Souris

910 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Selon les protocoles, on leur greffe des cellules tumorales sous la peau ou dans la prostate par chirurgie, ou on déclenche des tumeurs par injections de tamoxifène, avant des séries d'injections répétées et des séances d'imagerie sous anesthésie s'étalant jusqu'à dix-huit mois. Le porteur indique que les souris développent des tumeurs et une dégradation progressive de leur état général, encadrées par des points limites. Le projet vise à confirmer chez la souris le rôle de la signalisation calcique dans le cancer de la prostate et à tester un anticorps, l'application chez l'humain restant présentée comme une perspective.

Objectifs

L’objectif du projet consistera à permettre une validation in vivo de nos résultats obtenus in vitro à savoir : -la signalisation calcique est impliquée dans la croissance tumorale en réponse à une stimulation du système nerveux parasympathique -la signalisation calcique est impliquée dans la résistance aux traitements chimiothérapeutiques -la signalisation calcique est impliquée dans la formation des métastases osseuses du cancer de la prostate -la signalisation calcique est une cible thérapeutique potentielle in vivo.

Bénéfices attendus

Les enjeux en matière de cancérologie sont importants car nous avons identifié in vitro que la signalisation calcique un rôle central dans plusieurs mécanismes clés de la cancérogenèse (prolifération, angiogenèse, métastase, apoptose, résistance aux chimiothérapies…). Nous devons confirmer ces données obtenues in vitro par des études chez la souris. Une autre application importante de ce projet sera l’étude de l'efficacité d'un anticorps monoclonal ciblant spécifiquement la signalisation calcique des cellules tumorales afin de stopper la progression tumorale. L’anticorps testé pourra être modifié et utilisé chez l’homme comme thérapie seule ou en combinaison contre les cancers prostatiques avancés aujourd’hui incurables.

Procédures

Procédures 1,2 et 5: 1 Anesthésie à l'isoflurane (10 min) suivie d'1 injection sous-cutanée de cellules tumorales. Une fois par semaine (pendant 9 semaines): traitements avec les chimiothérapies ou solvant seul (1 injection intra péritonéale/sem soit 9 IP) et/ou 1 administration per os/sem de Rucaparib (ou solvant seul) (soit 9 PO) et/ou 1 injection IP de l'anticorps monoclonal ou son peptide contrôle (à renouveler tous les 3 jours) (soit 21 IP). Procédure 3 : 1 Anesthésie par isoflurane avant la procédure chirurgicale (implantations dans la prostate de cellules cancéreuses humaines à l'aide de seringues à insuline). Puis, chaque semaine (durée étude 25 semaines), la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence : 1 injection (100 µL) IP de luciférine (25 IP au total) puis 1 Anesthésie à l’isoflurane (25 AG au total) puis imagerie. A partir de la semaine 4 et pendant 21 semaines, traitements appropriés comme indiqué (anticorps ou anticorps-CTL ; à renouveler tous les 3 jours soit 49 IP; docetaxel 1 IP/sem soit 21 IP; inhibiteur de PARP 1 IP/sem soit 21 IP ; docetaxel+PARP 1 IP/sem soit 21 IP). L’influence du système nerveux périphérique sera également évaluée avec un antagoniste des voies cholinergiques/muscariniques (darifenacin (Chrm3)). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (soit 147 IP). Procédure 4: durée de 18 mois. 5 IP intrapéritonéales consécutives à la semaine 2 (souris âgées de 15 jrs) pour l'administration du tamoxifène ou du solvant seul (huile de maïs). A partir de la semaine 4, les souris concernées recevront une IP journalière de darifenacin à 2.5 mg/kg dans du PBS ou du PBS seul (476 IP au total). Pour toutes les souris de la procédure 4: 36 anesthésies par isoflurane (pour chaque souris tous les 15 jours) afin de réaliser un suivie par imagerie petit animal à rayon X de l'apparition des métastases osseuses.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sur les souris concerneront la douleur et la maladie puisque les souris vont développer des tumeurs selon trois approches : xénogreffes sous cutanées, xénogreffes orthotopiques protatiques ou tumeurs spontanées. Pour les xénogreffes sous cutanées (Procédures 1, 2 et 5), une injection souscutanée de cellules tumorales sera réalisée au niveau du dos sous anesthésie générale. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements (chimiothérapies, anticorps) que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Pour les xénogreffes orthotopiques protatiques (Procédure 3), une injection intra-prostatique de cellules tumorales sera réalisée également sous anesthésie générale. Un acte chirurgical sera nécessaire. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à bioluminescence (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. Enfin, en ce qui concerne les tumeurs spontanées (Procédure 4), les souris recevront une administration de tamoxifène par injection intrapéritonéale une fois toutes les 24 heures pendant 5 jours consécutifs afin d’induire la délétion d’ORAI3 spécifiquement dans la prostate. Il n’y aura pas d’autres nuisances causées par d’autres actes expérimentaux par la suite hormis les différents traitements que subiront les différents groupes de souris et qui seront injectés en intra-péritonéal. Cependant, chaque semaine, la progression de la maladie sera surveillée par imagerie petit animal à rayon X (non invasif) et une anesthésie générale à l’isoflurane sera nécessaire. En ce qui concerne les nuisances ou effets indésirables attendus et engendrés par suite des expérimentations (conséquences, phénotype), les souris vont développer des tumeurs et donc des douleurs pourront apparaître avec une détérioration progressive de l’état générale. Ainsi, pour chaque procédure des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces pour permettre de limiter la douleur à son minimum, sans remettre en cause les résultats du projet sont présentés.

Devenir

Tous les animaux des différents protocoles seront euthanasiés sans douleur à la fin de chaque procédure expérimentale afin de récupérer les tumeur pour réaliser des analyses omics.

Remplacement

Les caractéristiques morphologiques, physiologiques et immunologiques de la souris ne sont pas reproductibles in vitro. De même, l’influence de l’innervation qui est un paramètre que nous souhaitons examiner n’est pas reproductible in vitro. La délétion de manière inductible et spécifique dans les cellules épithéliales de la prostate permettra d’évaluer précisément le rôle de la protéine ORAI3 au sein d’un microenvironnement composé de différents type cellulaires (cellules nerveuses, stromales, immunes) dans différents contextes physiologiques et physiopathologiques. De plus, l’utilisation d’animaux d‘expérimentation comme la souris est particulièrement pertinente dans le cadre de la recherche en cancérologie afin de confirmer in vivo l’intérêt de nouvelles associations de chimiothérapies ou l’utilisation d’un anticorps monoclonal thérapeutique dont nous avons montré in vitro l'efficacité

Réduction

Afin de réduire la variabilité des résultats, l'environnement des souris et leur statut sanitaire seront contrôlés. Des tests statistiques appropriés ont été utilisés afin de déterminer le nombre nécessaire et suffisant de souris par lot. La randomisation sera également appliquée afin de supprimer certains risque de biais. Au total, ces mesures permettent de réduire au maximum le nombre des animaux utilisés pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Les souris cohabiteront par groupe de 5 dans des cages adaptées en termes de surface et 3 enrichissements seront prévus (tunnel, coton, igloo rouge) pour réduire le stress des animaux. Aucun nouvel animal ne sera introduit dans des groupes déjà formés. L'environnement des animaux, l'équipement, système d’abreuvoir, la qualité de l’eau, la nourriture et la litière seront contrôlés régulièrement. L’état de bien être des souris sera également évalué quotidiennement par l’observation des signes physiques, physiologiques et comportementaux (perte de poids, aspects du pelage, morsures...). Lors de chaque anesthésie, la température des animaux sera maintenue grâce à l’utilisation de coussins chauffants. De plus, un gel oculaire (à base de vaseline) est appliqué au niveau des yeux des animaux pour éviter tout dessèchement de la cornée à chaque anesthésie. Nous allons utiliser des analgésiques et/ou des anesthésiques locaux adaptés afin de prévenir et/ou réduire au maximum la douleur chez les animaux.

Choix des espèces

L’innervation du cancer de la prostate est un paramètre que nous souhaitons examiner et n’est pas reproductible in vitro. Le modèle murin est aujourd’hui validé pour l’étude de l’innervation du cancer de la prostate. Les protocoles seront réalisés avec des souris mâles âgées de 5 semaines. En effet, pour les expériences utilisant des souris immunodéprimées (nude) il est connu que les souris d'un âge plus avancé peuvent récupérer des lymphocyte T par rapport aux souris jeunes. Dès lors, pour les autres souris du projet et afin de pouvoir comparer les différents groupes nous utiliserons pour tout le projet des souris âgées de 5 semaines. Pour la procédure3: des souris plus âgées seront utilisées (8 semaines car il nous faut attendre la maturité sexuelle des mâles soit 8 semaines pour réaliser les injections intra-prostatiques). Pour la procédure 4: le développement tumorale sera induit par injections de tamoxifène sur des souris âgées de 15 jours et l'étude de survie durera 18 mois.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une double injection d'une solution qui dégrade l'articulation du genou pour provoquer une arthrose, puis une injection de la thérapie testée, avant d'être tué pour prélever le genou. Le projet vise à évaluer une combinaison de cellules-médicament et d'une molécule anti-vieillissement chez des souris jeunes et âgées, les bénéfices pour les patients arthrosiques restant formulés au conditionnel. Sur le remplacement, le porteur affirme que les organoïdes et les organes sur puce sont des pistes prometteuses mais encore trop peu maîtrisées pour remplacer le modèle animal.

Objectifs

L’arthrose est la maladie la plus répandue en rhumatologie. Elle consiste en une dégradation progressive du cartilage pour laquelle, aucun traitement curatif n’est disponible. Parmi les propositions thérapeutiques applicables à l’arthrose, l’injection de cellules-médicament dans le genou a démontré des effets prometteurs chez le modèle de souris d’arthrose traumatique. Néanmoins, les essais cliniques chez les patients arthrosiques âgés n’ont présenté que des résultats très limités. Dans de nombreuses pathologies liées à l’âge telle que l’arthrose, il a été démontré que les tissus âgés malades accumulaient des cellules dites « sénescentes ». Ces dernières sont responsables de la dégénérescence du tissu, et peuvent induire le vieillissement prématuré des cellules environnantes par effet domino. In- vitro, ce même profil de sécrétion a un impact négatif sur les propriétés régénératrices des cellules-médicament. L’environnement articulaire du sujet âgé pourrait donc expliquer le manque d’efficacité de ces thérapies cellulaires chez le patient arthrosique. Cependant, à notre connaissance, aucune étude concernant ce dernier aspect n’a été menée dans le cas de l’arthrose chez la souris âgée. Au laboratoire, nous avons pu démontrer in- vitro que la combinaison d’agents anti-vieillissement cliniquement approuvés et de cellules-médicament, induisait des effets synergiques favorables à la régénération du cartilage. Ce projet de 2 ans a pour but d’étudier in- vivo, l’action d’une telle combinaison afin de développer une biothérapie 2.0 pour le traitement de l’arthrose du sujet âgé. Nous proposons : 1- d’identifier la présence de cellules sénescentes dans un modèle d’arthrose induite par la collagénase chez les souris jeunes et âgées, 2- d’évaluer l’efficacité thérapeutique d’une combinaison cellules-médicament/médicament anti-vieillissement, 3- de déterminer l’impact de l’âge sur ces mêmes conditions.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet sont multiples. Dans un premier temps, il permettrait d’évaluer les propriétés thérapeutiques, de manière séparée ou combinée, d’une drogue anti-vieillissement et de cellules-médicament, sur un modèle expérimental et maitrisé d’arthrose. Ensuite, ce projet permettrait une étude de l’effet de l’âge de la souris sur l’efficacité des thérapies cellulaires. Nous envisageons une perte du potentiel de nos cellules-médicament chez la souris âgée, qui pourrait être contrebalancée par l’action d’une molécule anti-vieillissement. En effet, nous avons démontré in- vitro que ce type de drogue réduit l’impact négatifs des cellules sénescentes, favorise la régénération et accroit les propriétés régénératrices des cellule-médicament. Le but de ce projet est donc de proposer une thérapie cellulaire 2.0 en ciblant l'environnement articulaire âgé du patient arthrosique.

Procédures

Toutes les procédures chirurgicales seront effectuées sur des animaux anesthésiés à l’isoflurane avec application d'une analgesie locale avant chirurgie. Nos procédures, depuis l’endormissement au réveil des animaux, prennent environ 5 minutes par souris. Chaque animal recevra trois injections prenant en moyenne 30sec par souris : une double injection de solution dégradant l’articulation à j0 et à j2 et une injection de la thérapie à j7.

Impact sur les animaux

L’injection de la solution dégradant l’articulation peut induire une douleur passagère au niveau du genou

Devenir

A la fin du projet, les souris seront euthanasiées pour permettre le prélevement de l'articulation du genou.

Remplacement

L'arthrose est une maladie de l'ensemble de l'articulation impliquant les cellules qui y résident mais également le système immunitaire circulant dans le sang. En effet, les différents tissus qui composent une articulation sont atteints et par conséquent, l'analyse du rôle de la senescence cellulaire et de son traitement sur un modèle d'arthrose ne peut se faire que sur animaux vivants. Parmi les alternatives aux modèles animaux, les organoïdes et les organes artificiels sur puces sont des pistes prometteuses néanmoins, ces systèmes sont encore peu maitrisés/caractérisés et ne peuvent remplacer, à l'heure actuelle, un modèle animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé en se basant sur l'expérience acquise au laboratoire en termes d'incidence de l'arthrose chez la souris (~75%) et de mise en évidence d'effet significatif sur les paramètres histologiques mesurés en fin d'expérience. A l’origine du projet, 5 candidats médicaments ont été présélectionnés. Nos expériences in-vitro nous ont permis de réduire à une seule molécule pour éviter d’accroitre le nombre de souris nécessaires pour ce projet.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour réduire la souffrance des animaux. Les injections intra-articulaires se feront sous anesthésie gazeuse pour limiter au maximum la douleur infligée aux animaux. Le milieu d’hébergement sera enrichi (carrés de cellulose, copeaux de litière) et les animaux seront surveillés quotidiennement. Les points limites seront déterminés à l'aide d'une grille d'évaluation permettant d'identifier les signes de douleur ou d'inconfort des animaux. Ces points limites se basent sur un score obtenu en évaluant comportement, la respiration, l'alimentation ou encore, les expressions faciales des animaux. et sont décidés d'un commun d'accord avec la service du Bien-Etre Animal (SBEA). L'échelle de cette grille, allant de 0 à 23, nécessite une intervention analgésique dès le grade 6 et une consultation de la SBEA à partir du grade 12 pour décider des modes de soulagement.

Choix des espèces

Le modèle murin d'arthrose induite chimiquement présente l’avantage de reproduire fidèlement les caractéristiques cliniques observées chez l’Homme, c’est-à-dire chez le sujet jeune après le traumatisme articulaire ou chez le sujet âgé par une arthrose spontanée. Afin de montrer les effets thérapeutiques synergiques d’une combinaison drogue anti-vieillissement/cellules-médicament mais également l’impact de l’âge sur ces mêmes propriétés, les souris seront utilisées à 2-3 mois (groupe jeune) et à 18-20 mois (groupe âgé).

195 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour porter le récepteur humain du SARS-CoV-2 dans le muscle, elles sont infectées par injection intramusculaire, gavées de tamoxifène cinq jours, saignées tous les deux jours et soumises pendant six mois à des tests d'effort, grip test, tapis roulant et actimétrie. Le porteur n'attend pas de dommage musculaire important, seulement une fatigue, et reconnaît devoir d'abord mettre au point cette infection encore jamais tentée. Il indique compléter par de la culture cellulaire mais juge la souris nécessaire, le modèle devant aussi servir "l'industrie pharmaceutique" pour d'autres projets sur la COVID.

Objectifs

Si la grande majorité des malades infectés par le SRAS-CoV-2 se remettent de cette infection (98,7% au 09 mars 2022, https://COVID19.who.int/) ; certains d’entre eux continuent à présenter des symptômes, parfois des mois après leur guérison. Ce type de manifestations cliniques, qualifié de syndrome post-COVID (PCS), concerne 30 à 60% des malades, principalement des femmes. Le PCS touche plusieurs organes et demande une surveillance et un suivi à long terme des patients, ce qui en fait aujourd’hui un véritable problème de santé publique. Parmi les principaux symptômes observés, on note en troisième position les troubles musculo-squelettiques. Les exercices physiques permettent parfois de réduire ces symptômes suggérant une atteinte directe du muscle. Cependant, à notre connaissance, il n'existe aucune étude sur les effets à long terme de la COVID-19 sur le tissu musculaire. Depuis 2020, la littérature scientifique atteste de la pertinence et de l’intérêt des modèles rongeurs pour l’étude de l’infection par le SRAS-CoV-2 et de la physiopathologie de la COVID-19. Un modèle de souris transgénique HSACreERT2: ACE2(GFP)hACE2 a été développé exprimant le récepteur humain du SRAS-CoV-2, l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (hACE2), uniquement au niveau du tissu musculaire. Nous proposons de l’utiliser pour (i) caractériser l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2 et (ii) comprendre les bases moléculaires de la physiopathologie musculaire de la COVID-19.

Bénéfices attendus

Les résultats obtenus permettront d’établir une cartographie détaillée des conséquences fonctionnelles et physiopathologiques de l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. Cette étude jamais réalisée jusqu’à présent permettra de mieux comprendre les symptômes musculaires observés chez les patients COVID Long. Le développement de thérapies ciblées et la prise en charge adaptée des patients pourraient bénéficier de ces observations inédites. Si aucun effet n’est observé à la suite de l’infection directe du muscle, cela apportera néanmoins un élément de réponse à la compréhension du phénotype musculaire dans le cas des patients de COVID Long. Nous pourrons dans ce cas envisager d’orienter nos investigations futures vers le réseau vasculaire ou le système inflammatoire. De plus, notre modèle restera tout de même un outil important pour la communauté scientifique et l’industrie pharmaceutique dans le cadre d’autres projets sur les formes aigues ou persistantes de la COVID.

Procédures

Pour la réalisation des infections virales, les animaux seront anesthésiés sous isofluorane (induction 4%; maintien 2%) et soumis à des injections intramusculaires du SARS-CoV-2. L'intervention sera faite une seule fois par souris et la durée de l'intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Le prélèvement du sang tous les deux jours sera fait sous anesthésie à l'isoflurane. La durée de la prise de sang sera d'environ 30 secondes. Pour réaliser les manipulations, le tamoxifène est administré par gavage pendant 5 jours à la concentration finale de 85 mg/kg de poids corporel. La séance de gavage dure environ 2 minutes pour chaque souris avec une fréquence d'une fois par jour pendant 5 jours. Les études functionelles seront realisées une fois par mois pendant 6 mois. La durée du grip test sera de 30 secondes et la durée de la séance du tapis roulant sera de 20 minutes. Pour finir, l'activité de déplacement mesuré par l'Activmètre aura une durée d'acquisition réglée sur 24/48 heures pour quantifier l'activité tout au long du cycle circadien.

Impact sur les animaux

Le projet porte sur l’infection du tissu musculaire par le SRAS-CoV-2. En raison de l’absence de données préalables, il est nécessaire de mettre au point l’infection expérimentale. Cette étape repose sur notre grande expérience des injections intramusculaires et de la virologie du SRAS-CoV-2. Toutefois, il n’est pas attendu de dommages musculaires importants chez la souris. En effet, seule de la fatigue musculaire est signalée chez les patients COVID Long et un phénotype similaire devrait être observé chez la souris infectée.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour les prélevements prévus dans chaque procédure.

Remplacement

Notre projet s’intéresse à l’étude des processus biologiques associés aux interactions entre le virus SRAS-CoV-2 et les cellules ou tissus de l’hôte et de leur évolution au cours du temps (6 mois). De fait, l’analyse de ces interactions au sein d’un organisme, où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication, nécessite des observations chez l’animal et ne peut être substituée qu’en partie par des études in vitro. Des résultats préliminaires ont montré que les cellules musculaires humaines sont susceptibles à l’infection par le SRAS-CoV-2. De plus, nous avons démontré que le récepteur ACE2 est exprimé au niveau du tissu musculaire. La culture cellulaire restera un outil que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans le but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessive d’animaux, le nombre d’animaux par groupe a été calculé sur la base de protocoles publiés et de l’expérience acquise précédemment. Un des enjeux est de pouvoir obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses prévues. Ce nombre de souris n’a pas été défini à l’aide de méthodes statistique mais est basé sur notre expérience dans l’obtention de différent matériel biologique pour chaque technique. Les conditions expérimentales de l’infection sont établies sur la base d’une approche par escalade de doses. Cinq souris par condition seront utilisées pour des analyses histologiques et virologiques. La sensibilité de ces techniques est importante et l’effet attendu est fort, ce qui permet de limiter le nombre d’individus. Pour les autres expériences, la sensibilité attendue est moindre, obligeant à augmenter la taille des groupes à 10 individus pour les analyses fonctionnelles. Afin de respecter la règle des 3R, les animaux seront utilisés pour plusieurs études (par exemple, analyses fonctionnelles et investigation de la physiopathologie de l’infection musculaire) et, quand cela est possible, un même tissu sera exploité pour différentes analyses (par exemple, un même muscle pour les analyses histologiques et les analyses moléculaires) dans le but de réduire au maximum le nombre des animaux. Des tests statistiques seront mis en œuvre.

Raffinement

Pour minimiser le stress induit aux animaux, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) avant inoculation intra-musculaire du virus. L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide permettant la réalisation de la procédure en un temps court et d’assurer un réveil rapide tout en minimisant l’hypothermie. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre expérience du modèle souris a été également mise à profit pour aborder la question du raffinement : enrichissement et habituation de l’animal à la manipulation. La bonne connaissance du modèle infectieux sur lequel repose ce projet permet de limiter les souffrances ressenties par les animaux au cours des procédures expérimentales. Les souris seront hébergées par 6 mois dans des portoirs ventilés, avec à leur disposition du matériel de nidification (coton), des tunnels et des maisonnettes en carton ainsi que des bûchettes de bois à ronger. Des points limites (perte excessive >20%, lordose, dyspnée, poil piqué, difficultés locomotrices) seront utilisés afin de garantir le bien-etre des animaux après l'infection.

Choix des espèces

La souris (Mus musculus) constitue un outil essentiel pour la recherche par sa facilité de manipulation, sa petite taille, ses cycles de reproduction courts, et sa grande disponibilité. Cependant, la souris n’est pas sensible à l’infection par le SRAS-CoV-2, puisque la protéine spike “S” ne reconnaît pas le récepteur murin ACE2. Des stratégies d’insertion du gène humain ACE2 dans les modèles transgéniques ont été réalisées, mais son expression est ubiquitaire alors que chez l’homme, elle est restreinte, notamment aux voies respiratoires supérieures et inférieures. Afin de contourner ces différentes limitations et dans l’objectif de fournir à la communauté scientifique un modèle préclinique murin versatile, nous avons généré une lignée murine humanisée (ACE2(GFP)hACE2) exprimant le récepteur hACE2 au locus de mAce2 de manière conditionnelle et inductible. En effet, il n’existe pas à notre connaissance de knock-in inductible, tissu-spécifique et conditionnel de hACE2 chez la souris. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé.

610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage d'un ver intestinal puis par un parasite de la malaria, subissent des prélèvements sanguins trois fois par semaine, puis une ponction cardiaque suivie de la mort par dislocation cervicale. Le porteur décrit une infection le plus souvent asymptomatique et une anémie transitoire liée à une souche de plasmodium "non létale", et tue toute souris dont l'état se dégrade. Il présente la souris comme le "modèle de choix", ces interactions à trois partenaires ne pouvant selon lui être reproduites in vitro, l'étude portant d'abord sur la capacité d'adaptation du ver.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’adaptation à la coïnfection entre un nématode intestinal et un des agents de la malaria murine, en termes de la capacité à réguler la réponse immunitaire de l’hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et en effet on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection peut entrainer des dynamiques très différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, un des paramètres clé déterminant la dynamique de la coïnfection est la capacité des nématodes intestinaux à moduler la réponse immunitaire de l’hôte. Cette capacité d’immunomodulation a pour objectif de favoriser la persistance des vers au sein de l’hôte. Cependant, un hôte dont la réponse immunitaire est sous exprimée devient également plus susceptible à l’infection par d’autres pathogènes. La question que nous souhaitons aborder ici est donc la suivante : Y a-t-il un potentiel d’adaptation du nématode aux conditions de coïnfection qui limite le niveau d’immunosuppression de l’hôte ?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le potentiel d’adaptation d’un nématode intestinal à la coïnfection avec plasmodium en termes de sa capacité à immunomoduler l’hôte. Ces deux parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la manipulation de la réponse immunitaire par le nématode pourrait jouer dans le risque encouru par ces populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : gavage (200 µl d’eau de boisson à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Nous attendons peu d’effets indésirables sur les animaux. Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté et ceci basé sur de centaines de souris infectées au cours de ces 10 dernières années. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris (p.ex. état de prostration) elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Nous avons déjà effectué des infections de C57BL/6JRj avec cette souche de plasmodium et avons pu constater qu’aucune mortalité n’intervient. Le seul symptôme observable associé à l’infection par Plasmodium yoelii 17X NL est une diminution du nombre de globules rouges (anémie). Cette diminution est cependant transitoire (elle se produit entre les jours 14 et 22 post-infection) et après J26 les valeurs reviennent à la normale. Le gavage est réalisé en quelques secondes, à l’aide s’une sonde souris, et ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau (200 µl). Les injections i.p. sont réalisées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Comme pour le gavage, chaque individu ne reçoit qu’une seule injection. Les micro prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont aussi réalisés après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Les prélèvements de fèces sont effectués en isolant les souris (afin de pouvoir identifier l’appartenance de l’échantillon à chaque individu). Cependant, les souris ne sont isolées que pendant 1 heures, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer l’adaptation d’une espèce de nématode intestinal à la coïnfection par plasmodium en termes d’immunosuppression de l’hôte. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans cette expérience a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 5 souris par passage pour chaque groupe expérimental, et 15 souris tests dont l’objectif est de vérifier si les paramètres mesurés ont dévié par rapport à la génération initiale. Le nombre de 15 souris est le plus petit possible car 5 souris sont mises à mort pour chaque jour de prélèvement. Afin de réduire ultérieurement le nombre total de souris, nous avons décidé de ne répéter l’expérience qu’une fois. Par ailleurs cette répétition ne concerne que les souris tests et non pas les souris utilisées pour les passages. Au total, avec les répétitions, 610 souris seront nécessaire sur une période de 3 ans.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans cette expérience. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (minimum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Lors des prélèvements de fèces, les animaux ne sont isolés que pendant 1 heure, ce qui représente 1% du temps hebdomadaire passé en isolement. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les injections et prélèvements de sang sont effectués après application d’un anesthésiant local pour éviter toute douleur. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

534 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Modèles génétiques de la maladie d'Alzheimer, elles subissent des prélèvements mensuels de sang et de liquide céphalorachidien, ce dernier via une chirurgie stéréotaxique de pose de canules, et des tests de mémoire, labyrinthe en Y, reconnaissance d'objet et piscine de Morris. Le porteur reconnaît des douleurs post-chirurgicales et un risque d'hypothermie lors du test aquatique, et n'attend qu'un stress léger des épreuves comportementales. Il affirme qu'aucune méthode ne remplace ces modèles murins pour étudier ensemble les lésions d'Alzheimer et les déficits de mémoire, les retombées thérapeutiques restant hypothétiques.

Objectifs

Les personnes atteintes du syndrome de Down présentent des niveaux accrus de DYRK1A dans le tissu cérébral et de plasma. Une expression accrue des transcrits DYRK1A a été signalée dans des échantillons d'hippocampe provenant de patients atteints de la maladie d'Alzheimer, bien que les niveaux de protéine DYRK1A dans des homogénats de cortex frontal se soient avérés similaires entre les patients atteints de la maladie d'Alzheimer et les témoins. Récemment, il a été demontré que les personnes âgées souffrant de troubles de la mémoire et présentant une imagerie amyloïde positive présentaient des taux plasmatiques de DYRK1A plus faibles que celles présentant une imagerie amyloïde négative. En outre, il a éte également observé que les adultes âgés cognitivement normaux et sans dépôts amyloïdes présentaient des niveaux plasmatiques de DYRK1A plus élevés que les individus plus jeunes, ce qui pourrait suggérer que l'augmentation de DYRK1A associée à l’âge protègerait de la maladie d'Alzheimer. Dans cette étude, nous cherchons à préciser le lien entre les niveaux cérébraux et plasmatiques de DYRK1A et les deux neuropathologies de la maladie d'Alzheimer.

Bénéfices attendus

Ce projet contribuera à mieux comprendre le rôle de la surexpression/downregulation de DYRK1A dans l'étiologie de la maladie d'Alzheimer, en particulier les pathologies amyloïdes et tau. Ce projet contribuera également à une meilleure compréhension de l'apparition précoce de la neuropathologie de la maladie d'Alzheimer chez les personnes atteintes du syndrome de Down, étant donné que le gène codant pour la DYRK1A est situé sur le chromosome 21 et qu'il est donc surexprimé dans cette population. L'étude de biomarqueurs plasmatiques capables d'identifier les individus à haut risque pour la maladie d'Alzheimer de manière rapide et efficace permettrait d'initier un traitement pré-symptomatique de cette maladie, en particulier dans les populations à haut risque. Enfin, les efforts visant à élucider les mécanismes moléculaires impliqués dans les pathologies amyloïdes et tau pourraient également ouvrir de nouvelles approches thérapeutiques visant à modifier le développement de la maladie d'Alzheimer.

Procédures

Des prélèvements sanguins et de LCR seront effectué une fois par mois entre l'âge de 2 et 6 mois. La souris sera manipulée (pour 3-5 minutes par animal) pour le prélèvement sanguin et de LCR. Les capacités cognitives des souris seront évaluées dans 3 différents tests d'apprentissage et de mémoire: Y maze (8 minutes par animal), reconnaissance de nouvel objet (4 sessions de 10 minutes – 1 session par jour - par animal) et piscine aquatique de Morris (4 sessions de 1 minute par jour pendant 7 jours et 1 session - “probe test” - de 1 minute le jour 8 par animal). 224 souris seront soumises à une injection i.p. d'un mélange d'anesthésiques (2 à 3 minutes par animal ; 1 injection i.p. par animal).

Impact sur les animaux

Pendant le prélèvement de l’échantillon de sang, l'animal est retenu avec précaution par la peau du cou et du dos afin d'immobiliser la tête. Un stress passager peut survenir en raison de l'immobilisation. Une ponction trop profonde peut entraîner la pénétration du sang dans la cavité buccale et un risque d'hémorragie. Un hématome sur le côté du visage peut se produire occasionnellement. L'anesthésie générale utilisée pour la chirurgie stéréotaxique (mise en place de canules pour le prélèvement du LCR) peut entraîner une altération de la thermorégulation, une dépression des systèmes cardiovasculaire et respiratoire, une diminution de l'activité métabolique et une vasodilatation périphérique pouvant conduire à une baisse de la température corporelle. Des douleurs et une détresse post-chirurgicales peuvent également survenir. Les tests comportementaux sont basés sur les comportements spontanés de l’animal avec une procédure graduelle d’habituation-familiarisation aux dispositifs de test. En général, les tests comportementaux utilisés dans ce projet peuvent causer un stress léger. Pour les tests dans l'eau (Labyrinthe aquatique de Morris), il y a un risque d'hypothermie. La contention et la manipulation par l'injection IP peut provoquer un léger stress à l'animal.

Devenir

Deux méthodes d'euthanasie seront utilisées pour atteindre les objectifs du projet.

Remplacement

Il n’existe pas de méthode alternative autre que le recours aux modèles souris de maladie d'Alzheimer et aux croisements avec des souris surexprimant ou sous exprimant DYRK1A, pour atteindre les objectifs du projet: analyses de la pathologie Alzheimer (amyloide et tau) ainsi que des déficits d'apprentissage et de mémoire.

Réduction

Le nombre d'animaux est réduit au minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre a été calculé sur la base d'études précédemment élaborées et publiées, notamment des études du laboratoire. Des groupes de 15 souris seront nécessaires afin d’atteindre un poiuvoir statistique suffisant permettant de détecter des variations significatives dans les données comportementales. Nous utiliserons sur 3 ans un total de 534 souris.

Raffinement

Les méthodes utilisées et la manière de traiter les animaux pendant les expériences et dans l’animalerie assureront à ces derniers un minimum de contraintes et un maximum de bien-être. Les conditions d'élevage, d'hébergement, de soins et les procédures expérimentales sont les plus appropriées pour minimiser toute douleur, souffrance, anxiété/détresse ou dommage que les animaux pourraient subir. Des mesures telles que la formation du personnel, la surveillance quotidienne, l'habituation, l'acclimatation et le temps de récupération sont prises pour réduire tout impact physique et psychologique potentiel des procédures expérimentales. Les conditions d'élevage et d'hébergement (enrichissement de l'environnement avec des carrés de coton) sont mises en œuvre afin d'accroître autant que possible le bien-être des animaux. La préférence pour les procédures non invasives par rapport aux procédures invasives est prise en considération et, lorsque des interventions invasives sont nécessaires, les directives appropriées en matière d'anesthésie/analgésie seront suivies, en accord avec le comité de bien-être animal. Un animal sera immédiatement euthanasié après atteinte de l’un des points limites. Les points limites sont définis ci-dessus. Les zootechniciens conseillent sur l’état sanitaire de l’animal identifié et suggèrent les procédures à appliquer, les soins et éventuellement le recours à l’euthanasie. Nous suivrons des recommandations de la cellule bienêtre et vétérinaire avec application de produits disponible par la plateforme. En outre, nous effectuerons un suivi par l’utilisateur journalier avec pour critère l'aspect général de l'animal, comme le poids, le pelage, l'hydratation, l'activité, etc.

Choix des espèces

Deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer seront utilisés dans ce projet. L'un développe une pathologie amyloïde étendue, tandis que l'autre est un modèle de tauopathie, développant des enchevêtrements neurofibrillaires, une perte neuronale et une atrophie cérébrale. Les deux modèles de souris de la maladie d'Alzheimer présentent des déficits cognitifs. Nous utiliserons également un modèle de souris qui porte trois copies du gène Dyrk1a de la souris, comme dans la trisomie 21. Un modèle de souris qui porte une seule copie de ce gène complète cette étude. Dans ce projet, nous analyserons les effets de la surexpression du gène Dyrk1a, ainsi que de sa sous-expression sur les pathologies amyloïdes et tau en croisant ces différentes lignées de souris. Des échantillons de sang et de LCR seront prélevés sur des souris adultes à différents âges afin de détecter différents biomarqueurs. Les performances cognitives seront évaluées à l'âge de 4 mois, et des tissus cérébraux seront prélevés sur les souris à l'âge de 6 mois.

314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour développer les troubles moteurs et sensoriels d'une maladie neuromusculaire humaine, elles reçoivent un vecteur viral de thérapie génique, cinq prélèvements sanguins et cinq séries de tests comportementaux sur douze mois, avant le prélèvement de leurs organes. Le porteur qualifie le stress des tests de faible à modéré, sans détailler les cinq tests employés, et n'attend aucun autre effet indésirable. Il indique avoir déjà obtenu des résultats sur cellules et neurones en culture mais juge "essentiel" de valider la thérapie chez la souris, cette étape restant un "premier pas" avant l'humain.

Objectifs

Ce projet concerne le développement d’une thérapie génique pouvant constituer un traitement curatif pour une maladie neuromusculaire fatale chez l’Homme et pour laquelle, il n’existe aujourd’hui aucun traitement curatif. Cette maladie est provoquée par des mutations d’un gène, et cela entraine des troubles moteurs et sensoriels chez les patients dès l’enfance. La thérapie génique consiste donc à compenser le gène défectueux en important une copie du gène fonctionnelle dans l’organisme grâce à un vecteur viral. Précédemment, nous avons développé un modèle animal (souris) qui reproduit pour la première fois les troubles moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients. Nous avons élaboré une méthodologie avec ce modèle pour développer notre thérapie. Notre premier objectif est d’optimiser les conditions de notre protocole (choix du meilleur promoteur, doses à utiliser) en analysant les effets sur le comportement et l’organisme de nos souris (prélèvements sanguins, analyses moléculaires). Ensuite, notre deuxième objectif est d’évaluer les bénéfices de ce protocole thérapie génique grâce à un essai pré-clinique dans notre modèle sur une durée de 12 mois. Nous évaluerons ces bénéfices en évaluant le comportement et l’effet sur l’organisme de ces souris.

Bénéfices attendus

La validation de notre protocole et l’évaluation des bénéfices de notre thérapie génique chez la souris constituerait un premier pas vers une thérapie adaptable à l’Homme dans le cadre d’une maladie génétique. De plus, lors des analyses sanguines, nous aimerions pouvoir mettre en évidences des marqueurs sanguins de cette maladie. Ces marqueurs pourraient être utilisés également dans le cadre du diagnostic d’autres maladies neurodégénératives.

Procédures

Les souris recevront le vecteur viral (durée : 5mn) sous anesthésie générale. Les souris auront 5 prélèvements sanguins (durée : 5mn). Les souris réaliseront 5 fois la série de tests comportementaux (5 tests comportementaux, durée : entre 30s et 15mn) entre 1 mois et 12 mois. Ces tests permettront d’évaluer les capacités motrices et sensorielles des animaux permettant de rendre compte de l’efficacité de l’approche thérapeutique.

Impact sur les animaux

L’administration du vecteur viral, les prises de sang pourront induire un stress faible chez les animaux. Les tests comportementaux pourront induire un stress variable chez les animaux allant de faible à modérer. Aucun autre effet indésirable n’est attendu à l’issu de ces éléments.

Devenir

Ce projet compte 2 procédures. La première permettra de valider le protocole de thérapie génique sur les souris par des analyses comportementales et tissulaires, nécessitant leur mise à mort afin d’étudier le phénotype tissulaire (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses). La deuxième permettra d’évaluer les bénéfices de la thérapie au niveau comportemental et tissulaire nécessitant la mise à mort des souris (prélèvement d’organes post-mortem pour analyses.

Remplacement

Le projet a pour but de valider un premier essai pré-clinique de thérapie génique pour une maladie neuromusculaire fatale et incurable chez l’Homme. Les modèles in vitro (cellules immortelles et neurones en culture) ont permis de mettre en évidence des effets au niveau moléculaire/cellulaire de cette approche. Elle nécessite à présenter être validée dans un organisme modèle de mammifère. Le tissu nerveux ne pouvant être accessible chez l’Homme et les essais thérapeutiques ne pouvant être testés directement chez l’Homme, il est essentiel de prouver l’efficacité de notre approche dans une étude pré-clinique chez la souris.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux par condition expérimentale tout en conservant un nombre suffisant de souris par lot pour pouvoir analyses nos résultats de façon statistique et ne pas avoir besoin de reconduire ce type de projet.

Raffinement

Le phénotype de notre modèle murin ne diffère pas du modèle sauvage durant le temps de l’expérimentation (12 mois maximum) permettant un hébergement en cage collective pour respecter leurs besoins sociaux. L’administration du vecteur viral est réalisée sous anesthésie générale avec un réveil post-anesthésie dans une cage chauffée, du gel ophtalmique est appliqué post-injection et mise en place d’une analgésie si besoin. Les prises de sang sont effectuées sous anesthésie générale avec réveil post-anesthésie dans une cage chauffée et mise en place d’une analgésie si besoin. L’organisation des tests comportementaux seront précédés d’une phase d’entrainement et une période de récupération d’au moins une demi-journée voir 2 jours entiers est prévue afin de limiter au maximum le stress des animaux. Chaque animal sera surveillé de façon individuelle et de façon quotidienne. A chaque étape du projet, des points limites ont été établis pour soustraire l’animal à la souffrance.

Choix des espèces

Avec 98% d’identité protéique avec l’Homme, la souris constitue un modèle idéal pour reproduire les pathologies humaines afin de les étudier dans un contexte physiologique mais également de pouvoir tester et valider des approches thérapeutiques. L’étude réalisée sur notre modèle a montré qu’il reproduit pour la première fois les symptômes moteurs et sensoriels retrouvés chez les patients, justifiant son utilisation valider notre approche de thérapie génique. Notre projet utilisera le stade juvénile (1 mois) et le stade adulte (2 à 12 mois). Notre modèle murin présente des défauts moteurs et sensoriels à partir de 3 mois ; il est donc nécessaire de débuter la stratégie à un stade précoce. La validation du protocole et l’évaluation des bénéfices au niveau comportemental et histologique doivent être évaluées au stade adulte pour évaluer les effets de la thérapie à moyen- et long-terme.