Souris

1 064 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales, l'implantation chirurgicale de pompes miniosmotiques et des examens cardiaques sous anesthésie, avant d'être euthanasiées pour analyse des tissus cardiaques et musculaires. La destruction ciblée de certains gènes vise à comprendre le remodelage du cœur menant à l'insuffisance cardiaque, dans une recherche fondamentale dont les applications thérapeutiques sont renvoyées à "un deuxième temps". Le porteur affirme qu'il n'est "pas possible de reproduire en culture" la fonction cardiaque de l'animal entier.

Objectifs

Une modification des propriétés contractiles, une altération de l'architecture cellulaire du muscle cardiaque et un changement métabolique conduisent à des phénomènes de remodelage cardiaque (hypertrophie/dilatation) aboutissant dans un deuxième temps à l'insuffisance cardiaque. Au niveau moléculaire, ce phénomène de remodelage est caractérisé par un changement dans l'expression des gènes cardiaques. Ce changement est régulé par une série de protéines appelées facteurs de transcription dont l'effet sera analysé dans le cadre du projet. L'altération du cytosquelette cellulaire conduit aussi à des phénomènes de remodellage cardiaque. Ainsi une anomalie des gènes codant pour les filaments intérmédiares peuvent conduire à des pathologies cardiaques et dont les effets seront analysés. Enfin, la mitochondrie, réservoir d'énergie pour les cellules, est régulée par une série de protéines dont la mutation conduit à des défauts métaboliques. Le rôle d'une de ces protéines sera étudié dans le cadre de ce projet. Enfin, l'obésité étant un facteur de risque majeur dans l'avénement de complications cardiovasculaires, le rôle des différents gènes étudiés sera analysé aussi dans ce contexte. Ainsi, l'objectif de notre étude sera d'analyser les fonctions cardiaques de ces gènes à travers leur inactivation à un temps précis dans un modèle murin.

Bénéfices attendus

Ce projet de recherche fondamental, permettra de mettre en évidence le rôle des gènes étudiés dans le cadre de l'étude et aboutira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires liés au remodelage cardiaque dans un contexte de cardiomyopathie en association avec des facteurs de risques comme l'obésité. La mise en évidence de nouvelles voies de signalisation imliquées dans la progression de la pathologie, permettra d'identifier de potentielles cibles thérapeutiques dans un deuxième temps

Procédures

Les interventions sur les animaux seront 1) Contention et injection en intrapéritonéal: fréquence trois jours successives avec alternence des côtés gauche et droite, durée de l'acte 30sec. 2) Incision (5mm) au niveau dorsal pour implantation des pompes miniosmotiques: intervention (5minutes; 1 fois) réalisée sous anesthésie et analgésique (30 minute avant l'incision). L’injection d'analgésique est répétée à 24 et 48h après la procédure pendant la phase de cicatrisation et adaptation de la souris à la pompe. 3) Echocardiographie: fréquence 3, durée 15 minutes, espacé de 15jours puis un mois, intervention non invasive réalisée sous anesthésie 4) ECG: fréquence 3, espacé de 15 jours puis un mois, durée 5minutes. En fin de procédure, les animaux seront euthanasiés pour l'analyse histologique et moléculaire des tissus afin de récolter les données.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables consistent en une réduction de la fonction cardiaque chez les souris suite à la délétion des gènes étudiés. La contention pour l'injection en IP et pour l'ECG pourrait générer du stress à l'animal, L'implantation de minipompes osmotiques pourrait occasionner une sensation de gêne et douleurs pendant les deux premiers jours.

Devenir

L'ensemble des souris impliqué dans le protocole sera euthanasié par une méthode réglementaire et ceci afin de récolter les différents tissus (coeur, muscles, vaisseaux) et procéder à l'examen histologique et moléculaire de ces tissus et recueillir ainsi les donnés indispensables pour déterminer le rôle des gènes étudiés dans la progression de la cardiopyopathie.

Remplacement

Pour le présent projet, le choix de l’expérimentation animale se justifie par le fait qu’il n’est pas possible de reproduire en culture la fonction cardiaque, vasculaire et musculaire telle qu’elle se retrouve dans l’animal entier (organisation structurale, régulations neuro-hormonale, influence de la dépense énergétique globale de l’organisme).

Réduction

L’utilisation du même matériel biologique pour 3 types d’analyse (morphologie, ARN et protéine) permet de diviser par trois le nombre de souris nécessaire. Le principe de réduction est appliqué par le calcul de puissance statistique de nos test basés sur des expériences de même type dans d’autres modèles de souris qui nous permettent de réduire à 7-10 souris par groupe, le nombre de souris utilisées. Ce projet nécessitera l’utilisation de 76 souris pour chaque lignée (7 lignées) ainsi qu'un nombre équivalent en souris contrôle. Ainsi 1064 souris sont prévues pour l'ensemble du projet.

Raffinement

Nous réduirons au maximum la souffrance des animaux. En effet, toutes les manipulations chez l’animal durant nos procédures seront réalisées sous anesthésie générale et analgésie (pour l'imlantation de minipompes osmotiques), garantissant une pénibilité minimale pour celui-ci. Pour réduire les effets indésirable liés à des anesthésies fréquentes, l'injection en IP correspondant en terme de douleur et stress à une piqure sera réalisée sans anethésie. Une grille d’évaluation des points limites est établie. Si une souris présente des signes de stress ou de souffrance sans que le point limite soit franchi, il sera reconnu comme souffrant. L’animal sera mis sous surveillance accrue (avec marquage de cage par carte) et l’administration d’un analgésique sera envisagée en cas de nécessité. Tous les animaux qui ont atteint ces points limites seront euthanasiés précocement. Toutes ces attentions particulières portées au bien-être animal seront complétées par un hébergement adapté, c’est-à-dire avec des congénères (répartis en cages de 5) et avec des éléments d’enrichissement dans les cages (cubes de bois à ronger, abris, substrats pour la construction de nids, nourriture et eau de boisson ad libitum) afin de créer un environnement propice au confort des animaux. Le milieu sera enrichi avec des nids et des maisons en carton.

Choix des espèces

Pour atteindre notre objectif, nous sommes amenés à utiliser un modèle murin car aucun système in vitro et aucun modèle d’organisme plus simple ne permet de reproduire la complexité de la fonction cardiaque. La souris a été sélectionnée pour la possibilité de générer par recombinaison homologue ou transgénèse des modèles d’invalidation ou surexpression du gène Les animaux utilisés auront entre 2 et 4mois d'âge (considéré comme l'âge où le coeur a fini sa croissance et présente les caractéristiques d'un coeur adulte) au début de la procédure. Les souris seront maintenues en cages (5/cages)

1 322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules de mélanome sous la peau ou en intraveineuse, des gavages répétés pouvant atteindre 52 séances par animal, des applications cutanées de bactéries et des injections d'immunothérapie, avant d'être mises à mort pour prélever tumeurs et organes lymphoïdes. L'étude cherche à comprendre comment le microbiote influence la réponse au traitement du mélanome. Le porteur affirme que l'interaction entre bactéries intestinales et réponse immunitaire ne peut être étudiée que sur "organisme entier".

Objectifs

Le mélanome est un cancer qui se développe initialement au niveau de la peau (mélanome cutané) ou de l’œil (mélanome uvéal). Le mélanome cutané est le cancer dont le taux d’incidence a le plus augmenté entre 2010 et 2018 (+3,4 %). La mortalité due à ce cancer diminue notamment grâce à des avancées thérapeutiques importantes au cours de la dernière décennie. En effet, les immunothérapies permettant de renforcer l’action anti-tumorale des lymphocytes T constituent la première ligne de traitement du mélanome en France. Cependant 60% des patients résistent à ces traitements. Nous étudions une protéine qui pourrait jouer un rôle majeur dans cette résistance. Notre hypothèse est que cette protéine, surexprimée dans le microenvironnement tumoral, élimine des bactéries indispensables pour la réponse au traitement. Nous proposons d’identifier ces bactéries, puis d’évaluer si ces dernières potentialisent l’efficacité de l'immunothérapie. Alternativement, nous évaluerons l’efficacité thérapeutique d’un inhibiteur de notre protéine d'intérêt. L’objectif fondamental de ce projet est de déterminer l’impact de ces traitements sur les cellules immunitaires au site de la tumeur.

Bénéfices attendus

Nous avons mis en évidence le rôle d’une protéine dans l’agressivité du mélanome. Ce projet permettra de mieux comprendre le mécanisme d’action de cette protéine. Compte tenu d’une part de sa capacité à lyser des bactéries in vitro et d’autre part de sa surexpression lors du développement du mélanome, cette protéine pourrait modifier in vivo la composition des bactéries aux niveaux de l’intestin mais aussi de la peau, site du développement tumoral. Nous émettons l’hypothèse que le retard du développement tumoral chez les souris dont l’expression de cette protéine a été inactivée est dû à la présence de bactéries anti-tumorales et que ces bactéries sont spécifiquement éliminées chez des souris exprimant notre protéine d’intérêt. Nous déterminerons quel est l’impact de telles bactéries sur le développement tumoral et la mise en place d’une réponse immunitaire dans un modèle de mélanome induit par transplantation et dans un modèle de mélanome spontané. Nous déterminerons si ces bactéries anti-tumorales ou un inhibiteur de notre protéine d'intérêt augmentent l’efficacité d’un traitement par immunothérapie. Des essais cliniques récents supportent que des patients atteints de mélanome métastatique, initialement réfractaires à une immunothérapie, répondent au traitement après avoir reçu une transplantation des selles de malades répondeurs à ce traitement. A terme, nos travaux pourraient permettre de proposer deux nouvelles stratégies pour traiter le mélanome cutané chez l’homme. Une première stratégie consisterai à modifier la composition des bactéries, non plus de façon systémique, mais au niveau cutané. Alternativement, nous proposer d’associer à l’immunothérapie de référence un inhibiteur de notre protéine d’intérêt.

Procédures

Prélèvement sur souris vigiles de 15-20 jours de bactéries cutanées par écouvillon et de fèces. Rasage des souris (5 minutes par souris), un jour avant l'injection en sous-cutanée des cellules de mélanome. Injection en sous-cutanée (estimation 5 minutes) ou en intra-veineuse (estimation 6 minutes) de cellules de mélanome. Ceci n'est réalisé qu'une fois par souris. Cinq mesures des tumeurs avec un pied à coulisse suite à la transplantation de cellules de mélanome en sous-cutanée. Cela prend environ 5 minutes par souris maintenues en contention. Gavage oral (5 minutes par souris) tous les 3 jours avec des fèces chez des souris avec un mélanome transplanté. Le gavage sera réalisé maximum 6 fois par souris. Application topique avec une pipette de bactéries sur la peau rasée de souris sous anesthésie. 5 dépots de bactéries sont prévus par souris. L'intervention durera le temps de pénétration des bactéries dans la peau puis le temps de réveil. Cela est estimé à 30 minutes par souris. Plusieurs souris seront traitées simultanément. Administration intra-péritonéale (estimation 3 minutes par souris) d'une immunothérapie tous les 5 jours à partir de J14 et gavage oral (estimation 5 minutes par souris) avec des bactéries tous les 4 jours à partir de J15 dans le modèle de mélanome spontané. Au total 10 injections de l'immunothérapie et 11 gavages par des bactéries sont prévus par souris. Gavage oral bi-quotidien (5 minutes par souris) avec un inhibiteur de notre protéine d’intérêt (100µl) pendant 26 jours. Au total 52 gavages par souris.

Impact sur les animaux

Les injections sous-cutanées, intra-veineuses, intra-péritonéales et par gavage oral peuvent occasionner stress et douleurs lorsque celles-ci sont pratiquées aux animaux. Le dépôt de bactéries sur la peau n'engendre pas de douleur. La croissance tumorale, spontanée ou induite par la transplantation des cellules de mélanome, peut occasionner un stress, une gêne ou des douleurs. Enfin la manipulation pour collecter les fèces chez des souris avant sevrage ou encore mesurer les tumeurs à l’aide d’un pied à coulisse peut également induire un stress chez les animaux. La transplantation de cellules tumorales en intra-veineuse peut induire une perte de poids des animaux.

Devenir

Les males reproducteurs seront tous mis à mort à l’atteinte des points limites. Tous les autres animaux seront mis à mort pour prélever des organes lymphoides secondaires (rate et ganglions) et des tumeurs primaires et des métastases.

Remplacement

Des expériences in vitro suggèrent que la protéine que nous étudions empêche la mise en place de réponses immunitaires anti-tumorales. Des expériences sont actuellement réalisées in vitro pour évaluer si cette protéine est également capable de lyser spécifiquement des bactéries fécales cultivées dans des conditions qui miment le flux intestinal. L’objectif est d’identifier des bactéries sensibles à cette protéine. Cela sera complémentaire de la caractérisation des bactéries fécales et cutanées présentes chez les souris exprimant ou non notre protéine d’intérêt. Le recours à l’expérimentation animale est justifié par l’impossibilité de modéliser in vitro ou in silico les interactions entre les bactéries intestinales et les cellules immunitaires associés au mélanome primaire ou aux métastases cutanées. En effet, la complexité de la réponse immunitaire in vivo dans la tumeur et les organes lymphoïdes secondaires des vertébrés ne peut être reproduite par des méthodes alternatives. Le bénéfice d’une réponse à un traitement (réorientation du microbiote ou inhibiteur de la protéine d’intérêt) sur le développement tumoral ne peut être étudié que sur organisme entier en raison de l’organisation et de la coopération des tissus.

Réduction

Pour respecter le principe des 3R, la durée du traitement par l’inhibiteur de la protéine que nous étudions a déjà été optimisée par notre collaborateur qui a développé cette molécule. Un nombre minimum d'animaux sera inclus dans chaque groupe mais toutefois suffisant. L’expérience des manipulateurs permettra d’assurer la reproductibilité de la procédure et d’appliquer des tests statistiques entre les différentes conditions. Ainsi les groupes reposant sur le modèle de mélanome spontané nécessitent 40 souris, alors que les procédures de transplantation tumorale requièrent des groupes de 16 souris. Les élevages permettent de générer non seulement des souris transgéniques pour un oncogène développant spontanément un mélanome, mais aussi des souris contrôles non transgéniques de la même portée.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation et contrôlées pour réduire toute douleur, souffrance, angoisse ou dommage durable potentiels. Les souris disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de “maison-abri” en carton. Nous nous efforcerons à chaque instant de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. Nous avons défini des points limites pour lesquels les animaux seront mis à mort. L’état général des animaux sera suivi par le personnel qualifié de l’animalerie lors des changes. A partir des traitements, les animaux seront suivis 3 à 5 fois par semaine par le responsable du projet pour suivre le comportement des animaux et la progression tumorale. Les animaux injectés par des cellules tumorales en intra-veineuse seront pesés à J0 et à J7 et J12. Tout état anormal sera transmis au responsable de projet et les mesures pour remédier à la douleur animale seront mises en place (mise à mort et analyse des animaux).

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été choisie car c’est un excellent modèle pour étudier la réponse immunitaire anti-tumorale, de nombreuses voies étant conservées entre la souris et l'homme. En particulier, le modèle de mélanome spontané est relevant cliniquement par rapport à la pathologie humaine. Nos données préliminaires de co-hébergement de souris,contrôles ou déficientes pour la protéine qui nous intéresse, montrent le rôle du microbiote sur la progression tumorale ce qui justifie d’identifier des bactéries pro- et anti-tumorales chez ces souris. Dans notre modèle comme chez l’homme, le traitement de référence utilisé en clinique pour traiter le mélanome cutané métastatique n’est que partiellement efficace. Nous espérons améliorer son efficacité soit en modifiant simultanément les bactéries présentes aux niveaux intestinal ou cutané, soit en l’associant un inhibiteur de notre protéine d’intérêt. Les souris contrôles et déficientes pour la portéine qui nous intéresse auront entre 6 et 10 semaines au moment de la transplantation tumorale car il est nécessaire que le système immunitaire soit mature pour étudier le développement tumoral et l’effet de la modulation du microbiote sur celui-ci. Les souris transgéniques que nous utilisons développent un mélanome primaire vers l’âge de 3 semaines qui métastase au niveau cutané vers 4 à 5 semaines. Les fèces seront donc prélevés sur des animaux de 15 à 20 jours, un peu avant la détection macroscopique de la tumeur primaire, dans la mesure où le microbiote influence très tôt le développement tumoral. Ces souris seront également traitées dès J14 pour étudier l’effet de la modulation du microbiote et de l’immunothérapie sur le développement tumoral. Finalement, elles seront traitées avec l’inhibiteur de notre enzyme associé ou non à l’immunothérapie soit à J14 soit à J60 pour étudier l’effet sur le développement tumoral dans des conditions prophylactique et thérapeutique.

384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour reproduire la leucodystrophie métachromatique, une maladie neurodégénérative infantile, elles reçoivent par chirurgie un implant sous-cutané de cellules encapsulées et jusqu'à six prélèvements sanguins mensuels, puis sont euthanasiées pour analyses post-mortem. L'étude évalue une enzymothérapie visant les patients déjà symptomatiques, pour lesquels il n'existe à ce jour aucun traitement. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de modèle in vitro et que la souris est la "seule espèce" pour laquelle un modèle de cette maladie a été créé.

Objectifs

La leucodystrophie métachromatique (MLD) est une maladie neurodégénérative héréditaire conduisant à une perte de myéline (isolation de la gaine nerveuse) qui s’accompagne de signes cliniques très sévères cognitifs et moteurs chez le jeune enfant avec une aggravation très rapide et un décès des patients. De nos jours la majorité des patients atteints de MLD sont diagnostiqués lorsque leurs symptômes sont déjà bien installés (patients symptomatiques). Les traitements actuels, présentent de bons résultats pour les enfants traités en présymptomatique mais restent inefficaces une fois les symptômes présents. L’enjeu pour cette maladie est donc de trouver des traitements pouvant agir sur les patients symptomatiques et notamment sur l'inflammation cérébrale, une composante majeure de la maladie. Nous proposons d’évaluer l’efficacité d’une nouvelle thérapie pour le traitement de la pathologie via une sécrétion continue de la protéine (mode d'administration confidentiel) dans le modèle murin de la maldie déjà bien caractérisé.

Bénéfices attendus

À l’heure actuelle il n’existe aucun traitement pour les patients atteints de MLD ayant des symptômes déjà bien installés (patients symptomatiques). Ce projet a pour but d'identifier une nouvelle voie thérapeutique chez les patients déjà symptomatiques pour la LDM.

Procédures

- prelevement sanguin une fois par mois soit 6 au maximum, durée d'environ 5min sous anesthésie - une chirurgie d'implantation une fois à 6 mois avec une procédure par animal d'une durée maximale de 20min sous anesthésie et analgésie - euthanasie à la fin du projet

Impact sur les animaux

Le principal effet indésirable concerne le stress que pourrait engendrer les prises de sang mensuelles sur l’animal. Enfin, l'implant de ce projet a une taille minimale comparé à notre étude précédente avec des implants rectangulaires de 25mmx12mmx13mm d'épaisseur, qui était déjà bien tolérés. Il y a de plus un risque anesthésique et un risque de douleur post chirurgical.

Devenir

En fin de procédure tous les animaux seront euthanasiés, car les prélèvements et analyses (histologique et biochimique) sont nécessaires post-mortem.

Remplacement

À l’heure actuelle il n’existe pas de modèle In vitro ou de système cellulaire pour étudier les symptômes et marqueurs moléculaires associés à la Leucodystrophie métachromatique (MLD). Nous avons donc besoin de modèles animaux pour reproduire et étudier cette maladie et surtout évaluer l’effet thérapeutique de l'implantation en sous cutanée des cellules encapsulées permettant une sécrétion continue d'arylsulfatase A. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé.

Réduction

Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats fiables. Compte tenu de la littérature et des effets attendus, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire. De ce fait un nombre de 12 souris par groupe a été choisi, ce qui va nous permettre de limiter la variabilité inter-animale et inter-groupe, et de réaliser des tests statistiques fiables. Un nombre total maximal de 384 souris (comprenant 2 répétions des expériences par groupe) sera nécessaire pour ce projet.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises en œuvre afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal en limitant au maximum la douleur et le stress (anesthésie pour les prises de sang, manipulation en amont de la procédure pour une habituation au manipulateur, prise de poids mensuelle). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. En cours de procédure une attention particulière est donnée à nos animaux afin de garantir leur bien-être grâce à une surveillance quotidienne (points limites) et de soins adaptés. Enfin, en terme de raffinement nous avons réduit la taille de notre dispositif. Les animaux seront hébergés dans des conditions standard avec mise à disposition d'enrichissement

Choix des espèces

Nous avons besoin d’un modèle animal pour reproduire et étudier la MLD et surtout pour évaluer l’effet thérapeutique de la sécrétion en continu d'ARSA par des cellules encapsulées. Le modèle de choix pour étudier la MLD est la souris car seule espèce pour laquelle un modèle de MLD a été créé. Nous prévoyons de conduire notre étude sur un modèle murin déjà connu de MLD déficient pour l’enzyme ARSA, le modèle murin de la pathologie, génétiquement modifié est très proche de ce que l’on retrouve chez les patients. Les souris développent tardivement à partir de 15-18 mois, un phénotype ataxique et moteur. Ce phénotype tardif n’est pas dommageable, sachant que nos souris seront euthanasiées à 12 mois soit avant l'apparition des anomalies motrices. Les animaux entreront en procédure à 5mois et 2 semaines (acclimatation à la zone A1 de l’animalerie, et habituation au manipulateur) avec un début du traitement à 6 mois, âge auquel débutent des premiers symptômes chez la souris (souris symptomatiques). La fin de la procédure aura lieu lorsque les souris auront 8 ou 12 mois selon la durée du traitement et selon les différents groupes.

1 016 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes reçoivent une injection pour activer leur système immunitaire, leur descendance est isolée trois semaines puis reçoit une injection stéréotaxique dans le cerveau, avant une batterie de tests de locomotion, d'anxiété, de sociabilité, de dépression et de cognition dont le RNT ne précise pas le détail. Le porteur étudie comment l'infection pendant la grossesse et l'isolement précoce affectent le cerveau et le comportement. Il affirme que ces effets dépendent du développement cérébral de l'embryon à l'adulte et ne peuvent être reproduits in vitro.

Objectifs

L'infection virale pendant la grossesse et l'isolement chronique pendant l'enfance ont un impact sur le développement du cerveau et peuvent entraîner des problèmes de comportement à long terme. Ce projet vise à mesurer l'impact de l'activation immunitaire maternelle couplé à l’isolement social juvénile sur l'expression génétique dans les plexus choroïdes et le cortex préfrontal chez la souris adolescente et adulte. Ce projet vise également à analyser les différences liées au sexe et à la résilience. Le profilage des cytokines dans le sérum des souris juvéniles et adultes permettra d'établir une corrélation entre le stress et le comportement. L'analyse du comportement des souris adultes permettra d'évaluer la socialisation, la stéréotypie, la régulation sensorimotrice, la cognition et les phénotypes liés à l'anxiété. Afin de réparer les effets négatives de ces stress, nous allons modifier des facteurs provenant du plexus choroide pour induire de la plasticité cérébrale chez l’adolescent et permettre un ajustement positif du cortex préfrontal en réponse à l'expérience sociale. La réussite de la réparation sera évaluée par le comportement et l'expression génétique chez l’adulte.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes à l'origine des symptômes liés à l'anxiété, le stress et les infections virales subis pendant le dévelopement embryonaire et la petite enfance. Il fournira de nouvelles cibles moléculaires pour le traitement des troubles du développement neurologique caractérisés par une maturation et un fonctionnement défectueux des interneurones corticaux.

Procédures

Une injection intrapéritoneale sera réalisée sur animaux gestantes et vigiles; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront hébergés en isolement pendant 3 semaines. Une prise de sang sera effectuée sur des animaux anesthésiés; la procédure dure environ 1 minute en moyenne et sera effectuée une seule fois. Certains animaux seront soumis à un seul test de locomotion qui dure 30 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau d'anxiété et dure 10 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test d’interaction social qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test qui évalue le niveau de dépression et dure 8 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test de stéréotypie qui dure 20 minutes. Certains animaux seront soumis à un seul test cognitif qui dure 6 minutes. Une injection stéréotaxique intracérébrale sera effectuée sur des animaux anesthésiés; cette procédure chirurgicale dure environ 1 heure et sera effectuée une seule fois.

Impact sur les animaux

Les injections intrapérioneales d’acides nucléiques sur des femelles gestantes entraînent généralement une perte de poids qui dure 24 heures. Les animaux reprennent un poids normal par la suite. Suite à la chirurgie, il est possible que les animaux soient stressés après réveil, sujets à des fluctuations de poids ainsi que de la douleur locale. Les animaux issus d'une mère soumise à une activation immunitaire peuvent présenter des effets [attendus] sur leur comportement adult (anxiété, dépression, stéréotypie, troubles de la perception sensori-motrice). L’isolement des animaux peut avoir des effets [attendus] tel que la néophobie, des troubles de la perception sensori-motrice, l’agressivité, et des troubles de socialization.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort et leur cerveau et sang seront collectés afin de permettre des analyses histochimiques et biochimiques.

Remplacement

Nos recherches sur les effets du stress sur la plasticité du cerveau nécessitent des modèles de souris pour comprendre comment l'environnement juvénile affecte le comportement adulte. Ces expériences ne peuvent être reproduites in vitro car elles dépendent du développement du cerveau de l’embryon jusqu’à l'âge adulte.

Réduction

Nos travaux antérieurs sur des animaux soumis à des injections cérébrales suivies de plusieurs analyses comportementales nous ont permis de démontrer qu'un nombre de 12 souris par condition expérimentale est nécessaire. Ceci nous permet d'obtenir une puissance statistique satisfaisante même si 1 ou 2 souris sont perdues lors de la chirurgie. Pour les procédures avec analyses comportementales mais sans chirurgie, nous utiliserons 10 souris par condition. Nous allons faire plusieurs analyses (sang, comportement, histologie, biochimie) sur chaque souris afin de minimiser le limiter le nombre d’animaux.

Raffinement

Toutes les expériences invasives sont réalisées sous anesthésie générale, associée à un traitement analgésique. Après la chirurgie, les animaux sont transférés dans une cage chauffée avec un tapis chauffant jusqu'à leur réveil. Ils sont ensuite hébergés dans leur groupe d'origine pour éviter le stress de l'isolement, puis observés et pesés quotidiennement pendant 2 jours. Pour évaluer les points limites, les souris seront inspectées quotidiennement afin de détecter les signes d'infection et de douleur (changement de posture, de pelage, d'expression faciales), et des mesures de poids seront prises au moins deux fois par semaine. En cas d'infection ou de signes de douleur, les animaux recevront un traitement approprié. En cas de perte de poids, les animaux seront placés dans des cages chauffées et recevront un régime alimentaire enrichi. Les animaux seront euthanasiés si aucune amélioration n'est constatée après 2 jours de traitement ou si la perte de poids dépasse 20% du poids de départ.

Choix des espèces

La génétique de la souris est très bien connue et proche de celle de l'homme, ce qui en fait un modèle privilégié pour l'étude de la plasticité cérébrale et des effets du stress en début de vie. C'est un animal avec lequel nous avons l'habitude de travailler et pour lequel nous avons une bonne expertise pour réduire les conditions de stress, d'inconfort et de douleur. Il nous permet également de créer des modèles pour l'étude des pathologies humaines. Ce projet implique un stress postnatal précoce, un sauvetage moléculaire pendant l'adolescence et l'analyse des phénotypes adolescentes et adultes. Des injections stéréotaxiques dans les ventricules cérébraux seront effectuées sur des souris agées de 45 à 50 jours, lorsque cette région du cerveau est plastique. Le comportement sera évalué chez l’adolescent (agées de 45 à 55 jours) et chez l’adulte (agées de 70 à 110 jours), lorsque les phénotypes se manifestent.

254 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit une minipompe implantée par chirurgie, une autre est isolée sept jours en cage à métabolisme avec de l'eau acidifiée, et des prélèvements sanguins sont réalisés au coin de l'œil, geste que le porteur reconnaît traumatisant. Le porteur étudie le rôle d'un récepteur membranaire dans les cellules du rein qui sécrètent de l'acide. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire ne reproduit le canal collecteur du rein et juge le recours à la souris indispensable, avant prélèvement des reins et de la rate.

Objectifs

Le rein contrôle la composition en ions et en eau de l'organisme. Cette fonction est rendue possible grâce à des cellules qui forment de longs segments en forme de tubes dans le rein. Il existe plusieurs types de cellules tubulaires qui ont chacune des fonctions particulières. Certaines cellules appelées cellules intercalaires sécrètent des acides dans l’urine en formation. Ces dernières sont importantes lorsque l’organisme est surchargé en acide comme dans plusieurs situations : diabète, régime riche en protéines, troubles du métabolisme. Le nombre des cellules du canal collecteur varient en fonction des apports en ions. Par exemple, une charge acide (induite par un produit introduit dans l’eau de boisson) provoque l’augmentation du nombre de cellules intercalaires. Cette augmentation a un rôle important puisque son défaut entraine une perturbation de la régulation de l’état acido-basique pour autant sa régulation n’est pas bien comprise. Ce projet propose d’étudier le rôle d’une protéine située sur la surface des cellules intercalaires A sur la fonction de ces cellules. Il aura pour objectifs de déterminer l’importance de cette protéine pour 1/ la sécrétion acide par le rein, 2/ le comportement des cellules intercalaires, 3/ la régulation du nombre de ces cellules. Il n’existe pas de modèle alternatif de cellules intercalaires en culture au laboratoire qui reproduisent l’ensemble des cellules tubulaires du canal collecteur. Ce projet nécessite l’utilisation de souris dont la composition cellulaire rénale est proche de l’homme. Chez des souris, la protéine étudiée dans ce projet sera inactivée par une molécule chimique ou par inactivation d’un gène. Nous mesurerons la fonction du rein chez ces souris ainsi que le contenu en ions du sang de ces animaux. La composition cellulaire des reins de ces souris sera également explorée.

Bénéfices attendus

La régulation du nombre de cellules dans le canal collecteur rénal est mal connue. Pourtant, il joue un rôle fondamental dans le maintien bien équilibré d’un organisme pour son contenu en eau et en ions, pour le maintien du pH sanguin et une pression artérielle constante. Ce projet permettra de mieux connaitre certains mécanismes du rein qui sont modifiés lors de maladies comme l’hypertension ou de troubles métaboliques comme le diabète. La protéine étudiée dans ce projet est également la cible de molécules anticancéreuses dont certains effets secondaires concernent le rein. Ce projet permettra donc également de préciser le mécanisme de ces molécules anticancéreuses et leurs effets sur le rein.

Procédures

Une minipompe osmotique sera placée sous la peau du dos de souris et nécessite une procédure chirurgicale faite sous anesthésie générale. La chirurgie dure moins de 15 minutes et les animaux se réveillent de l’anesthésie au bout de 45 minutes. La minipompe administrera une molécule inhibitrice du récepteur étudié pendant 14 jours. La pose d’une minipompe concernera au maximum 174 souris. Un prélèvement sanguin (durée du prélèvement inférieure à 10 secondes) sous anesthésie gazeuse sera imposé à 42 de ces souris pour mesurer les taux circulants de monocytes et neutrophiles. Pour étudier la fonction rénale, 132 souris seront installées individuellement dans des cages spéciales (cages à métabolisme) pendant 7 jours consécutifs permettant de récolter leurs urines. Le poids des souris, la quantité de nourriture ingérée ainsi que le volume de boisson seront mesurées dans ces cages. L’eau de boisson des souris sera acidifiée permettant de solliciter les cellules intercalaires rénales, Un prélèvement sanguin après application d’un collyre anesthésiant pour chacune des 132 souris permettra de mesurer les concentrations en ions du sang (durée du prélèvement inférieure à 10 secondes). Un autre lot de 80 souris dont un gène a été inactivé sera également placé dans ces cages à métabolisme permettant de suivre la composition de leurs urines lorsque ces souris sont soumises à une charge en acide. Elles auront deux prélèvements sanguins après application d’un collyre anesthésiant avant et après leurs placements en cages à métabolisme (durée de chaque prélèvement inférieure à 10 secondes). L’ensemble des souris seront mises à mort sous analgésie et sous anesthésie générale profonde par une perfusion d’un liquide fixateur des tissus.

Impact sur les animaux

Une molécule sera administrée par minipompe osmotique implantée sous la peau de la souris nécessitant une chirurgie sous anesthésie générale. Pour mesurer plusieurs composés du sang, des prélèvements sanguins sont nécessaires. Ces prélèvements seront réalisés au niveau du coin de l’œil ce qui peut être traumatisant pour la zone autour de l’œil. Certaines souris seront placées dans une cage adaptée pour recueillir leurs urines. Dans cette cage, les souris sont placées sur une grille. L’hébergement dans ces cages se fait de manière individuelle en isolant chacune des souris. Le séjour en cages à métabolisme durera 7 jours consécutifs. Dans ces cages, l’administration d’un traitement acide dans l’eau de boisson testera la fonction rénale des souris. Le traitement acide entraine une modification transitoire du pH sanguin mais qui est compensée au bout de 7 jours. Dans ce projet, une nouvelle souche de souris sera générée pour inactiver un gène dans certaines cellules rénales et ceci n’a jamais été fait ni décrit dans la littérature. Il n’est pas anticipé d’effets indésirables de cette inactivation.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer les tissus (reins et rate) et d’en analyser le contenu en cellules et de quantifier l’abondance de plusieurs transporteurs ioniques.

Remplacement

Les modèles de cellules rénales en culture ne permettent pas d’obtenir les informations souhaitées ; ce projet nécessite un systèmes intégré multi-cellulaire reproduisant fidèlement le canal collecteur. Ce modèle n’existe pas à l’heure actuelle. Le recours aux modèles animaux s’avère donc indispensable. De plus, nous avons besoin dans ce projet d’une souche de souris génétiquement modifiée. Cette souche permettra l’inactivation ciblé du gène du récepteur dans un nombre restreint de cellules du rein. L’inactivation permettra de déterminer le rôle du récepteur sur le fonctionnement des cellules intercalaires rénales.

Réduction

Dans toutes les procédures, le nombre d’animaux par lot a été défini a minima afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Pour les mesures du contenu sanguin en ions, les protocoles ont été élaborés pour réduire au minimum le volume de sang prélevé et ainsi faire deux mesures sur les mêmes animaux à 2 semaines d’intervalle. Cela permet de réduire le nombre total de souris d’une procédure. L’administration du traitement acide dans l’eau de boisson et l’utilisation des cages à métabolisme pour mesurer la fonction rénale ont été déjà validés par plusieurs publications permettant d’anticiper parfaitement le nombre souris minimum nécessaire au projet. Le nombre de souris a également été calculé pour détecter des différents significatives entre les différents mesures histologiques et biochimiques faites sur les reins prélevés après mises à mort des animaux. Deux doses de la molécule inhibitrice seront testées et une seule dose sera utilisée dans la suite du projet en fonction des premiers résultats.

Raffinement

Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée entre l’arrivée des souris dans l’animalerie et le début des expérimentations sur celles-ci. Les animaux bénéficieront tous d’une surveillance rapprochée dès le début des procédures. La mise en place du dispositif d’injection sous la peau est fait sous anesthésie générale et analgésie locale. Pour limiter les effets indésirables de ce dispositif, le plus petit modèle a été sélectionné. Les prélèvements sanguins seront faits sous anesthésie générale lorsque cela sera possible sans fausser les mesures. Pour la mesure des concentrations ioniques dans le sang, le prélèvement sera fait avec analgésie locale avec un collyre anesthésiant. Les animaux seront observés après les prélèvements avec l’utilisation de points limites. Le protocole d’utilisation des cages à métabolisme comporte un suivi quotidien des animaux avec une grille de différentes mesures. Des points limites ont été établis ayant pour conséquence la sortie du protocole pour l’animal. Une habituation des souris à la cage et à la nourriture en poudre. Un abri opaque est également installé dans la cage permettant à l’animal de s’y réfugier. Le séjour dans les cages à métabolisme a été réduit au minimum. En cas de comportement agressif d’un animal envers ses congénères dans une cage de stabulation, les animaux seront isolés dans des cages individuelles pour éviter le risque de sur-blessure. Les cages de stabulation seront également enrichies avec des boules d’ouate, des bâtonnets de bois, du carton.

Choix des espèces

La souris représente un modèle de choix car elle présente une organisation du rein très semblable au rein humain. Nous savons déjà que le récepteur étudié dans ce projet est présent à la surface des mêmes cellules chez la souris adulte et chez l’homme adulte. Nous avons également des résultats préliminaires qui montrent que ce récepteur est fonctionnel chez la souris. Les souris utilisées dans ce protocole seront des souris adultes car le projet porte sur l’étude de la fonction rénale d’un organisme adulte.

2 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la moitié réutilisée dans d'autres projets et l'autre tuée pour prélèvement d'organes. Certaines reçoivent une minipompe implantée sous anesthésie, toutes reçoivent un candidat médicament par diverses voies puis passent le test d'Irwin, une batterie d'observations neurologiques, l'amphétamine et l'halopéridol servant de références. Le porteur, prestataire de service, propose cette évaluation des effets d'un composé sur le système nerveux central dans le cadre d'une offre commerciale. Il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne suffit pour évaluer les effets comportementaux et neurologiques avant le passage chez l'humain.

Objectifs

La développement de nouveaux médicaments s'accompagne d'une évaluation de leurs potentiels effets secondaires chez l'animal avant toute administration chez l'homme. Cette évaluation pré-clinique de la sécurité du candidat médicament au niveau du système nerveux central peut être effectuée par le test d'Irwin chez la souris. Le test consiste à effectuer une batterie d'observations fonctionnelles incluant des paramètres comportementaux sensori-moteurs, autonomes ou neurologiques après administration d'un candidat médicament afin d'évaluer les effets secondaires de ce dernier sur le système nerveux central de la souris.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments avec peu d'effets secondaires pour le patient afin de traiter diverses maladies dans de nombreuses indications thérapeutiques (par exemple, les cancers, les maladies du système nerveux central). Ces composés pourraient avoir aussi une application en médecine vétérinaire. A court terme, les bénéfices attendus sont d'évaluer les éventuels effets secondaires du composé testé avant son passage en phases cliniques. Pour l’animal, les bénéfices attendus sont une acquisition de connaissances sur l’espèce utilisée (souris) par le développement d’outils de raffinement de plus en plus adaptés et le choix de l’espèce la plus prédictive.

Procédures

Avant de réaliser le test d'Irwin et afin de permettre une administration chronique du produit à tester, les animaux pourront être sujet à l'implantation d’une minipompe (environ 35 mins) sous anesthésie générale avec une analgésie morphinique et recevoir un suivi post-opératoire selon les bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux peuvent également recevoir le produit à tester par différentes voies d'administration (-2 minutes ; voie orale, intrapéritonéale, sous-cutanée, transdermique, intradermique, intramusculaire ou intraveineuse (bolus ou perfusion)) à un volume respectant les recommandations éthiques. Les animaux seront ensuite évalués d'un point de vue neurologique dans le test d'Irwin, un test durant 6 minutes et qui consiste en l'évaluation de différents paramètres à différents temps de mesure post-admininistration. Leur activité locomotrice pourra également être évaluée dans un actimètre (environ 60 minutes). Une observation peut être réalisée avant l'adminsitration et la période d'observation post-administration sera de 24h à 72h. Celle-ci pourra être allongée en fonction de la durée de demi-vie du candidat médicament. Des prélèvements de sang (environ 1 min) pourront également être effectués en cours d'étude en respectant les recommandations éthiques pour les volumes et la récupération entre les séries de prélèvements. Des fluides corporels et des tissus pourront également être prélevés à la fin de l'étude après euthanasie de l'animal selon les bonnes pratiques vétérinaires.

Impact sur les animaux

Si chirurgie pour implanter une minipompe, les animaux seront sujets à une anesthésie. . Les animaux peuvent également être mis en isolement social après la chirurgie et jusqu'à 3 semaines post-chirurgie. Le test d'Irwin en lui-même ne provoque pas plus de nuisance pour l'animal qu'un éventuel stress lié à la préhension et au déplacement de ce dernier. L'administration d'éléments de référence comme l'amphétamine et l'halopéridol peuvent induire des effets secondaires modérés et limités par les doses utilisées dans cette procédure. Les animaux peuvent également être mis à jeun pour une période de 18-20h avec complémentation en glucose ou non.

Devenir

A la fin de l'étude, les animaux pourront être euthanasiés pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal. Un certain nombre d'animaux pourra également être réutilisé dans un autre projet ayant un degré de sévérité sans réveil, léger ou modéré après accord du vétérinaire.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les symptômes comportementaux ou neurologiques. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour évaluer la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuels signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire et un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • La réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse, • La familiarisation des animaux aux procédures expérimentales.

Choix des espèces

La souris est l'une des espèces animales les plus pertinentes, les mieux caractérisées et les plus couramment utilisées pour évaluer les potentiels effets secondaires d'un produit sur le système nerveux central. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement afin de s'affranchir de divers effets liés au développement et à l'âge (par exemple les changements hormonaux).

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection quotidienne de D-galactose pendant dix semaines pour provoquer un vieillissement accéléré avec déficits de mémoire et anxiété, puis passent cinq tests comportementaux dont un test de peur conditionnée. Le porteur étudie le rôle des exosomes et d'un régime enrichi en oméga-3 dans la protection des fonctions cognitives liées à l'âge. Il affirme que le comportement et les régimes ne s'étudient que sur animal vivant, avant prélèvement du cerveau.

Objectifs

Le vieillissement s’accompagne d’une inflammation chronique à bas bruit, c’est-à-dire qu’elle est silencieuse, le mécanisme inflammatoire se situe alors sous le seuil de la douleur et cause des dégâts dans l’organisme sans qu’il y ait de foyer inflammatoire précis. Cette inflammation impliquent notamment la communication entre les neurones et les cellules microgliales, les principales cellules du système immunitaire cérébral. Cette communication repose sur des vésicules extracellulaires, les exosomes, qui participent à la fois aux fonctions physiologiques et aux réponses inflammatoires dans le cerveau. L’alimentation est clé dans le bon fonctionnement cérébral et le vieillissement cognitif. Les acides gras polyinsaturés n-3 (AGPI n-3) ou oméga 3, ont un rôle bénéfique sur les fonctions cognitives. Leurs mécanismes d’action restent à ce jour méconnus. Ce projet consiste à identifier les biomarqueurs du cerveau du risque de déclin cognitif accéléré par l'étude des exosomes, et de déterminer le rôle des exosomes dans la protection par la nutrition des fonctions cognitives dans un modèle de vieillissement murin accéléré. Ce projet a pour objectif d’identifier des biomarqueurs cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles ciblant la neuroinflammation pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Nous allons utiliser un modèle de vieillissement accéléré déjà établi, reposant sur l'utilisation du D-galactose, et soumettre une partie des animaux à un régime enrichi en Oméga-3 afin de protéger des effets cognitifs. Nous étudierons alors les capacités de mémoire, la neuroinflammation et les exosomes.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans la protection des effets du vieillissement par les oméga-3. Il permettra également de déterminer des marqueurs du vieillissement cérébral au niveau sub-cellulaire (exosomes) et ceci dans le cerveau mais également dans le sang.

Procédures

Injection quotidienne de D-galactose ou Saline chez les souris pendant 10 semaines. Tests comportementaux à la fin du modèle D-galactose (10 semaines) (5 tests par animal) – quelques minutes par test.

Impact sur les animaux

Le modèle D-galactose peut impacter le bien être de l'animal par l'injection SC journalière durant les 10 semaines. Ce modèle étant un modèle de vieillissement accéléré, il est attendu que les animaux présentent des déficits de mémoire ainsi qu'une augmentation de leur anxiété. Le modèle D-galactose peut entrainer un comportement de maladie, un suivi des animaux est prévu avec la grille de score bien être. Le régime supplémenté en oméga 3 n'impacte en rien le bien-être de l'animal. Les tests comportementaux ne durent que quelques minutes et n’induisent pas d’altération de l’état général des animaux. Le test de peur conditionné peut induire un gêne passagère des animaux durant la phase d'acquisition du comportement.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupérer les structures et/ou exosomes nécessaires pour les études biochimiques et moléculaires.

Remplacement

L’étude des régimes alimentaires nécessite l’utilisation d’animaux vivants. De même, les comportements ne peuvent être étudiés que sur des animaux vivants et vigiles. L’objectif général du projet vise à étudier le rôle des exosomes dans les déficits cognitifs liés à l'âge et la protection de ces déficits par un réfime enrichi en oméga-3. Pour se faire, nous utilisons des tests in vivo, et dans ce contexte, bien que certaines études soient développées sur des modèles cellulaires pour traiter les aspects neurobiologiques, le recours à des modèles animaux pertinents et adaptés aux études in vivo reste donc une nécessité expérimentale afin d’appréhender la réalité physiologique de nos résultats. Une recherche d’alternatives et d’autres méthodes dans des bases de données démontre que les solutions de rechange appropriées à ces procédures ne sont pas disponibles, et qu’aucun dupliqua du travail proposé n’est aujourd’hui identifié.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés pour ces expériences, les animaux qui passeront les tests comportementaux serviront également pour récupérer les cellules ou structures centrales nécessaires pour les études de biologie cellulaire, évitant donc de générer une nouvelle cohorte pour ces analyses biochimiques et moléculaires. Nous avons déjà inscrit ce projet dans un consortium de travail international visant à partager les données afin de limiter les doublons expérimentaux et de conduire à un raffinement des approches de recherche dans la communauté scientifique. Nous avons déterminé le nombre d'animaux nécessaire au projet sur la base de nos résultats antérieurs permettant d'obtenir des résultats comportementaux ou biochimique/biologie cellulaire robustes. Nous nous sommes également basés sur le nombre d'animaux nécessaire à l'obtention d'une quantité de matériel suffisante pour l'étude des vésicules extra cellulaires, fort de nos résultats préliminaires au laboratoire.

Raffinement

Les expérimentateurs formés porteront une attention particulière au raffinement des procédures afin de limiter la douleur, la soulager si elle ne peut être évitée par l’utilisation d’antalgiques les plus adaptés à chaque procédure, optimiser les procédures, soulager le stress des animaux et leur fournir les meilleures conditions de vie tout au long du projet. Pour leur bien-être, les animaux vivent en groupe sociaux le plus longtemps possible. Ils auront à leur disposition des éléments d’enrichissement de leur milieu. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement avec une surveillance renforcée après les différentes expérimentations. Des points limites suffisamment précoces seront définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, des traitements vétérinaires si nécessaire.

Choix des espèces

L’objectif général du projet vise d’identifier des biomarqueurs mécanistiques cérébraux associés au déclin cognitif, de déterminer leur rôle fonctionnel dans le déclin cognitif et de développer des approches nutritionnelles pour restaurer les capacités cognitives du sujet âgé afin de promouvoir le bien vieillir cérébral. Pour ce faire, nous utilisons des modèles souris. Une partie de nos hypothèses ont été formulées sur la base de données obtenues in vivo chez la souris par l'utilisation de régimes imitant les statuts nutritionnels humains. Ce projet s'appuie également sur les données issues d'un article utilisant ce modèle et des régimes enrichis en lipides chez la souris. Dans la cadre de cette étude, le recours à ce modèle murin est donc pertinent et adapté aux objectifs fixés dans l'étude. Le modèle D-galactose est introduit à l'âge adulte. Nous utiliserons donc des animaux contrôles adultes dans ce projet.

540 souris, 270 mâles et 270 femelles, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des tests de sensibilité à la douleur pouvant brûler la peau de la queue, des injections de codéine et jusqu'à seize prélèvements sanguins à la queue. Le porteur cherche à savoir si l'effet analgésique et le métabolisme de la codéine diffèrent entre mâles et femelles, en vue d'adapter les doses chez l'humain. Il affirme que la douleur ne se détecte que par un test comportemental sur animal vivant et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

La codéine est un analgésique utilisé pour traiter les douleurs modérées. Une fois administrée, celle-ci est transformée (métabolisée) en morphine, puis en morphine-3-glucuronide (M3G) qui provoque de la douleur et qui est rapidement éliminée dans l’urine. De la codéine-6-glucuronide, qui est un produit de dégradation de la codéine est également formée et pourrait être anti-douleur. Des différences de sensibilités face à la douleur et aux traitements analgésiques sont décrits chez l’homme et la femme, ainsi que chez les rongeurs. Ainsi, les rongeurs femelles sont plus sensibles à la douleur et les médicaments analgésiques sont moins efficaces. Nous avons récemment montré que le métabolisme de la morphine est différent en fonction du sexe. Ainsi, nous avons observé une diminution des effets analgésiques de la morphine chez la souris femelle et une apparition plus rapide de ses effets secondaires. Cette découverte pose la question de la bonne prise en charge de la douleur chez les femmes par les opiacés, et dans notre cas, la codéine. Le but de cette étude est de déterminer s’il existe une différence d’analgésie et de métabolisation de la codéine entre les souris mâles et femelles. Ces résultats permettraient de développer par la suite des prises en charge de la douleur chez l’être Humain différentes en fonction du sexe, avec des posologies adaptées aux sexes. D’autre part, ce projet vise aussi à caractériser l’activité analgésique de la C6G qui pourrait être, par la suite, utilisée comme nouvel analgésique.

Bénéfices attendus

Il existe des différences entre les effets analgésiques de la morphine entre les hommes et les femmes. Chez la souris, Les femelles nécessitent 30% de morphine en plus comparé aux mâles pour avoir une analgésie identique. Notre équipe a démontré que les souris femelles dégradent la morphine 2 fois plus en M3G qui est proalgique que les mâles. Or, la codéine possède un effet analgésique via sa transformation en morphine et potentiellement en C6G. L’étude proposée vise à définir s’il existe des différences sexe-spécifiques d’analgésie à la codéine et à la C6G chez la souris. Si des différences existent, cela signifierait qu’il existe potentiellement une mauvaise prise en charge de la douleur des femmes douloureuses du fait d’une posologie non adaptée. Si des différences sont observées lors de notre étude, une étude clinique sera mise en place pour vérifier si c’est également le cas chez l’être humain. D’autre part, ce projet vise à caractériser l’activité analgésique de la C6G qui pourrait être par la suite être utilisée comme nouvel analgésique.

Procédures

Un groupe de souris subira un test de sensibilité à la douleur (durée 30sec) pendant 7 jours, puis une injection sur animal vigile (durée 30sec) ou une injection sur animal anesthésié (durée 3 minutes) suivie d’un test de sensibilité à la douleur (durée 30sec) 30 minutes après injection. Un autre groupe subira une injection sur animal vigile (durée 30 sec) et 16 prélèvements sanguins à la queue sous analgésie locale seront réalisés. Un dernier groupe subira une injection sur animal vigile (durée 30sec).

Impact sur les animaux

- Une injection de codéine dans un organe peut provoquer un changement de comportement des animaux (prostration, dos arqué, réticence au déplacement, léthargie, agressivité). - Une injections d’une dose élevée de codéine peut provoquer une constipation. - Une injections peuvent induire une inflammation locale. - Concernant les prises de sang à la queue de l’animal des saignements peuvent se produire après le retour en cage. - Le test de sensibilité à la douleur peut induire une brulure du tissu de la queue des animaux. - La contention du test de sensibilité à la douleur peut induire un stress.

Devenir

Procédure 1 à 4 : Les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements sanguins et tissulaires

Remplacement

Les modèles de culture cellulaire se heurtent à une transposition dans des modèles intégrés. En effet, les notions de nociception (correspondant au mécanisme de perception) et de douleur (correspondant à l’interprétation du message) sont uniquement visibles et détectables chez l’animal par un test de comportement spécifique. C’est pour cette raison qu’une approche in vivo sur des souris est nécessaire.

Réduction

Un minimum de 270 souris mâles et 270 femelles (540 au total) est nécessaire à la réalisation des études statistiques. En effet, nos études antérieures ont montré que des effectifs de 8-12 animaux par groupe étaient suffisants pour obtenir la significativité statistique de l’effet d’un traitement antidouleur. Les effectifs de 10 animaux tiennent également compte de la possibilité de devoir écarter un animal en cours de procédure ou de la possibilité d’un problème technique. Si ces éléments ne sont pas anticipés, une nouvelle cohorte devra être ajoutée, ce qui va à l’encontre de la réduction du nombre d’animaux. Les expériences sont réalisées en plusieurs lots successifs avec un maximum de 40 animaux répartis sur les différentes conditions à tester dans chaque lot. les résultats obtenus seront comparés grâce à des tests statistiques adaptés pour répondre aux objectifs du projet.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes de 5 animaux du même sexe pour respecter leurs besoins d'interactions sociales. Leur cage est enrichie avec des carrés de coton pour favoriser le comportement de nidation. Le changement de litière se fait avec des tunnels pour éviter la prise par la queue et réduire le stress des animaux. Les blessures superficielles sont désinfectées avec une solution de chlorhexidine. Avant toute procédure expérimentale, une phase d'habituation à l'expérimentateur et au contexte du test (i.e. poche de confinement) est réalisée. Dans les tests comportementaux où l’on évalue la sensibilité à un stimulus nociceptif (c’est-à-dire provoquant potentiellement une douleur), un seuil maximal de stimulation est déterminé (point limite afin d'éviter une souffrance à l'animal ou des dommages tissulaires), même en absence de réaction de l'animal. Une veille de la littérature et la participation à des séminaires dans le cadre de la formation continue en expérimentation animale permettent d'intégrer aux procédures tout nouvel élément contribuant au bien-être animal.

Choix des espèces

Dans notre cas, l’utilisation du modèle de la souris permet une comparaison avec les autres études précédemment effectuées. En effet, 70% des études portant sur l’analgésie aux opiacés sont réalisées chez la souris. Par ailleurs, l’utilisation de cette souche est cohérente avec nos derniers travaux sur l’effet de la morphine et de son métabolisme. Le modèle de souris reste la référence dans les études pré-cliniques pour réaliser des expériences. De plus, en plus d'avoir la possibilité de tester la sensibilité nociceptive chez la souris, dans le cadre de notre étude métabolique, la physiologie de cette espèce s'apparente facilement à celle de l'homme (biotransformation majoritaire de la morphine en M3G). Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles âgées de 10 semaines. En effet, les prises de codéine en tant qu’analgésique concernent principalement les populations adultes.