animaux -Transport vers le site où est réalisée l’irradiation -Pose d’un implant Sous Cutané -Induction tumorale -Traitements par voies orale, Intraveineuse, intrapéritonéale, sous cutanée ou radiothérapie -Suivi des animaux par imagerie Les gestes suivants induiront une douleur plus marquée. -Les traitements par voie intramusculaire/intradermique Au début de l’étude, les animaux seront randomisés. Cette nouvelle organisation sociale pourra engendrer un stress léger. La prise de mesure des animaux (poids) induira un stress pouvant être considéré comme faible qui diminuera avec l’habituation Les prélèvements de sang ou de moelle osseuse en cours d’expérience induiront un stress plus important chez l’animal : Le développement tumoral induira une perte de poids et des difficultés locomotrices.

Devenir

Les animaux étant porteur de tumeur ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidatsmédicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais restent toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations des paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individu. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 30 études sont réalisées chaque année, mais le nombre peut varier en fonction des demandes. Une étude peut être composée de 1 (dans le cas d’un développement d’un nouveau modèle) à 20 groupes. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 6 et 15 par dose de produit, ce nombre sera adapté en fonction de la connaissance interne du modèle ou en fonction des études réalisée dans la littérature. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal. En général, en oncologie et du fait de la randomisation, le nombre d’animaux greffés est supérieur au nombre d’animaux utilisés randomisés dans chaque groupe. Pour les modèles disséminés ce nombre d’animaux surnuméraire est réduit à un maximum de 10% (pour 100 animaux, 110 seront greffés). Au-delà, une dérogation sera demandée et le modèle sera expertisé pour évaluer si plus de 10% des animaux sont réellement nécessaires. Dans tous les cas, il sera recommandé l’utilisation d’un minimum de résidus

Raffinement

Les procédures techniques sur les animaux seront réalisées selon les standards validés par le comité éthique. Toutes les procédures seront réalisées par des techniciens formés et dont les compétences ont été validées. La fréquence de pesée des animaux sera adaptée à leur état général. Chaque animal sera observé quotidiennement. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront suivis par la structure chargée du bien-être animal. Sous l’autorité du vétérinaire, des antalgiques pourront être prescrits. De l’enrichissement sera utilisé dans toutes les cages dès l’arrivée des animaux dans l’animalerie. L’induction tumorale se fera sous anesthésie. avec traitement antalgoique adaptée. L’induction tumrale fera l’objet d’une surveillance et de soins post induction seront pratiqués si nécessaires. Pour les traitements dont l’administration est douloureuse, les animaux en plus d’être anesthésiés recevront une antalgie adaptée. Les injections/prélèvements seront effectués en suivant les recommandations du comité éthique en termes de volume, d’anesthésie, de fréquence et d’antalgie. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte. A partir de 10% de perte de poids, la fréquence de pesée sera augmentée pour tous les animaux Dans toutes les cages, un gel nutritif ou de l’eau gélifiée seront rajoutés, la quantité de nourriture en fond de cage sera augmentée. Chaque animal avec une perte de poids de 10% sera réhydratés.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines (modèles xénogéniques) dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (6 semaines lors de leur première manipulation). Des animaux adultes sont utilisés afin qu’ils aient leur poids et leur morphologie adulte pour faciliter l’injection des cellules tumorales. Les animaux adultes pourront mieux supporter les effets secondaires des composés à tester. Les effets du développement tumoral sera plus facilement supporté par des animaux adultes.

634 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 510 d'entre elles subissent une ovariectomie pour induire une ostéoporose, d'autres reçoivent des injections sous-cutanées ou intrapéritonéales répétées, et toutes une ponction intracardiaque au moment de la mise à mort pour prélever le sang et les organes. Le porteur affirme que l'ovariectomie n'affecte pas le bien-être des animaux non-humains hormis un stress chirurgical transitoire, et fixe un point limite de mise à mort à 15 % de perte de poids. Sur le remplacement, il décrit les rares lignées cellulaires disponibles comme incapables de reproduire la diversité des ostéoclastes et conclut que le recours à la souris reste "indispensable".

Objectifs

L'ostéoporose est une pathologie liée à la chute des estrogènes à la ménopause ou à certaines maladies inflammatoires. Elle est caractérisée par une diminution de la masse osseuse due à une différenciation accrue des ostéoclastes, cellules responsables de la dégradation de la matrice osseuse. Ces cellules ont été longtemps considérées comme une population unique de cellules et les thérapies actuelles bloquent de façon globale l'activité des ostéoclastes. Elles sont efficaces, mais à long terme, elles ont des effets néfastes (os de mauvaise qualité, risque accru de fracture). De nouvelles approches thérapeutiques sont donc nécessaires. Il a été récemment démontré qu’il existe plusieurs populations d'ostéoclastes qui ont des propriétés et des fonctions différentes. Notre but est donc de caractériser ces différentes populations d'ostéoclastes en condition normale ou ostéoporotique pour déterminer quels ostéoclastes sont responsables de la destruction osseuse pathologique associée à l’ostéoporose. Cela pourrait conduire à des thérapies ciblées sur ces ostéoclastes pathologiques, sans affecter les autres. Ce projet aura donc des retombées importantes pour l’ostéoporose et les maladies inflammatoires associées à une perte osseuse. Nous travaillerons sur 2 modèles bien caractérisés et largement étudiés, l'ostéoporose post-ménopausique induite chez la souris femelle par ovariectomie, et la destruction osseuse inflammatoire induite par injection sous-cutanée au niveau de la calvaria (os supérieur du crâne) de facteurs stimulant la formation des ostéoclastes. Ces 2 modèles ont déjà permis de caractériser certaines propriétés des ostéoclastes conservées chez l'Homme. Nous utiliserons des souris normales commerciales et des souris génétiquement modifiées, déficientes pour le métabolisme du glucose (pfkb3) car nos résultats in vitro suggèrent que les populations d'ostéoclastes diffèrent dans leur capacité à utiliser et métaboliser le glucose, ce qui peut impacter leur fonction. Cela nous permettra de déterminer si la modulation du métabolisme du glucose peut réduire les ostéoclastes pathologiques in vivo dans le contexte de la destruction osseuse.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but de mieux comprendre la diversité des ostéoclastes chez un individu normal ou ayant une destruction osseuse. Cette diversité a été identifiée très récemmment et est très peu documentée dans la litérature. C'est donc un projet original qui apportera des connaissances très nouvelles sur la biologie des ostéoclastes. Identifier les sous-populations d'ostéoclastes qui sont spécifiquement impliquées dans la destruction osseuse pourra à terme permettre d'améliorer les traitements des pertes osseuses en ciblant de façon spécifique ces ostéoclastes pathologiques sans affecter ceux responsables du remodelage osseux physiologique. Enfin, de nombreuses maladies sont associées à une destruction osseuse (rhumatismes inflammatoires, tumeurs osseusesn et autres maladies inflammatoires). Nos résultats pourront donc avoir des conséquences plus larges que l'ostéoporose post-ménauposique.

Procédures

Les animaux seront soumis à une procédure chirurgicale pour induire une ostéoporose par ovariectomie. L’intervention (temps d’anesthésie) dure environ 15 minutes. Cela concerne 510 animaux qui seront opérés une seule fois. Les animaux recevront également des injections sous-cutanées de quelques secondes, soit 1 seule fois pour 96 animaux, soit 2 fois par jour pendant 3 jours consécutifs pour 48 animaux. Tous les animaux recevront des injections intrapéritonéales, soit une seule fois au moment de la mise à mort pour 144 animaux, soit 2 fois (une au moment de la chirurgie et une au moment de la mise à mort) pour les 510 animaux soumis à la procédure de chirurgie. Enfin ils seront également soumis une seule fois à une ponction intracardiaque de 2-3 minutes après anesthésie pour collecter le sang. Cela concerne tous les animaux au moment de la mise à mort.

Impact sur les animaux

L'ovariectomie est le modèle standard d'ostéoporose utilisé en recherche. En dehors de l'acte chirurgical qui peut induire un stress transitoire, elle n'affecte pas le bien-être des animaux. La perte osseuse résultante n'induit pas de souffrance et est observable après 3 semaines. Dans quelques cas, il peut y avoir une mauvaise cicatrisation de la plaie. La perte osseuse locale induite par injection sous-cutanée au niveau de la calvaria de facteurs stimulant les ostéoclastes est aussi un modèle validé. En dehors de l'injection sous-cutanée elle-même qui peut induire un stress très transitoire, elle n'affecte pas le bien-être des animaux et la perte osseuse résultante n'induit pas de souffrance. Elle est observée 5 jours après l'injection et est localisée à la calvaria. Les souris génétiquement modifiées que nous utiliserons n'ont pas de phénotype dommageable (viabilité, poids, comportement et reproduction normaux). Nos résultats préliminaires montrent que les ostéoclastes pathologiques sont présents en très faible proportion chez les souris normales. Leur phénotype n'a donc pas d'incidence sur les animaux

Devenir

Tous les animaux dans chacune des procédures seront mis à mort pour permettre le prélèvement des organes pour l'analyse du phénotype et de la fonction des ostéoclastes et de leurs progéniteurs, ainsi que pour la mise en culture de cellules primaires.

Remplacement

L’existence de plusieurs populations d’ostéoclastes n’a été mise en évidence que très récemment et les rares lignées de cellules disponbles pour étudier les ostéoclastes ne reproduisent pas leur diversité et ne permettent pas d'analyser leur interaction avec leur environnement. Elles ne reproduisent pas non plus le phénotype des ostéoclastes pathologiques. L'utilisation d'ostéoclastes primaires issus de souris saines ou ayant une destruction osseuse reste donc indispensable. De plus, étant donné la complexité des mécanismes impliqués, aborder ce problème seulement par des analyses in vitro n'est pas suffisant et le recours à des modèles animaux est lui aussi indispensable. Pour l’instant, aucune méthode alternative in vitro n’est adaptée afin de remplacer totalement le modèle murin. Cependant, nos résultats pourraient permettre à terme d’améliorer ces modèles in vitro en les modifiant génétiquement grâce aux marqueurs et autres caractéristiques que nous identifierons pour qu'ils reproduisent les différentes sous-populations d'ostéoclastes. Si cela est possible, cela permettrait à terme de réduire grandement le nombre d’animaux utilisés pour l’étude de ces cellules en condition normale et pathologique.

Réduction

Le nombre d'animaux a été calculé au plus juste en fonction du nombre de cellules nécessaire aux différentes analyses et d'une évaluation statistique, en tenant compte de pertes éventuelles afin de ne pas avoir à répéter inutilement les procédures, et avec le nombre de souris minimum par groupe. Pour l'évaluation statistique, nous avons utilisé le test G*power qui permet d'estimer le nombre d'animaux nécessaires en fonction des différences attendues sur la base de nos expériences antérieures et des résultats de la littérature. Chaque animal inclus dans l'analyse est utilisé de façon optimale pour permettre l'analyse simultanée d'un maximum de paramètres et réduire encore le nombre d'animaux. Nous ne produisons ni ne commandons plus d'animaux que ceux nécessaires à chaque expérience. Enfin, l’excédent de cellules sera congelé pour utilisation ultérieure ce qui nous permettra de réduire encore plus le nombre d’animaux

Raffinement

Toutes les expériences et manipulations des animaux seront effectuées afin de respecter le bien-être animal et de réduire au minimum le niveau de stress des animaux. Pour réduire au maximum la souffrance des animaux, une grille de score a été établie pour le suivi des animaux avec des critères bien définis pour détecter tout signe de souffrance et des points limites bien définis. La procédure d'ovariectomie inclut un traitement pré-opératoire par un analgésique (buprénorphine), et un suivi post-opératoire selon la grille de score présentée en annexe. Un antalgique sera administré si les animaux présentent des signes de souffrance. Si ces signes ne disparaissent pas, comme indiqué dans la grille de score, ils seront mis à mort par dislocation cervicale. Si le score atteint la limite de 6 (point limite) les animaux seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale. Les animaux ovariectomisés seront pesés toutes les semaines car l'ovariectomie est caractérisée par une prise de poids modérée (environ 10%). Si au contraire une diminution du poids est observée, les animaux seront pesés 2 fois par semaine et s’ils présentent une perte de 15% par rapport à leur poids au jour 0, ils seront immédiatement mis à mort par dislocation cervicale (point limite).

Choix des espèces

Nos résultats précédents, ainsi que la majorité des données de la littérature sur lesquelles nous nous appuyons, ont été obtenus chez la souris. Nous allons travailler par analogie avec ces résultats dans la continuation de nos travaux précédents. Les données de la littérature montrent que les deux modèles utilisés (ovariectomie et modèle calvaria) ont permis de générer des données qui ont ensuite été validées chez les patients (sur d'autres questions touchant les ostéoclastes). Enfin, il existe déjà des modèles de souris génétiquement modifiées dont l'utilisation permettra de répondre à certaines de nos questions. Pour toutes les procédures, nous utiliserons des animaux au stade adulte, entre 6 et 12 semaines. A ce stade le système osseux des souris est mature et c'est le stade auquel nous avons déjà travaillé dans nos études précédentes.

128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent chaque jour dans le nez, sous anesthésie, un condensat de fumée de cigarette pendant huit semaines, puis une bactérie ou un champignon respiratoires, avant d'être tuées pour prélever leur sang et leurs poumons. Le porteur décrit une perte de poids initiale et des troubles respiratoires possibles, et indique que l'infection bactérienne rend les souris fébriles sans les tuer. Il étudie ainsi les mécanismes de la bronchopneumopathie chronique obstructive et affirme nécessaire de prendre en compte l'"organisme en entier" après des travaux in vitro.

Objectifs

La Broncho-Pneumopathie Chronique Obstructive (BPCO) est une maladie inflammatoire chronique des bronches, se caractérisant par un rétrécissement progressif et une obstruction permanente des voies aériennes dont le facteur de risque principal est la fumée de cigarette. Nous savons maintenant que la progression et la sévérité de la BPCO est accentuée suite à des exacerbations provoquées essentiellement par des infections respiratoires. Malheureusement, les mécanismes qui gouvernent la pathogenèse des exacerbations de BPCO sont encore obscurs à ce jour et les thérapies demeurent inefficaces. Cela est dû à une mauvaise compréhension des mécanismes sous-jacents de la genèse de la maladie. Dans ce projet, nous nous intéressons aux pathogènes fréquemment isolés au cours de l’exacerbation des BPCO, la bactérie Haemophilus influenzae et le champignon Aspergillus fumigatus. Ce projet vise à déterminer les mécanismes impliqués dans l’inflammation pulmonaire causée par la cigarette et les pathogènes grâce à des modèles murins.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre d’en apprendre davantage sur les mécanismes impliqués dans l’inflammation chronique au cours de la BPCO et notamment dans l’exacerbation de BPCO par Haemophilus influenzae et/ou Aspergillus fumigatus. Une première expérience sur modèle murin avec Aspergillus fumigatus nous a permis d’identifier des médiateurs inflammatoires clés impliqués dans le recrutement de cellules immunitaires dans l’exacerbation de BPCO médiée par le champignon Aspergillus fumigatus et nous souhaiterions étudier plus en détail les mécanismes permettant cette augmentation d’inflammation. Nous utilisons des souris sauvages et une lignée de souris génétiquement modifiée permettant d’invalider des enzymes du neutrophile car ce sont des enzymes qui vont dégrader le tissu pulmonaire et conduire à une perte des fonctions respiratoires.

Procédures

Instillation intranasale de solution saline (souris contrôles) ou de fumée de cigarette en solution (souris cigarettes et Cigarettes+pathogènes) 1 fois/jour, 5 jours/semaine et pendant 8 semaines. Instillation intranasale de solution saline (souris contrôles et souris cigarettes) ou de pathogènes (souris pathogènes et Cigarettes+pathogènes) additionné de solution saline ou de fumée de cigarette en solution : cette instillation aura lieu 4 semaines après le début de l’expérimentation et 24h avant la mise à mort des animaux, à la place de l’instillation effectuée les autres jours, afin de ne réaliser qu’une anesthésie et une instillation ces 2 jours. Toutes les instillations se feront après anesthésie (1 à 3min en fonction de la vérification de l’immobilité et absence de réflexe de retrait de la patte arrière des animaux en appuyant sur celle-ci). L’instillation intranasale dure moins de 2 min.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont une perte de poids au démarrage de l’exposition mais le poids devrait se stabiliser au cours des semaines, un stress notamment lié à l’anesthésie et qui ne devrait pas durer après l’exposition, possibilité de troubles respiratoires après exposition aux pathogènes ou à la fumée de cigarette en solution ou la combinaison exposition aux pathogènes et à la fumée de cigarette en solution. Concernant l’infection intranasale bactérienne, elle rend les souris fébriles indépendamment de leurs génotypes 24h post-challenge sans engendrer de mortalité.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les prélèvements sanguins et pulmonaires.

Remplacement

Afin de mener à bien ces investigations, des études in vitro ont été menées en amont. Il s’agit à présent de prendre en considération l’organisme en entier pour un cadre plus complexe et réel. De plus, la souris est un modèle éprouvé et fiable.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour ne garder que le nombre nécessaire aux analyses statistiques. L’utilisation de 8 souris (4 mâles et 4 femelles = ratio équivalent) par groupe permettra d’obtenir des résultats statistiquement significatifs à cause des variabilités de réponse qui peuvent exister entre souris et pouvoir regarder les biais sexuels éventuels (4 mâles et 4 femelles/groupe). Lors de notre précédente expérimentation, l’utilisation de 8 souris par groupe a permis d’obtenir des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris seront hébergées par groupe, dans des conditions d’hébergement optimisées pour assurer leur confort (enrichissement, soins et suivi post-instillation). Une anesthésie générale sera réalisée avant toute instillation pour limiter tout risque de douleur et d’angoisse pouvant résulter de l’intervention. Les animaux seront observés 2 fois par jour et pesés 2 fois par semaine pour suivre leur prise de poids. Les expérimentateurs sont formés aux gestes impliquant un contact avec l’animal et à l’observation des signes cliniques fondamentaux. La connaissance des modèles animaux a permis de définir des points limites précis.

Choix des espèces

La souris est utilisée dans cette procédure plutôt que la drosophile car il s’agit d’un modèle proche de l’Homme et qui est adapté pour étudier la réponse inflammatoire ou immunitaire avec des mécanismes similaires à ceux présents chez l’Homme. La souris peut être modifiée génétiquement pour définir l’importance relative du gène d’intérêt en condition physiologique ou physiopathologique Les souris utilisées auront entre 8-10 semaines, soit environ 25-30 grs, afin d'utiliser des animaux à maturation pulmonaire.

94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent sous anesthésie des injections d'infliximab agrégé ou non à la base de la queue, subissent des biopsies de peau et des prises de sang, puis sont tuées au dioxyde de carbone pour prélever leurs ganglions et organes lymphoïdes. Le porteur décrit une douleur au point d'injection et un état inflammatoire de type fébrile qu'il juge transitoire, sans perte de poids attendue. Il veut suivre le trajet des agrégats d'anticorps dans l'"organisme entier" et affirme que les cultures de cellules ne suffisent pas à trancher.

Objectifs

Lorsque les patients sont traités avec des anticorps thérapeutiques, ces derniers peuvent s’associer pour former des agrégats pouvant produire des effets secondaires délétères pour les patients. Notre équipe étudie la façon dont les agrégats d’anticorps sont perçus par notre système immunitaire. Nous avons déjà montré qu’ils peuvent activer différents types de cellules immunitaires humaines en culture. Toutefois, ces données in vitro ne nous permettent pas d’évaluer la prise en charge des agrégats par les différentes cellules au sein de l’organisme entier, ni d’étudier le transport des formes agrégées d’anticorps depuis le site d’injection vers les organes où se développe la réponse immunitaire. Pour cette raison, un modèle d’étude animal est nécessaire, afin de disposer de données concernant la dynamique de prise en charge des agrégats dans l’organisme entier, et d’identifier les cellules immunitaires activées au niveau des organes lymphoïdes, où ont lieu les interactions entre cellules immunitaires. Cette étude sera menée chez la souris et est dimensionnée pour minimiser le nombre d’animaux utilisés, en garantissant la possibilité de dégager des conclusions robustes. Les aspects de raffinement des procédures de maintien et manipulation des animaux ont été également optimisés.

Bénéfices attendus

L’immunogénicité des anticorps thérapeutiques est suivie par la mesure de différents paramètres chez les patients en cours de traitement, cependant l’effet particulier des agrégats d’anticorps ne peut être distingué lors de ce suivi. Afin de prédire et d’évaluer la réponse immunitaire due spécifiquement aux agrégats, ces études doivent être complétées par un modèle intégré, permettant de suivre la migration des cellules immunitaires prenant en charge les agrégats au site d’injection, leur activation, ainsi que leurs interactions avec un environnement cellulaire complexe au sein de l’organisme. C’est en cela que le modèle animal est pertinent. Ce projet permettra d’apporter des réponses précises quant à la prise en charge des agrégats d’anticorps au site de l’injection, de suivre les populations cellulaires permettant leur migration vers les organes lymphoïdes, et d’étudier de manière approfondie les populations de cellules recrutées dans ces organes. A notre connaissance, une telle étude n’a jamais été réalisée. Elle apportera des éléments scientifiques nouveaux quant au rôle des agrégats dans l’immunisation contre les anticorps thérapeutiques et la mobilisation des cellules immunitaires impliquées. Ces données sont importantes pour comprendre comment les patients s’immunisent contre leur traitement et quelle est la contribution des agrégats protéiques dans ce processus.

Procédures

Il s’agit d’administrer un anticorps thérapeutique sous forme agrégée ou non à différents groupes de souris, afin d’analyser les réponses cellulaires induites, ainsi que le cheminement des agrégats dans les organes lymphoïdes. Pour cela les souris seront sous anesthésie gazeuse et l’anticorps sera administré sous forme agrégée ou non, par voie sous cutanée à la base de la queue. Pour 3 groupes, les souris seront euthanasiées par inhalation de dioxyde de carbone 2h, 4h et 24 heures après l’injection, puis des biopsies de la peau seront réalisées au site d’injection, pour en extraire les cellules cutanées pour analyse. Les ganglions lymphatiques inguinaux seront également prélevés pour également y analyser les populations de cellules. Pour 3 autres groupes, des prélèvements sanguins seront effectués à 3 temps (J7, J14 et J28), afin de réaliser des dosages dans le sang. Pour limiter l’anxiété et la douleur, les animaux seront prélevés sous anesthésie gazeuse. Puis les souris seront euthanasiées au 28ème jour, par inhalation de dioxyde de carbone, et les organes lymphoïdes seront prélevés pour analyser les populations de cellules immunitaires qui s’y trouvent.

Impact sur les animaux

Lors de l’administration des différents produits, la viscosité des préparations va probablement engendrer une douleur au point d’injection et un état général inflammatoire des animaux (fièvre), comme lors d’une vaccination. Cet état devrait être transitoire cependant, et nous n’anticipons pas de perte de poids ou de dégradation de l’état général des animaux. L’effet de ces injections répétées sera la mise en place d’une réponse immunitaire chez l’animal, sans dégradation de l’état général attendue. Pour limiter le stress des souris lors des immunisations et des prélèvements sanguins, elles seront anesthésiées par inhalation gazeuse.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés pour prélèvements de tissus et analyses post-mortem.

Remplacement

Chez les patients en cours de traitement, l’immunogénicité des anticorps thérapeutiques est suivie par la mesure de différents paramètres cependant l’effet particulier des agrégats d’anticorps ne peut être distingué lors de ce suivi. Il faut donc prévoir des modèles alternatifs permettant l’étude de l’impact des agrégats d’anticorps dans l’immunogénicité globale. On peut ainsi utiliser des cellules en culture issues de donneurs sains ou de patients. Mais ces études doivent être complétées par un modèle intégré, permettant de suivre au sein d’un organisme entier la migration des cellules immunitaires prenant en charge les agrégats au site d’injection, leur activation, ainsi que leurs interactions avec un environnement cellulaire complexe au sein des organes lymphoïdes. Ce type d’étude ne peut être directement réalisé chez l’homme, c’est pourquoi le modèle animal reste encore pertinent, et en particulier la souris.

Réduction

Notre protocole a été conçu pour minimiser le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la possibilité de dégager des conclusions robustes de nos travaux, pour les deux axes du projet : 1) Etude des réponses immunitaires chez des souris immunisées par l’infliximab agrégé ou non Sur la base des travaux antérieurs réalisés sur l’animal dans notre laboratoire, nous avons calculé que ces expériences nécessiteront 8 animaux par groupe afin de pouvoir réaliser des tests statistiques adaptés aux groupes de petits effectifs. Donc au total en nombre d’animaux est restreint à 40 animaux. Cette première procédure constitue une étude pilote de manière à vérifier que les souris sont capables de monter une réponse immunitaire contre l’infliximab et/ou les agrégats. Autrement dit elle est un pré-requis avant d’initier le second volet du travail. 2) Etude de la prise en charge et du transport des agrégats d’anticorps thérapeutiques par les sous-populations de DC La réalisation de l’ensemble de cette procédure, tenant compte des groupes de souris nécessitera 54 souris en tout. En effet, comme expliqué pour la première procédure nous avons calculé que 8 souris par groupe (traitées par infliximab non agrégé et agrégé) seront nécessaires afin de garantir l’interprétation des résultats et la possibilité de générer des conclusions statistiquement étayées.

Raffinement

Les souris seront hébergées selon les règles en vigueur en termes de densité de population et surveillées quotidiennement. Leur entretien sera réalisé par la même personne. Le temps de manipulation des souris sera minimisé afin de limiter le stress. Il sera réalisé par le même manipulateur, tout au long des protocoles. Les manipulations susceptibles d’induire de la douleur chez les animaux (injections et prélèvements sanguins) seront réalisées sous anesthésie gazeuse et une attention particulière de l’état général des souris sera apportée, pour déceler un comportement anormal. Une souris dont le comportement se modifie (prostration, poils mal entretenus et/ou hérissés) sera surveillée de façon accrue. Toute souris ayant perdu 20 % de son poids depuis le début du protocole ou 10% en 24h sera ainsi retirée du protocole. Les souris blessées au cours d’éventuelles bagarres seront isolées et les plaies désinfectées. Si les plaies perdurent, la souris sera retirée du protocole et euthanasiée. Le jour du sacrifice, les souris seront manipulées dans un local différent de celui où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées.

Choix des espèces

Les expériences réalisées étudient la mobilisation des cellules du système immunitaire suite à l’immunisation par un anticorps thérapeutique natif ou agrégé. Classiquement ce type d’expérience se fait chez la souris car les mécanismes immunitaires sont comparables à ceux observés chez l’homme, et que de nombreux outils d’analyse sont disponibles pour suivre les cellules immunitaires et leurs réponses. C’est également le principal modèle animal utilisé dans la littérature pour les études d’immunogénicité chez le petit animal. Les souris utilisées pour ce type d’étude auront 7 semaines, et commenceront le protocole après deux semaines d’adaptation à leur nouvelle animalerie, afin d’atteindre le poids de 20g.

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'ablation chirurgicale du ménisque du genou, l'autre une injection de monoïodoacétate dans l'articulation pour provoquer une arthrose, puis toutes marchent sur un tapis tous les quinze jours pendant quatre-vingt-dix jours afin de mesurer leur douleur. Le porteur précise qu'aucun traitement anti-inflammatoire n'est possible, l'objectif étant justement d'induire l'inflammation, avant la mise à mort pour prélever les articulations. Il teste un complément à base de peptides de collagène marin et de polyphénols, et présente le recours à la souris par ses "faibles coûts" et sa facilité de manipulation.

Objectifs

Les peptides de collagène marin ainsi que les extraits poly-phénoliques de pépins de raisin et d’olive possèdent des bénéfices démontrés et décrits dans la littérature sur l’arthrose. Le but de cette étude est d’évaluer l’effet d’un ingrédient Santé d’origine naturelle, associant peptides de collagène et polyphénols, pour les sujets sportifs et âgés susceptibles de développer une arthrose.

Bénéfices attendus

Trouver un traitement efficace à la diminution du développement de l’arthrose.

Procédures

Dans ce projet, nous évaluerons l’impact de l’association de nutraceutiques, peptides de collagènes et polyphénol, dans la progression de l’arthrose. Les souris recevront dans l'eau de boisson le traitement durant les 90 jours de l'étude. Un modèle d’arthrose post-traumatique, en ôtant le ménisque interne, sera réalisé sur des souris jeunes et âgées. Cette interventions sous anesthésie nécessite 20min par animaux. Un modèle d’arthrose par dégradation des cellules de l’articulation (les chondrocytes) sera également réalisé par injection de monoïodoacétate au niveau de l’articulation choisie du genou. Cette injection necessite la contention de l'animal pendant 1min. Afin d’évaluer les douleurs engendrées par les 2 modèles, les souris seront amenées à se déplacer librement sur un tapis de marche tous les 15 jours durant les 90 jours de l'étude. A la fin de l'étude, un prélevement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des mangeoires et igloos seront disposés au fond de la cage.

Devenir

Une mise à mort sera effectuée afin de prélevé les tissus arthrosiques (articulation du genou) chez les souris

Remplacement

Dans un premier temps, une validation objective de l’efficacité biologique sera réalisée sur les différentes formulations de cette association entre peptides de collagène et extraits poly-phénoliques. Pour cela, la toxicité des produits développés seront déterminées in vitro par l’évaluation de leur cytotoxicité sur des chondrocytes (cellules du cartilage présentes dans les articulations), fibroblastes (cellules de la membrane synoviales de l’articulation) et macrophages (cellules de la membrane synoviale de l’articulation, mais également cellules immunitaires recrutées sur les sites inflammatoires dont les articulations arthrosiques). Les études in vivo complémentaires permettront de valider l’efficacité du produit choisi in vitro (seuls ou en association).

Réduction

Nous limitons la répétition inutile des expériences grâce à un échange permanant entre les membres de l’équipe. Nous essayons d’effectuer le maximum d’analyses réalisables sur les mêmes animaux sans altérer la qualité de l’expérience et le bien-être des animaux. Chaque animal sera son propre contrôle. L’arthrose induite sera effectuée sur une seule patte et les résultats seront comparées avec la patte saine, ce qui permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaire pour l’étude. Enfin, tous les protocoles expérimentaux sont, une fois validés, mis à disposition de l’ensemble des membres de l’équipe. Le nombre d’animaux utilisé correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Les groupes d’animaux constitués de 6 individus permettront une étude statistique

Raffinement

En dehors de la visite quotidienne habituelle des animaux, les souris seront surveillées quotidiennement pendant 15 jours suite à l’intervention au niveau de l’articulation et puis 1 fois /semaine . Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des igloos et des croquettes seront disposés au fond de la cage pour l’enrichissement et pour faciliter la prise alimentaire. Il n’y a pas de possibilité de réaliser un traitement anti-inflammatoire car le but du modèle est d’induire une inflammation.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc.) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Souris adultes car l’arthrose se développent majoritairement chez l’adulte : - Souris âgées de 8 à 10 semaines, afin de mimer l’adulte jeune sportif - Souris âgées de 12 à 18 mois, afin de mimer la personne âgée Ces deux populations, adulte jeune sportif et personnes âgées, sont celles les plus susceptibles de développer une arthrose.