Souris

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ces souris exprimant une forme humaine mutée de la protéine tau reçoivent des injections intrapéritonéales ou orales deux fois par semaine pendant deux mois, avant mise à mort pour analyser le cerveau. Le porteur teste des sucres complexes censés freiner les tauopathies comme la maladie d'Alzheimer, dont il affirme déjà qu'ils "se révèlent utiles". Il présente la souris comme "la seule espèce mammifère" modifiée pour exprimer la tau humaine mutée et juge la confirmation in vivo "nécessaire".

Objectifs

Les tauopathies, auxquelles appartiennent la maladie d’Alzheimer et les démences fronto-temporales, se caractérisent par une perte neuronale due à l’accumulation de la protéine tau sous une forme anormale (=tauopathie) dans le cerveau des patients. À ce jour, aucun traitement curatif de ces pathologies n’existe sur le marché. Dans le but de développer un traitement pour ces pathologies, notre laboratoire étudie le rôle de certains sucres complexes (=oligosaccharides), sur la modification anomale de la protéine tau. Il a notamment été montré que certains sucres complexes sont critiques pour le développement et l’évolution de la maladie d’Alzheimer. La forme anormale de tau dans les cellules neuronales résulte de l’interaction de la protéine avec ces oligosaccharides complexes internalisées dans les neurones des sujets malades. Enfin des études préliminaires ont montré la capacité d'un oligosaccharide mimétique à diminuer le développement des tauopathies en rentrant en compétition avec les sucres complexes de la membrane cellulaire et en diminuant la propagation de la tauopathie. Les oligosaccharides mimétiques se révèlent dès lors être utiles dans le traitement des tauopathies, et tout particulièrement dans le traitement de la maladie d’Alzheimer. Notre objectif va être de démontrer qu'il est possible en utilisant nos oligosaccharides mimétiques de diminuer le développement de la tauopathie dans un modèle murin exprimant la protéine Tau humaine mutée responsable du développement de la maladie. Ainsi en poursuivant l’étude de ces molécules dans ce modèle, sélectionné pour sa capacité à reproduire plusieurs aspects de la maladie (modification de la tau, mort des neurones et troubles cognitifs aux âges avancé…), nous espérons avoir des preuves solides de l’efficacité de cette stratégie thérapeutique pour débuter de premières études chez l’homme. En effet, il est nécessaire d'un point de vue réglementaire de démontrer que notre concept est efficace dans un modèle se rapprochant de l'homme pour débuter des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Actuellement les traitements sur le marché sont uniquement symptomatiques et ont un bénéfice clinique limité pour les patients. Il est ainsi important de développer un traitement capable de stopper ou ralentir les mécanismes impliqués dans le développement de la maldie d'Alzheimer. Ce projet consiste donc à caractériser l'effet d'une nouvelle classe de molécules thérapeutiques ciblant un mécanisme impliqué dans l'agrégation anormale de la protéine Tau, qui mène aux troubles cognitifs de la maladie.

Procédures

Les procédures 1 et 2 consistent en des traitements 2 fois par semaine (les matinées du lundi et jeudi) pendant 2 mois par injection intra-péritonéale ou administration par voie orale des molécules d'intérêt (max 0,1 ml/souris) ou des mises à mort afin de récupérer le tissu cérébrale en vue d'analyses. Pour un groupe d’animaux (6 animaux par cage) il faut environ 10 min par traitement. Cela comprend la pesée et l’injection intra-péritonéale (ou administration par voie orale) des 6 animaux du même groupe.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux dans nos procédures sont liés à l’élevage en captivité des animaux sur plusieurs mois et la manipulation des animaux (contention, change). Pour information, les animaux sont utilisés à des âges inférieurs à 5 mois, c'est-à-dire avant le début des signes cliniques moteurs modérés induits par la tauopathie dans ce modèle. Nos deux procédures sont classées modérées et les nuisances et effets indésirables attendus sont liés à la contention et à l'insertion répétée de l'aiguille en intra-péritonéale même si le site d'injection est alterné (droite et gauche). Pour information l'analyse toxicologique de nos molécules faite chez la souris C57BL6 par un laboratoire pharmaceutique n'a pas montré de toxicité même à forte dose (500 mg/kg) pour la voie orale. Les effets indésirables pourront également être évalués lors des études de biodisponibilité des produits qui seront réalisées par la même société en amont de cette partie expérimentale. Par ailleurs de précédentes études utilisant nos molécules n'ont pas mis en évidence de potentiels effets toxiques de la molécule aux doses utilisées (voie intra-péritonéale, 2 mois, 2x/semaine, 25 mg/kg).

Devenir

Les animaux de l'ensemble des procédures seront mis à mort à la fin des procédures expérimentales afin de réaliser les analyses nécessaires à la quantification de nos paramètres biologiques dans le cerveau.

Remplacement

La tauopathie est une maladie humaine et la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine Tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie caractéristique de la maladie d'Alzheimer. Des résultats antérieurs obtenus sur des cellules primaires issues de ce modèle de souris montrent des effets prometteurs de notre molécule d'intérêt. La confirmation dans un modèle murin est maintenant nécessaire.

Réduction

Pour les études chez l'animal, nous avons optimisé le nombre d’animaux par groupe (12 souris / groupe pour la procédure 1 et 20 souris / groupe pour la procédure 2) afin d’obtenir des résultats statistiquement exploitables et réaliser des analyses avec un nombre d’animaux réduit au strict nécessaire. Pour chaque animale, différentes régions du cerveau seront étudiés afin de caractériser l'évolution de la pathologie. Ainsi chaque groupe sera subdivisé en sous-groupe de 12 ou 20 animaux, selon leur âge, qui seront maintenus vivants dans les conditions standard d’animalerie pendant 2 et 4 mois. Aux temps correspondants, les différents groupes d’animaux seront mis à mort afin d’étudier l’évolution de la maladie dans le cerveau ainsi que sa corrélation avec notre cible. Pour répondre à ces objectifs au maximum, 256 souris seront nécessaires (sur 5 ans). Les différentes lignées de souris utilisées dans le projet seront disponibles par un élevage en interne. De plus, dans le but de réduire le nombre d'animaux dans le cadre de la sélection de la dose optimale, la biodisponibilité des molécules les plus efficaces a été réalisée en externe par un laboratoire pharmaceutique.

Raffinement

Afin de détecter et de limiter la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux, nous surveillerons leur état général et leur comportement. Une liste de vérifications contenant l’ensemble de points définis pour identifier la douleur ou la détresse de l’animal est établie : -L’évolution du poids de la souris -L’état de ses poils : poil hérissé -Sa posture, sa démarche et comportement : dos voûté, léthargie ou réticence à se déplacer, état défensif, grattage ou morsure. -On explore son environnement : absence de toilettage, redressement sur ses pattes arrière, diminution de la quantité de nourriture et d’eau ingérée. L’ensemble permet d’identifier si les animaux souffrent. Les animaux sont observés 2 fois/jour jusqu’à leur mise à mort (sacrifice). En cas de douleur : Les souris souffrantes seront transportées dans des cages isolées. Une injection d'un anti-douleur sera réalisée pour un effet antalgique et l’état de l’animal sera suivi. Durant la période d’hébergement, l’eau de boisson sera changée chaque jour et un régime alimentaire normal sera fourni. En cas de non-récupération observée nous allons consulter le personnel vétérinaire du laboratoire afin d’obtenir leur expertise en matière de signes cliniques de la douleur ou de la détresse.

Choix des espèces

Notre objectif est de valider l’importance de certains sucres complexes, dans un modèle mammifère de tauopathie. L’expérimentation sur le rongeur reste une étape indispensable avant toute expérimentation sur des modèles plus proche de l’homme (primate). Les rongeurs sont adaptés aux études scientifiques : 98% des gènes partagés avec l’homme, faibles tailles, grandes fécondités, courtes durées de vie, accessibilité et disponibilité d’outils biologiques. De plus, la souris est la seule espèce mammifère actuellement modifiée pour exprimer la protéine tau humaine avec la mutation qui induit la tauopathie (modèle reconnu par la communauté scientifique). Les souris qui développent la tauopathie sont utilisées à l'âge adulte à partir de 2 mois et jusqu'à 4,5 mois (mise à mort à 4 et 4,5 mois), c’est -à-dire de l'âge où la tauopathie commence à se développer (2 mois) et sacrifiées avant l'apparition des signes cliniques moteurs (8 mois). Les souris « contrôle » de même fond génétique ne possédant pas la mutation, servant de référence à ces études sont utilisées aux mêmes âges. Les organes périphériques des souris traitées avec les molécules seront également utilisés pour étudier les effets secondaires périphériques possibles des molécules. Ces souris seront utilisées à l'âge adulte (2-4 mois).

162 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique sous anesthésie pour implanter une mini-pompe diffusant dans le cerveau une substance bloquant la réaction inflammatoire, puis leur comportement alimentaire est mesuré sous régime standard puis gras. Le porteur étudie le rôle de l'inflammation cérébrale après un repas sur la satiété, avec un lien aux troubles alimentaires humains présenté comme une perspective. Il indique que l'implantation de la pompe empêche toute réutilisation, ce qui justifie selon lui la mise à mort de toutes les souris.

Objectifs

L’existence de la réaction inflammatoire après un repas (PIR) sans fièvre ni douleur est bien documentée. En revanche, ses effets sur l’organisme sont encore mal connus. La PIR apparaît chez l’individu sain dans un contexte de physiologie normale. Elle se caractérise par l’augmentation transitoire de facteurs pro-inflammatoires circulants après un repas, qui est exacerbée lors d’une consommation d’un repas gras. Dans les cellules, les nutriments activent un senseur moléculaire. Ce senseur active la caspase1, une enzyme qui transforme la pro-interleukine 1β (pro-IL-1β) en sa forme active l’interleukine 1β (IL-1β). Tant qu’elle n’est pas chronique, la production d’IL-1β semble exercer un rôle positif sur le contrôle glycémique périphérique, stimulant la sécrétion d’insuline et l’utilisation de glucose). Cependant, le rôle de la PIR dans un contexte physiologique reste mal compris. Récemment, il a été montré que la PIR se développait aussi dans le cerveau, en particulier dans l’hypothalamus, une structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. La PIR est faible et presque indétectable après un repas standard, mais elle devient visible après un repas riche en graisses. La PIR cérébrale pourrait constituer une réponse physiologique en favorisant le maintien de l’homéostasie énergétique. Dans l’hypothalamus, elle serait impliquée dans le contrôle de la prise alimentaire et favoriserait la sensation de satiété, freinant ainsi la consommation de calories en excès lors d’un repas gras. Le projet de recherche consistera à bloquer la PIR au niveau central chez la souris puis à étudier les effets de cette inhibition sur le comportement alimentaire. Nous pourrons ainsi évaluer si la PIR modifie la fréquence et/ou la taille des repas, dans différentes conditions nutritionnelles (alimentation standard ou grasse/hypercalorique). Il s’agira d’administrer dans le cerveau, une substance empêchant la formation du senseur moléculaire, ou une substance bloquant l’action de l’IL-1β sur les cellules cibles, ou un inhibiteur de l’enzyme produisant l’IL-1β. L’étude prévoit 162 souris.

Bénéfices attendus

Les résultats permettront de définir pour la première fois le rôle de l’inflammation cérébrale transitoire postprandiale sur le comportement alimentaire. En particulier nous définirons le rôle de certains acteurs moléculaires de la réaction inflammatoire : un complexe protéique, une enzyme et un composé B activé par cette enzyme. Ce projet apportera de nouvelles connaissances sur le contrôle de l’appétit, et pourrait permettre de mieux comprendre les troubles du comportement alimentaire tels que la boulimie, l’hyperphagie, ou l’anorexie.

Procédures

Les animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse en présence d’analgésique et d'antiinflammatoire. Cette chirurgie devrait durer ½ heure par animal.

Impact sur les animaux

Les animaux des groupes « traitement » subiront une chirurgie stéréotaxique et un traitement pharmacologique qui devraient impacter le comportement alimentaire en comparaison avec les groupes « témoin » subissant la chirurgie mais ne recevant pas les antagonistes. Nos travaux précédents conduisent à l’hypothèse selon lequel les animaux traités auront un comportement alimentaire non modifié sur alimentation standard équilibrée (mesurée pendant 3 jours) mais présenteront une hyperphagie par perte de satiété sur alimentation HFD (mesurée pendant 3 jours). Aucune anorexie et/ou anhédonie ne sont attendues en réponse à la chirurgie, aux différents traitements pharmacologique, ou à l’individualisation.

Devenir

Les 162 souris ayant subi une chirurgie mettant en place une mini pompe osmotique ne pourront être utilisés dans un autre projet. C’est pourquoi ils seront tous mis à mort.

Remplacement

Cette étude nécessite l’utilisation de modèles expérimentaux vivants, et respecte le principe des 3Rs appliqué en recherche animale. En effet, il n’existe pas actuellement de méthodes ou de modèles de substitution permettant d’étudier l’équilibre énergétique et le dialogue inter-organes d’un point de vue intégré. De plus, les réponses comportementales autonomes et les sensations de faim et de satiété que nous souhaitons étudier représentent des paramètres complexes qui ne sont pas modélisables in vitro ou in silico. Ainsi ce projet sera réalisé chez la souris, qui constitue un modèle de référence pour les études métaboliques et neurophysiologiques. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire.

Réduction

La procédure décrite, ainsi que la stratégie expérimentale, ont été optimisées, standardisées et validées précédemment, ce qui permet de réduire la variabilité interindividuelle, d’éviter des études pilotes supplémentaires, et donc de réduire les effectifs nécessaires au projet. De plus, les animaux seront leur propre témoins en étant exposés au régime standard puis au régime enrichi, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux. Le fait de travailler avec des animaux standardisés (sexe, âge, et fond génétique maitrisés) dans des conditions d’élevage standardisées (environnement, nutrition, intervention humaine) est un élément qui permet également de réduire la variabilité interindividuelle, et donc de réduire les effectifs nécessaires dans l’étude. Nous utiliserons des tests statistiques permettant d’identifier les différences significatives entre les groupes expérimentaux, ce qui permet enfin de mener des études conformes sur des effectifs réduits. En l’absence de données dans la littérature, les expériences pharmacologiques à mener imposent de tester différentes doses de différents agents pharmacologiques. Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires au projet, les concentrations les plus faibles pour chaque agent pharmacologique seront étudiées en premier. Si celles-ci s’avèrent suffisantes pour conclure quant à l’implication de la voie de signalisation antagonisée (différence significative par rapport au lot contrôle), les autres concentrations ne seront pas testées.

Raffinement

Depuis l’arrivée des animaux au laboratoire, tout est mis en place pour réduire la souffrance et l’angoisse des animaux (manipulation par les personnes compétentes, calme dans les pièces). Les animaux seront élevés dans un environnement enrichi et placés dans une pièce en cycle jour-nuit 12h-12h. L’enrichissement de l’habitat sera fait grâce à des dômes de nidation et de carrés de coton qui permettent l’expression de comportements innés et favorisent la protection des animaux. Après réception des animaux, une semaine d’acclimatation sans intervention d’expérimentateurs sera respectée pour que les animaux puissent s’habituer à leur nouvel environnement et au personnel. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse. Du matériel stérilisé sera utilisé. Un traitement analgésique et antiinflammatoire sera donné en pré-opératoire, ce qui réduit la douleur post-opératoire. Une voie anesthésiante locale sera réalisée avant incision. Un traitement analgésique et antiinflammatoire post-chirurgical sera donné pendant 2 jours après chirurgie. La chirurgie sera réalisée en maintenant la température corporelle (tapis chauffant). Un gel oculaire sera appliqué pour éviter le dessèchement des yeux pendant l’opération. Le champ opératoire sera filmé avec un microscope et l’opération sera suivie sur un écran afin d’augmenter la précision des gestes chirurgicaux. Des lampes froides seront utilisées pour éclairer le champ opératoire. Une injection de liquide physiologique sera administrée dans la cavité abdominale en fin d’opération pour réhydrater les animaux et favoriser l’élimination des toxines. Après opération, les animaux seront allongés dans des cages de réveil chauffées puis transférés dans leur cage individuelle standard avec enrichissement du milieu (dôme de nidation et coton). Des croquettes humides seront disposées sur la litière. Habituellement, cette chirurgie n’entraine pas de mortalité postopératoire et montre un retour au poids normal après 2 jours. L’équipe maîtrise la chirurgie stéréotaxique chez le rongeur, comme en attestent des publications depuis plus de 20 ans, et elle a installé un environnement technique dédié qui fait référence (vidéo-monitoring, développement de masque anesthésique spécifique, gestion de la douleur, etc). Ce savoir-faire accroît le raffinement des procédures. Une surveillance particulière quotidienne (2x par jour, avec inspection approfondie) sera faite pour s’assurer du bien-être de chaque individu.

Choix des espèces

La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. Cet animal nous permet d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les expériences seront réalisées sur des souris C57BL/6J jeunes adultes, âgées de 8 à 12 semaines. Cet âge correspond aux coordonnées fournies par l’atlas stéréotaxique de la souris.

940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection intramusculaire d'un composé myotoxique sous anesthésie pour léser le muscle, certaines des injections de tamoxifène et un suivi par imagerie, avant mise à mort par surdose d'anesthésique et perfusion d'un fixateur. Le porteur étudie la régénération musculaire et les dépôts fibro-adipeux des myopathies, avec des retombées thérapeutiques présentées comme potentielles. Il décrit des méthodes in vitro de réduction, cellules immortalisées et mini-muscles humains, mais conclut qu'une validation in vivo reste "indispensable".

Objectifs

Ce projet a pour but d’étudier les mécanismes impliqués dans le processus de régénération du muscle squeletique sain ou pathologique chez la souris. Le muscle adulte est capable de régénérer suite à des lésions, grâce aux cellules souches musculaires (cellules satellites), ainsi qu’à l’action coordonnée des plusieurs autres cellules, parmi lesquels les macrophages, les vaisseaux sanguins, et des cellules que nous appelons « progéniteurs fibro-adipogéniques » (ou FAPs), composants clés du tissus-conjonctif musculaire. Chez un individu adulte sain, ce processus permet de maintenir la masse musculaire en réparant les microlésions liées à l’activité musculaire normale ou les lésions aigues induites par des blessures physiques. Le processus de régénération est dysfonctionnel dans divers pathologies du muscle, conduisant à une fonte musculaire accompagnée d'infiltrations de tissus fibreux et adipeux. Ces infiltrations résultent d’un comportement anormal des FAPs, qui prolifèrent en exces et se transforment en fibrose ou en adipocytes. Cette multiplication des FAPs et la transformation fibroadipeuse sont normalement inhibées dans un muscle sain, et cette protection est perdue dans certaines myopathies (comme la dystrophie Duchenne, ou la dystrophie facioscapulohumérale (FSHD)). Nous cherchons à identifier les molécules participant à cette protection naturelle. Partie 1 : Nous explorerons la contribution à ce processus du gène FAT1, dont nous avons précédemment identifié l’influence clé sur la croissance et la forme de sous-groupes de muscles pendant l’embryogénèse, et dont nous avons montré que le dysfonctionnement se produisait dans la FSHD. Nous examinerons comment l’inactivation du gène FAT1 dans les FAPs chez la souris perturbe la régénération musculaire induite par une lésion, et evaluerons si elle conduit à l’apparition de dépots fibro-adipeux. Partie 2 : Grace à une recherche de candidats basée sur des données publiées issues de modèles humains et murins de dystrophies musculaires, nous avons identifié des molécules caractéristiques des FAPs, produites en quantité augmentées ou réduites dans les pathologies musculaires avec infiltrations fibro-graisseuse. La liste de candidats sera complétée avec les résultats de la partie 1. Nous testerons l’implication de ces candidats dans les formations fibro-adipeuses, en etudiant leurs fonctions a) in vitro dans des cultures primaires de FAPs de souris ; puis b) in vivo chez la souris.

Bénéfices attendus

L’apparition de dépots fibro-adipeux dans les myopathies marque un stade de non-réversibilité des symptomes. Ces dépots changent les propriétés physiques du muscle, et compromettent l’efficacité du processus régénératif, non seulement spontanné, mais aussi thérapeutique, en empêchant de nouvelles fibres de s’intégrer ou même de se contracter. Ainsi, il est essentiel d’identifier les moyens de bloquer l’apparition ou la progression des dépots fibro-adipeux, afin de retarder l’évolution des symptomes chez les patients, et leur permettre de bénéficier de thérapies inovantes. Partie 1 : L’identification d’un gène tel que FAT1, régulant le développement et la régénération des muscles, et dont nous suspectons que le dysfonctionnement participe à l’apparition des symptomes de la FSHD, a fourni une nouvelle cible thérapeutique potentielle. Divers éléments permettent d’anticiper que l’inhibition de FAT1 dans les FAPs sera détrimentaire au fonctionnement normal des FAPs, pourrait empecher une bonne régénération et favoriser l’apparition de dépots fibro-adipeux dans les muscles lésés. En confirmant cette hypothèse et clarifiant les mecanismes, nos résultats feront émerger de nouvelles options thérapeutiques qui pourraient à terme, bénéficier aux patients. Partie 2 : Le projet permettra d’identifier, parmi les protéines présentes dans les FAPs et produites en quantités anormales dans les pathologies avec dépots fibro-adipeux, ceux qui sont responsables de la formation de tels dépots. Nous obtiendrons dans un premier temps la preuve de principe que reproduire un changement observé dans les pathologies est suffisant pour induire ces dépots. Dans un deuxieme temps, nous déterminerons si corriger une ou plusieurs anomalies dans les modèles de pathologies (in vitro, puis in vivo) est suffisant pour empêcher, retarder ou ralentir la formation des dépots fibro-adipeux. Pour toute molécule remplissant ces deux critères, la correction (deuxième étape) est susceptible d’améliorer les symptomes musculaires chez les patients, et de maintenir les muscles dans un état leur perméttant de bénéficier de thérapies innovantes favorisant la formation de nouvelles fibres saines et fonctionnelles.

Procédures

Le projet comporte 3 procédures, impliquant de 2 à 4 étapes. La procédure de lésion par injection intramusculaire (concerne toutes les souris) est une chirurgie faite sous anésthésie générale, et permettant une injection intramusculaire ciblée d'un composé myotoxique. Elle dure environ une heure, et ne sera effectuée qu'une seule fois pour chaque animal, sur tous les animaux impliqués dans le projet. Etapes ne concernent que des sous-groupes d'animaux. - injection en IP de Tamoxifen (modèles inductibles), une à 5 injection par animal, une fois tous les 2 jours (ou une seule injection lorsque pratiquée à P1). - suivi longitudinal par imagerie non invasive (étape sous anesthésie, procédure 3, répétée 3 à 5 fois pour chaque animal), - Mise à mort par surdose d’anesthésique suivi d’une perfusion intracardiaque de PFA : procédure sans réveil faite sous anesthésie profonde, une seule fois par animal. Gestes visant à réduire la souffrance : Anesthésie (injection IP), injection sous-cutanée d’antalgiques ou d’anesthésie locale. Ces gestes sont pratiqués en préparation de la chirurgie/Lésion, ainsi qu’avant la procédure de mise à mort par perfusion.

Impact sur les animaux

L’injection dans le muscle de composés myotoxiques induit une blessure limitée dans le temps et restreinte au seul muscle injecté. Pendant 3-4 jours, une inflammation (nécessaire pour la cicatrisation) se produit au niveau du site d’injection, puis s'estompe d'elle même. L'expérience a un impact limité sur les conditions de vie de la souris, même lorsque les modifications génétiques étudiées compromettent l'efficacité de la réparation. Dès le lendemain, les souris ont récupéré une activité/locomotion normales. Le fait d'utiliser des modèles génétiques dits « inductibles » (déclenchement par le Tamoxifen) evite que les effets des modifications étudiées commencent avant le demarrage de la procédure expérimentale. Toutes les lignées nécessaires au projet sont élevées dans notre animalerie, et les cohortes expérimentales sont produites par croisements. Les lignées utilisées ne présentent aucun phénotype dommageable lorsque maintenues séparément. Lorsque ces lignées sont combinées : 1) les lignées utilisées pour visualiser les cellules mutantes (grace à un marquage par une protéine fluorescente) ou pour rendre les cellules modifiables par les adenovirus, n’ont pas d’effets dommageables car les protéines introduites n’ont pas de cibles naturelles chez la souris. 2) L’utilisation des systemes inductibles par le Tamoxiden permet que la modification génétique désirée ne commence qu’au démarrage de l’expérience. Il n'y a donc ni douleur ni souffrance avant la procédure expérimentale. L’expérience est terminée en maximum 3 semaines (les douleurs locales étant limitées aux 3 premiers jours), et est écourtée en cas de problemes inattendus. Nous n’attendons pas d’anomalies majeures ailleurs que dans le muscle. 3) Certaines souris utilisées présentent de légères anomalies de forme de certains muscles, non-dommageables car les muscles affectés ne sont pas vitaux (le diaphragme n’est pas touché). Ces souris ont une durée de vie normale, et ne présentent aucun signe de souffrance. 4) Le modèle de souris FSHD a été choisi pour son caractère inductible, limitant la toxicité de la proteine DUX4 (agent causal de la FSHD), à la durée de l’expérience. Même le Tamoxifen devait déclencher dans ces souris des anomalies en dehors du muscle, cela se produira dans le temps de l’expérience, et nous veillerons à écouter le suivi longitudinal si nécessaire, et les expériences effectuées pourraient (de par leur objectif) identifier un moyen de diminuer ces anomalies.

Devenir

La procédure se termine par une mise à mort des animaux visant à prélever les tissus (muscle lésé, ainsi que certains organes supplémentaires). Ces tissus sont soit fixés pour de l'histologie, soit dissociés afin de mettre les cellules en culture. En conséquence tous les animaux utilisés pour ce projet sont mis à mort à l'issue de la procédure.

Remplacement

1) Afin d'éviter des expériences inutiles chez l'animal, nous commençons par exploiter des données publiques déjà disponibles (analyses déjà publiées de biopsies de patients ou de modèles « souris ») pour identifier des mecanismes potentiellement responsables du remplacement de la masse musculaire par des dépots fibro-adipeux dans les pathologies musculaires. 2) Le projet implique une étape basée sur des cultures de cellules isolées à partir de souris. Afin de limiter au maximum l’étape d’isolement à partir de souris, nous développons une méthode alternative utilisant des cellules « souches » humaines (lignées déja établies par d'autres laboratoires), dont le caractère « souche » permet une utilisation répétée/prolongée. En mimant in vitro les étapes du développement du muscle, nous induirons la formation de « mini-mucles » reproduisant autant que possible le contexte physiologique. Une fois optimisée, cette approche sera une alternative efficace pour remplacer les cellules de souris et pour toutes les études-pilotes concernants la compréhension des mécanismes en jeu. 3) Une fois que nous aurons identifié in vitro des molécules susceptibles d’être responsables de l’apparition des dépots fibro-adipeux dans les muscles malades, et que nous aurons montré avec succès que contrer leur action a un effet thérapeutique, il sera néanmoins nécessaire de valider ces résultats in vivo, en passant par un modèle animal. En effet, les modèles in vitro (cellules de souris ou mini-muscles humains), aussi puissants soient ils, ne reproduisent pas l’ensemble des événements mis en jeu dans la réparation musculaire normale ou pathologique. Il est difficile par exemple de reproduire le contexte de la blessure, de l’inflammation, de l’irrigation sanguine, et l’influence du métabolisme des individus malades. Ainsi, un mécanisme efficace in vitro pourrait s’avérer inefficace chez l’animal ou chez l’homme. Il est donc indispensable de déterminer, parmi les approches validées in vitro, lesquelles sont les plus susceptibles d’être efficaces chez l’homme en passant par une étape en modèle animal. Cette validation ne portera cependant que sur des cas pour lesquels nous aurons obtenu une preuve de principe in vitro, limitant largement l’ordre de grandeur des tests in vivo.

Réduction

1) La manière dont nous procédons pour l’histologie (partie 1) permet qu’un même échantillon soit réutilisé pour plusieurs analyses, réduisant ainsi le nombre d'animaux. En effet les tissus prélevés (muscles) sont divisés en plusieurs fragments congelés/stockés séparéments. Sur chaque fragment de tissus, nous réalisons des coupes alternées sur plusieurs séries de lames histologiques. Nous réalisons une base de données permettant l’optimisation de l’utilisation de ces échantillons/lames. Ainsi, un seul muscle d’un seul animal peut servir à des dizaines de tests différents. Une seule cohorte d’animaux (comprenants les souris étudiées et les controles adequats) suffit pour réaliser l’ensemble de l’étude pour un stade donné d’analyse. Les nombres d’animaux dans chaque cohorte (5-10 souris par lot (incluant males et femelles)) sont nécessaires pour l’obtention de résultats statistiquement robustes (tests statistiques considérés significatifs si p

Raffinement

1) Les souris sont hébergées en cages ventilées, avec enrichissement (dôme ou rouleau de carton + baton de papier ou carré de coton pour nidification). Elles sont suivies quotidiennement pour vérifier la nouriture et l'eau, ainsi que leur état de santé et leur bien être. 2) Pour la chirurgie, les souris sont anesthésiées par injection intra-péritonéale. Au préalable, elles recoivent des prémédications visant un effet antalgique (30 minutes avant l'anesthésie) at une anesthésie locale. La peau au niveau de la zone à opérer est rasée et aseptisée par application de solution antiseptique. 3) Nous avons défini des points limites nécessitant interruption anticipée d'une procédure: Une perte de poids dépassant 20% par rapport au poids de reference (poids à l'entrée dans la procédure) est considérée comme limite au dela de laquelle l'expérience est interrompue et l'animal est euthanasié. Par ailleurs, comme un des produits utilisés peut, dans de rares cas, liés au lot ou à la préparation, s’avérer toxique et déclencher une inflammation dans le foie, nous surveillerons le poid des animaux après injection, et fixons à 15% de perte par rapport au poids initiale la limite au dela de laquelle ces effets secondaires sont susceptibles d’interférer avec l’expérience. Dans ce cas, les animaux seront exclus de la cohorte et mis à mort. D'autres parametres d'exclusion sont: pelage hérissé; infection de la cicatrice; immobilité et indifférence à l'environnement, tremblements. 4) Nous utiliserons des tests statistiques adequats pour les comparaisons entre cohortes d’animaux (cohortes test et controles appropriés, males/femelles, differentes approches) avec 5 à 10 souris par cohorte et par stade d’analyse.

Choix des espèces

La souris est un modèle particulièrement adapté à l'étude de la regeneration du muscle. La dynamique du processus est bien connue suite à différents modèles de lésions (cardiotoxine, brulure au froid, glycerol, barium, ces modèles différant légèrement les uns des autres). La regeneration est rapide, et complete en 3 semaines, sans séquelles dans des souris sauvages. La souris permet l'utilisation de modèles génétiquement modifiés élaborés de telle sorte qu'il soit possible de definir précisément le type cellulaire dans lequel un gène est modifié et le moment à partir duquel cette modification est déclenchée. Ceci permet de limiter le dommage au seul organe/tissus considéré. L'utilisation des modèles génétiquements modifiés ainsi que des vecteurs adénoviraux permet d'explorer les mécanismes génétiques et de tester l'effet de nouvelles modifications génétiques, et d'evaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Aucun modèle cellulaire/ex-vivo humain ne reconstitue l’environnement du muscle suffisamment pour valider la pertinence in vivo d'un mécanisme ou d'une option thérapeutique. Stades d’utilisation : 1) L’Induction par le Tamoxifen (modèles inductibles) est faite soit 1 jour après la naissance (P1), soit au stade adulte, un peu avant et juste après la lésion. Pour obtenir une meilleure efficacité de recombinaison, il est justifié d'acriver la CRE au moment coincidant à un pic d'expression (nombre de cellules et intensité) de la lignée CRE utilisée, basée sur le territoire d’expression du gène PDGFRA. PDGFRA est fortement exprimé pendant la première semaine après la naissance. Chez l’adulte, PDGFRA est produit par les FAPs, mais ces derniers sont « dormants », et en faible nombre. La lésion provoque une augmentation de l’intensité d’expression, et active fortement la multiplication des FAPs. En conséquence, le meilleur moment pour activer la lignée avec le Tamoxifen est juste au moment de la lésion. 2) injection intra-musculaire (lésion/Adenovirus) : Souris Adultes (3 à 6 mois). 3) Suivi longitudinal de la lésion (par imagerie bioluminescence), à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions, pour suivre l'évolution de la régénération musculaire dans une fenetre correspondant aux résultats de la litérature, et pour évaluer l'impact des conditions expérimentales sur l'apparition d'infiltrations fibro-adipeuses. 4) mise à mort (à l’issue du suivi longitudinal ou à un stage post-lésion donné (à 3, 5, 7, 14 et 21 jours après lésions

1 056 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mères reçoivent des prébiotiques pendant la gestation, subissent des traites de lait sous anesthésie et des prélèvements, tandis que la descendance femelle est sensibilisée par injections d'allergène puis soumise à un gavage déclenchant une réaction allergique, avec prise de température rectale. Le porteur relie l'étude à un essai clinique en cours chez des femmes enceintes allergiques et cherche des biomarqueurs de tolérance. Il affirme qu'il est "impossible" de reproduire in vitro le microbiote et le système immunitaire intestinaux.

Objectifs

Les maladies allergiques affectent 30 à 40% de la population mondiale, et l’augmentation globale de leur prévalence en font à ce jour un enjeu de santé public. Les allergies alimentaires (AA) représentent environ 6% de la population industrialisée et elles sont souvent associées à des allergies cutanées comme la dermatite atopique (DA). Les réactions dues aux AA peuvent être systémiques et engendrer des chocs anaphylactiques. Elles sont détectables dès les premiers mois de vie et peuvent perdurer chez l’adulte. Le rôle précoce d’une anomalie de diversité du microbiote a été récemment mis en évidence ainsi qu’un dysfonctionnement au niveau des barrières épithéliales intestinales et du système immunitaire. L’origine du développement des AA est multifactorielle (facteurs génétiques, mode de vie, environnement extérieur, etc…) et dépend notamment du régime alimentaire. Aujourd’hui, il n’existe aucune stratégie thérapeutique préventive du développement de l’AA chez l’enfant. Or, la grossesse représente une fenêtre d’intervention optimale dans la régulation du processus allergique à travers une modulation des systèmes immunitaire et microbien du fœtus, ce qui en fait une piste prometteuse pour la prévention de l’AA. En effet, notre étude préclinique a montré chez la souris une diminution de l’AA après une exposition aux prébiotiques durant la gestation et l’allaitement. L’objectif de ce projet sur 5 ans est de comprendre les mécanismes physiologiques, cellulaires et moléculaires de l’effet préventif des prébiotiques sur l’AA dans un modèle murin pour identifier des biomarqueurs précoces de la mise en place de la tolérance induits par les prébiotiques administrés pendant la gestation, qui pourrons être alors investigués chez l’homme dans notre étude clinique PREGRALL. PREGRALL évalue l’effet préventif de la supplémentation en prébiotique chez la femme allergique pendant la grossesse sur l'apparition de l’allergie alimentaire et la dermatite atopique chez des enfants à 1 an. (L’étude PREGRALL est financée par le PHRC-I 2015 et a démarré en février 2018).

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet préclinique sont d’identifier chez la souris des biomarqueurs associés à la supplémentation en prébiotiques pendant la gestation chez la mère et d’identifier les biomarqueurs associés à la protection de la survenue de l’allergie alimentaire chez la descendance. Ces biomarqueurs pourraient ainsi être investigués chez l’homme dans notre étude clinique PREGRALL. En effet en 2018, nous avons lancé le premier essai clinique au monde évaluant la supplémentation en prébiotique chez la femme allergique pendant la grossesse sur l’apparition de l’allergie alimentaire et la dermatite atopique chez les enfants à haut risque d’allergie. PREGRALL, financé par le ministère de la Santé, recrute 376 femmes enceintes allergiques. Les participantes sont randomisées pour recevoir une supplémentation en prébiotiques ou en placebo, à partir de 20 semaines d’aménorrhée jusqu’à l’accouchement. Le critère principal est l’apparition de la dermatite atopique associée ou non à l’allergie alimentaire chez les nourrissons à un an. PREGRALL nous permet de mettre en place une étude mécanistique ancillaire grâce à une bio-collection d’échantillons réalisée au cours du protocole clinique (sang, selle, lait, placenta, écouvillons jugaux), CIMMAP. CIMMAP vise à améliorer la compréhension de la physiopathologie de l’allergie, les mécanismes d’action des prébiotiques et à identifier les biomarqueurs précoces de la pathologie ou de mise en place de la tolérance induits par les prébiotiques.

Procédures

Les souris reproductrices femelles et mâles seront mises en reproduction sur 1 semaine. Deux prélèvements de lait seront réalisés sur les souris reproductrices femelles à 10 jours d’intervalle.Un prélèvement de sang sera réalisé sur les souris reproductrices femelles en fin de protocole. Six prélèvements de fèces seront réalisés sur les souris reproductrices femelles à 10 jours d’intervalle en moyenne entre chaque prélèvement. La descendance femelle sera soumise à 2 injections intrapéritonéales espacées de 10 jours et d’un gavage oral en fin de protocole. Un prélèvement de sang sera réalisé sur la descendance femelle en fin de protocole. Quatre prélèvements de fèces seront réalisés sur la descendance femelle à 10 jours d’intervalle en moyenne entre chaque prélèvement.

Impact sur les animaux

Lors du prélèvement de lait chez les souris reproductrices femelles, la traite au niveau des tétines pourrait induire une irritation. De plus, pour le prélèvement de lait, les souris seront anesthésiées. Lors de l’injection intrapéritonéale de l’allergène, une petite lésion au niveau de l’introduction de l’aiguille peut avoir lieu. Lors du gavage oral (challenge avec l’allergène pour déclencher les symptômes de l’allergie alimentaire), une irritation de la gorge et/ou de l’œsophage peut avoir lieu rendant la déglutition difficile. Lors de la prise de température rectale pour mesurer la chute de température induite par la réaction allergique, une irritation du colon peut avoir lieu.

Devenir

Mise à mort des animaux afin de récupérer les différents tissus nécessaires à l’étude physiologique, immunologique et du microbiote suite à la supplémentation en prébiotique et à l’induction de l’allergie alimentaire.

Remplacement

Impossible de prendre des mesures de remplacement. Il est impossible de reproduire efficacement les systèmes biologiques très complexes que sont le microbiote et le système immunitaire intestinaux in vitro ou in silico et ce notamment dans le cadre d’interactions complexes comme ici avec des prébiotiques et leur influence au cours de la période prénatale.

Réduction

Le modèle animal utilisé a été conçu pour permettre de réduire un maximum le nombre d’animaux du fait de la connaissance et de la précision des paramètres observés. Pour évaluer l’impact des prébiotiques sur les nouveaux nés, le projet étudiera 3 conditions, les mères avec une alimentation standard (160) et avec une alimentation supplémentée en prébiotique HMO (160) ou GOS/Inuline (160). A l’issu de la reproduction nous obtiendrons 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime contrôle, 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime HMO et 96 souriceaux femelles issus de mères sous régime GOS/Inuline. Les 96 souriceaux femelles de chaque groupe seront divisés en 2 : 48 souris sensibilisées par voie intrapéritonéale et 48 souris non sensibilisées considérées comme le contrôle négatif intrapéritonéale. Le nombre de reproducteurs a été sélectionné en fonction de l’efficacité de reproduction, du nombre de petits issus de chaque portée, du rapport mâle/femelle obtenu à l’issu de la gestation. Ces nombres permettront d’être statistiquement significatif pour réaliser des tests quantitatifs de comparaison : Anova, Kriskal-Wallis, Mann & Whitney ou t de Student.

Raffinement

Hébergement adéquate, ajout d’au moins 2 enrichissements (dôme, tuyau, coton), utilisateurs expérimentés et qualifiés, utilisation d'anesthésique et tapis chauffant pour les prélèvements de lait. L’observation quotidienne des souris permet de détecter un changement de comportement. Si une souffrance de l’animal est détectée et jugée trop importante, alors la souris sera euthanasiée sans délais. Si un seul signe clinique sévère ou 2 signes notables sont détectés, alors le responsable de la SBEA et le responsable de l’étude seront prévenus et la souris sera sacrifiée sans délais. Les signes spécifiques et notables sont les suivants : -Notables : aspects extérieurs : pelage sale, pâleur (yeux, oreille, peau), position recroquevillée, faciès contracté, yeux larmoyants. A la manipulation : réticence à se déplacer, zone urogénitale souillée. Evolution pondérale : perte de poids à 10%.

Choix des espèces

D’après la bibliographie, les modèles murins d'allergie alimentaire (Bouchaud & al. 2016 ; Gourbeyre & al. 2011) sont ceux se rapprochant le plus de la pathologie humaine. Ce modèle est bien établi dans la littérature et dans notre laboratoire. Nous avons débuté notre modèle sur les femelles Balb/cj et afin de rester cohérent dans nos études, nous souhaitons continuer à utiliser ce modèle. Les souris reproductrices femelles seront âgées de 4 semaines à leur arrivée à l’animalerie. Après 2 semaines d’acclimatation, donc à 6 semaines de vie, elles seront mises en reproduction pendant 1 semaine car c'est à 6 semaines que les souris femelles atteignent leur maturité sexuelle. Les souris reproductrices mâles seront âgées de 6 semaines à leur arrivée à l’animalerie. Après 2 semaines d’acclimatation, donc à 8 semaines, elles seront mises en reproduction pendant 1 semaine car c’est à 8 semaines que les mâles atteignent leur maturité sexuelle. Les souriceaux seront séparés des mères à 3 semaines de vie correspondant au sevrage. Les souriceaux femelles seront acclimatés 1 semaine et le début du protocole de sensibilisation aura lieu à 4 semaines de vie pour la première injection intrapéritonéale puis à 5 semaines de vie pour la 2ème injection intrapéritonéale. Une semaine après, donc à 6 semaines de vie, nous réaliserons le gavage oral pour déclencher les symptômes de l’allergie. Le protocole d'induction d'allergie commence à 4 semaines de vie car c'est l'âge le plus pertinent pour l'induction de l'allergie et ce modèle d'induction à 4 semaines de vie a été décrit comme un bon modèle d'induction d'allergie dans l'article de Selle et al., 2022 : Prebiotic Supplementation During Gestation Induces a Tolerogenic Environment and a Protective Microbiota in Offspring Mitigating Food Allergy. Les souriceaux mâles seront acclimatés 1 semaine et les études comportementales seront réalisées durant les 2 semaines suivantes car c’est à partir de 4 semaines de vie que la mémoire de la souris peut être étudiée.

160 souris d'une lignée génétiquement modifiée vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié reçoit des antibiotiques dans l'eau de boisson pendant huit semaines pour supprimer leur microbiote, toutes subissent des jeûnes de six heures, des prélèvements sanguins répétés à la queue et des gavages, avant mise à mort pour trier les cellules intestinales. Le porteur étudie l'effet des bactéries intestinales sur les hormones digestives, avec une application humaine dans l'obésité et les maladies inflammatoires présentée comme lointaine. Il indique que la déplétion du microbiote produit "a priori peu d'effets indésirables" et affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'interaction entre bactéries et intestin.

Objectifs

Les intestins sont un organe majeur pour la santé car ils sont à l’interface entre alimentation, les bacteries intestinales et l’organisme. L’intestin permet notamment la digestion et l’absorption des aliments, tout en faisant barrière aux microbes et aux toxines. L’intestin produit également des produits (hormones) qui régulent les fonctions de différents organes, modulant ainsi par exemple le comportement alimentaire, la régulation énergétique ou les fonctions intestinales (transit intestinal, digestion…) elles-mêmes. Ces hormones sont produites par des cellules intestinales spécifiques, appelées cellules entéroendocrines. Ces cellules jouent le rôle de senseurs, libérant les hormones en réponse à des modifications de leur environnement Des modifications des fonctions intestinales et notamment des hormones intestinales sont associées à différentes maladies telles l’obésité ou des maladies digestives. Ces maladies sont également associées à une modification des bactéries intestinales. Notre travail de recherche vise à mieux caractériser comment les bactéries de l’intestin influent sur les hormones intestinales et les cellules qui les produisent. Dans ce projet, nous éliminerons les bactéries intestinales par l’action d’antibiotiques, mesurerons le niveau des hormones et analyserons précisément ces cellules grâce à l’utilisation de souris exprimant une fluorescence associée à ces cellules et permettant de les isoler.

Bénéfices attendus

Le rôle de l’intestin et en particulier des hormones intestinales pour la santé de l’homme apparait comme étant très important, en particulier dans l’obésité ou les maladies inflammatoires l’intestin, qui touchent plus de 650 millions d’individus à travers le monde. Un lien entre microbes et les cellules produisant les hormones intestinales a déjà été établi. Cette étude nous permettra d’identifier plus précisément comment les cellules produisant les hormones intestinales sont impactées lors de la suppression du microbiote intestinal. Pour cela, nous utiliserons un modèle de souris permettant de trier cette population cellulaire rare, et mesurerons les niveaux d’hormones après différentes stimulations. Cela nous permettra d’identifier comment ces cellules sont régulées. Compte tenu du rôle important de ces hormones, ce projet permettra de proposer de nouvelles voies modulant leurs niveaux lorsque les fonctions de ces hormones sont altérées, dans le but à terme de prévenir et/ou guérir des maladies.

Procédures

La moitié des animaux recevra un mélange d’antibiotiques dans leur eau de boisson pendant toute la durée de la procédure, soit 8 semaines, conduisant à la déplétion de leur microbiote intestinal. Pour mesurer les niveaux des hormones et les activités des cellules produisant ces hormones, trois tests métaboliques seront réalisés, espacés de 15 jours, sur tous les animaux. Un test métabolique permet de mesurer l’effet d’un stimulus particulier sur l’animal, notamment au niveau intestinal en comparant l’animal avant et après ajout du stimulus. Chaque test comporte une phase de jeun (6h), trois prélèvements sanguins, un avant l’administration du stimulus, et deux après, à 5 et 15 minutes respectivement après l’administration pour un volume total de 150µLet un gavage par voie orale ou une injection en intrapéritonéal, permettant de mesure la libération des hormones en réponse au stimulus. La durée d’un test métabolique n’excède pas une heure entre la première prise de sang et la dernière. Des mesures de transit intestinal par gavage (au maximum trois par animal, deux au cours de l’expérience (avec un suivi pendant 48h) et un au moment de la mise à mort (gavage une heure avant) seront également réalisées pour mesurer les fonctions intestinales, ainsi que des prélèvements de sang avant la mise à mort et la récupération des tissus intestinaux.

Impact sur les animaux

Ce protocole produit a priori peu d’effets indésirables sur les animaux : la consommation des antibiotiques dans l’eau de boisson a déjà été pratiquée à de nombreuses reprises sans impact sur la santé et le comportement des animaux, les antibiotiques étant introduits séquentiellement pour éviter tout rejet par néophobie. Les animaux seront conservés en groupe et manipulés régulièrement. Le gavage oral et la prise de sang à la queue seront réalisés par des personnes compétentes, avec des temps de manipulations réduits. Les prises de sang séquentielles se faisant de manière rapprochées, une seule incision à la queue est nécessaire pour réaliser le prélèvement. Les jeûnes seront limités dans le temps, induisant une perte de poids réduite qui est en général rattrapée les jours suivants. Les souris seront suivies pendant l’heure qui suit l’administration des stimuli puis pendant le reste de l’expérimentation pour s’assurer qu’aucun n’induit d’effets indésirables, aucun n’effet étant attendu sur le type de stimuli testés.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort afin de récolter leurs tissus pour l’isolement des cellules produisant les hormones intestinales par tri cellulaire. Les fonctions des cellules pourront alors être analysées par différentes techniques

Remplacement

L’utilisation de souris pour cette expérimentation est nécessaire par l’impossibilité d’étudier in vitro ou de modéliser l’interaction entre les bactéries et l’intestin. La lignée de souris utilisée permettra d’étudier spécifiquement les fonctions des cellules entéroendocrines, ce qui n’est pas possible dans un autre modèle. Les intestins récupérés dans ces expérimentations serviront à la production de culture de cellules intestinales (organoïdes intestinaux) qui seront utilisés dans des projets ensuite pour étudier (1) le développement de l’épithélium intestinal issu de souris déplétées en microbiote et (2) la réponse des cellules entéroendocrines à des produits spécifiques, notamment produits par les bactéries.

Réduction

160 animaux au total répartis en 20 lots seront utilisés dans ce projet, répartis en 10 procédures. Chaque procédure incluera un lot de 8 souris traitées par antibiotiques et un lot contrôle de 8 souris non traitées et sera effectuée sur des animaux de même sexe pour tester l’effet de trois stimuli et récupérer les tissus pour un usage spécifique. 5 procédures différentes permettront de tester au total 15 stimuli de cellules entéroendocrines (par exemple, glucose, mélange d’acides aminés et protéines, acides gras, produits microbiens..), ainsi que pour récupérer les tissus intestinaux des souris pour différents usages, un seul tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage lors du tri cellulaire (transcriptomique, peptidomique, génération d’organoides, histologie…). Les procédures seront reproduites sur les femelles et les mâles.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum et seront hébergés à plusieurs par cage. L’hydratation, notamment lors de l’introduction des antibiotiques, sera surveillée et si nécessaire, l’ajout d’antibiotiques sera modifié pour permettre une meilleure tolérance. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole. Les animaux seront observés quotidiennement et pesés (ainsi que leur ingéré alimentaire) 2 fois par semaine. Une grille de décision (points limites) est établie et permet d’agir de façon appropriée en cas d’apparition de signes de souffrance chez un animal, Les volumes de gavage seront adaptés aux poids des animaux, avec un maximum de 10µL/g et celui-ci sera pratiqué par des expérimentateurs entrainés à la contention et au gavage. Les animaux seront habitués à être manipulés avant et pendant toute la durée de l’expérimentation afin de diminuer leur stress lors de la contention et les prélèvements. Les souris seront au moins 2 par cage pour éviter l'isolement. Une grille de score de bien être permettra de suivre régulièrement chaque animal individuellement en prenant en compte son aspect général, son poids et son comportement. En cas de hausse modérée du score, un suivi plus attentionné sera réalisé avec l’ajout de nourriture plus facilement accessible. Dans le cas d’une forte dégradation du score les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Les souris utilisées sont issues d’une lignée génétiquement modifiée pour exprimer une protéine fluorescente dans toutes les cellules entéroendocrines. Cette lignée est un modèle particulièrement utile pour l’étude des cellules entéroendocrines, permettant de les trier ou de les distinguer facilement lors de l’analyse des tissus. Les procédures seront appliquées sur les femelles et les mâles avec un lot de souris traitées aux antibiotiques et un lot contrôle. Les procédures seront reproduites 5 fois pour tester différents stimuli et pour différents usages des tissus, chaque tissu ne pouvant être utilisé que pour un seul usage. L’étude portant sur les cellules entéroendocrines matures, des souris adultes (8 à 12 semaines au démarrage du protocole) seront utilisées.

3 322 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules ou de peau tumorale, puis des injections d'anticorps deux à trois fois par semaine pendant quatre semaines, les tumeurs pouvant croître jusqu'à un point limite fixé à 1 500 mm³. Le porteur teste de nouveaux anticorps anticancéreux et renvoie l'application clinique chez l'homme à un objectif lointain. Il affirme qu'il n'existe aucun système alternatif et que l'expérimentation in vivo a une valeur prédictive supérieure aux essais in vitro.

Objectifs

Avec l’objectif de développer de nouveaux médicaments anti-cancéreux, notre laboratoire s’attache à découvrir et valider des anticorps innovants dirigés contre des cibles impliquées dans différents types de cancer. Ces anticorps peuvent être sélectionnés pour leur capacité à s’attaquer aux cellules tumorales mais aussi à affecter simultanément les cellules se trouvant dans l’environnement de la tumeur et connues pour jouer un rôle crucial dans son développement. Notre projet va permettre de sélectionner et valider chez la souris de futurs candidats-médicaments en étudiant leur efficacité anti-tumorale ainsi que leur distribution dans l’organisme. Nos anticorps candidats seront systématiquement comparés aux traitements de référence déjà disponibles sur le marché ou en développement clinique avancé. En effet, il n'existe pas à ce jour d'autres moyens que l'expérimentation animale pour caractériser de façon fiable l'efficacité des anticorps. Dans le but d'appliquer strictement la règle des 3R et donc de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, seuls les anticorps ayant été validés au terme d’essais in vitro très exigeants en laboratoire, seront administrés aux souris. Ainsi, pour chaque cible identifiée et validée par notre Comité Médical, de 1 à 3 anticorps issus des pré-sélections in vitro seront testés ce qui représente au total, sur les 5 années du projet, un nombre maximal de 3232 souris.

Bénéfices attendus

L’objectif est de tester l'efficacité thérapeutique de nouveaux anticorps dans différents modèles murins porteurs de tumeurs cancéreuses. Les résultats de ces travaux permettront in fine de sélectionner des candidats-médicaments en vue de leur développement pour une utilisation en clinique humaine.

Procédures

Les souris seront soumises à une greffe de cellules par injection sous cutanée (20 secondes /souris y compris contention) ou à une greffe de peau sous cutanée avec chirurgie (20min/ souris y compris anesthésie). Elles seront traitées 2 à 3 fois par semaine pendant 4 semaines par injection intrapéritonéale (5 secondes /souris y compris contention) ou par voie intraveineuse (2 minutes /souris y compris contention) avec le traitement.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables attendus sont : - Signes de douleur, souffrance, angoisse, changement de comportement ou d’aspect physique liés à la cytotoxicité des anticorps ; - Douleur légère et immédiatement réversible au moment de l’injection/prélèvement.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés soit parce qu'ils ont atteint un des points limites définis pour chaque procédure, soit car l'expérimentation prend fin. En cours d'étude, tout animal démontrant une souffrance irréversible ou inacceptable sera immédiatement euthanasié.

Remplacement

Dans le processus de développement des médicaments, les études précliniques jouent un rôle fondamental. Elles font principalement appel à des expérimentations dans des modèles animaux, murins notamment. C’est un prérequis obligatoire pour justifier l’investigation clinique et la première administration chez l’Homme. Ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. Les processus tumoraux ainsi que les interactions des composants du système immunitaire avec les médicaments à base d’anticorps sont des processus complexes qui résultent de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires. De fait, ils sont difficilement modélisables in vitro ou ex vivo. Il n’existe pas à l’heure actuelle de systèmes alternatifs. L’objectif de notre projet étant de caractériser de façon fiable l'efficacité et la toxicité de nouveaux anticorps, notamment en étudiant leur impact sur le stroma tumoral et sur la modulation de l’activité anti-tumorale du système immunitaire, seule l’expérimentation animale peut répondre à notre objectif.

Réduction

Afin de réduire à son minimum le nombre de souris utilisées pour l’ensemble des études, les anticorps testés auront au préalable, été validés par une série de tests complets en laboratoire. De plus, 3 études de mise au point permettront de réduire au minimum le nombre d'animaux utilisé tout en disposant d'un nombre statistiquement suffisant. Dans le but de confirmer le nombre de souris nécessaires pour les études d’efficacité thérapeutique et de biodistribution, nous avons calculé via un logiciel de statistique un nombre de 10 animaux par groupe afin d'obtenir des résultats robustes. Les études pilotes n'utiliseront que 3 animaux / groupe, permettant d’optimiser les meilleures conditions à retenir pour les procédures expérimentales.

Raffinement

Pour la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures ont été mises au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats obtenus dans le strict respect du bien-être animal. Les points limites ont été établis dans chaque procédure expérimentale et le suivi clinique des animaux se fera sur la base de la fiche de scoring établie par la SBEA de notre Institut. Les souris seront surveillées quotidiennement y compris les week-ends et jours fériés : suivi du développement de la tumeur (point limite volume >1500 mm3 ou nécrose tumorale précoce), pesée (toute perte de poids ne devra pas excéder 20% du poids normal attendu de l’animal) et détection du moindre signe de souffrance et/ou de détresse de l’animal. En fonction des observations, des décisions allant de l’adaptation des conditions d’hébergement à l’injection d’analgésique jusqu’à une décision d’euthanasie, seront prises. D’autre part, une fiche de soins validée par la SBEA de notre Institut est utilisée pour la prise en charge des animaux.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour cette étude est la souris car elle est l’espèce qui est le mieux défini génétiquement et pour laquelle les données scientifiques de référence sont nombreuses, s’agissant notamment des études en immunothérapie. Dans le cas où les anticorps candidats médicaments testés ne reconnaîtraient pas la cible murine, nous pourrons être amenés à utiliser des lignées de souris transgéniques exprimant la forme humaine de la cible. Les souris seront âgées de 4 à 7 semaines à la réception (souris adultes). Après 1 semaine d’acclimatation en zone d’hébergement, les souris âgées 5 à 8 semaines subiront la greffe.