Souris
Rôle des lymphocytes MAIT dans un modèle murin de leishmaniose viscérale
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Elles reçoivent le parasite de la leishmaniose viscérale par injection dans l'abdomen, un gavage de tamoxifène cinq jours de suite, puis sont tuées à deux mois pour prélever leurs organes. Le porteur indique que l'infection reste asymptomatique jusqu'à cette date et que le tamoxifène fait perdre environ 10 % du poids, repris une semaine plus tard. Il veut établir le rôle des lymphocytes MAIT dans cette maladie et affirme le recours à la souris "inévitable", les données humaines ne permettant pas de trancher in vivo.
Objectifs
Le système immunitaire, et notamment les lymphocytes T, jouent un rôle essentiel dans la défense contre les agents pathogènes. Nous étudions une population de lymphocytes T particulièrement abondante chez l’humain, et capable de tuer les cellules infectées par des bactéries grâce à la reconnaissance d’antigènes bactériens. Ces lymphocytes T sont appelés MAIT (Mucosal Associated Invariant T cells) et représentent des cibles thérapeutiques privilégiées du fait de leur fréquence élevée chez l’humain (1-10% des lymphocytes T du sang, 10-40% dans le foie), leur présence chez tous les individus, leur capacité à répondre très rapidement en cas de stimulation, et la versatilité de leur réponse (production de différents molécules selon le contexte de stimulation). De façon surprenante, une étude a démontré que ces lymphocytes T sont activés chez les patients atteints de leishmaniose viscérale, suggérant que les lymphocytes MAIT pourraient contribuer à la réponse immune anti-parasitaire, une notion non-explorée à ce jour. La leishmaniose est une parasitose vectorielle transmise par la piqûre d’insectes infectés, les phlébotomes. Il existe une vingtaines d’espèces de Leishmania dans le monde, responsables de 1 à 2 millions de cas humains par an dans 98 pays, dont la France. Selon l’espèce, l’infection prend des formes cliniques différentes : leishmaniose cutanée, cutanéo-muqueuse ou viscérale. La leishmaniose viscérale (LV) est mortelle en l’absence de traitement. Après la piqûre infectante, le parasite se multiplie dans les cellules phagocytaires et gagne la moelle osseuse, le foie, la rate, et les ganglions. La LV pose des problèmes thérapeutiques, chez l’homme comme chez le chien. Dans ce projet, nous proposons d’utiliser un modèle murin de LV pour déterminer le rôle des lymphocytes MAIT dans cette pathologie, et pour définir si l’activation des lymphocytes MAIT en cas de LV repose sur la reconnaissance d’antigènes produits par le parasite.
Bénéfices attendus
La leishmaniose viscérale (LV) est mortelle en l’absence de traitement et touche 500 000 personnes chaque année. La LV pose des problèmes thérapeutiques, liés soit au coût des médicaments, soit à leur toxicité ou encore à l’émergence de résistances. Il existe donc un besoin de mieux comprendre les mécanismes de résistance, notamment immunitaires, à ce parasite. Ce projet permettra de déterminer de façon définitive et bien contrôlée le rôle d’une population lymphocytaire clef, récemment décrite comme impliquée dans la réponse anti-leishmania chez des patients. En fonction de nos résultats, des études visant à activer ou inhiber les lymphocytes MAIT chez les patients atteints de LV pourraient être envisagée. Le projet peut donc offrir de nouvelles opportunités thérapeutiques.
Procédures
Procédures 1 et 2: 1 injection par voie intrapéritonéale (1 minute) sur animaux vigiles. Procédure 3: 1 gavage (1 minute) par jour sur animaux vigiles pendant 5 jours consécutifs, puis 1 injection intrapéritonéale (1 minute) sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues lors de l’administration du parasite par voie intrapéritonéale seront celles liées à l’injection intrapéritonéale. La leishmaniose viscérale est une infection systémique évoluant sur plusieurs mois chez l'homme comme chez la souris, de façon asymptomatique. Le décès survient tardivement (autour de 6 mois post-infection chez la souris). Aux temps d'observation les plus tardifs de cette étude (euthanasie à J60), nos études précédentes ont montré qu’aucun symptome n'est à craindre, ni aucune altération de la qualité de vie chez les animaux. Suite aux administrations de tamoxifène par gavage, une perte de poids d’environ 10% du poids initial peut se produire. Le poids initial est retrouvé une semaine plus tard.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem : collecte des organes et analyses par PCR ou cytométrie en flux.
Remplacement
Une activation des lymphocytes MAIT a été documentée au cours de la leishmaniose viscérale chez l’humain. Ces informations sont utiles mais ne permettent pas de conclure quant au rôle de ces lymphocytes in vivo. Les lymphocytes MAIT ont des propriétés différentes selon le contexte, et peuvent promouvoir ou réduire l’inflammation. A ce stade, il est donc impossible de savoir si l’activation observée chez les patients est associée à un effet clinique bénéfique ou délétère. L’utilisation du modèle Souris, qui est particulièrement bien connu dans le cadre de la leishmaniose viscérale, reste donc inévitable pour établir le rôle des lymphocytes MAIT dans cette pathologie.
Réduction
Nous utiliserons un modèle de LV chez la souris. Le modèle a déjà été mis en place et toutes les souris inclues dans le protocole peuvent être étudiées, limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. D’autre part le nombre d’animaux à utiliser a été réduit au strict minimum nécessaire pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochable. Le nombre minimum d’animaux qu’il faut utiliser pour répondre aux questions posées a été calculé en utilisant un test statistique. Ce nombre a été calculé pour obéir aux minima nécessaires à des analyses statistiques valides, condition nécessaire pour une interprétation biologique des résultats. Le projet est conçu en 2 phases et la 3ème procédure ne sera mis en place que si nécessaire, selon les résultats des 2 premières procédures, de façon à réduire le nombre d’animaux au minimum.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et bénéficient d’un enrichissement adapté. A noter qu’aux temps d’observation utilisés dans le protocole, l’infection est asymptomatique et ne génère aucune souffrance physique aux animaux, ni aucun signe visible d’infection. La perte de poids possiblement induite par le traitement au tamixifène sera mesurée. Nous utiliserons une grille de score pour évaluer de façon objective l’état des animaux et des points limites adaptées à la perte de poids ont été définis.
Choix des espèces
La souris est l'espèce dans laquelle les lymphocytes T (notamment les MAIT) ont été largement étudiés (en dehors de l’humain) et pour laquelle nous disposons d’outils moléculaires et génétiques permettant leur étude. La souris est également le modèle de choix pour reproduire la leishmaniose viscérale humaine, y compris pour l’étude des mécanismes de réponse immunitaire et de la physiopathologie, du fait de l’existence de modèles bien définis et de la parenté génétique avec l’humain. - Les souris seront utilisées à l’âge adulte. - Nous utiliserons des souris adultes car nous souhaitons que les souris aient un système immunitaire et un microbiote matures.
Projet de recherche préclinique de traitements de métastases hépatiques chez la souris.
- Recherche appliquée
- Cancers
8 250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales avec ablation d'une partie de la rate sous anesthésie, puis développent une tumeur et des métastases au foie, suivies six semaines par imagerie et prises de sang hebdomadaires, sous administration quotidienne de composés jusqu'à quarante-deux jours. Le porteur indique que la maladie provoque une perte de poids et une baisse d'activité, et tue les animaux pour analyser leurs organes. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit la progression tumorale et l'échappement aux traitements, et conclut à la nécessité du recours in vivo.
Objectifs
Les cancers font partie des maladies les plus complexes à traiter. Notre projet propose de trouver de nouvelles thérapies anticancéreuses et permettra de comprendre pourquoi on observe un échappement de la maladie lors de traitement à base d’anticorps ou de molécules pharmaceutique mais également de proposer des stratégies pour rendre ces thérapies plus efficaces.
Bénéfices attendus
Les traitements actuels ne permettent pas de traiter 100% des patients atteint d’un cancer et l’on observe de plus en plus d’échappement aux thérapies déjà existantes à cause de la formation de métastases hépatiques. Ces études permettront à la fois d’expliquer le mécanisme d’échappement à ces traitements mais aussi d’expliquer le mécanisme d’action de certains traitements. Ces résultats seront comparés à ceux obtenus in vitro au préalable mais également avec les résultats que l’on attend des différents traitements observés lors des phases clinique chez l’homme. De plus, ces études permettront de tester de nouvelles thérapies plus innovantes et donc de proposer de nouveaux traitements plus efficaces aux patients atteints de cancer.
Procédures
1) Injection de cellules tumorales et ablation d’une partie de la rate sous anesthésie une seule fois dans l'étude, 2) l'imagerie de la tumeur une fois par semaine pendant 6 semaines se fera sous anesthésie pendant 5 min après une injection de sonde bioluminescente, 3) Prélèvements sanguins une fois par semaine pendant 6 semaines: prélèvement en moins d'une minute avec anesthésie ou intraveineux sans anesthésie en moins d'une minute, 4) Administration des composés à tester ou de leur solvant en moins d'une minute par animal, une à deux fois par jour pendant un maximum de 42 jours
Impact sur les animaux
La chirurgie nécessaire à l’implantation des cellules en intra-splénique ainsi que l’injection en sous cutané de cellules tumorales chez la souris va induire le développement d’une tumeur et d’une métastase hépatique qui vont grossir au fur et à mesure. Les effets indésirables attendus chez la souris sont dans un premier temps une perte de poids, une diminution de l’activité. Les animaux seront également manipulés délicatement mais rapidement afin d'éviter au maximum le stress de la manipulation, des administrations et du gavage.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale, des analyses sur les organes étant nécessaires pour mesurer l’efficacité des molécules testées.
Remplacement
A ce jour, aucun modèle cellulaire ne récapitule complètement la cinétique et la complexité cellulaire impliquées dans la progression d’une tumeur, la formation de métastases ou encore son échappement à une thérapie. Cette complexité rend nécessaire l'utilisation d'études in vivo pour comprendre ce phénomène et évaluer de potentiels candidats médicaments. Afin de réduire au maximum le nombre d’étude et donc le nombre d’animaux utilisés, les différentes stratégies antitumorales seront préalablement testées in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe des 3R, nous veillerons à ce que toutes les expériences qui pourront être réalisées in vitro le soient et que ne soient testés, in vivo, que les meilleures molécules ou anticorps obtenus in vitro. Le nombre de souris utilisées par groupe sera réduit au minimum tout en permettant une bonne analyse statistique. Une analyse statistique rétrospective permettra de calculer le nombre nécessaire et suffisant d'animaux par groupe afin d’obtenir pour chaque paramètre étudié une puissance de 80% et alpha=0.05. L’utilisation de l’imagerie bioluminescente et de cellules tumorales exprimant la luciférase permettront un suivi longitudinal des animaux et donc diminuera le nombre d’animaux utilisés dans les études. Nous utiliserons un modèle bien établi dans la littérature afin de limiter la phase de mise au point et ainsi de limiter le nombre d’animaux
Raffinement
Afin de réduire le stress, une acclimatation de 4 jours sera réalisée avant l'entrée en étude. Les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé en continu et relié à un système d’alarme. La densité dans les cages sera en conformité avec les recommandations. Les animaux et leurs conditions d’hébergement seront sous surveillance quotidienne. L’environnement des animaux sera enrichi à leur arrivée et pendant toute la période d'étude. La bonne connaissance des études permettra de raffiner et d’anticiper le développement de la maladie chez l’animal et donc d’anticiper la mise à mort éthique. Pour cela, un programme d'analgésie ainsi qu'une grille de score, l'utilisation de points limites adaptés, d'un arbre décisionnel et de critère d'arrêt de souffrance sont mis en place.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour ce type de modèle et donc le plus décrit. Son utilisation permettra de bénéficier de toute la littérature scientifique déjà parue sur ce modèle utilisant cette espèce. Nous nous appuierons sur de la bibliographie solide et sur un modèle déjà bien documenté afin d’éviter l’utilisation d’un nombre excessif d'animaux pour la mise au point. Nous utiliserons des animaux à l’âge adulte afin de travailler sur des organes parfaitement développés.
Utilisation de rongeurs pour le maintien des cycles biologiques des schistosomes
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Hamsters dorés : 360
3 960 souris et hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Chaque animal patauge une heure dans une eau contenant des larves de schistosomes qui traversent sa peau, puis héberge le parasite jusqu'à ce qu'il ponde, avant d'être tué pour récupérer les œufs. Le porteur qualifie cette infestation d'indolore et affirme utiliser les animaux avant que l'accumulation des œufs, qui grossit le foie et la rate, ne provoque de souffrance. Il présente ce maintien permanent de cycles parasitaires comme la base "nécessaire et indispensable" à tous ses projets sur la schistosomose, et le juge impossible à reproduire in vitro faute d'hôte vertébré.
Objectifs
La Bilharziose ou schistosomose est la maladie parasitaire humaine la plus répandue dans le monde après le paludisme. Le cycle biologique de ce parasite se réalise dans de l’eau douce et nécessite deux hôtes : l’Homme, un rongeur ou une vache dans lequel le schistosome se reproduit et un escargot d’eau douce dans lequel le schistosome se multiplie. Les passages entre les hôtes se font grâce à des larves nageantes qui pénètrent par la peau. Dans les pays où la maladie est persistante et où de nombreuses personnes sont infestées, comme en Afrique, nos études permettent de développer des stratégies de contrôle de la maladie : par exemple, nous testons l’effet de substances sur le développement et la survie des parasites ; nous formons des enseignants à connaître cette maladie et à lutter contre elle pour qu’ils enseignent à leur tour à leurs élèves. Concernant les pays dans lesquels la maladie est récente, où peu de personnes sont infestées mais où la maladie peut se répandre, comme l’Europe, nos projets permettent d’analyser les effets du changement climatique sur la propagation de la maladie. Par exemple, nous recherchons quels sont les animaux qui peuvent transmettre la maladie, nous analysons le comportement des larves de parasites en fonction du pays de provenance, en fonction de l’animal qui est infesté (Homme ou rongeur), nous analysons grâce la biologie moléculaire s’il existe des parasites hybrides et étudions leur comportement.
Bénéfices attendus
Il existe de nombreux bénéfices qui peuvent découler de nos projets : des connaissances pour la recherche dite fondamentale afin de mieux comprendre la diversité de ces parasites et des bénéfices pour la recherche appliquée où nos résultats peuvent être utilisés dans la lutte contre cette maladie. La maintenance des cycles biologiques constituent la base nécessaire et indispensable à tous les projets scientifiques concernant la schistosomose. Ils permettent aux chercheurs d’avoir une base à partir de laquelle ils peuvent monter leurs propres projets.
Procédures
Chaque rongeur, vigile, est placé dans un bac transparent adapté, avec 0,5 cm de hauteur d’eau de forage à 25°C contenant les larves de parasites issues des mollusques ; il patauge pendant une heure sous surveillance (seules les pattes et la queue trempent dans l’eau) ; la pénétration des larves de parasite à travers la peau des rongeurs est indolore. Au bout d’une heure, le rongeur est replacé dans sa cage identifiée en fonction du parasite utilisé et la cage ramenée par un personnel habilité dans la salle d’hébergement correspondante des animaux (souris ou hamsters) infestés.
Impact sur les animaux
Pour leur infestation, les rongeurs sont transférés de leur cage vers un bac transparent contenant 0,5 cm de hauteur d’eau de forage à 25°C ainsi que les larves de parasites issues des mollusques ; le pataugeage dure 1 heure ; c’est le mode d’infestation naturel. La pénétration des larves de schistosome à travers la peau des rongeurs est indolore. Le développement des larves jusqu’au stade adulte ne peut provoquer de nuisances dans les tissus des rongeurs. Les parasites sont matures, et donc pondent des œufs, à partir de 2 mois chez la souris et de 3 mois chez le hamster. C’est l’accumulation des œufs du parasite au cours du temps qui est responsable de la pathologie liée à l’infestation par les schistosomes. Les symptômes visuels sont le grossissement du foie et de la rate dû à l’accumulation des œufs du parasite. Ces effets sont chroniques. Les animaux sont utilisés avant que le parasite n’induise de souffrance.
Devenir
Euthanasie des rongeurs pour récupération des œufs du parasite.
Remplacement
Impossible, on ne peut pas réaliser le cycle in vitro. En effet, le parasite a besoin d’un hôte vertébré et les rongeurs sont connus pour être des animaux réservoirs chez toutes les espèces de schistosomes.
Réduction
Pour chaque souche de schistosome nous utilisons le minimum d’individus nécessaires au maintien de l’ensemble de nos cycles biologiques. En effet, ceci nous permet de ne pas perdre les cycles biologiques de nos parasites pour lesquels il est difficile, voire impossible, de les récupérer sur le terrain.
Raffinement
Pour chaque cycle de schistosome entretenu, l’infestation se fait avec le nombre optimal de parasites permettant à la fois le bien-être de l’animal et le maintien du cycle du parasite. La pénétration des larves de parasite à travers la peau des rongeurs est indolore. Une surveillance quotidienne par les zootechniciens est effectuée. Afin de maintenir une socialisation, tout rongeur se retrouvant seul dans une cage est placé, après marquage non toxique sur la queue ou sur le pelage, dans une autre cage contenant des rongeurs infestés par la même souche de parasite. Les animaux bénéficient d’enrichissements de milieu tels que des tunnels en plastique ou en carton, des Aspen bricks (petits bouts de bois à ronger) et des carrés de coton pour la nidification. Ces différents enrichissements permettent qu’ils aient des activités ludiques et sociales.
Choix des espèces
Le choix pour les rongeurs s’est porté sur les souris (Mus musculus) qui présentent la meilleure compatibilité avec nos différentes espèces/souches (actuellement 3 espèces, Schistosoma mansoni, Schistosoma rodhaini et Schistosoma bovis avec un total de 12 souches) et les hamsters dorés (Mesocricetus auratus) pour les 3 souches de l’espèce Schistosoma haematobium avec lesquelles la souris n’est pas compatible. Animaux adultes. Les animaux sont infestés entre 6 et 16 semaines.
Étude chez la souris de l’impact du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique des cellules hôtes : Rôle dans les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
2 340 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des transplantations de matière fécale par gavage et subissent des colites provoquées, soit par un produit dans l'eau de boisson soit par injection de cellules, avant le prélèvement de plusieurs organes. Le porteur décrit une inflammation intestinale douloureuse qu'il estime de quelques heures, et tue les souris qui perdent plus de 15 à 20 % de leur poids. Il affirme qu'aucun système in vitro comme les organoïdes ne recrée la complexité d'un "organisme entier", et justifie l'effectif de 2 340 par des groupes de dix répétés sur au moins deux expériences.
Objectifs
L'hypothèse principale du projet est que l'altération du microbiote intestinal dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI) contribue à l'altération du métabolisme énergétique des cellules humaines intestinales et immunitaires, et au développement de la maladie. Les objectifs sont donc (i) d'identifier les composants du microbiote ayant un impact sur le métabolisme énergétique des cellules et les mécanismes impliqués, (ii) de déchiffrer les conséquences des altérations du microbiote intestinal sur le métabolisme énergétique dans les maladies inflammatoires de l'intestin, et (iii) de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur le microbiote pour manipuler l'état énergétique cellulaire. La compréhension du rôle du microbiote intestinal dans la physiologie humaine est d'une importance cruciale, car il est impliqué dans de nombreuses maladies humaines, notamment les MICI, mais aussi, le cancer, le syndrome métabolique et les troubles neuropsychiatriques.
Bénéfices attendus
Ce projet représente un programme de recherche complet aux multiples bénéfices susceptibles de découler de ces travaux : - la caractérisation de la modulation fine du métabolisme énergétique des cellules hôtes par le microbiote intestinal ; - l'identification des principaux acteurs microbiens dans ces processus ; - l’identification de nouvelles stratégies thérapeutiques potentielles dans les maladies inflammatoires de l'intestin et probablement dans plusieurs autres maladies humaines affectées par le microbiote intestinal (maladies inflammatoires rhumatologiques, maladies métaboliques, cancer…). Les résultats obtenus chez la souris seront confrontés à des données obtenues à partir d’échantillons humains, ce qui ouvrira la voie aux développements de nouvelles interventions thérapeutiques. Ce projet va donc relever des défis importants en produisant des résultats d’avant-garde pour une meilleure compréhension du dialogue entre microbiote et cellules humaines. Ces résultats ouvriront la voie au développement de nouveaux traitements pour les dans les maladies inflammatoires de l'intestin d'abord, puis pour de nombreuses autres maladies affectées par une altération du microbiote.
Procédures
*Transplantation fécale : un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) +/- un gavage intragastrique unique (2 secondes) *Transplantation fécale: un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- Colite induite par traitement dans l’eau de boisson pendant 7 jours *Transplantation fécale : un gavage intragastrique (2 secondes) par jour, trois jours de suite +/- Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) *Gavage intragastrique (2 secondes) une fois par jour durant 4 à 5 semaines ou 8-12 semaines +/- Colite induite par le transfert adoptif : une injection intrapéritonéale unique (2 secondes) Chaque point (*) représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.
Impact sur les animaux
Le projet comprend différentes techniques d’administration basique (gavages, injections intrapéritonéales ou encore intraveineuse) pouvant causer un stress et un inconfort pour l’animal lors de la contention et de la réalisation du geste. Les modèles de colites sont associés à des effets indésirables attendus. Dans ces modèles la douleur imposée aux animaux est liée à l’inflammation intestinale qui n'entraîne pas la mort de l'animal. On peut estimer que son intensité sera légère ou modérée au maximum et qu’à ce niveau, sa durée sera de quelques heures au maximum.
Devenir
L’ensemble des animaux (n= 2340) sera euthanasié à la fin de la période de maintien afin de pouvoir réaliser les différents prélèvements d’organes et réaliser les analyses nécessaires au projet de recherche. Sur chaque animal, plusieurs organes sont prélevés en entier pour analyse ce qui impose une euthanasie.
Remplacement
Malgré le développement et l’utilisation de modèles non animaux tels que les organoïdes ou les systèmes d’intestin artificiel, un système vivant est nécessaire pour étudier les acteurs mis en jeu dans les interactions complexes entre le microbiote intestinal et son hôte en situation basales et inflammatoires. A l’heure actuelle il n’est donc pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires et microbiens rentrant en jeu.
Réduction
Nous limiterons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. Du fait des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Le nombre d’animaux utilisés par groupe est basé sur notre expérience de plus de 15 ans d’utilisation des modèles en question. Pour prendre en compte la variabilité biologique et assurer la robustesse des résultats obtenus, nous avons besoin de réaliser les expériences décrites dans des groupes expérimentaux de 10 souris et ce dans au minimum 2 expériences indépendantes (10 x2 = 20 souris en tout par condition). Le recours à une troisième expérience indépendante ne sera réalisé qu’en cas d’interprétation impossible des résultats après la 2eme expérience. Ce projet impliquera donc un maximum de 2340 animaux. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer. D’une façon générale, les modèles seront testés avec un seuil de validité de 5%. Nous utiliserons des tests statistiques non paramétriques car les conditions de normalités ne sont fréquemment pas remplies.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Le personnel impliqué dans le projet est formé en continu pour garantir leur compétence et une veille scientifique et technique en continue. Il y aura une vérification quotidienne des animaux et une observation individuelle hebdomadaire à l’occasion des interventions d’entretien (litière/abreuvement/nourriture). Les animaux seront hébergés en isolateur dans des cages standards par groupes de sexe identique (4-6 souris/cage). Du papier absorbant à déchiqueter, des buchettes de bois à grignoter et des tunnels en plastique pour se cacher seront ajoutés dans les cages. Les souris recevront à volonté un aliment standard et de l’eau stérilisé. La litière sera constituée de copeaux stérilisés. Points limites en dehors des situations d’inflammation intestinale: Si l'expérimentateur observe les critères suivants, une euthanasie sera pratiquée : - Perte de poids > 15% par rapport à la première mesure - Dégradation de l’état général de l'animal : difficulté de mobilité, dos vouté, état du pelage (poil hérissé). - Problème lors du gavage ou de l’injection avec agitation anormale ou trouble de la respiration/saignement après le geste. Points limites dans les deux modèles d’inflammation intestinale : Si l'expérimentateur observe les critères suivants, une euthanasie sera pratiquée : - Perte de poids >20% sur la durée de l'expérimentation en comparaison avec le poids de J0 (début de la procédure DSS ou injection cellules). - Dégradation de l’état général de l'animal : difficulté de mobilité, dos vouté, état du pelage (poil hérissé). - Problème lors du gavage ou de l’injection IP avec agitation anormal ou trouble de la respiration/saignement après le geste.
Choix des espèces
La souris est une espèce de référence en immunologie, microbiologie et métabolisme, qui sont les thématiques de notre projet. La souris est un modèle d’étude très largement utilisé dans le cadre de l’étude de pathologies intestinales humaines. Les souris seront utilisées à l’âge adulte, entre 6 et 14 semaines. Les souris axéniques seront colonisées avec les microbiotes d’intérêt dès leur sevrage (3-4 semaine de vie) mais les autres étapes ne se feront qu’à partir de l’âge adulte (minimum 6 semaines de vie). La colonisation le plus proche possible du sevrage permet d’éviter les altérations du système immunitaire observée chez les souris axéniques colonisées à l’âge adulte Apres colonisation de souris axéniques, il est nécessaire d’attendre 3 semaines pour que le microbiote et le système immunitaire se stabilise.
Knock-down de la Cx43 dans le CVD : Impact sur le contrôle de la balance énergétique dans un contexte d’obésité induite par l’alimentation
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
84 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'injection intracérébrale sous anesthésie, un régime enrichi en graisses et en sucre pendant dix-sept à vingt-neuf semaines, puis des tests métaboliques avec mise à jeun de quatorze heures, gavage de glucose et sept prélèvements de sang à la queue. Le porteur cible la connexine 43 de cellules gliales pour comprendre la régulation de l'appétit, et renvoie les retombées contre l'obésité au conditionnel et au long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ne permet d'étudier ces cellules gliales et conclut au recours à la souris.
Objectifs
L’obésité et les troubles métaboliques associés constituent un enjeu de santé publique majeur et une préoccupation planétaire. L’obésité est une maladie chronique de la nutrition qui trouve son origine, en partie, dans des dysfonctionnements de plusieurs structures nerveuses. Ces structures cérébrales intègrent les informations liées à nos réserves adipeuses et à l’alimentation. Elles participent au contrôle de l’appétit pour maintenir un poids corporel stable. Malgré une recherche intense dans le domaine, les mécanismes régulant notre appétit restent mal compris et les stratégies pour lutter efficacement et durablement contre l’obésité sont limitées. Ce projet vise à mieux comprendre comment une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régule la prise alimentaire et à identifier des cibles thérapeutiques potentielles. Il étudie le rôle dans la régulation de l’appétit et du poids corporel de cellules non-neuronales appelées cellules gliales. Plus spécifiquement, il étudie un acteur cellulaire, la connexine 43 qui contribue à la communication entre cellules gliales et entre neurones et cellules gliales. Ce projet permettra d’étudier le rôle fonctionnel joué par la connexine 43 dans un contexte d’alimentation enrichie en graisses et en sucres. La moitié des animaux (nourris sous un régime standard ou hypercalorique) auront l’expression de la connexine 43 réduite pendant le développement de l’obésité pour tester la propension des animaux à prendre du poids sous régime enrichi en graisses et en sucre. L’autre moitié des animaux auront l’expression de la connexine 43 réduite alors que l’obésité est déjà installée pour déterminer si la communication des cellules gliales par les connexines 43 modifie le contrôle de prise alimentaire, la glycémie ou le poids corporel chez des souris obèses.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à mieux comprendre comment les cellules gliales d’une structure cérébrale en relation avec le tube digestif régulent la prise alimentaire et la glycémie. Les données recueillies apporteront un éclairage nouveau sur l’importance fonctionnelle de la communication des cellules gliales : 1) dans la propension des animaux à développer une obésité lors d’un régime enrichi en graisses et en sucre, 2) dans le contrôle de prise alimentaire ou du poids corporel lors d’une obésité déjà installée. A plus long terme, ces résultats pourraient ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques dans le traitement de l’obésité et de ses comorbidités.
Procédures
A partir de 5 semaines d’âge, la moitié des animaux est alimentée avec un régime enrichi en graisse et en sucre, et ce, jusqu’à la fin des procédures (pendant 17 semaines pour la procédure 1 et 29 semaines pour procédure 2). Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale sous analgésie préopératoire et anesthésie générale (durée 45 minutes) pour l’injection intracérébrale d’un composé qui cible la connexine 43. Les animaux seront ensuite hébergés en cage individuelle pour la durée restante du projet, pour leur sécurité (risque de blessures par les congénères) et pour les mesures individuelles nécessaires pour déterminer l’impact de la réduction de la connexine 43 sur le contrôle de la glycémie et la prise alimentaire. Les animaux subiront un (procédure 1) ou deux (procédure 2) test(s) métaboliques (4 h), au cours duquel une solution de glucose sera administrée par voie orale (moins d’1 min), puis des prélèvements sanguins seront réalisés à la veine caudale sous anesthésie locale pour suivre l’évolution du glucose sanguin (7 prélèvements en 4 h, moins d’1 min par prélèvement). Ces tests nécessitent une mise à jeun préalable de 14 h. A l’issue de ces régimes, les animaux seront mis à mort pour les analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Les procédures utilisées ont pour objectif de tester la contribution des cellules gliales à la régulation du métabolisme et de la glycémie. La période de récupération post-opératoire est source d’inconfort et de douleur pour l’animal. Les animaux sont hébergés individuellement, pour leur sécurité durant la récupération post-opératoire et pour le suivi individuel de la consommation alimentaire et des régulations du statut glycémique. L’accomplissement de cet objectif implique le recours à une chirurgie d’injection intracérébrale. L’exposition à un régime riche en sucre et en graisse ne génère aucune douleur ou inconfort, mais nécessite des pesées régulières et une manipulation des animaux qui peut être une source d’inconfort. L’administration orale de glucose cause un inconfort dû à la contention de l’animal et à l’administration elle-même. Ces administrations sont précédées d’une mise à jeun indispensable à la standardisation du statut glycémique, limitée à 14 h. Cette mise à jeun est une source de stress pour les animaux. Le suivi du statut glycémique requiert des prélèvements répétés d’une goutte de sang à la veine latérale de la queue.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, des analyses histologiques post-mortems sont indispensables : 1) Pour vérifier que la région d’intérêt a correctement été ciblée; 2) et caractériser les réponses cellulaires gliales. Dans la procédure 2, les animaux « résistants » à l’obésité induite par l’alimentation, c’est-à-dire nourris avec le régime enrichi en graisses et en sucre et qui n’auraient pas eu un gain de poids supérieur ou égal à 130 % à la prise de poids moyenne de la cohorte contrôle sont mis à mort. Ces mises à mort sont réalisées avant les injections intra-cérébrale pour éviter de générer de l’inconfort chez des animaux qui ne pourront pas être utilisés dans nos expériences. Les animaux éventuellement sortis de l’étude prématurément en raison d’une souffrance non-traitable seront mis à mort.
Remplacement
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques se justifie ici car il n’existe, à ce jour, aucune méthode de substitution in vitro n’utilisant pas l’animal de laboratoire et permettant l’étude de l’implication des cellules gliales dans le contrôle de l’homéostasie glucidique, la consommation alimentaire et le poids corporel.
Réduction
Le nombre de souris nécessaire à ce projet est de 84 souris mâles. Notre expertise nous permet de définir ce nombre au plus juste compte tenu du nombre des paramètres à tester et des mesures à effectuer pour chaque lot d’animaux. Nos résultats préliminaires ont vérifié une altération de l’expression de la connexine 43 de la 3e à la 10e semaine post-chirurgie. Il s’agit ici de déterminer l’impact fonctionnel de cette réduction d’expression. Les mesures terminales à effectuer consistent en une analyse immunohistochimique pour vérifier l’efficacité de nos injections intra-cérébrales, et pour observer le nombre et de la morphologie des cellules gliales dans notre modèle. Le nombre de lots nécessaires à ces analyses dépend du nombre de variables testées dans chaque procédure. Pour chaque procédure : Présence ou absence de connexine 43 (des animaux recevront le composé qui permet de réduire l’expression de la connexine 43 et les autres animaux recevront un composé inactif) x 2 conditions différentes de régime alimentaire, soit 4 lots d’animaux. Pour l’effectif par lot, une analyse des données de la littérature indique que la quantification du nombre et de la morphologie des cellules gliales nécessite 7 - 8 animaux par lot, compte-tenu de la variabilité des mesures. Un effectif de 8 animaux par groupe est choisi ici pour prendre en compte la variabilité de ciblage des injections. Néanmoins, nous devons également prendre en compte le pourcentage d’échec, pouvant aller jusqu’à 30 %, pour induire une obésité chez la souris. Un effectif de 13 animaux par lots d’animaux soumis au régime hypercalorique est nécessaire. Ces effectifs par lot sont pleinement compatibles avec les tests métaboliques qui mobilisent 4 lots d’animaux chacuns (2 variables par expérience : composé ciblant ou non la Cx43 x 2 régimes alimentaires.
Raffinement
Les expérimentations seront effectuées par un personnel compétent et entraîné. L’état clinique des animaux sera suivi quotidiennement et tout repérage d’un état anormal fera l’objet d’une quantification par une grille de score adaptée, assortie de points limite et de points d’arrêt préétablis permettant une prise en charge adaptée. Les actes pouvant générer de la douleur seront réalisés sous analgésie et/ou anesthésie. La chirurgie d’injection intracérébrale est réalisée sous analgésie préopératoire, anesthésie locale et anesthésie générale et analgésie post-opératoire. En période post-opératoire, un suivi renforcé est mis en place. Durant les deux premiers jours post-opératoires, une alimentation sous forme de gel enrichi est disposée en fond de cage pour limiter la déshydratation et la perte de poids et une analgésie est systématiquement administrée. Les prélèvements sanguins pour dosages glycémiques seront réalisés sous anesthésie locale. La mise à mort est réalisée sous analgésie préopératoire et anesthésie générale. Les animaux seront habitués à la manipulation et à la contention avant les tests métaboliques. Ces phases d’habituation ont pour objectif de réduire l’angoisse animale et d’éviter des fluctuations importantes de la glycémie dû à la manipulation des animaux et à la contention. De plus, une habituation au retrait de la mangeoire (pendant 2 h en phase diurne les deux jours précédant la mise à jeun de 14 h) contribuera à diminuer le stress des animaux. Le maintien en hébergement individuel est nécessaire pour les mesures individuelles de prise alimentaires et les tests métaboliques. Pour limiter l’inconfort qui résulte de cet isolement, les cages transparentes pour rongeurs sont disposées de façon à permettre des contacts visuels et olfactifs avec les congénères. Par ailleurs, un enrichissement plus varié est mis en place. Deux enrichissements au choix (en plus des nids composés de lanière de papier) seront placés dans la cage et modifiés toutes les deux semaines parmi : dôme en carton, tunnel en polycarbonate rouge, bûchette en bois, tunnel en carton, cylindre de coton.
Choix des espèces
La souris est le meilleur modèle pour ces expériences puisque c’est le modèle le plus documenté dans la littérature. Des souris à partir de 5 semaines seront utilisées. Il est important de débuter les régimes obésogènes peu après le sevrage pour en maximiser les effets sur la croissance pondérale.
Rôle de l’interleukine-3 au niveau cardio-rénal et immunitaire dans l’insuffisance rénale aiguë
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système immunitaire
298 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie coupant la circulation d'un rein pendant vingt-cinq minutes pour provoquer une insuffisance rénale aiguë, suivie d'échographies et de mesures de pression artérielle, avant d'être tué à un à vingt-huit jours pour prélever ses organes. Le porteur indique que la chirurgie provoque une douleur au site opératoire et une perte de 10 à 15 % du poids, prises en charge par des antalgiques. L'objectif déclaré est de tester si le blocage d'une molécule inflammatoire, l'interleukine-3, limite les atteintes cardiaques et rénales, le porteur jugeant le recours à l'animal "nécessaire".
Objectifs
Notre étude vise à évaluer l’implication d'une molécule inflammatoire dans l’insuffisance rénale aiguë. Nous travaillons sur un modèle murin chez qui nous induisons une insuffisance rénale aiguë via une chirurgie visant à couper la circulation sanguine dans le rein pendant 25 minutes, on parle d'un modèle d'ischémie reperfusion rénale. Nous allons analyser chez des animaux contrôles et des animaux ne possédant pas notre molécule inflammatoire d'intérêt les conséquences de l'ischémie reperfusion rénale au niveau du rein, du cœur mais également au niveau immunitaire. L'objectif de cette étude est d'évaluer si l'inhibition de cette molécule inflammatoire est en mesure de réduire les conséquences cardio-rénales induites par une insuffisance rénale aiguë.
Bénéfices attendus
Nous étudions le syndrome cardio-rénal, soit la survenue d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale ainsi que les conséquences immunitaires dans ces organes (cœur et reins). Notre étude s'intéresse plus particulièrement au rôle d'une molécule produite lors d'une inflammation. Il est rapporté dans la littérature que cette molécule inflammatoire est associée à une surmortalité dans différentes maladies telles que dans les infections graves. L’inhibition de cette molécule est désormais une potentielle cible thérapeutique. Mieux comprendre le rôle du système immunitaire dans le développement des complications à long terme qui succèdent à l'insuffisance rénale pourrait permettre de dégager de nouvelles thérapeutiques et un meilleur suivi de ces patients.
Procédures
Les animaux de la série 1 sont soumis à 2 procédures : - procédure chirurgicale d'ischémie reperfusion rénale sous anesthésie (35 minutes) avec une mise à mort des animaux à j1, j3 j7 ou J28 -procédure chirurgicale d'ischémie reperfusion rénale sous anesthésie (35 minutes) combiné à une échocardiographie sous anesthésie avant chirurgie et au moment de l’euthanasie de l’animal (2 fois 10 min) et à une mesure de la pression artérielle sur animal vigile chaque jour pendant une semaine avant la chirurgie pour habituer l’animal, puis au moment de l’euthanasie de l’animal (6 fois 10 minutes).
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales s'accompagnent de douleur au niveau du site opératoire. Un traitement antalgique pré- et post-opératoire systématique sera administré pour diminuer les douleurs liées à la chirurgie. La potentielle persistance de la douleur au-delà de 24h sera systématiquement recherchée et traitée. La perte de poids est une complication attendue suite à la chirurgie, celle-ci n'excède pas 10-15% du poids corporel et régresse quelques jours après. La diminution de l'activité est également attendue et habituelle et n'excède pas 48 heures au-delà des différentes procédures. L’échocardiographie est réalisée sous anesthésie et n’induit pas de nuisance spécifique. La mesure de la pression artérielle peut induire un stress à l’animal du fait de la contention, ce stress sera atténué par une habituation des animaux à ce type de procédure préalablement à la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin des procédures aux différents temps de l'étude (j1, j3, j7, j28) en concervant tous les organes que nous avons à analyser.
Remplacement
Le recours à l'expérimentation animale est nécessaire pour ce projet car il n’existe pour l’heure aucune autre technique que l’expérimentation in vivo pour réaliser les procédures expérimentales prévues dans ce projet. Les modèles in vitro, ex vivo ou in silico ne permettent pas de reproduire actuellement les organes complexes et surtout leur interaction et leur effet sur le corps entier. Le modèle murin a été retenu pour sa proximité avec les situations cliniques humaines, il est régulièrement cité en référence dans les publications relatives à l’insuffisance rénale aigüe et maitrisé par les équipes scientifiques du laboratoire.
Réduction
Grâce à des analyses statistiques, les groupes expérimentaux ont été conçus de façon à réduire à son minimum le nombre d’animaux utilisé. Nous optimiserons nos expériences en réalisant le plus grand nombre possible d'analyses et de prélèvements d’organes sur un même animal.
Raffinement
Les gestes chirurgicaux sont maîtrisés par le personnel de l’étude permettant ainsi une manipulation plus aisée conduisant à un réveil et à une récupération plus rapide en post-opératoire. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux lors des procédures expérimentales, les mesures suivantes seront prises : Administration systématique d'antalgique par voie intra péritonéale à h8 post-chirurgie pour tous les animaux, surveillance 2 fois/jour pendant les 3 premiers jours après chirurgie et administration à h24, h36, h48 chez les animaux montrant des signes de mal-être voire mise à mort si le traitement est sans effet au-delà puis surveillances chaque jour par le personnel de l'animalerie pendant toute la durée du protocole.
Choix des espèces
Le modèle murin présente de nombreux avantages pour notre projet de recherches. Outre sa petite taille et son hébergement aisé, le modèle d’ischémie-reperfusion rénale comporte de nombreuses similitudes par rapport à une insuffisance rénale aiguë chez l’Homme. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d’analyser l’effet d’une absence/surexpression d’un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour les procédures expérimentales auront le fonds génétique le plus utilisé pour les modèles transgéniques. Nous utiliserons des souris mâles jeunes adultes de 4-8 semaines environ afin de permettre une récupération optimale après IRr et de grader des paramètres physiologiques normaux. Seuls des mâles seront utilisés dans ce protocole, car les femelles présentent une protection relative à l’insuffisance rénale induite par ischémie reperfusion rénale liée aux œstrogènes Le stade de développement des animaux correspond à de jeunes adultes afin de mimer au mieux les conditions de pathologies chez l'Homme.
l’inhibiteur de protéase de leucocytes secrétoires : protection contre le remodelage cardiaque post-infarctus
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal subit une chirurgie cardiaque sous anesthésie provoquant un infarctus par ligature d'une artère coronaire, trois échographies sous anesthésie et l'administration répétée d'une protéine pendant quatre semaines, avant d'être tué pour analyser ses tissus. Le porteur indique que l'insuffisance cardiaque induite peut entraîner des difficultés respiratoires et une perte de poids, la mise à mort étant déclenchée au-delà de 20 % de perte de poids ou en cas de prostration. Il présente l'objectif comme une preuve de concept d'un traitement contre l'insuffisance cardiaque, les bénéfices pour les patients restant lointains.
Objectifs
L’objectif du projet présenté ici est d’étudier les effets cardioprotecteurs d’une protéine anti-inflammatoire contre la défaillance cardiaque suite à un infarctus. Dans un travail précédent, nous avons mis en évidence le rôle cardioprotecteur de cette protéine produite dans l’organisme pour se protéger en cas de lésions d’un organe. Administrer cette protéine anti-inflammatoire permet de réduire la taille de l'infarctus sur le court-terme . L’objectif de notre projet est d’évaluer si cette substance peut avoir un effet protecteur contre l’insuffisance cardiaque sur le long-terme.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’obtenir une preuve de concept de l’utilisation de cette protéine anti-inflammatoire comme traitement protecteur contre le remodelage ventriculaire post-infarctus qui conduit à l’insuffisance cardiaque, pathologie chronique invalidante. Ce traitement aura un impact sur la santé publique car il devrait permettre de diminuer les taux de mortalité post-infarctus et les coûts que cela engendre pour la société (coûts directs de maladie pour la sécurité sociale, d’hospitalisations à répétitions et couts indirects d’arrêt de travail). Les maladies cardiovasculaires représentent la première cause de mortalité dans le monde. De plus, la morbidité par insuffisance cardiaque continue à croitre car, de plus en plus de patients sont pris en charge rapidement pour leur infarctus et donc ont la vie sauvée. L’insuffisance cardiaque génère des coûts sociétaux directs (hospitalisations à répétition) et indirects (arrêt de travail). Cette maladie a un impact significatif sur la qualité de vie des patients, comme l'a récemment montré l'enquête "Handicap-Santé". Plus de la moitié des patients atteints d'insuffisance cardiaque avaient de fortes difficultés à réaliser les activités habituelles (hygiène et habillage) en raison d'un " trouble de la santé ". Les conséquences sur l'emploi sont également notables pour les patients âgés de 25 à 60 ans, avec un taux de population active réduit à 56,6% pour les patients coronariens, et à 38,8% pour les patients atteints d'insuffisance cardiaque (contre 78% dans la population sans maladie cardiovasculaire). L'insuffisance cardiaque, causée à 90% par l'infarctus du myocarde, le diabète et l'hypertension artérielle, représente 1 million de patients avec des coûts médicaux estimés à 2,5% des dépenses totales de santé publique.
Procédures
Les animaux subiront une procédure chirurgicale sous anesthésie générale durant 1 heure (seuls la peau et les muscles entre deux côtes seront incisés) ainsi que trois échographies sous anesthésie gazeuse (durant chacune 30 minutes maximum). De plus le traitement par la protéine cardioprotectice sera administrée quotidiennement pendant 3 jours, puis tous les deux jours pendant 4 semaines.
Impact sur les animaux
Les animaux vont subir des nuisances suite aux injections que ce soit d'anesthésie pour le protocole chirurgical ou pour la mise à mort mais également pour l’administration de la protéine anti-inflammatoire. Les animaux seront soumis à deux types d’anesthésie : une générale pour la chirurgie et une gazeuse pour les trois echocardiographies prévues dans le projet. Des effets indésirables peuvent apparaitre dans la phase de réveil : somnolence, douleur, déshydratation. L'insuffisance cardiaque qui doit apparaitre suite à la ligature de la coronaire peut engendrer des nuisances telles que des difficultés respiratoires (essoufflement) ou une perte d'appétit conduisant à une perte de poids. Pour éviter tous ces effets indésirables, les souris feront donc l’objet d’une surveillance accrue par l’expérimentateur afin de contrôler que les nuisances n'atteignent pas les points limites nécessitant une mise à mort. Les points limites suivants seront considérés pour un arrêt du protocole : perte de poids supérieure à 20%, isolement et prostration signe de souffrance, difficultés respiratoires et complication sévère de la cicatrice .
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de réaliser des examens sur tissus post-mortem.
Remplacement
Nous ne pouvons pas remplacer ce modèle in vivo car l’évaluation de la substance cardioprotectrice doit maintenant être réalisée dans une véritable étude pré-clinique long-terme permettant de mimer ce qui se passe chez l’homme (l’évaluation des effets court-termes de la protéine ayant déjà été réalisée dans nos études antérieures in vitro). Le protocole proposé ici est le seul protocole disponible permettant d’étudier la pathologie chronique de la défaillance cardiaque.
Réduction
Pour une étude sur le long-terme, condition mimant les patients qui survivent, plusieurs mesures seront réalisées et répétées dans le temps afin de récolter le maximum d’informations sur les effets du traitement tout en limitant le nombre d’animaux. Le nombre d’animaux à inclure dans les groupes de traitement ont été définis à priori par un calcul statistique. Des comparaisons statistiques seront également réalisées sur les résultats obtenus. Pour limiter le nombre d’animaux, plusieurs mesures seront réalisées sur le même animal et des examens seront pratiqués en utilisant l’animal comme contrôle interne. Les tests d’évaluation seront combinés afin de limiter le nombre d’animaux : échocardiographie non-invasive, analyse de sang.
Raffinement
Conditions d’hébergement: Les souris seront stabulées dans l’animalerie au moins 1 semaine après la livraison et avant le début de l’expérimentation. Elles seront plusieurs par cage avec un milieu enrichi (maisons en carton) pour éviter le stress de l’isolement. Protocole : -Les échographies sous anesthésie générale sont pratiquées avant toute chirurgie afin que chaque animal soit son propre contrôle. - L’administration d’une pré-médication permet de limiter le stress de la chirurgie. - La douleur engendrée par la chirurgie sera limitée au maximum en diminuant la taille des incisions. Après la chirurgie et la phase de réveil en unité de soins intensifs, les souris seront regroupées dans les cages avec milieu enrichi. Ceci permettra également de les stimuler dans la phase post-opératoire. Elles seront ensuite surveillées quotidiennement afin de dépister tout signe de souffrance, de complications post-opératoires et d’angoisse.. Cependant, si aucune solution n'est possible,et que les points limites sont atteints, l'expérience sera arrêtée le plus rapidement possible.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour développer les modèles d’étude de l’équipe car l’Homme et la souris possèdent 99% de gènes homologues. - la souche choisie est celle qui est reconnue internationalement et qui sera utilisée pour les études règlementaires pré-cliniques futures (toxicité, pharmacologie...) - Les conditions d’hébergement sont compatibles avec celles proposées par l’Institut où seront réalisées les expériences - les animaux sont de petite taille et les coûts engendrés faibles Jeunes adultes mâles de 7 – 8 semaines : les animaux ont un poids standard à cet âge, ils ont moins de tissu adipeux donc cela est plus facile à gérer pour les protocoles d’anesthésie. La taille de la trachée est également compatible avec l’utilisation de la sonde oro-trachéale de notre appareil d'assistance respiratoire.
Evaluation de candidats médicaments contre les crises vaso-occlusives chez un modèle murin de drépanocytose
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Génétiquement modifiées pour développer une drépanocytose, elles présentent anémie, atteintes du foie, des reins et de la rate et troubles respiratoires liés aux crises douloureuses, et reçoivent des prélèvements sanguins répétés ainsi qu'une injection d'hémine dans le sinus de l'œil sous anesthésie, avant d'être tuées. Le porteur indique que la fréquence, la durée et la voie d'administration des composés testés dépendent de la demande d'un "sponsor". Il conclut que le remplacement par culture cellulaire est impossible et que le recours à ce modèle est "indispensable".
Objectifs
Il est aujourd’hui estimé qu’il naît chaque année dans le monde, plus de 300 000 enfants atteints de drépanocytose. La drépanocytose (parfois appelée « anémie falciforme ») est une maladie génétique qui touche l’hémoglobine, la protéine contenue dans les globules rouges qui sert à transporter l’oxygène à travers le corps. Dans la drépanocytose, la forme anormale adoptée par cette protéine engendre des déformations des globules rouges qui deviennent fragiles, rigides et qui bouchent les capillaires sanguins. Ces anomalies favorisent l’anémie, les crises vaso-occlusives douloureuses causées par une mauvaise circulation sanguine et un risque accru d’infections. La complication la plus grave de ces crises est la survenue d’un syndrome thoracique aigu dans environ 20 % des cas, se manifestant par des douleurs thoraciques pouvant aboutir rapidement à une situation de détresse respiratoire. Le caractère imprévisible des crises vaso-occlusives et les dommages tissulaires sévères rendent extrêmement difficile l'établissement d'un traitement efficace, expliquant pourquoi, à ce jour, il n'existe encore aucun traitement curatif applicable à l'ensemble de la population drépanocytaire. La complexité de cette maladie nécessite de pouvoir faire la preuve de concept et d’efficacité dans un organisme intégré comme l’animal. Ce projet a pour objectif d'étudier l'effet de nouvelles molécules contre les crises vaso-occlusives dans un modèle murin transgénique développant la maladie (modèle Townes). Ce travail permettra également de comparer les candidats médicaments au traitement de référence de cette maladie. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagées afin de couvrir au mieux les potentiels effets recherchés sur la sévérité et la progression de cette maladie dans le modèle murin utilisé.
Bénéfices attendus
La crises vaso-occlusive étant la première cause de consultations aux urgences et d’hospitalisation des patients atteints de drépanocytose, ce projet propose d'évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques afin d’améliorer la prise en charge des patients drépanocytaires. Ce projet permettra également de comparer de futurs candidats médicaments aux traitements actuels. Plusieurs voies d’administration de ces composés seront envisagés afin de couvrir au mieux les effets potentiels sur la sévérité et la progression des manifestations cliniques de la drépanocytose telles que les crises vaso-occlusives.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvement sanguins suivant une cinétique de prélèvement définis par le sponsor (en sachant qu'un prélèvement sanguin de 7,5% du volume total nécessite une semaine de récupération). Les animaux recevront l'administration des composés à tester. La fréquence, la durée et la voie d'administration des composés dépendra de la demande du sponsor. Sur animal anesthésié à l'isoflurane 3%, une injection intraveineuse d'hémine au niveau du sinus rétro-orbital sera réalisée. Enfin, un prélèvement en point final de sang sera effectué puis un prélèvement d'organes (selon la demande du sponsor) aura lieu après mise à mort de l'animal pour histologie, analyse cellulaire, moléculaire et fonctionnelle ex- vivo.
Impact sur les animaux
Les effets indésiréables attendus sont ceux induits par le phénotype drépanocytaire spontanné des souris transgéniques Townes. Les souris Townes présentent une anémie, une demi-vie érythrocytaire raccourcie, une atteinte hépatique, rénale et splénique, une augmentation de l'érythropoïèse et des troubles respiratoires induits par les crises vaso-occlusives. Ces souris présentent un phénotype drépanocytaire dont l’ensemble des manifestations cliniques de la maladie serviront de paramètres d’évaluation d’efficacité de l’ensemble des composés pharmacologiques à tester. Ce projet étant classé à un stade sévère, il fera l'objet d'une évaluation rétrospective.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure 1 et des prélèvements sont réalisés pour étudier l'effet des composés testés.
Remplacement
Lorsque cela est possible les composés sont évalués sur culture cellulaire ou organe isolé préalablement aux tests animaux afin de remplacer ou de réduire le nombre d’animaux impliqués dans ce protocole. Cependant, le remplacement total de l'expérimentation animale par des essais sur culture cellulaire n'est pas possible pour l'étude de la drépanocytose. En effet, les modifications physiopathologiques nécessaires au développement de la maladie sont très complexes et nécessitent la mobilisation d'effecteurs moléculaires et cellulaires nombreux. Il est impossible d'explorer l'ensemble de ces événements par une approche subsitutive de culture cellulaire. Il est donc important de pouvoir disposer de modèles physiologiques pertinents (modèle Townes) pour permettre une recherche fondamentale et appliquée tout en évaluant l'efficacité de nouvelles molécules à visée thérapeutique.
Réduction
Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante (test non-paramétriques de Mann-Whitney et Kruskal Wallis) pour pouvoir interpréter et valider les résultats d’expérience, tout en prenant en compte la disponibilité et la fragilité du modèle transgénique Townes.
Raffinement
Les expérimentateurs et les animaliers sont formés aux différentes manipulations garantissant le bien-être animal. Le suivi des compétences est reporté de manière individuelle sur un livret de compétence mis à jour régulièrement. Les souris seront hébergés selon les conditions de la réglementation 2010/63, à raison de 6 animaux par cage maximum, en unités ventilées. Un cycle jour/nuit de 12h/24 est assuré de façon automatique et la température est maintenue constante à 22°C. Leur environnement sera enrichi (igloo, buchette) afin d'éveiller leur sens, leur curiosité, leur activité physique. Les animaux seront pesés et leur aspect général sera suivi quotidiennement en accord avec le comité de suivi du bien-être animal de notre établissement et reporté sur une feuille clinique par les animaliers et les expérimentateurs. L’atteinte d’un point limite défini dans la procédure avant la fin de l’expérimentation entrainera la mise à mort de l'animal. Ce projet étant classé à un grade sévère, la Structure en charge du Bien-Etre Animal sera impliquée dans le bon déroulé de l'expérience et ce projet fera l'objet d'une évaluation rétrospective.
Choix des espèces
Dans ce projet, les expériences in vivo sont indispensables car il n’existe pas de procédé in vitro ou in silico pour évaluer d’une part la délivrance des composés mais également leur efficacité sur les manifestations les plus fréquentes de la drépanocytoses telles que les crises vaso-occlusives. La modèle murin Townes a été choisi car il reproduit au mieux génétiquement et cliniquement la pathologie drépanocytose. Les souris utilisées auront entre 7-12 semaines au début de la procédure afin d'avoir des souris adultes avec un système immunitaire mature et ayant développé la pathologie.
Analyse de la non-réponse aux antibiotiques dans le cadre des infections urinaires à Escherichia coli
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Système urogénital
2 350 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, une cinquantaine en gravité sévère. Des femelles sont infectées par Escherichia coli au moyen d'un cathéter posé dans la vessie sous anesthésie, puis reçoivent des antibiotiques en sous-cutané toutes les deux à douze heures, avant d'être tuées pour prélever vessie et reins. Le porteur indique que la plupart ne montrent pas de signe extérieur mais que des souches virulentes peuvent provoquer perte de poids et mortalité, une phase préliminaire de test de nouvelles souches pouvant entraîner une mortalité importante. L'objectif déclaré est de comprendre pourquoi des bactéries persistent malgré un traitement jugé efficace en laboratoire, un modèle que le porteur qualifie d'"indispensable".
Objectifs
Les infections urinaires sont parmi les infections bactériennes les plus fréquentes chez l’Homme (150 millions d’épisodes par an dans le monde). La bactérie responsable dans 80% des cas est nommée Escherichia coli (E.coli). On distingue les infections urinaires hautes qui touchent les reins (pyélonéphrite), provoquent de la fièvre voire une infection sévère pouvant nécessiter une hospitalisation, des infections urinaires basses ne touchant que la vessie (cystite). Les cystites sont extrêmement communes chez la femme puisqu’on considère qu’une femme sur deux souffrira d’une cystite au cours de sa vie. Dans un tiers des cas, ces cystites récidivent malgré un traitement antibiotique adapté et cela est à l’origine d’une altération importante de la qualité de vie des femmes atteintes. De plus, ces infections sont à l’origine d’une consommation importante d’antibiotiques, facteur favorisant l’apparition de bactéries multi résistantes (résistantes à de nombreux voire à tous les antibiotiques disponibles). La lutte contre la résistance aux antibiotiques un problème majeur de santé publique est l’un des volets prioritaires définis par l’Organisation Mondiale de la Santé. Une meilleure compréhension des infections urinaires est donc indispensable pour l’amélioration de la qualité de vie de millions de femmes autant que pour la diminution de la consommation d’antibiotiques au sein de la population générale. La résistance aux antibiotiques n’est pas la seule responsable du caractère récidivant des infections urinaires et des données expérimentales tendent à montrer que des bactéries survivent dans la vessie malgré le traitement antibiotique. Ces bactéries sont dormantes, comme en hibernation et tolèrent la présence de l’antibiotique sans être tuées. L’objectif de notre projet est de comprendre la discordance entre la non-réponse aux antibiotiques (persistance de bactéries dans les vessies) et la supposée sensibilité à l’antibiotique dans les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville (examen bactériologique des urines). Pour ce faire, nous utiliserons un modèle d’infection urinaire à E.coli de souris provoquant une infection de la vessie (cystite) et des reins (pyélonéphrite).
Bénéfices attendus
La discordance entre les tests habituellement réalisés en laboratoire de ville et l’évolution des symptômes de la maladie est fréquente dans les infections urinaires. La récidive de ces infections pose un problème d’altération de la qualité de vie des malades et de santé publique par la consommation d’antibiotiques qu’elle engendre. Cependant, les causes d’échec du traitement ne sont pas clairement identifiés et probablement multifactoriels. Nous pensons que l’analyse directe de ce phénomène chez l’animal nous permettra d’améliorer le traitement en l’adaptant au mieux au comportement de la bactérie dans le site infecté.
Procédures
-L’infection est réalisée en plaçant un cathéter (une petite sonde) au niveau de l’orifice par lequel s’écoulent les urines de la souris et jusque dans la vessie et en injectant doucement 50 microlitres de bactéries qui vont infecter la vessie et remonter jusque dans les reins . Ce geste est réalisé sous anesthésie générale. Cette étape d'infection dure environ 3 minutes par animal. -Le traitement antibiotique est réalisé par des injections sous cutanées d’antibiotiques sur un animal vigile (durée du geste d'environ 15 secondes). La fréquence (toutes les 2 à 12 heures) dépend de l’antibiotique ainsi que la durée du traitement (24 à 48 heures). -Les urines sont recueillies au cours d’une miction spontanée ou par pression abdominale douce. -La vessie et les reins sont ensuite prélevés stérilement après euthanasie. -La durée de l'infection est variable de 60 heures à 17 jours.
Impact sur les animaux
Les souris ne présentent pas de signe extérieur d’infection dans l'immense majorité des cas. Leur comportement est normal. Elles urinent de manière normale sans signe extérieur évoquant de la douleur au moment de la miction. Dans d'exceptionnels cas, si la souche utilisée est particulièrement virulente (agressive), les souris peuvent présenter des signes d'infection : diminution de la mobilité, perte de poids. La mortalité des suites de l’infection urinaire est exceptionnelle dans ce modèle de l’ordre de 3%. Une étude préliminaire sera réalisée sur 48 heures si une nouvelle souche est utilisée dont l'agressivité n'est pas connue. Elle va permettre de ne pas utiliser des souches trop agressives dans la suite du projet, mais dans cette procédure une mortalité importante pourrait être observée. Les souches agressives ne seront pas utilsées par la suite. Les produits administrés ne sont pas douloureux. Les administrations répétées d’antibiotique pourront avoir un impact sur le bien-être animal et provoquer un stress auquel nous serons particulièrement attentifs.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de prélever stérilement leurs organes (vessie, reins) après la mort pour analyser les bactéries qui s'y trouvent.
Remplacement
L’accessibilité aux organes touchés par l’infection urinaire (reins et vessies) en dehors des urines reste très limitée chez l’Homme. Or l’étude simple des urines ne permet pas d’expliquer la récidive de l’infection urinaire. L’analyse des bactéries dans les reins et les vessies est donc nécessaire et impossible sans modèle animal. L’étude des bactéries et de la réponse à l’antibiotique dans les tubes à essais est trop simpliste et ne rend pas compte des facteurs multiples qui sont impliqués dans un organisme entier.
Réduction
Grâce à une analyse statistique, nous réduisons au minimum le nombre de souris utilisées tout en s’assurant d’obtenir des résultats statistiquement significatifs c'est à dire qui nous permettent de conclure de manière fiable sur le plan mathématique. Les contrôles ayant été infectés par la même souche seront comptabilisés dans les analyses des différentes procédures ce qui pourra permettre de diminuer le nombre de contrôles dans une procédure ultérieure. De nombreuses analyses dans les tubes à essais seront réalisées en amont pour choisir les bactéries, les antibiotiques et les conditions les plus pertinentes afin de réduire les animaux utilisés. Nous optimisons au maximum nos expériences pour réaliser le plus d’analyses possibles à partir d’un même animal. Tous les organes prélevés sont congelés pour pouvoir les réanalyser au besoin ultérieurement.
Raffinement
Afin de réduire au minimum la douleur et la souffrance qui pourraient être ressenties par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions. Les souris seront hébergées dans un environnement enrichi c'est à dire avec des cotons pour jouer par exemple, avec une semaine d’adaptation avant l’expérimentataion. Un suivi quotidien sera réalisé. L’infection urinaire est réalisée sur une souris anesthésiée. Les souris seront euthanasiées si leur état se dégrade brusquement ou si elles présentent un état de souffrance. Une grille de score est prévue à cet effet qui sera également remplie quotidiennement.
Choix des espèces
Le choix de la souris comme espèce animale pour réaliser les expériences de ce projet est pertinent car l’infection urinaire chez la souris est très proche de celle chez l’Homme. Ce modèle est utilisé depuis de nombreuses années dans la littérature scientifique. Les souris utilisées seront des souris femelles car les infections urinaires sont plus fréquentes chez la femme. Ces souris seront des souris adultes de 8 semaines car l'infection urinaire survient le plus fréquemment chez la femme adulte jeune.
Étude du rôle d’un récepteur au froid (TRPM8) dans les modifications hémodynamiques observées lors d’une anesthésie et d’une hypothermie chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
34 souris vont être utilisées dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Chaque souris est endormie pendant soixante à quatre-vingts minutes, le cou incisé pour poser une sonde de pression dans la carotide, puis refroidie à 33 °C et exposée à un agent stimulant un récepteur au froid, avant d'être tuée. Le porteur indique que l'étude porte sur des souris génétiquement modifiées possédant ou non ce récepteur, pour comprendre comment le froid modifie la pression et le débit sanguins sous anesthésie. Il précise que les tissus prélevés serviront aussi à "entretenir les compétences du laboratoire", et présente les retombées cliniques comme lointaines.
Objectifs
Les maladies vasculaires liées à l’obstruction d’un vaisseau sanguin (Accident Vasculaire Cérébral, infarctus, etc.) sont traitées « mécaniquement » (en retirant ce qui obstrue le vaisseau). Ce traitement conduit à la restauration de la circulation sanguine dans le tissu mais cette reperfusion déclenche des mécanismes moléculaires induisant la mort d'une partie de la zone impactée. C’est ce que l’on appelle les lésions de reperfusion. Une des thématiques de protection contre les lésions de reperfusion porte sur l'étude du rôle du récepteur au froid de l’organisme (TRPM8). Dans un travail préliminaire, nous avons observé que l'hypothermie protège des lésions de reperfusion dans un modèle d'infarctus du myocarde chez la souris et que cet effet nécessite la présence du récepteur au froid TRPM8. L'hypothermie et les anesthésiques étant connu pour modifier les paramètres hémodynamiques (rythme cardiaque, pression artérielle, etc.), et pouvant activer TRPM8. Dans un précédent projet, nous avons mis en évidence que, sous hypothermie et anesthésie, le récepteur au froid induit une diminution du débit cardiaque. Cet effet pourrait être dû soit à une diminution de la force de contraction du cœur soit une diminution du tonus musculaire des vaisseaux sanguins. L'objectif de la présente demande d'autorisation consiste donc à tester si l'activation du récepteur au froid TRPM8, sous hypothermie et anesthésie, induit une modification du tonus musculaire des vaisseaux sanguins et/ou une diminution de la force de contraction du cœur.
Bénéfices attendus
Cette étude nous permettra de déterminer précisement le rôle du récepteur au froid dans la réponse hémodynamique induite par la synergie du froid et de l’anesthésique. A l’échelle fondamentale, cela pourrait nous permettre de mieux comprendre les mécanismes d’actions impliquant le récepteur au froid. A l’échelle clinique, et à plus long terme, une meilleure compréhension des variations de pression et de débit sanguin, potentiellement néfastes pour le patient lors d’une anesthésie ou d’une baisse de température, pourrait nous permettre, dans le domaine de l’anesthésie ou même de la réanimation, de rationnaliser l’utilisation de certains médicaments comme les anesthésiques dans ces conditions particulières (infarctus, arrêt cardiaque, chirurgie cardiaque). Nous pourrions, par ce biais, améliorer les pratiques cliniques et la prise en charge des patients.
Procédures
Tous les animaux seront soumis aux interventions suivantes : L’animal est anesthésié en intraveineux, par le biais de la pose d’un cathéter au niveau de la veine de la queue. L’animal est ainsi maintenu endormi tout au long de la procédure, jusqu’à son euthanasie en fin de procédure. Durant l’anesthésie (durée totale : 60 à 80 minutes), 2 méthodes sont utilisées simultanément pour étudier le système vasculaire : - Utilisation d’une caméra thermique (non invasive) pour mesurer la température à la surface de la peau - Incision cutanée au niveau du cou pour accéder à la carotide gauche et insérer une sonde de mesure de pression (5 à 10 minutes) Au cours de l’acquisition des mesures, les conditions de stimulation du récepteur au froid impliqueront les 2 phases suivantes : - Induction d’une hypothermie modérée : 33°C (20mn à cette température cible, sachant que la descente en température jusqu’à 33°C dure 7-8 minutes et la remontée jusqu’à 37°C dure 10-12 minutes) - L’administration d’un agent stimulant le récepteur au froid (30 secondes), pendant l’hypothermie modérée
Impact sur les animaux
Un cathéter est posé en intraveineux au niveau de la queue de l’animal pour permettre l’anesthésie. Puis, sous anesthésie et analgésie : - Une incision au niveau de la peau du cou est réalisée. - L’animal est également soumis à une hypothermie modérée transitoire. Il s’agit d’une procédure sans réveil.
Devenir
Les animaux seront mis à mort en fin d’expérimentation en raison de l’acte invasif invalidant, empêchant leur replacement ou leur ré-utilisation pertinente pour d’autres projets.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe aucune méthode alternative (notamment in vitro ou in silico) permettant de mimer ou prédire correctement la réponse d’un organisme en termes d’hémodynamique ou de fonction vasculaire lors de la modification de paramètres précis. Pour ceci, un modèle in vivo est alors nécessaire.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire à l’obtention de résultats statistiquement exploitables, sur la base des résultats précédemment obtenus dans les mêmes conditions (tests de puissance). Dans un objectif de réduction, les animaux mis à mort à la fin de cette procédure contribueront également, via le prélèvement de tissus et organes, à entretenir les compétences du laboratoire.
Raffinement
Outre les conditions d’hébergement minimales (enrichissement, boisson et nourriture standard ad libitum, surveillance quotidienne), une surveillance stricte de l’animal durant toute la procédure d’anesthésie sera réalisée : mesure en continue de la température, de la fréquence cardiaque et de la fréquence respiratoire de l’animal. Une surveillance continue de l’état de sédation de l’animal sera également réalisée par l’expérimentateur avec majoration ou diminution de la dose d’anesthésie en fonction de la profondeur de sommeil.
Choix des espèces
Les animaux utilisés seront des souris, possédant ou non le récepteur au froid (animaux génétiquement modifiés). Les souris seront âgées de 8 à 20 semaines (jeunes adultes – adultes) Ceci nous permettra d’avoir une population d’animaux concordante avec les autres projets du laboratoire et donc une comparaison possible inter-projets. Il s’agira d’animaux mâles et femelles, le sexe n’influençant peu ou pas les paramètres étudiés.
Impact d’une hypothyroxinémie maternelle sur les cellules gliales entériques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
28 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes reçoivent dans leur eau de boisson un composé qui abaisse leur taux d'hormone thyroïdienne, puis les animaux sont tués pour prélever leurs intestins et mettre en culture leurs cellules gliales. Le porteur indique que le traitement pourrait perturber l'alimentation et provoquer de l'agressivité, et qualifie l'effectif de réduit au strict minimum. L'objectif déclaré est d'étudier, avec une équipe chilienne, l'effet d'une carence thyroïdienne maternelle sur l'inflammation intestinale de la descendance.
Objectifs
Les hormones thyroïdiennes maternelles sont essentielles au développement et à la différenciation cellulaire du fœtus. Des carences en hormones thyroidiennes maternelles affectent de manière irréversible le développement du système nerveux central, des poumons, de l'intestin, des muscles squelettiques, des os, de la réponse immunitaire et de la réponse physiologique au stress chez la descendance. L'hypothyroxinémie gestationnelle (HTX) est une forme d’hypothyroïdie dans laquelle la concentration sanguine de T3 (l’hormone thyroïdienne active) est normale alors que celle de T4 (précurseur de T3) est diminuée. Cette anomalie en T4 peut être la conséquence d’un régime alimentaire pauvre en iode ou d’une hypertension. Des modèles d’HTX maternelle chez la souris et le rat montrent l’existence de troubles digestifs chez la descendance associé à une inflammation intestinale. On sait que les cellules gliales entériques du système nerveux entérique jouent un rôle central dans la physiologie intestinale et dans les mécanismes inflammatoires au niveau intestinal. Cependant, on ignore l’impact d’une HTX maternelle sur les cellules gliales entériques. L’objectif du projet sera d’étudier l’impact d’une HTX maternelle sur le statut inflammatoire des cellules gliales entériques et leur réponse à différents agents inflammatoires, et cela sur la descendance à l’adolescence et au stade adulte.
Bénéfices attendus
L’hypothyroxinémie maternelle constitue un facteur de risque de développer des maladies inflammatoires intestinales plus tard au cours de la vie. Le système nerveux entérique, et en particulier les cellules gliales entériques, sont des acteurs majeurs dans les processus inflammatoires de l’intestin. Cependant, les conséquences de l’hypothyroxinémie sur le statut inflammatoire des cellules gliales entériques sont encore largement inconnues. Dans ce contexte, l’étude dans un modèle rongeur de l’impact d’une hypothyroxinémie maternelle sur les cellules gliales entériques présente un réel intérêt pour la compréhension des mécanismes impliqués, mais également dans la perspective d’un traitement thérapeutique des atteintes inflammatoires de l’intestin associés à une hypothyroxinémie. Cette étude sera réalisée et financée en collaboration avec une équipe du Chili.
Procédures
Les animaux ne seront pas soumis à des interventions invasives. La seule intervention est l’addition de 0,02% de 2-mercapto-1- methylimidazole (MMI) dans l’eau de boisson des mères gestantes entre le stade gestationnel 10 et 14 jours après accouplement.
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues seraient faibles. Les animaux pourraient ne pas supporter le traitement et avoir une alimentation modifiée entrainant une absence de prise de nourriture. Les animaux pourraient avoir un comportement altéré induisant une agressivité. Tous ces signes seront observés quotidiennement au cours du traitement.
Devenir
Mise à mort des animaux pour collecter les intestins des animaux afin de récupérer les cellules et les mettre en culture.
Remplacement
Le modèle de culture de cellules gliales nécessite l’utilisation d’intestins d’animaux. Pour notre étude des conséquences de l’hypothyroxinémie sur le statut inflammatoire des cellules gliales entériques, nous ne pouvons pas remplacer l’utilisation de rongeurs.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au strict minimum. Nous avons décidé de réaliser une étude préliminaire avec au total 8 souris gestantes (4 contrôles et 4 traitées) afin de définir le meilleur stade pour mettre en culture les cellules gliales. A l’issue de ces tests, 10 souris gestantes contrôles et 10 traitées sont prévues. La culture de cellules gliales se fait en collectant les ganglions à la suite de différents traitements et les intestins de souris sont petits. Pour avoir suffisamment de « matériel » pour effectuer la culture, nous avons besoin de 10 souris gestantes/condition. Nous estimons que nous aurons 6-7 souriceaux max/femelle gestante.
Raffinement
Le bien être animal sera pris en compte tout au long de l’expérimentation. Nous recevrons les femelles gestantes 4 jours avant le début du traitement. Les animaux seront hébergés dans des cages avec de la litière et des enrichissements tels que des frisottis pour se faire des nids. Une observation quotidienne sera effectuée tout au long du traitement (de 10 à 14 jours après l’accouplement). A la naissance, les petits seront hébergés avec leur mère et ce jusqu’au sevrage à 21 jours après la naissance. Les signes cliniques seront observés et les animaux seront exclus de l’étude s’ils présentent 2 ou 3 signes cliniques notables ou 1 seul des signes cliniques sévères.
Choix des espèces
La souris a été choisie pour ce projet car l’induction d’une hypothyroxinémie chez une mère gestante est bien caractérisée dans cette espèce. En effet , des résultats préliminaires ont déjà été obtenus chez la souris par nos collaborateurs du Chili. Les souris gestantes seront réceptionnées au stade gestationnel 6 jours après accouplement et recevront 0,02% de 2-mercapto-1-methylimidazole (MMI) dissout dans l’eau de boisson entre le stade gestationnel 10 et 14 après accouplement. En parallèle, les animaux témoins recevront de l’eau de boisson classique. Les mères seront gardées jusqu’au sevrage des souriceaux, qui seront gardés eux-mêmes jusqu’à l’âge 30 ou 55 jours, correspondant respectivement à un stade adolescent ou adulte.
Impacts d’une exposition chronique aux nanopesticides de cuivre, de la vie in utero à l’âge adulte sur l’homéostasie intestinale et métabolique.
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
2 842 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles sont exposées à des nanopesticides de cuivre par l'alimentation dès avant la gestation puis pendant la lactation, et une partie des petits est exposée jusqu'à l'âge adulte, avec tests d'intolérance au glucose, prélèvements sanguins répétés et passages en cage à métabolisme. Le porteur indique qu'une procédure vise à provoquer une inflammation intestinale et que les souris exposées pourraient perdre davantage de poids que les témoins. L'objectif déclaré est de fournir des données sur le risque de ces nanopesticides pour éclairer leur éventuelle autorisation sur le marché européen.
Objectifs
Le cuivre (Cu) est depuis longtemps utilisé en agriculture pour ses propriétés antifongiques et antibactériennes (biocides) et l’application répétée de pesticides à base de Cu est la principale source de pollution cuprique des sols agricoles. Compte tenu de la toxicité du Cu pour l’environnement et la santé rapportés par l’EFSA, la Commission européenne (CE) a recommandé en 2018 de réduire le recours au Cu et a limité son utilisation phytosanitaire à 28 kg/ha sur 7 ans. Des nanopesticides à base de nanoparticules (NPs) de Cu constituent une alternative aux pesticides conventionnels riches en Cu et sont déjà utilisés en agriculture conventionnelle et biologique hors UE. Leur taille nanométrique facilite le passage dans les micro-organismes pour des effets antibactériens et antifongiques plus importants que les formes conventionnelles, tout en réduisant les taux d’applications de Cu sur les sols ou les plantes. Face à la nécessité de réduire l’usage de Cu, ces formulations « nano » sont susceptibles d’être rapidement mises sur le marché Européen et d’être pulvérisées en France. Toutefois, le nombre limité de données sur le devenir et les impacts des NPs de Cu ne permet pas d’évaluer le risque spécifique lié à leur taille, en particulier si la réduction de l’utilisation de Cu se fait au détriment d’une plus grande toxicité des NPs pour l’environnement et l’Homme. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact d’une exposition chronique à des nanopesticides sur la mise en place du microbiote et les fonctions intestinales et métaboliques. Pour ce projet, des souris femelles seront exposées dès 61 jours avant la mise bas et pendant la gestation et la lactation à des nanopesticides de Cu via l’alimentation. La déséquilibre du microbiote de la mère et des nouveau-nés, ainsi que la répartition des particules dans l’organisme seront étudiées par microscopie et dosage. Au sevrage, certains petits seront ensuite exposés aux mêmes régimes que leur mère jusqu'à l'âge adulte.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des données utilisables pour l'évaluation des risques pour la santé humaine et animale dans l'utilisation de produits phytosanitaires nanoformulés afin d'aider les politiques publiques dans leurs décision d'autoriser ou non la mise sur le marché Européen de tels produits et/ou d'établir des normes pour une utilisation sûre et durable des nanotechnologies en agriculture.
Procédures
Dans le cadre des mesures d'intolérance au glucose et de la perméabilité intestinale, les animaux recevront une administration orale de glucose ou d'un marqueur de perméabilité intestinale (geste rapide d'environ 30 secondes) et des prélèvements sanguins seront également réalisés au niveau de la queue, après application d'une crème anesthésiante locale (10 secondes/prélèvement). Des prélèvements de fécès seront aussi effectués deux fois par semaine tout au long de l’expérience. Les souris seront isolées pendant 5 minutes dans des cages sans sciure pour permettre de récolter les fèces. Les urines de 24h seront prélevées lors d'un passage dans une cage à métabolisme pendant 24h avec accès ad libitum à l'eau de boisson et à la nourriture.
Impact sur les animaux
La mise en oeuvre de nos procédures pourra générer du stress. Il sera attenué par des manipulations hebdomadaires lors du suivi de poids ou d'observations. Ensuite la réalisation des mesures d'intolérance au glucose ou de mesure de perméabilité seront génératrices d'inconfort notamment lié à l'administration orale de glucose ou du marqueur de perméabilité intestinale et aux prélèvements de sang. Une prise en charge de la douleur liée à aux prélevements sanguins sera réalisée par application d'une crème anesthésiante locale. Enfin la dernière procédure visant à provoquer une inflammation intestinale de faible intensité pourrait entraîner une baisse de poids plus importante chez les animaux exposés aux nanopesticides comparés aux animaux contrôles.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront euthanasiés.
Remplacement
Les modèles alternatifs ne permettent pas aujourd'hui d’étudier la répartition des particules dans l’organisme ni de recréer la complexité des dialogues Microbiote-intestin -foie -cerveau, ni de voir les impacts sur un organisme exposé dès la périnatalité.
Réduction
Nous avons conçu nos expériences pour à la fois répondre à nos questions scientifiques et respecter la nécessité de réduire le nombre d'animaux dans la recherche scientifique. Nous utiliserons le plus petit nombre possible d'animaux requis pour cibler nos objectifs en fournissant des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux a été déterminé par un calcul de puissance basé sur des résultats antérieurs d'études similaires. Chaque groupe expérimental sera donc constitué de 12 souris. Pour les analyses des données récoltées, des tests statistiques adaptés seront réalisés.
Raffinement
Durant l'étude, les animaux seront en hébergement collectif (5 ou 3 par cage selon l’expérimentation, 1 femelle par cage avec leurs petits pendant la lactation) avec un enrichissement des cages (dispositifs de nidification en papier absorbant) afin de réduire l'angoisse des animaux. Concernant la gestion de la douleur nous appliquerons un analgésique local sur la queue 1 heure avant les prélèvements de sang. Dans le cas où un animal présenterait des signes de souffrance, il sera retiré de l'étude et des soins adaptés pratiqués. Le cas échéant une euthanasie sera pratiquée.
Choix des espèces
La souris est un modèle reconnu en toxicologie, pour lequel de nombreux outils sont développés afin d’étudier le microbiote, l’intestin le foie et le cerveau. Nous travaillerons avec la lignée C57bl/6 car nous avons déjà des résultats préliminaires concernant l’exposition des adultes aux additifs alimentaires. Dans ce projet, les souris seront étudiées à plusieurs stades de développement (in-utéro, souriceaux de 18j et adultes)