Souris

78 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Comme dans le volet complémentaire du même projet, des composants de bioprothèse cardiaque sont implantés sous la peau de leur dos sous anesthésie, avec deux séances d'imagerie TEP, avant euthanasie à J29 pour prélever le sang et les tissus. Le porteur teste un revêtement censé réduire l'inflammation déclenchée par les valves biologiques, un bénéfice pour les patients qu'il formule au conditionnel. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe aucune méthode fiable sans animaux et que la souris reproduit fidèlement la réaction humaine aux biomatériaux.

Objectifs

Les valves cardiaques artificielles sont utilisées pour remplacer des valves malades chez l'Homme. Certaines valves dites biologiques sont composées de tissus biologiques d’origine animale (porc ou bovin). Elles présentent de nombreux avantages par rapport à des prothèses complétement synthétiques (valves dites mécaniques), notamment en termes de fonction et risque de formation de caillots (thrombose). En revanche, la composition des valves biologiques reste « étrangère » au système immunitaire du receveur les rendent susceptibles d’être rejetées par le tissu receveur. En effet, malgré toutes les mesures mises en place pour rendre le tissu biologiquement inactif, les cellules qui assurent la défense de notre organisme reconnaissent inéluctablement la différence d’origine du tissu implanté et déclenchent une réaction inflammatoire qui réduit sensiblement la durée de vie des bioprothèses par rapports aux solutions mécaniques. Ainsi, bien que plus performantes, les bioprothèses sont rarement implantées chez les sujets jeunes en raison de ce risque de vieillissement prématuré. L’objectif de cette étude est de tester le potentiel d'un traitement de surface sur les valves biologiques capable de diminuer cette réaction inflammatoire.

Bénéfices attendus

Les effets attendus sont une diminution de l'inflammation des tissus environnants lorsque les bioprothèses sont recouvertes avec le traitement de surface à l'étude avant implantation par rapport aux bioprothèses standard non traitées. L'évaluation pré-clinique du bénéfice apporté par le revetement proposé peut considérablèment accélérer le transfert de l'innovation chez l'homme (application aux bioprothèses cardiovasculaires qui sont utilisées en pratique clinique).

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure d'implantation des composants des bioprothèses (traitées avec le traitement de surface ou non) sous la peau du dos sous anesthésie générale et à deux séances d'imagerie dans les suites (TEPscanner, 7 jours et 28 jours après implantation, toujours sous anesthésie générale) pour visualiser et mesurer la réaction inflammatoire au niveau de la zone d'implantation. Ces procédures d'imagerie comportent une injection d'un traceur par voie intraveineuse. Les procédures de chirurgie dureront 20 minutes et les séances d'imagerie 40 minutes.

Impact sur les animaux

Concernant l'intervention chirurgicale, les effets indésirables potentiels après l'intervention comportent des douleurs au site d'implantation sur la peau du haut du dos, des démangeaisons et des troubles de la cicatrisation. Concernant les scanners, ces examens sont peu invasifs et ne comportent pas d'effets indésirables attendus.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés le lendemain de la dernière imagerie (soit J29) afin de prélever du sang et d'étudier les biomarqueurs de l'inflammation. Les composants des bioprothèses implantés 29 jours plus tot seront également prélevés pour etre analysés en microscopie.

Remplacement

Dans ce projet, il n'existe pas de moyens alternatifs à l'expérimentation animale. En effet, à ce jour il n'existe pas de méthode fiable permettant d'estimer de facon fiable l'efficacité du traitement de surface à l'étude. Toutefois, des manipulations préliminaires sur des cellules endothéliales aortiques humaines (expériences "in vitro") ont permis d'affiner le protocole du traitement de surface et d'utiliser le nombre minimal d'animaux.

Réduction

Afin de diminuer au maximum le nombre d'animaux, un calcul statistique a été réalisé en amont. De la meme facon, une mutualisation des résultats expérimentaux au sein de l’unité de recherche pourrait permettre l'exploitation des résultats par d'autres chercheurs et de limiter l'utilisation ultérieure d'animaux.

Raffinement

Le confort, la douleur et le stress des animaux seront scrupuleusement recherchés à l'aide de grille de surveillance journalière. Un recours à l’anesthésie générale sera systématique pour toutes les procédures et des soins spécifiques pourront etre conduits en fonction de l'examen (désinfectant, anti-douleurs). L'administration d'anti-douleurs sera réalisée en cas d'inconfort ou de douleurs et une euthanasie sera pratiquée dans les plus brefs délais en cas de non-amélioration. La surveillance de points limites (devant faire stopper l'expérimentation) sera systématique et faite quotidiennement. Les conditions d’hébergement seront également optimisées au maximum avec respect du rythme veille/sommeil. Afin de minimiser le stress post-chirurgie, des éléments d’enrichissement des cages comme des bâtons à ronger et du coton, ainsi que de la nourriture en gélée, seront placés. Enfin, nous priviliégerons des procédures d’imagerie non invasive (TEPscanner) pour visualiser l'inflammation des tissus.

Choix des espèces

Le modèle animal (souris) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet. Des souris adultes C57Bl6/J de 6 à 9 semaines d'âge seront utilisées. Bien qu'il n'existe pas d'impact de genre attendu, des sujets femelles seront utilisés pour une meilleure cohabitation. La reaction aux biomatériaux chez cette espèce reproduit de façon très fidèle les réponses observées chez l'homme (mammifère). Les tests précliniques sont communemment effectués dans cette espèce et sont abondamment documentés dans la littérature scientifique.

78 souris femelles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des composants de bioprothèse cardiaque sont implantés sous la peau de leur dos sous anesthésie, suivis de deux séances d'imagerie TEP avec injection d'un traceur, avant euthanasie à J29 pour prélever le sang et les tissus. Le porteur teste un traitement de surface censé réduire l'inflammation, un bénéfice pour les patients humains qu'il renvoie au conditionnel et à un transfert futur. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de moyens alternatifs et que la réaction aux biomatériaux chez la souris reproduit celle de l'homme.

Objectifs

Les valves cardiaques artificielles sont utilisées pour remplacer des valves malades chez l'Homme. Certaines valves dites biologiques sont composées de tissus biologiques d’origine animale (porc ou bovin). Elles présentent de nombreux avantages par rapport à des prothèses complétement synthétiques (valves dites mécaniques), notamment en termes de fonction et risque de formation de caillots (thrombose). En revanche, la composition des valves biologiques reste « étrangère » au système immunitaire du receveur les rendent susceptibles d’être rejetées par le tissu receveur. En effet, malgré toutes les mesures mises en place pour rendre le tissu biologiquement inactif, les cellules qui assurent la défense de notre organisme reconnaissent inéluctablement la différence d’origine du tissu implanté et déclenchent une réaction inflammatoire qui réduit sensiblement la durée de vie des bioprothèses par rapports aux solutions mécaniques. Ainsi, bien que plus performantes, les bioprothèses sont rarement implantées chez les sujets jeunes en raison de ce risque de vieillissement prématuré. L’objectif de cette étude est de tester le potentiel d'un traitement de surface sur les valves biologiques capable de diminuer cette réaction inflammatoire.

Bénéfices attendus

Les effets attendus sont une diminution de l'inflammation des tissus environnants lorsque les bioprothèses sont recouvertes avec le traitement de surface à l'étude avant implantation par rapport aux bioprothèses standard non traitées. L'évaluation pré-clinique du bénéfice apporté par le revetement proposé peut considérablèment accélérer le transfert de l'innovation chez l'homme (application aux bioprothèses cardiovasculaires qui sont utilisées en pratique clinique).

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule procédure d'implantation des composants des bioprothèses (traitées avec le traitement de surface ou non) sous la peau du dos sous anesthésie générale et à deux séances d'imagerie dans les suites (TEPscanner, 7 jours et 28 jours après implantation, toujours sous anesthésie générale) pour visualiser et mesurer la réaction inflammatoire au niveau de la zone d'implantation. Ces procédures d'imagerie comportent une injection d'un traceur par voie intraveineuse. Les procédures de chirurgie dureront 20 minutes et les séances d'imagerie 40 minutes.

Impact sur les animaux

Concernant l'intervention chirurgicale, les effets indésirables potentiels après l'intervention comportent des douleurs au site d'implantation sur la peau du haut du dos, des démangeaisons et des troubles de la cicatrisation. Concernant les scanners, ces examens sont peu invasifs et ne comportent pas d'effets indésirables attendus.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés le lendemain de la dernière imagerie (soit J29) afin de prélever du sang et d'étudier les biomarqueurs de l'inflammation. Les composants des bioprothèses implantés 29 jours plus tot seront également prélevés pour etre analysés en microscopie.

Remplacement

Dans ce projet, il n'existe pas de moyens alternatifs à l'expérimentation animale. En effet, à ce jour il n'existe pas de méthode fiable permettant d'estimer de facon fiable l'efficacité du traitement de surface à l'étude. Toutefois, des manipulations préliminaires sur des cellules endothéliales aortiques humaines (expériences "in vitro") ont permis d'affiner le protocole du traitement de surface et d'utiliser le nombre minimal d'animaux.

Réduction

Afin de diminuer au maximum le nombre d'animaux, un calcul statistique a été réalisé en amont. De la meme facon, une mutualisation des résultats expérimentaux au sein de l’unité de recherche pourrait permettre l'exploitation des résultats par d'autres chercheurs et de limiter l'utilisation ultérieure d'animaux.

Raffinement

Le confort, la douleur et le stress des animaux seront scrupuleusement recherchés à l'aide de grille de surveillance journalière. Un recours à l’anesthésie générale sera systématique pour toutes les procédures et des soins spécifiques pourront etre conduits en fonction de l'examen (désinfectant, anti-douleurs). L'administration d'anti-douleurs sera réalisée en cas d'inconfort ou de douleurs et une euthanasie sera pratiquée dans les plus brefs délais en cas de non-amélioration. La surveillance de points limites (devant faire stopper l'expérimentation) sera systématique et faite quotidiennement. Les conditions d’hébergement seront également optimisées au maximum avec respect du rythme veille/sommeil. Afin de minimiser le stress post-chirurgie, des éléments d’enrichissement des cages comme des bâtons à ronger et du coton, ainsi que de la nourriture en gélée, seront placés. Enfin, nous priviliégerons des procédures d’imagerie non invasive (TEPscanner) pour visualiser l'inflammation des tissus.

Choix des espèces

Le modèle animal (souris) a été soigneusement choisi d’après les publications internationales les plus pertinentes sur le sujet. Des souris adultes C57Bl6/J de 6 à 9 semaines d'âge seront utilisées. Bien qu'il n'existe pas d'impact de genre attendu, des sujets femelles seront utilisés pour une meilleure cohabitation. La reaction aux biomatériaux chez cette espèce reproduit de façon très fidèle les réponses observées chez l'homme (mammifère). Les tests précliniques sont communemment effectués dans cette espèce et sont abondamment documentés dans la littérature scientifique.

2 100 souris et 2 100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur est implantée dans leur cerveau, un geste que le porteur décrit comme sévèrement douloureux, avec irradiation, traitements répétés et exsanguination terminale. L'établissement réalise une douzaine d'études par an selon les commandes de clients. Il affirme que les méthodes alternatives ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo, les retombées cliniques étant renvoyées aux essais ultérieurs.

Objectifs

Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est d’utiliser des modèles de tumeur intracrâniennes (tumeur implantée dans le cerveau des animaux, = tumeur stéréotaxique), déjà mis en place dans nos laboratoires ou bien d’en développer de nouveaux (dans nos laboratoires) chez les rongeurs (rats ou souris) afin de refléter la pathologie cancéreuse humaine et de pouvoir évaluer des nouveaux médicaments pour traiter le cancer. L’évaluation des traitements potentiels chez l’animal permettra d’étudier ces nouveaux médicaments, seuls ou en combinaison, dans un contexte physiologique le plus proche possible de la pathologie humaine et d’arriver, avant les essais cliniques, à réaliser une réelle évaluation de l’efficacité des molécules destinées à traiter les cancers chez l’homme. Grace à ces modèles précliniques de cancer, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour finalité de sélectionner des molécules thérapeutiques ou diagnostiques grâce à des modèles précliniques les plus prédictifs possibles afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais cliniques. Pour cela, les expériences chez l’animal, représentant un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettent la première évaluation de l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés. Au cours des expériences, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur ou mimer l’apparition de sites métastatiques dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance/échappement après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme des moyens de défense.

Procédures

- Identification des animaux (implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage), sous anesthésie - Transport vers le site ou est réalisé l’irradiation (durée totale moins de 30 minutes, les animaux restant dans leur cage de stabulation). - Irradiation - Greffe des cellules tumorale dans le cerveau, sous anesthésie et antalgie. - Traitements par voies intraveineuse, intrapéritonéale ou sous-cutanée sous anesthésie, mais pouvant être réalisés sur animaux vigiles - Traitements par voies intradermique ou intramusculaire, sous anesthésie et analgésie - Traitements par voie orale, sur animaux vigiles sous contention. - Suivi des animaux (poids) - Suivi des animaux par imagerie (sous anesthésie) - Prélèvements de sang, sur animaux anesthésiés, par ponction dans : la veine jugulaire. - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine saphène (possibilité de déposer de la poudre hémostatique pour limiter le saignement s’il se produit après le prélèvement). - Prélèvements de sang, sur animaux vigiles sous contention, par piqure dans la veine caudale (animal placé dans 1 boite thermorégulée à +37°C). - Prélèvement d’un grand volume de sang lors de l’euthanasie (« exsanguination terminale ») par ponction intracardiaque ou via l’aorte abdominale, sous anesthésie profonde, suivi d’une confirmation de la mort par une deuxième méthode physique - Mise à mort en fin de procédure (overdose d’anesthésique confirmée par une deuxième méthode physique, CO2 suivi d’une deuxième méthode physique - Prélèvements de tissus après euthanasie (post-mortem)

Impact sur les animaux

Une douleur sévère sera induite par la procédure de greffe, l’analgésie mise en place permettra de l’atténuer très significativement. Un stress sera ressenti par les animaux, pendant 1 ou 2 jours, lors de la randomisation et/ou le début des traitements. De même un stress léger sera ressenti lors de la réalisation des gestes techniques pour identification des animaux (tatouage par exemple), lors d’un transport de courte durée, ainsi que pour les traitements (par voie intraveineuse, orale, sous-cutanée ou intrapéritonéale) et le suivi des animaux (mesures des poids et par imagerie). Une douleur légère sera également ressentie lors de la piqure pour traitement par voies intraveineuse et intrapéritonéale. Un stress et une douleur légère liée à la piqure seront ressentis par les animaux lors des prélèvements de sang (en cours d’étude). Une douleur forte sera ressentie dans le cas d’injections intramusculaires et intradermiques, celle-ci sera fortement atténuée par une analgésie adaptée. Les animaux pourront perdre du poids à la suite des traitements avec de nouveaux composés. Une douleur forte sera ressentie par l’animal lors de prélèvements de sang à l’euthanasie par ponction intracardiaque, elle sera fortement réduite par une analgésie adaptée.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteur de tumeur dans le cerveau et ayant fait l’objets de gestes techniques, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.

Remplacement

Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments En effet, les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D peuvent être utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposables à l’homme.

Réduction

Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes sera ajusté à la question scientifique posée et aux paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la survie des animaux entre les différents groupes de l’étude seront comparées pour évaluer l’efficacité des composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter individuelles. L’analyse statistique sera effectuée au moyen d’un test d'analyse de la variance (ANOVA). Près de 12 études seront réalisées chaque année, mais le nombre pourra varier en fonction des commandes des clients. Une étude peut être composée de 3 à 10 groupes [un groupe contrôle (= véhicule), un groupe recevant un médicament de référence, 1 à 8 groupes recevant des nouvelles molécules]. Le nombre d’animaux par groupe varie généralement entre 7 et 20. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser, si possible, des biomarqueurs (cytokine plasmatique par exemple) et des techniques faiblement invasives d’imagerie (IRM par exemple) chez le petit animal. Ces techniques permettent de suivre les biomarqueurs sur le même animal tout au long de l’étude, ceci réduisant la taille de la cohorte nécessaire pour la réalisation de l’expérience. Ces techniques peuvent également constituer un moyen d’atteindre les objectifs de l’étude avant l’apparition des signes cliniques, et donc limiter la souffrance des animaux.

Raffinement

Toutes les procédures sur les animaux seront réalisées par des techniciens formés et qualifiés, selon des modes opératoires validés. La greffe des tumeurs sera réalisée sous anesthésie et analgésie pour atténuer fortement la douleur que ce geste technique engendre. Les animaux bénéficieront également de soins adaptés après la greffe. Les animaux ressentiront un stress léger lorsque ceux-ci seront attribués aux groupes de traitement, stress toutefois limité par l’enrichissement de leur environnement. Un stress léger sera également perçu lors des manipulations pour suivre le poids des animaux ou bien lors des séances d’imagerie (pour suivi de l’évolution de la tumeur). La fréquence des mesures de poids sera adaptée, elle pourra être quotidienne et ce afin de prodiguer des soins adaptés aux animaux dès que nécessaire et éviter toute souffrance. Les traitements avec des nouveaux produits à tester induiront un stress léger. C’est pourquoi, la plupart seront réalisés sous anesthésie. Si jamais des traitements engendre une douleur quelconque, les animaux bénéficieront d’une analgésie adaptée pour la supprimer. Des prélèvements de sang pourront être réalisés. Ils induiront un stress léger de l’animal. C’est pourquoi, ils seront réalisés sous anesthésie. Une douleur légère liée à la piqure sera également ressentie. La perte de poids des animaux sera suivie. Un animal montrant une perte de poids égale ou supérieure à 15% de son poids initial sera euthanasié. Toute intervention sur un animal qui pourrait engendrer une douleur sera réalisée avec une analgésie adaptée afin de l’atténuer fortement.

Choix des espèces

Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. Diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. Enfin, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvements et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 semaines minimum à la date d’induction tumorale). L’utilisation d’animaux adultes garantit la reproductibilité l’injection des cellules tumorales, c’est-à-dire que cette injection est toujours réalisée au niveau des coordonnées souhaités. Cela garantit également que la vitesse de croissance des tumeurs sera similaire d’une expérience à l’autre. L’utilisation d’animaux plus jeunes ne permet pas de garantir que l’injection des cellules est réalisée au niveau des coordonnées souhaitées (une injection au niveau de coordonnées non connues peut induire des effets neurologiques néfastes).

5 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Un fragment de tumeur humaine leur est greffé pour développer des modèles dits PDX, avec traitements et prélèvements sanguins, y compris par ponction intracardiaque terminale. L'établissement, prestataire, développe ces modèles pour des partenaires afin de cribler des molécules. Le porteur affirme que les PDX sont les seuls à reconstituer la complexité des tumeurs humaines, une perte de poids déclenchant supplémentation ou arrêt du traitement.

Objectifs

En Europe, les cancers pédiatriques sont la 1ère cause de mortalité infantile non accidentelle. 20% des enfants et adolescents diagnostiqués meurent chaque année et bien que 80% survivent, les 2/3 d’entre eux souffrent au long terme d’effets secondaires associés à un traitement souvent inadapté. Le développement de thérapies efficaces en oncologie pédiatrique est aujourd'hui devenu un enjeu majeur. Ces dernières années, grâce à l’avancée des thérapies ciblées, une augmentation très importante de nouvelles molécules approuvées pour le traitement des cancers chez l’adulte a été enregistrée. Or, il existe encore peu d’options thérapeutiques accessibles aux enfants et adolescents atteints de cancers. Pour pallier à ce retard, ce projet a été mis en place pour permettre le développement de systèmes de criblages performants dans le but de tester de nouvelles molécules développées chez l'enfant et des molécules développées ou en cours de développement chez l'adulte qui pourraient aussi être efficaces chez l'enfant. Dans le cadre de ce projet, notre société est chargée de finaliser le développement de modèles de tumeurs humaines xénogreffées sur souris ou Patient Derived Xenografts (PDX) représentants au mieux l'hétérogénéité et la variété des cancers pédiatriques solides. Ces modèles seront utilisés pour réaliser des études précliniques avec un nombre d'animaux réduit afin d'identifier les meilleures thérapies potentielles dont pourraient bénéficier les enfants et les adolescents malades. Le développement de modèles PDX est indispensable car ces modèles sont les seuls permettant de reconstituer la complexité des tumeurs humaines et bien que l'environnement cellulaire qui entoure les greffons est constitué de tissus de souris, ce sont sans doute les modèles qui s'approchent le plus de la maladie humaine. Ces PDX sont donc, à l'heure actuelle, les outils les plus performants pour mimer les réponses observées chez les patients en clinique et établir une liste des meilleurs traitements potentiels pour lutter contre les cancers pédiatriques.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d'identifer des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Parmi un très grand nombre de molécules à tester, incluant de nouvelles molécules ou des molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte, et dont l’efficacité doit être démontrée chez l’enfant, les études précliniques avec un nombre d'animaux réduit sont une première étape vers l’identification des traitements les plus efficaces pour l’ensemble des cancers pédiatriques.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une greffe correspondant à l'implantation d'un fragment de tissus tumoral. Avant la greffe, les souris sont anesthésiées (anesthésie générale). La peau est incisée au niveau du dos de l'animal après désinfection préalable. La greffe est réalisée par l'implantation d'un fragment tumoral. Afin d'identifier avec précision le modèle implanté, les souris seront marquées au niveau des oreilles ou avec une puce insérée en sous cutané. L'incision est alors refermée par 2-3 agrafes préalablement aseptisées. La procédure a une durée globale de 30 minutes maximum par souris. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. Les animaux seront observés quotidiennement pour s'assurer de leur bien-être et de leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Les animaux seront manipulés une à trois fois par semaine si leur état général ne nécessite pas une surveillance renforcée: les souris seront pesées 1 fois par semaine et les tumeurs seront mesurées jusqu'à 3 fois par semaine en fonction de la croissance tumorale. Selon les molécules, l’administration sera réalisée par voie orale, intrapéritonéale, intraveineuse ou sous-cutané en fonction du schéma de traitement associé. Dans le cadre d'une meilleure connaissance des modèles des prélèvements de sangs pourront être effectués au niveau du sinus retro-orbital (sous anesthésie gazeuse) ou de la veine caudale, dans le respect des directives européennes. Des ponctions intracardiaques pourront être pratiquées lors de prélèvements terminaux, sous anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Certains modèles de PDX sont susceptibles d’induire une perte de poids chez la souris. L'administration de molécules est susceptible d’induire une perte de poids chez la souris. En cas d'une perte de poids supérieure à 15% du poids en début d'expérimentation pour les souris porteuses de modèles en développement ou une perte de poids supérieure à 10% pour les souris porteuses de modèles en traitement, une supplémentation sous forme de gel sera ajoutée dans la cage. Dans ce cas, la mesure du poids corporel est effectuée tous les jours jusqu'au retour à une perte de poids

Devenir

L'ensemble des animaux de ce projet étant porteur d'un fragment tumoral, à l'issue de chaque procédure tous les animaux seront euthanasiés. La réutilisation ne peut pas être possible car les effets des procédures précédentes que les animaux ont subies (greffe de fragment tumoral, traitement par des molécules) pourraient introduire une variabilité indésirable dans les résultats de toute étude ultérieure.

Remplacement

Ce projet a pour objectif de développer les modèles nécessaires pour déterminer l’efficacité de nouvelles molécules développées chez l'enfant ou de molécules développées ou en cours de développement chez l’adulte afin d’améliorer et d’identifier des thérapies efficaces pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations bien définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo dans le modèle murin permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme.

Réduction

Le développement de PDX est standardisé et la parfaite connaissance de ce type de modèles permet de mettre en place une stratégie expérimentale n’utilisant que le nombre strictement nécessaire d’animaux. Nous estimons développer 100% des modèles transférés par les partenaires du projet. L'approche sélectionnée pour la réalisation d'études précliniques permet d'évaluer, sur un nombre réduit de souris, l'efficacité et la toxicité de molécules sur une large cohorte de modèles. Ce format d'étude permet de réduire le champ d’investigation en diminuant le nombre important de molécules à tester dans des études précliniques plus approfondies et donc de réduire le nombre global d'animaux utilisés. La taille des groupes des études précliniques sur un nombre d'animaux réduit se base également sur la valeur classiquement utilisée du taux d'inhibition présentant un intérêt qui permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés tous en garantissant la puissance de l'expérimentation. A partir de nos données, nous avons pu déterminer les variables liées à la croissance tumorale de ce type de modèles et définir le nombre d’animaux minimum et nécessaire à l’observation significative d’un effet >58%.

Raffinement

Les animaux seront suivis quotidiennement pour monitorer leur bien-être général et leur comportement (isolement du groupe, prostration, aspect du poil...). Pour chaque animal, tout signe clinique observé susceptible de causer une douleur, une souffrance ou une angoisse, sera immédiatement enregistré. En cas d’apparition de signes cliniques importants, l’observation pourra être portée à 4 fois par jour au lieu d'une. Lors de l’acte chirurgical, la greffe se fera sous anesthésie générale par une injection par voie intrapéritonéale. Le réveil des animaux sera surveillé au maximum 24h après l'anesthésie. En cas d’une perte de poids supérieur à 15% du poids en début d'expérimentation, une supplémentation sous forme de gel alimentaire sera ajoutée dans la cage et/ou les traitements seront arrêtés jusqu'à ce que la perte de poids soit inférieure à 10% du poids en début d'expérimentation. En cas de diarrhée causant une perte de poids, les dispositions associées à la perte de poids seront prises. L'ensemble de ces mesures permet d'anticiper et de réduire une éventuelle souffrance de l'animal.

Choix des espèces

L'objectif du projet est le développement de modèles nécessaires pour la détermination de l’efficacité de nouvelles thérapies pour le traitement des différents types de cancers pédiatriques solides. Dans le cadre de développement de médicaments pour des populations définies (médecine personnalisée), il est indispensable de développer de nouveaux modèles sur un organisme complexe (souris) avec une activité du métabolisme pouvant changer la distribution et l’efficacité thérapeutique. Il n'existe pas de méthode alternative autre qu’in vivo permettant de valider les résultats avant un transfert chez l'homme. Nous utilisons des souches murines immunodéprimés qui sont classiquement utilisées pour des greffes de tumeurs humaines et dans le cadre d'évaluations pharmacologiques et qui ont été utilisées lors du pré-développement des modèles par les partenaire du projet. Les souris présentant un système immunitaire résiduel qui se développe avec l'âge et qui peut réduire le taux de prise de greffe, nous utiliserons des animaux, en fin de période d'acclimatation, de plus de 18g, âgés entre 6 et 10 semaines pour augmenter nos chances de succès.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur humaine leur est inoculée, avec des injections de traitement deux fois par semaine pendant quatre semaines, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut nécroser ou s'ulcérer, l'animal étant tué si elle dépasse 2 000 mm³. Il affirme que la validation de ces anticorps ne peut s'effectuer que chez l'animal vivant, l'entrée en essai clinique restant une perspective.

Objectifs

L’immunothérapie constitue un véritable espoir dans le traitement de nombreux cancers, notamment dans ceux sans prise en charge efficace actuellement. Ce traitement consiste principalement en l’administration d’anticorps monoclonaux dirigés contre les cellules tumorales ou leur microenvironnement afin de limiter la croissance tumorale. Plusieurs types d’anticorps monoclonaux peuvent être utilisés dans ce but, sous réserve que le patient présente bien la protéine ciblée au sein de sa tumeur. D’autres anticorps monoclonaux ont une action immunomodulatrice en levant le mécanisme d’inhibition du système immunitaire induit par la tumeur. Ces mécanismes sont communs à plusieurs cancers et ces traitements récents ont des indications dans déjà sept types de cancers : poumon, rein, vessie, tête et cou, mélanome , maladie de Hodgkin et maladie de Merkel et sont actuellement évalués dans de nombreux autres cancers. Bien que des réponses remarquables et prolongées aient pu être observées chez des patients atteints de cancers avancés métastatiques, un nombre important de patients (80 à 60% selon les cancers) restent réfractaires au traitement.

Bénéfices attendus

La première partie de ce projet permettra de compléter la caractérisation de notre produit par confirmation des marqueurs tumoraux identifiés et permettra de de débuter un essai clinique chez l’homme , dans des cancers ou le besoin médical est très important. Dans le cadre du lymphome cette étude permettra de confirmer l’intérêt thérapeutique de notre candidat médicament et ainsi d’offrir une vrai alternative thérapeutique aux patients atteints de lymphomes T périphériques et ne bénéficiant d’aucune prise en charge actuellement

Procédures

Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur humaine via injection en sous-cutanée sous anesthésie ou via injection en intra-péritonéale sur animal vigile. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal pour les traitements (2 fois par semaine pendant 4 semaines) sur animaux vigiles. L'anesthésie pour l'injection en sous-cutanée sera de courte durée :< à 5 min par souris. Pour les injections en intrapéritonéale la manipulation des souris n'excédera pas 1 min.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux sous-cutanées peuvent provoquer de la douleur si la tumeur nécrose ou s’ulcère (points-limites). La tumeur ne devant pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, celui-ci sera mis à mort si la tumeur atteint 2000mm3 (soit moins de 10% de la masse corporelle). Aucun autre effet indésirable n’a été remarqué sur ce type de modèle au laboratoire. Les modèles tumoraux sous-cutanés sont considérés comme des procédures modérées. Les modèles de lymphomes T périphériques peuvent induire une splénomegalie, mais aucune autre altération majeure n’est attendue. L’état clinique et le poids des souris seront suivies 3 fois par semaine. Ces modèles sont également considérés comme des procédures modérées.Une contention légère sera fait sur les souris pour l'administration intrapéritonéale par du personnel qualifié afin de ne pas engendrer de stress sur les souris. Cette manipulation ainsi que la piqure ne durera que quelques secondes et la souris sera rapidement remise avec ses congénères. La manipulation des souris pour mesurer la masse tumorale n’excédera pas 1 min. elle se fera 3 fois par semaine dont 2 fois en même temps que l’injection des traitements afin d’éviter les manipulations intempestives.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.

Remplacement

Du fait du contexte physiologique et de la complexité du système immunitaire, la validation d’un traitement par anticorps polyclonaux ne peut s’effectuer que dans un modèle in vivo. Il est nécessaire d’utiliser des animaux pour atteindre les objectifs du projet car cette étude a pour objet l'évaluation de l’efficacité thérapeutique d’un ou plusieurs traitements en préclinique. Les animaux sont indispensables à cette étape d’évaluation thérapeutique du traitement car ils permettent de tester in vivo l’efficacité ou la non-efficacité du (des) traitement(s), de caractériser le fonctionnement du (des) traitement(s), ainsi que les effets secondaires possiblement liés avant de le tester en clinique chez l’Homme si celui (ceux)-ci est efficace.

Réduction

Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 10 -15 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur l’analyse de données non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ces tests nous permettent d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.

Raffinement

Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour/nuit de 12h/12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique > à 7 sur deux jours consécutifs, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg/kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne.

Choix des espèces

La souris NMRI nude est très largement utilisée pour la mise en place de modèle xénogreffe. De plus elle présente une activité résiduelle du complément murin, ce qui la rend pertinente pour l’évaluer l’activité biologique de nos traitements à base de d’anticorps polyclonaux. Tous les modèles xénogreffe décrit dans ce projet ont été validé et caractérisé dans des publications. Adulte-8-10 semaines, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse anti-tumorale, et donc un stade tumoral différent.

1 200 souris et 300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur mammaire leur est greffée, avec jusqu'à deux chirurgies, radiothérapie, imagerie et prélèvements sanguins, puis mise à mort pour prélèvement d'organes. Le porteur indique que la tumeur peut réduire la mobilité, se nécroser ou métastaser jusqu'aux poumons. Il affirme que l'animal est un passage obligatoire avant l'humain, les bénéfices étant renvoyés au long terme.

Objectifs

Les cancers du sein sont les cancers les plus fréquents chez la femme. Ils représentent une pathologie très hétérogène. Ainsi, deux patients ayant le même diagnostic initial pourront présenter des réponses aux traitements conventionnels très différentes. Un seul type de modèle ne peut donc représenter l’ensemble de ces pathologies. Ce projet vise à évaluer les propriétés anti-tumorales de différentes approches thérapeutiques incluant notamment des candidats médicaments, la radiothérapie ou encore l'utilisation de dispositifs médicaux dans des modèles de tumeurs mammaires obtenues par greffe de cellules cancéreuses.

Bénéfices attendus

A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments pour traiter les cancers du sein. A court terme, les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé ou le dispositif médical testé est actif dans un modèle expérimental de tumeurs mammaires ou d’évaluer ses éventuels effets secondaires avant son passage en phases cliniques.

Procédures

En fonction de l'étude, les animaux pourront subir au maximum 2 chirurgies de 5 à 15 min chacune, sous anesthésie générale, pour l'implantation d'un dispositif médical et l'exérèse chirurgicale de la tumeur mammaire. Ils seront également anesthésiés au moins une fois, généralement par anesthésie gazeuse, pour l'implantation des cellules tumorales. Ils pourront également être anesthésiés plusieurs autres fois au cours de l'étude pendant quelques minutes, généralement par anesthésie gazeuse, afin de procéder à des traitements comme la radiothérapie et/ou à des suivis par imagerie. Dans le cas de radiothérapie, les animaux seront traités généralement pendant 5 jours consécutifs. Les suivis par imagerie se feront eux généralement 1 fois tous les 7 à 15 jours pendant environ 2 mois. Les animaux pourront également subir plusieurs prélèvements de sang dans le respect des recommandations éthiques (volumes prélevés, fréquences et temps de récupération).

Impact sur les animaux

Le développement de la tumeur mammaire peut entrainer un inconfort voire une réduction de la mobilité des animaux. Les tumeurs peuvent également développer une nécrose. Des métastases, en particulier au niveau des poumons, peuvent entrainer des difficultés respiratoires. Par ailleurs, les effets potentiellement indésirables du/des produits testé(s) font l’objet d’échange avec nos promoteurs et les responsables Bien-Etre Animal pour adapter les outils d’observations des animaux afin d'anticiper au mieux de potentiels signes cliniques.

Devenir

Mise à mort de l'ensemble des animaux à la fin de l'étude pour réaliser des prélèvements d'organes et/ou des observations macroscopiques.

Remplacement

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez le rongeur car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule sur les tumeurs mammaires. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris et le rat sont les espèces qui sont les plus adaptées à ce type de modèle d’étude.

Réduction

Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et d’effectuer des analyses statistiques. Nombre d’animaux minimal et suffisant par groupe pour réaliser une analyse statistique : 6-10 animaux/groupe.

Raffinement

Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • le suivi d’éventuel signes cliniques, • la détermination des points limites, • le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire. • un protocole analgésique adapté pour les chirurgies et la période post-opératoire ainsi qu'un suivi post-opératoire de l’état de santé des animaux avec des soins et un enrichissement adaptés afin de permettre une bonne récupération des animaux, • la réduction du volume sanguin prélevé grâce à l’amélioration de la sensibilité des méthodes d’analyse.

Choix des espèces

La souris et le rat sont les espèces animales les plus adaptées et les plus couramment utilisées dans les modèles animaux de tumeurs mammaires obtenues par greffe de matériel biologique d’origine tumorale. Les animaux utilisés sont des animaux adultes âgés de 6 à 10 semaines au moment de l’implantation des cellules tumorales. La prise tumorale est connue pour être moins bonne chez des individus plus âgés.

768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On provoque une inflammation chez des femelles gestantes porteuses d'une mutation, pour observer les effets sur le développement nerveux des embryons, avec suivi par échographie. Le porteur indique que l'injection peut induire un développement anormal in utero et une mise bas prématurée. Il affirme qu'il est impossible de remplacer ce modèle muté, les retombées cliniques étant renvoyées à une meilleure compréhension des pathologies.

Objectifs

Lorsque des infections sont contractées durant la grossesse, il en résulte l’apparition de davantage de pathologies du neuro-développement (PND), autisme, paralysie cérébrale, schizophrénie etc. Ces pathologies sont dues en particulier à un développement anormal du système nerveux. De plus, les naissances prématurées qui peuvent s’y ajouter sont un facteur également aggravant. Il a récemment été montré que des anomalies de motricité apparaissent précocement, avant que les anomalies cognitives ne puissent être diagnostiquées. Des travaux récents ont mis en évidence des mutations dans certains gènes, qui jouent un rôle crucial dans le développement du système nerveux central, et qui sont impliqués dans de telles pathologies neuro-développementales. L’existence simultanée d’une inflammation placentaire accentuerait les conséquences de ces modifications génétiques. Lors d’infections au cours de la grossesse, une inflammation du placenta peut être décelée et impacter le développement des embryons. En cas de fragilités génétiques dues à des mutations chez certains embryons, le développement normal du système nerveux est perturbé, ce qui peut conduire à différentes pathologies neurodéveloppementales. Nous provoquerons une situation d’inflammation chez la souris gestante, et nous analyserons l’effet de mutations dans les embryons sur : (i) des marqueurs inflammatoires présents dans les fluides amniotiques des portées, (ii) le développement neuro-anatomique du système nerveux, (iii) de l’appareil neuro-moteur dont les masses musculaires, ainsi que (iv) le développement du placenta.

Bénéfices attendus

Le gène étudié permet la transmission de signaux de l’environnement en permettant notamment le développement embryonnaire du cerveau. Son étude dans des modèles de souris nous permettra d'obtenir une meilleure compréhension des signaux moléculaires et cellulaires et des facteurs multiples conduisant aux pathologies neuro- développementales dans le contexte inflammatoire de la grossesse. Elle devrait également conduire à une amelioration du pronostic des troubles précoces du développement neuro-moteur.

Procédures

Les souris seront accouplées pour déclencher une gestation. Les accouplements seront réalisés jusqu’à l’obtention de 6 souris gestantes par groupe. Les souris suivies subiront 4 examens d'imagerie non invasive pour le suivi des gestations sous anesthésie générale ne dépassant pas 20 minutes. Au cours de cette gestation, une réponse inflammatoire suite à une seule injection (durée maximale : 30 sec) sous-cutanée d’une molecule déclanchant l’inflammation sera générée pouvant entraîner des défauts de développement in utero.

Impact sur les animaux

Impact de l’agent inflammatoire sur l’état général des souris : une vigilance sera portée sur l’inflammation provoquée, même si des conséquences telles que l’hypothermie sont peu probables aux doses faibles utilisées ici (jusqu’à 40 fois moins que les doses rapportées). Il est attendu que les injections d’un composant bactérien, qui provoque de l’inflammation, induisent un développement anormal des embryons in utero et une possible mise bas prématurée.

Devenir

Mort pour utilisation des tissus : analyses anatomiques et dosages immunologiques.

Remplacement

Il est impossible de remplacer ce modèle murin porteur d’une mutation constitutionnelle pour le gène d’intérêt, mais des études en culture ont permis de montrer son rôle sur le développement de certaines structures du système nerveux. Par ailleurs, nous avons déjà identifié des toxines utilisables en culture cellulaire pour renforcer certains des résultats que nous aurons obtenus dans les souris.

Réduction

Le nombre d’animaux par groupe sera de 6 pour atteindre une robustesse statistique. L'échographie non invasive permettra de déterminer in utero l'apparition d'une létalité dans les portées et de préciser à quel stade elle apparaît, évitant une mise à mort séquentielle des femelles gestantes au cours de la gestation, comme cela est habituellement le cas pour les études de mortalité in utero. Ce suivi nous permettra également d’éviter d’engager une inflammation dans des femelles n’ayant pas ou trop peu de petits.

Raffinement

L'échographie non invasive permettra de caractériser in utero plusieurs paramètres fonctionnels (fréquence cardiaque, flux sanguin et résistance hémodynamique) en plus des informations anatomiques (rapport périmètre cranial / périmètre abdominal). A partir des expériences préliminaires, nous établirons rapidement le timing auquel l’injection sera réalisée (précoce ou tardive) pour n’effectuer dans un premier temps l’étude que sur le stade d’injection qui donne les résultats les plus évidents. Les échographies seront faites sous anesthesie, et nous avons établi une grille qui nous permet d’évaluer l’éventuelle détresse et souffrance des animaux et de les supprimer ou soulager et ainsi d’améliorer leur bien-être. Les conditions d’hébergement seront optimisées en évitant l’isolement des animaux et leur maintien en groups sociaux dans des cages enrichies de cylindres en carton.

Choix des espèces

Choix du modèle murin : le modèle de souris a été choisi car il permet d’étudier les conséquences durant le développement embryonnaire de l’absence d’expression d’une protéine. Modèle mammifère, adapté pour les études à visée clinique : études sur la reproduction/gestation, rôle du placenta. Reproduction rapide, fond génétique homogène, nombre important d’animaux dans une même portée, avec des génotypes différents, permettant une comparaison interne fiable. Nombre de publications ont récemment rapporté que les mutations murines introduites miment la pathologie humaine. Les animaux seront utilisés à pour les études anatomiques du système nerveux, la mise en place des motoneurones qui a lieu précocement et le développement des masses musculaires.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur leur est greffée à la patte, avec injections cinq jours sur sept pendant quatre semaines et suivi par imagerie, pour tester des molécules contre un cancer pédiatrique, le rhabdomyosarcome. Le porteur précise n'utiliser que des femelles, notamment pour limiter les bagarres entre mâles. Il affirme que le modèle animal est le seul à intégrer les facteurs physiologiques en jeu, les retombées cliniques étant renvoyées à un transfert ultérieur.

Objectifs

Dans les cancers pédiatriques, le rhabdomyosarcome (RMS) représente 5% des tumeurs pédiatriques solides. Ces tumeurs malignes d’origine musculaire se développent dans diverses localisations, principalement dans la tête et le cou (40%), la vessie et les organes reproducteurs (20%), les membres (20%) et le tronc (10%). La survie à cinq ans des patients est d'environ 75 %, alors qu'elle est inférieure à 30 % chez les patients dont la maladie s'est propagée à d'autres parties du corps (maladie métastatique). Malgré les avancées de la médecine personnalisée, il n’y a eu que de faibles progrès dans le traitement de cette maladie. Une famille de nouvelles molécules ciblant la production d'énergie a été identifiée dont il faut démontrer qu’elles possèdent les caractéristiques de candidats médicaments anti-tumoraux et anti-métastatiques. Ceci permettrait d’améliorer la prise en charge médicale des RMS chez l’enfant et l’adolescent. L’objectif de ce projet est de confirmer chez la souris l’efficacité anti-tumorale de ces molécules, c’est-à-dire que le traitement induit une diminution du volume des tumeurs primaires et de l’étendue des métastases.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules candidats médicaments dans le traitement d’un type de cancers pédiatriques (rhabdomyosarcomes) et de confirmer les résultats déjà obtenus en vue d’un transfert technologique vers la clinique.

Procédures

Analgésique pré implantation : 1x lors de la greffe au niveau de la patte avant l'anesthésie. Anesthésie : 1x au moment de la greffe au niveau de la patte (Durée : 5 min maxi) et au niveau de la queue en intra-artérielle (Durée : 20 min maxi) ; 2x avant l’imagerie par l'échographie pour la préparation des animaux (Durée : 5 min maxi par point d’acquisition) ; 2x (lors du constat de la prise de greffe et en point final) pour l'imagerie par échographie (Durée : 10-20 min maxi par point d’acquisition) ; 13x max pour l'imagerie lumineuse (Durée : 8 min maxi par point d’acquisition soit 1x/semaine). Traitement : 5 jours/7 injection des molécules pendant 4 semaines maximum. Évaluation de l’efficacité des composés et prise de greffe par imagerie lumineuse sous anesthésie (1x/semaine) et par mesure au pied à coulisse de l’épaisseur des pattes (1x/semaine) pendant 91 jours maximum.

Impact sur les animaux

Implantation intra-musculaire (IM) : Avant l’implantation IM, l’injection en sous-cutanée d’un anti-douleur engendre une douleur légère. Puis, l’implantation IM sous anesthésie entraine une douleur légère. Le suivi de l'évolution du volume tumo va engendrer un stress léger lors de la mesure au pied à coulisse de l’épaisseur de la patte greffée et de la patte car ces mesures sont réalisées sur animaux vigiles. Implantation intra-veineuse ou intra-artérielle : L’implantation va entrainer une douleur légère. Développement des tumeurs/dissémination et imagerie : Le suivi dudéveloppement de tumeurs et/ou leur dissémination (métastases) peut engendrer une douleur modérée. Uniquement pour l’imagerie par bioluminescence, les animaux vont devoir recevoir en vigile une injection de luciférine en intra-péritonéale qui va engendrer une douleur légère. Traitements : Les animaux des procédures (3 et 4) reçoivent une injection en intra-péritonéale du traitement standard (Doxorubicine) ou des composés d’intérêt (MS-C2 et MS-C3) qui génèrent une douleur légère au début qui peut évoluer vers une douleur modérée suite à la répétition des injections (5J/7 des composés à tester ou 2J/7 le traitement standard) pendant les 4 semaines de traitement. Les effets secondaires pour le traitement standard et l’administration des composés d’intérêt sont connus et n’entrainent pas de douleur. La toxicité des molécules a été évaluée précédemment in vivo chez la souris et n’a pas montré de souffrance des animaux aux doses que nous allons utiliser. Les molécules MS-C2 et MS-C3 sont resuspendus dans du DMSO (= véhicule) et lors des traitements, seront injectées en présence d’un excipient lipidique (huile raffinée) dédiée et certifiée pour l’usage vétérinaire en injection. La concentration finale de DMSO dans l’excipient est ~1% et aucun signe particulier de souffrance ou d’irritation n’a été relevé chez les souris ayant reçu ce traitement lors des expériences réalisées selon le même protocole. Elles ont permis de déterminer la Dose Maximale Tolérée (DMT) utilisable pour un protocole de traitement incluant une injection intra-péritonéale 5J/7 pendant 4 semaines. Avec le traitement standard, nous allons observer une diminution de la taille des tumeurs donc une diminution potentielle de la douleur mais nous ne savons pas avec les composés d’intérêts.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure.

Remplacement

Des études précédentes sur des cellules cancéreuses et sur des embryons de poulet ont montré qu'une nouvelle famille de molécules était efficace sur la tumeur et les métastases. Le modèle animal est le seul permettant de prendre en compte de nombreux facteurs physiologiques susceptibles d’intervenir dans les effets de la molécule testée. Aucune donnée bibliographique n’est disponible sur ces molécules à l'heure actuelle.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des études précédentes ont permis de sélectionner les composés d'intérêts et de déterminer les doses maximales tolérées. Dans le but de réduire le nombre d’animaux, deux lignées cellulaires humaines, qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir à le mettre à mort. D’après les données de la littérature, on estime que le taux de prise de greffe sera de 90%. Cette donnée a été prise en compte afin d’utiliser le nombre minimum d’animaux permettant de s’assurer de la reproductibilité et de réaliser une analyse statistique des résultats. De plus, les procédures prévues dans ce projet sont séquentielles, ce qui permettra de réduire au maximum le nombre de souris impliquées dans le projet.

Raffinement

Deux lignées cellulaires humaines qui émettent de la lumière seront utilisées afin de pouvoir suivre la progression tumorale et/ou la dissémination métastatique au cours du temps sur le même animal sans avoir recours à sa mise à mort dans un but de raffinement. Au cours de ce projet, les précautions seront prises pour stresser au minimum l’animal. Dès leur arrivée, les souris seront hébergées par groupe de 5 animaux par cage. Une période d’acclimatation de 7 jours sera respectée avant l’entrée des animaux dans l’une des procédures présentées ci-après. L'administration d'analgésique/anesthésique, un suivi adapté des animaux et la définition précise des points limites précoces et prédictifs d'un mal être, permettent de limiter au maximum la souffrance animale. Post greffe, de la nourriture humidifiée sera ajoutée au fond de la cage au cas où les animaux présenteraient des difficultés à se déplacer. De plus, post-mortem différents organes seront prélevés pour des analyses complémentaires.

Choix des espèces

L’utilisation de souris dont le système immunitaire est altéré est nécessaire pour étudier l’efficacité du nouveau traitement sur des cellules de cancers pédiatriques humaines sans rejet de greffe par le système immunitaire. Les rhabdomyosarcomes sont des tumeurs pédiatriques rares, pour lesquelles un sexe-ratio Mâle/Femelle légèrement supérieur à 1 a été rapporté, toutefois très variable selon les études, l’âge et la localisation des tumeurs primaires. Les premières expériences de greffes en intra-musculaire au niveau de la patte ont été menées avec des femelles et ont permis l’obtention de tumeurs dans 90% des cas. Uniquement des femelles sera utilisée afin d’être dans les mêmes conditions que le projet précédent et aussi de limiter le risque d’agressivité/bagarre inter-individu par rapport aux mâles dans les cages et être obligé d’écarter des individus ou les mettre à mort suite à des blessures. Les essais chez le mâle seront ultérieurement envisagés en fonction d’effets endocriniens potentiels car actuellement aucune information n'est disponible. Les greffes seront réalisées sur des souris de 6 semaines pour une réalisation optimale de l’expérience. En effet à cet âge, d'après la littérature, la prise de greffe est plus fiable et donne des résultats clairs pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.