Souris

250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées, elles développent spontanément des cancers lymphoïdes, avec biopsie de la queue pour le génotypage et mise à mort à l'apparition de symptômes ou au plus tard à douze mois, pour étudier les voies de réparation de l'ADN. Le porteur indique une dégradation de l'état général et des difficultés à respirer, et surveille l'apparition de grosseurs ganglionnaires. Il affirme que les études in vitro ont "montré leurs limites" et que la souris est l'"organisme approprié" pour ce projet.

Objectifs

Les cassures doubles brins de l’ADN (DSBs) sont des lésions cellulaires toxiques qui doivent être réparées efficacement pour maintenir la stabilité du génome et prévenir le cancer. Dans les cellules de mammifères, deux voies principales de réparation existent pour détecter et ligaturer les DSBs : la recombinaison homologue (HR) et le « non-homologous end-joining » classique (NHEJ). Une troisième voie, moins bien définie, porte le nom de NHEJ alternatif (aNHEJ) et a été tout d’abord identifiée comme un système de "secours" capable de réparer les DSBs dans des cellules génétiquement déficientes pour un (ou plusieurs) facteur(s) essentiel(s) pour le NHEJ. Les cellules cancéreuses présentent fréquemment des mutations somatiques entraînant une altération des voies canoniques de réparation de l'ADN, ce qui provoque une instabilité génomique et favorise l'apparition et l'évolution des tumeurs. Dans ce projet, nous avons pour objectif d’étudier les mécanismes impliqués dans la promotion du développement tumoral en l’absence de NHEJ. Pour cela nous utiliserons des modèles murins qui développent spontanément de l’instabilité génomique et des cancers lymphoïdes proches de ceux observés chez l’Homme. Ces modèles présenteront différentes combinaisons de mutations au niveau de gènes impliqués dans la signalisation des dommages de l’ADN, (i.e. p53, ATM) et dans la voie NHEJ (i.e. Xrcc4, Shld1). Nos récents travaux in vitro indiquent que la polymérase Theta (Pol Theta), un facteur du aNHEJ, promeut la survie de lignées cellulaires lymphoïdes tumorales en l’absence de Xrcc4 et p53. Des animaux présentant en plus une déficience en Pol Theta seront donc générés afin de tester son rôle dans la tumorigénèse in vivo. L’analyse du développement tumoral et des échantillons leucémiques obtenus dans ces différents animaux nous permettra de mieux comprendre l’origine des leucémies et lymphomes humains et potentiellement de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre l’implication relative des différentes voies et facteurs de réparation de l’ADN dans l’apparition de l’instabilité génomique et la transformation cellulaire au niveau de l’organisme. A plus long terme, il pourrait nous permettre d’élargir le répertoire des stratégies thérapeutiques et d’améliorer le traitement des cancers.

Procédures

Pour l’ensemble des groupes d’animaux, une biopsie de queue sera parfois effectuée sur animaux vigiles pour vérifier le génotype. Ce geste dure quelques secondes et ne sera effectué qu’une seule fois au cours de la vie de l’animal. Pour l’ensemble des groupes d’animaux, la mise à mort sera effectuée soit par dislocation cervicale soit par exposition croissante à du CO2. Le prélèvement des échantillons leucémiques et des organes lymphoïdes sera effectués sur les animaux après la mise à mort.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales peuvent conduire à une dégradation de l'état général et de l’état corporel, et des difficultés à respirer.

Devenir

La procédure consiste à prélever des échantillons leucémiques et des organes lymphoïdes nécessitant la mise à mort de tous les animaux.

Remplacement

Des analyses expérimentales in vitro (protéines purifiées, extraits cellulaires, etc....) et dans des lignées cellulaires humaines, murines ou de hamster (knock-down, surexpression, transfection de mutants, etc....) ont été bénéfiques à la compréhension des mécanismes de réparation de l‘ADN et de la fonction des protéines impliquées. Cependant, ces études ont montré leurs limites pour comprendre in vivo les conséquences de la dérégulation de ces processus sur l’apparition de l’instabilité génomique et la transformation cellulaire. Pour ce faire, nous avons besoin d’une approche génétique dans un système biologique proche de celui du système immunitaire et lymphoïde humain. De ce fait, la souris est l’organisme approprié pour conduire ce projet.

Réduction

Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduction maximale possible en se basant sur des résultats déjà publiés et suivant le test statistique log-rank test.

Raffinement

Les souris seront maintenues dans un environnement protégé pour réduire le risque d’infection. Elles seront hébergées en groupe, avec une litière appropriée et des matériaux de nidification. Les animaux seront surveillés trois fois par semaines et seront mis à mort dès l’apparition de symptômes indiquant une condition générale de l’animal amoindrie telle que la dégradation de l’état corporel, isolement de l’animal, difficulté à respirer, position courbée, signe de stress, apparition visible d’une grosseur susceptible d’être d’origine tumorale (dans le cas de tumeurs lymphoïdes non solides : gros ganglion(s) au niveau du cou, de l’aisselle ou de l’aine, visible même sans palpation).

Choix des espèces

Mus Musculus est un modèle unique pour les travaux de recherche car il peut être génétiquement modifié, ce qui permet une analyse fonctionnelle in et ex vivo d’un gène ou d’un mécanisme donné dans un environnement génétique stable. Ce modèle permet d’étudier les effets combinés de plusieurs gènes. L’étude de chacune des lignées mutantes établies dans ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes de réparation de l’ADN et des anomalies menant à l’instabilité génomique. L’étude des voies et lésions oncogéniques des différents types de cancers lymphoïdes qui apparaitront dans nos modèles murins permettra une meilleure compréhension de l’oncogénèse des cellules lymphoïdes B et T. L’analyse de ces tumeurs et leur comparaison avec les données de séquençage des tumeurs humaines permettra la découverte potentielle de nouveaux gènes et/ou bio-marqueurs des cancers lymphoïdes. Le développement des tumeurs se fait entre 1 mois et 6 mois suivant le génotype des souris. Les tumeurs seront prélevées en respect des points critiques. Si aucune tumeur n’apparaît à 12 mois d’âge, les animaux seront mis à mort et sujets à une analyse phénotypique (autopsie).

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour l'induction d'une plaie cutanée et la greffe de cire contenant ou non des poils humains, puis un hébergement individuel jusqu'à leur mise à mort à deux ou quatre semaines. Le porteur indique une souffrance limitée dans le temps et un stress lié à l'isolement, atténué selon lui par des cages transparentes, et présente l'étude comme préliminaire. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou ex vivo ne permet de suivre la fonctionnalité d'une greffe dans la durée.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer chez la souris les effets de l’implantation de poils humains sur la cicatrisation de plaies cutanées. Il s’agit d’une étude préliminaire qui sera suivie, si les résultats sont concluants, par un projet plus conséquent. Des poils, prélevés par épilation à la cire sur un donneur humain sain, seront implantés dans le lit de plaies cutanées induites chez des souris possédant un système immunitaire fonctionnel ou non fonctionne , permettant ainsi d’évaluer d’une part la présence éventuelle d’une réaction de rejet, et d’autre part de suivre l’évolution du processus de cicatrisation au cours du temps. La comparaison se fera avec des souris qui seront greffées avec de la cire dépourvue de poils humains. Les poils greffés seront laissés en place tout au long de l’expérimentation. Un prélèvement cutané au large de la région greffée sera effectué sur une moitié des souris à un temps de cicatrisation moyen, 2 semaines, l’autre partie sera prélevée après cicatrisation complète de la plaie cutanée, soit environ 4 semaines. Un ensemble d'analyses sera effectué sur les prélèvements cutanés.

Bénéfices attendus

Les follicules pileux sont des mini-organes complexes qui résident dans une couche de la peau. Lorsque la peau est blessée, les cellules du follicule pileux s'activent et commencent à migrer vers le site de la plaie et contribuent au processus dee cicatrisation. Des greffes de poils pourraient ainsi permettre de favoriser la régénération du tissu cutané au niveau d’une plaie cutanée de taille importante tout en favorisant la repousse des poils au niveau de la zone lésée, permettant également d’avoir une cicatrice plus esthétique car beaucoup moins visible, les poils ne repoussant pas ou très peu au niveau d’une plaie cutanée de taille importante. Cela permettrait de réaliser une autogreffe en prélevant sur le patient des poils pour lui implanter directement dans la plaie à traiter, évitant ainsi tout rejet et traitement anti-rejet.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation de la greffe de cire contenant ou non des poils humains, effectuée sous anesthésie générale. Un traitement analgésique des souris sera administré 1 heure avant la chirurgie puis 6 heures, 12 heures et 24 heures après. La chirurgie sera réalisée en 15 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Les greffes seront protégées par une compresse et un pansement de couverture qui seront changés 2 fois par semaine, et des observations et un scoring seront réalisés lors de chaque change effectué. Un suivi quotidien de l’ensemble des souris sera réalisé pendant toute la durée des expérimentations. Le maintien des souris greffées ou non en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le pansement de couverture et la compresse, et surtout le greffon de cire.

Impact sur les animaux

L'induction d'une plaie cutanée avant la réalisation de la greffe de cire contenant ou non des poils peut induire une souffrance mais limitée dans le temps, souffrance qui sera limitée au maximum par la réalisation de la procédure expérimentale sous anesthésie générale et sous couverture analgésique. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées est nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le greffon et également pour éviter que cela interfère avec le processus de cicatrisation. Le processus cicatriciel est en effet long passant par différentes phases et la peau néoformée est une peau très fragile. Cet hébergement en cage individuelle des souris peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes mais cet effet sera limité par l’utilisation de cages transparentes, permettant à chaque souris de voir au moins une de ses congénères et de maintenir ainsi une forme de contact social.

Devenir

Procédure expérimentale 1 = Induction d’une plaie cutanée, greffe de poils humains et suivi de la greffe cutanée et des animaux : les 40 souris greffées nécessaires à la réalisation de ce projet seront mises à mort pour moitié 2 semaines après réalisation de la greffe et pour l’autre moitié 4 semaines après réalisation de celle-ci. Un ensemble d’analyses sera réalisé sur des prélèvements cutanés effectués au large de la région greffée.

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de greffes, processus dépendant de mécanismes complexes. L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de la réalisation de la greffe (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) puis après réalisation de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation, leur poids sera mesuré deux fois par semaine, et si une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids maximal est observée ou si des signes d’infection de la plaie greffée ou des modifications du comportement des animaux sont observés (cachexie, vocalises, convulsions…), ceux-ci seront mis à mort dans des conditions éthiques. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie représentative des plaies chroniques à traiter chez l’Homme, et le temps de cicatrisation est relativement court par rapport à l’utilisation d’autres espèces, permettant d’obtenir des résultats plus rapidement. Son utilisation est par ailleurs largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

Une à trois injections d'anticorps dans l'abdomen ou dans une veine, puis douze heures d'accouplement par trio d'un mâle et deux femelles : 216 souris CD1 vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les injections peuvent provoquer inflammation, hématome ou infection du péritoine, et la voie intraveineuse un saignement ou une opacification de l'œil avec cécité, alors que le porteur évoque une douleur "légère transitoire" pour une injection, "modérée transitoire" pour trois. Ces anticorps, obtenus en immunisant d'autres souris, visent deux peptides de la spermatogenèse que reconnaissent aussi des anticorps de patients atteints de COVID-19, et l'équipe compte les portées et les nouveau-nés pour mesurer leur effet sur la fertilité. Les souris traitées sont tuées pour analyses, et 118 souris, non traitées ou nées des accouplements, sont déclarées réutilisées.

Objectifs

Les agents infectieux jouent un rôle majeur dans la physiopathologie des maladies auto-immunes et ce par divers mécanismes dont le plus important est le mimétisme moléculaire consistant à déclencher une réactivité auto-immune lorsque l’agent pathogène et l’antigène tissulaire humain sont structurellement similaires(1). L'épidémie de COVID-19 a incité les immunologistes, à étudier l'impact de l'infection par le SARS-CoV-2 sur la population humaine mondiale. La préoccupation est de savoir si l'infection peut déclencher une auto-immunité par le biais d'une réactivité croisée. Les anticorps formés contre le SARS-CoV-2 se lieraient aux protéines des tissus humains partageant des séquences communes avec la protéine SPIKE, entraînant une réactivité auto-immune. Pour exemple, plusieurs études ont indiqué que les patients atteints de COVID-19 produisent des auto-anticorps et qu'une partie d'entre eux développent des troubles auto-immuns pouvant par exemple conduire à une altération de la spermatogenèse et notamment de l'étape de spermiogénèse nécessaire à la maturation des spermatozoïdes . Une première analyse in-silico a permis d'identifier 4 peptides liés à la spermatogénèse qui partageaient au moins 5 acides aminés communs avec la protéine Spike du SARS-CoV-2. Nous avons découvert que les patients infectés par la COVID-19 développaient des anticorps contre 2 peptides (peptide A et B dans l'étude) impliqués dans la spermiogénèse. Une analyse biochimique a prouvé que les anticorps anti-Spike S du virus Sars-COV2 peuvent reconnaitre les deux peptides A et B liés à la spermatogenèse chez les hommes mais également chez les femmes affectés par la COVID-19. Ce résultat indique l'apparition possible de nouveaux troubles de la fertilité et féconditité dans la population. Pour aller plus loin dans cette étude, nous avons produit des anticorps murins de sous-classe IgG réagissant avec les peptides A et B en immunisant des souris saines contre ces peptides. Le but de ce projet est d’évaluer la pathogénicité de ces anticorps en les administrant à des souris mâles et femelles saines et en déterminant leur effet sur la fertilité (nombre de portées) et la féconditité (nombre de nouveaux-nés)..

Bénéfices attendus

Les résultats de ce projet auront un impact à la fois sur la communauté scientifique et sur l'ensemble de la population. Cette étude permet de mieux comprendre les effets de l'infection par le SARS-Cov-2 sur les humains, en particulier la pathogénicité d'auto-anticorps sur le système reproducteur.

Procédures

Les souris mâles et femelles recevront 1 à 3 injections maximum d’une durée de 2 minutes chacune sur animal vigile ou anesthésié. L'accouplement est composé d'un trio : 1 mâle et 2 femelles. Temp d'accouplement 12 heures.

Impact sur les animaux

L'administration dans la cavité abdominale peut induire une inflammation, une induration, un hématome ou une infection de la cavité péritonéale et l'administration Intra-veineuse peut induire un un saignement, une inflammation, une infection ou une opacification avec cécitéselon que l'animal recevra une injection ou au maximum 3. Ces injections pourront induire une douleur légère transitoire si réalisée une seule fois sur l'animal voire modérée transitoire si au maximum selon les résultats de l'étude pilote 3 injections devaient être réalisées.

Devenir

Tous les souris traitées seront mise à mort pour analyses ultérieures. Les souris non traitées et les souricaux seront réutilisés.

Remplacement

Le projet actuel représente la partie finale d'une étude plus étendue préalables visant l'identification des peptides partageant des identités de séquence avec la protéine Spike (S) du SARS-CoV-2 et les protéines liées à la spermatogenèse. Ensuite, elle a été suivie des studios dans les sérums des patients atteints de COVID-19 . Actuellement, le seul modèle disponible pour prouver le rôle des anticorps anti-peptides sur le système reproducteur est un organisme complexe comme le modèle murin. Aujourd'hui, notre objectif ne peut pas être atteint en utilisant des modèles cellulaires artificiels. Le modèle murin représente la meilleure stratégie pour générer des données qui peuvent avoir un impact translationnel futur pour l'homme.

Réduction

Le nombre d'animaux dans le projet est évalué selon les calculs de puissance visant à réduire l'utilisation d'animaux à un nombre minimum mais suffisant pour obtenir des résultats biologiquement valides et significatifs pour les objectifs de cette étude.

Raffinement

Nous avons établi des points-limites qui permettent de soustraire l'animal à la souffrance sur la bse d'une grille de score permettant d'évaluer l'état de santé des animaux ainsiq ue la douleur. L'injection intra-veineuse est réalisée sous anesthésie. Afin de réduire la douleur, une goutte d'anti-douleur sera ajoutée après l'injection. Les souris sont logées en groupe social et chaque cage sera équipée de matériaux de nidification pour que les mères puissent construire le nid et d'un bâton à ronger.

Choix des espèces

Les souris ont un génome très proche de celui de l'homme et elles développent des pathologies similaires à celles observées chez l'homme. De plus, le modèle murin a un taux de reproduction élevé permettant d'obtenir rapidement des résultats. Les souris CD1 sont utilisées à l'âge de 6-8 semaines après avoir atteint leur maturité sexuelle.

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie sous anesthésie générale pour implanter des électrodes ou des fibres optiques dans le cerveau et injecter des virus, puis des tests comportementaux sur animaux vigiles, pour étudier l'influence des hormones de stress sur les circuits sociaux et un modèle du syndrome de Prader-Willi. Le porteur indique des douleurs modérées après les injections et la chirurgie, et un stress appliqué aux souris vigiles lors des tests. Il affirme que l'étude du comportement social suppose l'interaction entre êtres vivants, ce qui rendrait "impossible" le recours à un modèle in vitro.

Objectifs

Le stress est un facteur de risque de plusieurs maladies mentales affectant des millions de gens et imposant un coût socioéconomique important. Comprendre pourquoi certaines personnes sont plus de susceptibles que d'autres aux maladies mentales liées au stress est un défi prioritaire de la communauté Européenne et des associations de malades. Notre hypothèse est que le stress créerait un déséquilibre de perception entre des signaux d'alerte et de sûreté échangés entre partenaires sociaux. L'impact du stress serait d'autant plus important qu'il se rapprocherait de la période sensible du développement du cerveau. La persistence de ce déséquilibre chez l'enfant pourrait entrainer des troubles anxio-dépressifs chez l’adulte. De nombreuses études cliniques sont actuellement menées chez l’Homme dans lesquelles les hormones (ocytocine et vasopressine sont utilisées dans l’espoir de corriger les troubles d'anxiété et de comportements sociaux. Cependant, le mode d’action de ces deux hormones dans le cerveau reste méconnu. Un déficit de sécrétion de ces hormones pourrait avoir des conséquences directes sur le comportement social. C’est le cas par exemple de la maladie rare génétique du syndrome de Prader Willi (PWS) et du syndrome de Schaaf Yang (SY). Les trois quart des malades présentent des troubles du spectre autistique d’ordre cognitif et de sociabilité qui se manifestent chez l’adulte. De plus, l'administration d'un traitement chez les patients atteints de PWS montre un réel bénéfice à l'age adulte tant sur le comportement social que sur les autres troubles associés à la maladie comme par exemple l'hyperphagie. Le projet vise donc à suivre l’influence des hormones de stress sur le développement des cellules impliqués dans la perception des signaux d'alerte et de sûreté échangés avec des partenaires sociaux. Un autre des objectifs de ce projet est de mieux comprendre comment les neurones se mettent en place dans un modèle de PWS et leur impact sur le comportement social et le dernier objectif est de tester un traitement pour les personnes étant malades.

Bénéfices attendus

Cette étude représenterait un progrès significatif afin de comprendre comment le stress ou une maladie génétique influence la mise en place des circuits neuronaux ainsi que le comportement social. Dans un second temps, cela nous permettra de mieux caractériser le fonctionnement du traitement de PWS par l'ocytocine.

Procédures

Les animaux seront soumis à des procédures chirurgicales sous anesthésie générale. Cela concerne l'implantation des électrodes électroencéphalographiques ou des fibres optiques ainsi que l'injection de virus pour exprimer des transgènes traceurs ou bien modificateurs. Une facon de réduire les nuisances prévues consiste à poser les implants pendant la même procédure que l'injection de virus. Cette méthode est efficace en terme de résultats et permet de réduire le nombre d'intervention. Chaque procédure ne durera pas plus de 40 minutes et elles seront faites par un experimentateur formé avec soin pour respecter les normes européennes d'expérimentation animale.

Impact sur les animaux

Des douleurs modérées peuvent être constatés chez les souris suite à des piqures d'injection. Sont également à prévoir des douleurs modérés après la chirurgie sous anesthésie générale (des anesthésiques locaux sont administrés systématiquement après la chirurgie afin de diminuer les effets indésirables) et du stress sur animaux vigiles sera appliqué pour les test comportementaux.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés en respectant les bonnes pratiques et conformes à la protection des animaux pour vérifier l'inclusions ou non des individus avec les recombinaisons génétiques attendus.

Remplacement

La souris et l’homme partagent environ 98% de leurs 30 000 gènes, cela en fait donc un bon modèle pour étudier certaines maladies génétiques, d'autant que nous savons maintenant comment facilement manipuler leur génome. De plus, l'architecture cérébrale de la souris et de l'homme présente de nombreuses similitudes permettant de mieux comprendre les comportements humains grâce à la caractérisation du comportement de ce rongeur. Ces études du comportement social nécessite l'interaction entre des être-vivants rendant impossible l'utilisation de modèle in-vitro.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit grâce à une approche longitudinale de sorte que chaque individu est son propre controle. Le nombre d’animaux par groupe et par condition est determiné à minima afin d'obtenir des données statistiquement significative.

Raffinement

Les animaux ne sont pas isolés et ont un environnement enrichi. Des points limites ont été clairement établis ainsi que les mesures appropriés afin de prendre en charge la douleur. Les animaux sont manipulés par l'expérimentateur tous les jours de manière douce afin d'eviter le stress avant les procédures experimentales. Les animaux sacrifiés à la fin de l'experimentation seront utilisés afin de corréler les données obtenues lors des test de comportement social aux études de biologie moléculaire permettant ainsi une exploitation optimale des souris.

Choix des espèces

La souris est un animal facile à élever et à manipuler, pour lequel les caractéristiques pharmacologiques des récepteurs de l’ocytocine et de la vasopressine sont bien connues, dont les rythmes électro-encéphalographiques sont bien décrits et rapportés à des comportements caractérisés. Les animaux seront utilisés de la naissance jusqu'à l'âge adulte afin de réaliser des études longitudinales de comportement.

15 000 rongeurs, soit 7 000 souris, 7 000 rats, 800 hamsters dorés et 200 gerbilles, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des composés chimiques ou radiomarqués par de multiples voies, dont des chirurgies de pose de mini-pompe sous anesthésie, certains étant rendus diabétiques, obèses ou hypertendus, avant mise à mort pour prélever organes et sang. Le porteur décrit une plateforme d'évaluation pharmacologique en série plutôt qu'un projet ciblé, avec un bénéfice réduit à la mesure d'effets sur des biomarqueurs. Il indique que les tests in vitro sont "souvent insuffisants" et retient la souris comme l'espèce la plus décrite.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer les effets pharmacologiques et la distribution in vivo de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 à 12 jours maximum. Le mécanisme d’action de la molécule évaluée, déterminé préalablement in vitro, conditionnera le choix de l’espèce rongeur (souris, rat, hamster, gerbille) et de la souche à utiliser pour suivre les marqueurs d’efficacité appropriés qu’ils soient circulants, urinaires, fécaux, ou tissulaires. Dans toute étude utilisant des animaux, il est possible de mesurer différents paramètres en utilisant diverses méthodes d’analyse (dosage de protéines ou lipides ou acides animés, expression génique, analyse histologique…). Toutefois, ces techniques d’analyse dites « froides », c’est-à-dire sans utilisation de radioélément, ne sont pas toujours suffisamment sensibles pour quantifier les effets pharmacologiques des composés testés, notamment lorsqu’il s’agit d’études courtes. Les deux premières procédures de ce projet permettent de révéler l’efficacité des composés testés in vivo, soit par administration d’une molécule froide qui activera une voie biologique précise dans l’organisme, soit par administration d’un traceur radioactif qui sera incorporé dans une voie de synthèse particulière. Ces deux méthodes permettront de sensibiliser l’organisme au mécanisme d’action ciblé par le composé testé, et de mieux appréhender la réponse pharmacologique de ce composé in vivo. La troisième procédure de ce projet couvre l’utilisation d’un composé chimique ou biologique test qui a été préalablement radiomarqué afin de suivre son devenir lors d’une administration in vivo et de vérifier qu’il va bien atteindre les organes cibles pour délivrer son efficacité pharmacologique. Ces études pourront nécessiter l’utilisation d’animaux présentant une pathologie dommageable telle que le diabète, l’obésité, l’hypertension, la néphropathie. Un programme de soins spécifiques sera mis en place avec une surveillance rapprochée de ces animaux afin de leur éviter toute souffrance.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’évaluer les effets pharmacologiques sur certains biomarqueurs d’intérêt de composés biologiques ou chimiques après une ou plusieurs administrations chez le rongeur, sur une période allant de 1 à 12 jours maximum.

Procédures

Afin d’évaluer la pharmacocinétique et l’effet sur des paramètres biologiques de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques froids ou radiomarqués seront administrés aux animaux par voie : intranasale ou intratrachéale, sous anesthésie générale de maximum une heure, ou intramusculaire ou intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, ou orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), ou sous cutanée ou intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Pour évaluer l’efficacité des composés sur certains paramètres biologiques, il pourra être nécessaire d’administrer de petites molécules radiomarquées (glucose etc) par voie : intranasale ou intratrachéale, sous anesthésie générale de maximum une heure, ou intramusculaire ou intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, ou orale sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), ou sous cutanée ou intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon), ou par minipompe osmotique (intraveineuse, sous cutanée ou intrapéritonéale) posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie (chirurgie d’environ 15 minutes, anesthésie d’environ une heure). Si l’alimentation peut biaiser la pharmacocinétique, les animaux pourront être mis à jeun au maximum 16h. Les volumes administrés et fréquences d’administration respecteront les recommandations. La phase in vivo pourra durer jusqu’à 12 jours. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés afin de suivre la biodistribution et l’élimination des produits administrés. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera au maximum une heure. Pour les prélèvements individuels d’urine ou de fèces, il pourra être nécessaire d’héberger individuellement maximum une heure. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus, organes, et sang. Avant euthanasie, sous anesthésie générale profonde avec analgésie forte, une perfusion pourra être réalisée pour rincer les organes. Cela durera moins d’une heure avant euthanasie.

Impact sur les animaux

Afin de réaliser certains tests (par exemple les tests métaboliques), il pourra être nécessaire de mettre les animaux à jeun, au maximum 16 heures. Des pertes de poids liées aux composés administrés pourraient être observées.

Devenir

Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération des organes et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’effet des composés testés.

Remplacement

Les molécules chimiques ou biologiques dont l’efficacité sera évaluée dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le petit animal sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme. Dans le cas de molécules dont la biodistribution serait évaluée, dans la mesure du possible, l’absence de toxicité et les paramètres mesurables in vivo d’ADME auront au préalable été évalués.

Réduction

Le nombre d’animaux par lot pour les études sera défini en fonction de la bibliographie existante sur le modèle animal et les paramètres d’intérêt à mesurer dans l’étude. Une revue bio-statistique a déjà été réalisée sur des données historiques de mesure de quelques paramètres lors d’études internes. Cette analyse nous permet de déterminer le nombre minimal d’animaux requis afin d’obtenir des résultats significatifs malgré les variations interindividuelles. Par exemple, lors d’une étude sur la tolérance orale au glucose (OGTT), il est nécessaire d’avoir 10 animaux par groupe pour obtenir une différence significative de 30% entre 2 groupes sur les AUC de glucose sanguin. Pour les dosages d’acides gras plasmatiques, un nombre minimal de 8 animaux par groupe est requis. Les analyses statistiques à réaliser sur les autres paramètres mesurés en cours d’étude seront effectuées au moyen du test ANOVA.

Raffinement

Les animaux seront pesés au minimum 2x/semaine / quotidiennement à partir de 10% de perte de poids. La cause de la perte de poids sera évaluée: déshydratation, accès à la nourriture, diarrhée, nausées... Si possible, un traitement pharmacologique symptomatique sera mis en place. Un gel nutritif et de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de la cage en cas de perte de poids constatée. En cas de suspicion de toxicité du composé chimique ou biologique administré, un arbre décisionnel validé par le vétérinaire et la SBEA sera utilisé. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Les animaux présentant des signes de douleur ou de souffrance seront mis en suivi clinique. Ces animaux seront examinés tous les jours et recevront si nécessaire un traitement pharmacologique compatible ou non avec l’objectif de l’étude. Un vétérinaire est joignable tous les jours si besoin. Toute opération chirurgicale sera réalisée sous anesthésie générale en matinée afin d’assurer un meilleur suivi post-chirurgical (observation toutes les 2 heures durant les 6 heures post opératoires puis au moins 1 fois par jour), avec analgésie. En cours d’étude, plusieurs anesthésies seront pratiquées notamment en cas de prélèvements de sang ou d’injections de produits : Les administrations IV, IM, IP, SC, ID ou topiques cutanées ou oculaires de composés tests se feront si nécessaire sous anesthésie générale. Une administration de buprénorphine sera réalisée avant les administrations IM/ID. Afin de minimiser les risques d’infection lors d’injections intradermiques, une tonte de la peau avec désinfection sera réalisée avant injection. Les injections intradermiques se feront sous un volume de 50 µL par site d’injection afin de limiter la douleur. Les administrations IN ou IT de composés tests se feront sous anesthésie générale. L’implantation d’une mini pompe (IP, IV ou SC) ou la pose d’implants diffusant le produit en sous-cutané pourra être nécessaire lors d’une délivrance continue du composé test. La chirurgie d’implantation sera réalisée sous anesthésie générale et dans des conditions d’asepsie, avec une prise en charge analgésique. Le suivi de la cicatrisation sera enregistré, et les sutures désinfectées si nécessaire.

Choix des espèces

Si le profil pharmacocinétique est adéquat dans cette espèce, la souris sera privilégiée pour évaluer des nouveaux composés in vivo, car c’est l’espèce mammifère la plus décrite dans les modèles d’évaluation de molécules chimiques ou biologiques. La souris sera aussi préférée dans le cas d’une administration d’un composé ou d’un traceur radioactif, si le mécanisme d’action de la molécule le permet, pour des raisons pratiques de gestion de la radioactivité et de ses déchets. Pour certaines études pré-réglementaires comme l’étude de l’élimination d’un composé radiomarqué in vivo, le rat sera l’espèce préférée. Des hamsters et des gerbilles pourront être occasionnellement utilisés si besoin, en cas d’études préalables à la mise en place d’un modèle particulier bien décrit dans ces espèces (exemple : hamster pour une étude préalable à une étude d’infection au SARS-CoV2). Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), tel que référencé dans la littérature.