Souris
Rôle de facteurs de transcription dans la croissance, régénération et mécanotransduction musculaire chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage quotidien de tamoxifène pendant cinq à quinze jours, dont le porteur reconnaît le risque de perforation de l'œsophage ou de passage dans les poumons, subissent un test d'effort sur tapis roulant une heure par jour et un séjour de sept jours en cage métabolique isolée. À la fin, les 650 sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet étudie le rôle de deux facteurs de transcription dans la croissance musculaire, le porteur affirmant qu'aucun modèle cellulaire ne peut reproduire ce processus.
Objectifs
Le muscle squelettique est un tissu hautement spécialisé capable de se régénérer et de s’adapter à son environnement. La mécanotransduction se définit par la façon dont la cellule intègre le signal mécanique et le transforme en signal biochimique lui permettant de réagir, de s’adapter et même de modifier l’expression de ses gènes. Nous nous intéressons à 2 facteurs de transcription qui ont récemment été identifiés pour jouer un rôle clef dans la mécanotransduction dans divers tissus dont le muscle squelettique. De récentes données, montrent que ces 2 facteurs sont importants pour maintenir le bon fonctionnement du muscle squelettique adulte et la taille des organes car leur dérégulation peut conduire à un phénotype musculaire retrouvées dans différentes pathologies musculaires telles que les dystrophies musculaires. Notre objectif est de mettre en place pour la première fois des modèles de souris porteurs de 2 gènes non fonctionnels spécifiquement dans le muscle.
Bénéfices attendus
A terme ce projet permettra une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant à des désordres de croissance, de régénération et de respiration mitochondriale dans le muscle. Il permettra d’identifier de nouveaux biomarqueurs potentiellement impliqués dans d’autres pathologies musculaires et de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Procédures
Des souris seront soumises à des injections par gavage quotidiennement durant 5-15 jours pour induire l'inactivation de gènes spécifiques et seront ensuite mises à mort pour examen des tissus. Des souris seront soumises à un test d'effort musculaire à l'aide d'un tapis de course informatisé pendant 1H sur une période de 5 jours consécutifs pour évaluer les fonctions métaboliques dans le tissu musculaire. Des souris seront placées en cage métaboliques pendant 7 jours.
Impact sur les animaux
Certaines souris pourraient dévéloppées des problèmes de locomotion. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’oesophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. La mise en cages métaboliques des animaux pendant 7 jours peut générer un stress lié à l’isolement.
Devenir
A l'issue des Procédures, l'ensemble des 650 animaux seront mis à mort afin de collecter les organes postmortem pour analyses histologiques et moléculaires.
Remplacement
La croissance et régénération musculaire est un processus biologique complexe où de nombreux types cellulaires communiquent entre eux en 3 dimensions, aucun modèle cellulaire ne peut mimer à ce jour ces processus. Les modèles animaux sont nécessaires pour évaluer les altérations moléculaires à la base des maladies et les interactions avec les différents organes, le système immunitaire et les régulations hormonales. Les modèles in vivo permettent d’envisager des essais précliniques. Tous les gènes concernés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction. La souris est le modèle de choix pour introduire des mutations dans le génome des mammifères. Nous remplacerons dès que possible les expériences animales par des expériences in vitro.
Réduction
L'analyse de paramètres multiples par souris et l'utilisation de tests statistiques adaptés permettront de réduire le nombre de souris utilisées à son minimum. De plus, l’expérience du laboratoire montre qu’un groupe de 50 animaux est suffisant pour le test statistique choisi. Des groupes de 50 animaux seront donc utilisés. De plus, nous utiliserons un nombre minimal d'animaux pour avoir une puissance statistique (n= 650).
Raffinement
Le raffinement des conditions d’hébergement, d’élevage et de soins sera respecté par l’emploi de points limites précoces entraînant la mise à mort des animaux. Les souris bénéficieront d'un enrichissement constitué de coton et de « maisons » en carton. Les animaux sont observés tous les jours par le personnel qualifié pour assurer leur bien-être. Pendant les procédures, les responsables du projet tiendront une fiche d’observation des points limites tous les jours. Par ailleurs, toute procédure douloureuse ressentie par les souris entrainant une douleur, une souffrance ou une angoisse entrainera la mise à mort de l'animal. Le traitement au tamoxifen est donné sous forme de gavage quotidien qui sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des gavages sera réduit au minimum possible. Selon les seuils atteints, l’interruption de la procédure et la mise à mort anticipée de l’animal sera possible.
Choix des espèces
Voici plusieurs facteurs qui justifient le choix de la souris : 1) tous les gènes de la signalisation hippo jusqu’à présent identifiés sont conservés chez la souris et l’homme, ainsi que leur fonction ; 2) la souris est le modèle de choix pour les techniques qui visent à introduire des mutations dans le génome des mammifères ; 3) nous disposons également de nombreux outils (anticorps, vecteurs, méthodes) adaptés à la souris ; 4) la taille des souris, leur durée de vie, leur capacité reproductive est particulièrement adaptée à un programme de recherche de 5 ans. L’âge des animaux choisis pour l’induction au tamoxifen sera de 1 à 3 mois. Il est nécessaire que l’organogenèse soit terminée. L’âge de mise à mort sera choisi en fonction de l’âge de la survenue du phénotype musculaire attendus vers 1,5-4 mois.
Caractérisation comportementale et pharmacologique de trois modèles murins de stress chronique : évaluation de leur pertinence pour l’étude de la dépression
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3 120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de léger à sévère. Le modèle le plus sévère repose sur des agressions physiques répétées par des congénères, qui provoquent une douleur physique et psychique et un état de stress durable, et les souris passent une batterie de tests dont la nage forcée, la privation de nourriture et le test d'éclaboussement. Toutes sont ensuite tuées pour prélever leur cerveau. Le projet compare trois protocoles de stress pour l'étude de la dépression, le porteur affirmant qu'il est "essentiel" de développer ces modèles.
Objectifs
Les troubles dépressifs sont la principale cause d’invalidité dans le monde. Cependant l’efficacité des antidépresseurs est insuffisante chez un grand nombre de patients, ce qui nécessite une meilleure caractérisation des mécanismes neurobiologiques de la maladie ainsi que l’investigation de thérapies alternatives. Il est donc essentiel de développer des modèles précliniques liés à l’exposition à des événements stressants (« stresseurs ») générant des phénotypes comportementaux récapitulant au mieux certains aspects de la pathologie humaine. Nous proposons de comparer trois protocoles de stress chez la souris : le stress de défaite sociale (SDS), le stress variable chronique (SCV), et le stress chronique imprédictible (SCI). Ces trois protocoles diffèrent par la nature, la durée et l’intensité des stresseurs appliqués. La littérature suggère qu’ils ont également des conséquences qui peuvent être différentes sur l’expression des comportements anxiodépressifs selon les individus et le sexe. L’objectif est donc de comparer ces modèles au niveau des comportements anxiodépressifs qu’ils provoquent à différents points dans le temps. Si ces modèles s’avèrent pertinents pour l’étude de la dépression, nous explorerons leur profil de réponse à un antidépresseur couramment utilisé. Ces recherches permettront d’instaurer une diversité de modèles d’étude sur la dépression dans notre laboratoire, et ont le potentiel de mener au développement de thérapies innovantes et différenciées selon le sexe et l’individu. Nous attendons que ces modèles génèrent des résultats différents : par exemple, il est attendu que le SDS ait un impact plus important sur les phénotypes liés à l’interaction sociale étant donné la nature du stresseur par rapport au CVS ou au SCI. Ces différences sont une richesse, le but étant de modéliser différents symptômes présents chez les patients humains en utilisant plusieurs modèles précliniques. Concrètement, le développement et la validation de ces modèles nous servira dans la plupart de nos études postérieures : par exemple, dans nos études sur la neurostimulation ultrasonore et magnétique, qui sont des traitement alternatifs potentiels aux antidépresseurs. Tester ces nouveaux traitements dans ces modèles de stress nous permettra d’une part d’évaluer l’efficacité de ces traitements par rapport aux antidépresseurs, d’autre part de tester ces traitements dans différents types de stress.
Bénéfices attendus
Ce projet pourra permettre une meilleure utilisation utilisation des modèles précliniques de maladies neuropsychiatriques murins grâce à une caractérisation plus détaillée de trois modèles de stress différents couramment utilisés. Il pourra également identifier de potentielles différences dans les effets du stress ou du traitement antidépresseur selon le protocole, le sexe et les individus. De manière importante, il réduira l’utilisation d’animaux sur le long terme dans notre laboratoire en établissant des protocoles de stress reproductibles et en éliminant des protocoles peu reproductibles. Ces modeles seront par ailleurs essentiels à une meilleure compréhension des substrats neurobiologiques sous-tendant les atteintes aux différentes dimensions comportementales observées dans les pathologies psychiatriques liées au stress. En effet ces études nécessitent la mise en place d’outils d’imagerie de précision (exemple : imagerie calcique), combinés à des approches mécanistiques (modification d’expression de gènes, optogénétique, électrophysiologie, etc), pour la plupart nécessitant des chirurgies stéréotaxiques, et pour lesquelles il est essentiel de disposer d’un modèle comportemental fiable et reproductible.
Procédures
Le modèle de SDS (stress de défaite sociale) est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Cela induit des comportements anxio-depressifs chez les souris exposées au modèle. Les deux autres modèles provoquent peu ou aucune de douleur physique . L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser. Ces comportements anxio-dépressifs seront évalués par différents tests : l'apathie est mesurée par un test d'éclaboussement du pelage par une solution de sucrose sur 5 minutes, l'état du pelage évalue les mêmes symptômes (mesure hebdomadaire avec préhension des animaux), le test d'hyponéophagie évalue l'anxiété (privation de nourriture 12-24h puis mise en présence de nourriture pendant 5 minutes), l'open field, la boîte claire obscure et le labyrinthe en croix surélevé également (5 minutes dans l'arène), le test de préférence au sucrose évalue l'anhédonie (24h d'accès à une solution sucrée sur 5 jours), le test de nage forcée évalue les symptômes d'abandon (6 minutes). Les tests d'interaction sociales ont lieu sur des plages de 10 minutes qui peuvent être répétées sur 3 jours.
Impact sur les animaux
Le modèle de SDS est le plus sévère des trois modèles proposés. Celui-ci étant fondé sur des agressions physiques répétées, il induira de la douleur physique (de très courte durée, sauf en cas de blessure où elle sera prise en charge par les expérimentateurs) et psychique, ainsi qu’un état de stress aigu pendant la procédure qui deviendra durable après les répétitions (l’impact comportemental constaté dans la littérature est présent jusqu’à 3-4 semaines). Les deux autres modèles provoquent respectivement peu et aucune douleur physique. L’objectif final de cette étude étant de comparer les modèles puis d’étudier les substrats neurobiologiques des changements comportementaux induits par chaque modèle, et des comportements anxio-dépressifs pertinents pour nos études ayant été validés par la littérature dans ces modèles, il est essentiel de les caractériser.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des expériences afin de récupérer les cerveaux pour des études histologiques. Ces études histologiques permettront de décrire les effets de chaque protocole de stress au niveau cérébral afin de mieux comprendre les mécanismes en jeu.
Remplacement
Aucune méthode alternative in vitro n’est disponible à ce jour pour répondre à la problématique posée. Le stress chez l’animal, comme modèle de pathologie psychiatrique humaine, repose sur l’observation du comportement de l’animal vivant. L’étude de la réponse cérébrale et comportementale nécessite également l’utilisation d’animaux.
Réduction
Les effectifs sont optimisés, les analyses comportementales nécessitent une taille d’effectifs suffisante compte tenu de la variabilité inter-individuelle. Les effectifs seront adaptés en fonction de la taille des effets et deux cohortes seront utilisées au lieu de trois dans la première partie si nous trouvons les conditions adéquates dès la première cohorte. Egalement, la seconde partie sera abandonnée si nous n’obtenons pas de résultats dans la première partie. La stratégie des trois cohortes suit une analyse statistique a priori utilisée de manière standard dans la communauté scientifique.
Raffinement
Les conditions d’élevage des animaux seront optimales au regard des normes en vigueur avec enrichissement du milieu. Les animaux sont hébergés une semaine avant l’initiation des expériences. Des habituations à la pièce d’expérimentation d’au moins une heure sont réalisées avant les tests comportementaux pour diminuer le stress des animaux. En cas de blessure, les animaux recevront un traitement analgésique . En cas d’hypothermie, chaque animal est placé sur une couverture thermorégulée pour éviter toute hypothermie. Une surveillance accrue d’une semaine est réalisée pour suivre chaque souris montrant des signes de mal-être et intervenir si nécessaire . Les éxpérimentateurs sont experts dans la préhension et la contention des souris, et sont soucieux d’éviter tout stress inutile lors de la réalisation des procédures. Des points limites gradés sont appliqués et la décision d’euthanasie est prise s’il n’y a pas d’amélioration au bout d’une semaine.
Choix des espèces
Les similarités entre la neurobiologie humaine et celle de la souris, ainsi que l'expérience du laboratoire dans l'évaluation comportementale des rongeurs, l’implémentation d’un modèle de dépression et de neurostimulation, ainsi que la possibilité d’utiliser des technologies permettant l'étude détaillé du cerveau. Les animauxseront adultes au début de l’étude car il s’agit de comprendre ces phénomènes comportementaux associés à un cerveau adulte.
Travaux Pratiques en expérimentation animale – BUT Génie Biologique Parcours Biologie Médicale et Biotechnologie 1ère année
- Enseignement supérieur
360 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dans le cadre de travaux pratiques d'un cursus universitaire. Elles reçoivent deux à quatre injections intrapéritonéales et servent à des tests comportementaux, dont une échelle des grimaces, en étant manipulées par des étudiants que le porteur décrit lui-même comme non formés. À la différence de la plupart des projets, elles sont proposées à l'adoption à l'issue plutôt que tuées. Le porteur reconnaît qu'un remplacement total n'est pas possible pour l'apprentissage des gestes sur animal vivant mais prévoit des vidéos en complément.
Objectifs
Au cours de cette formation, les étudiants doivent ainsi être sensibilisés à l'expérimentation animale voire plus. En effet comme mentionné dans le programme national de cette formation, "les étudiants pourront être accompagnés, au cours de leur formation, dans la préparation de tout ou partie du certificat d'expérimentation animale, niveau applicateur." Ce projet comptabilisant 3 expérimentations différentes permettra aux étudiants, en complément des autres enseignements théoriques et pratiques, d'aborder plusieurs notions liées à l'expérimentation animale à savoir la réglementation, l'éthique, le bien-être, les gestes expérimentaux basiques avec des rongeurs de laboratoire (contention, injection, etc). Plus spécifiquement, au travers de ces 3 expérimentations, les étudiants : i) appréhenderont ce qu'est le métier de technicien animalier par le suivi et le soin aux animaux, ii) apprendront à manipuler et à réaliser des injections aux souris et iii) à étudier les comportements des souris en activité normale mais aussi dans le cadre d'une étude de l'effet de substances actives pharmacologiquement aux moyens de tests comportementaux, d'échelle des grimaces, etc.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra aux étudiants d'acquérir la compétence " Mener des études à l'échelle de l'organisme et de la cellule en biologie de la santé" exigées dans le cadre de cette formation. L'acquisition de cette compétence nécessite pour l'étudiant de maitriser un certain nombre d'apprentissages critiques (AC) qui sont, pour cette compétence, : i) Mettre en oeuvre des procédures expérimentales d'études physiologiques. Cet AC sera abordé via les expérimentations n°2 et 3 ; ii) Acquérir les gestes expérimentaux basiques sur l'animal de laboratoire. Cet AC sera abordé via les 3 expérimentations de ce projet. Le contenu de ce projet répond ainsi à ces apprentissages critiques et entre donc dans le processus d'acquisition de cette compétence en complément des autres enseignements théoriques et pratiques de la Ressource "Physiologie et Expérimentation animale" et de la SAé associée. Pour résumé, au travers des enseignements théoriques et pratiques (entre autres par ce projet), les étudiants auront ainsi une vision d'ensemble sur ce qu'implique l'expérimentation animale (réglementation en vigueur, éthique, bien-être, gestes de base, dispositif expérimental, pharmacologie...).
Procédures
Les animaux utilisés dans cette procédure ne seront pas soumis à ce type d'interventions. Ces animaux seront soumis uniquement à 2 (voire 4 injections pour les souris participant 2 fois à la expérimentation n°3) en intrapéritonéale.
Impact sur les animaux
Durant ce projet, les animaux seront confrontés à différentes nuisances : 1) le maniement par des personnes non formées et inconnues (ce dernier point sera amoindri au cours du temps car les souris seront toujours suivis par les mêmes étudiants. Nous essaierons également en TP qu'ils aient les mêmes souris que pendant le suivi; 2) l'utilisation dans 3 expérimentations différentes mais cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés 3) injections de substances thérapeutiques à dose active mais ces substances ont une durée de vie courte dans l'organisme donc les effets s'estomptent quelques heures après l'injection.
Devenir
Pour le bien-être animal, l'adoption est à privilégier dans notre cas, d'autant plus que les étudiants les ayant suivies 3 semaines y sont attachés. Il est à noter que lors des adoptions, un sachet de granulés ainsi qu'un peu de litière de leur cage d'origine sont donnés aux adoptants pour l'acclimatation de l'animal dans son nouvel environnement et des recommandations telles que l'introduction progressive de la nouvelle alimentation sont données. Pour finir, les étudiants comme les associations permettant la réhabilitation des animaux de laboratoire, reçoivent le certificat sanitaire de notre vétérinaire référent et l'autorisation triennale de la DDPP.
Remplacement
Il est difficile d'acquérir des compétences en expérimentation animale sans l'utilisation de l'animal in vivo c'est pourquoi un remplacement total n'est pas possible mais un remplacement partiel l'est. En complément de ces expérimentations in vivo et dans un objectif de remplacement, des vidéos seront mises à disposition des étudiants pour qu'ils puissent en plus des enseignements théoriques et pratiques, préparer au mieux leurs interventions / expérimentations avec les animaux.
Réduction
Le nombre de souris utilisé est réduit au minimum. Chaque année, 72 souris seront utilisées et seront subdivisées en 2*36 souris réparties dans 8 cages (voire 9 cages selon la corpulence des souris "vieilles") : 36 souris jeunes versus 36 souris 'vieilles'. D'autre part, nous avons choisi de faire travailler les étudiants par groupe de 3 ou 4 étudiants réduisant ainsi le nombre de groupe d'étudiants à 4 par TP. Ces 8 cages seront ainsi suivis par 12 groupes d'étudiants différents impliquant que 4 cages seront suivies par 2 groupes en TP différents. D'autre part, ces 72 souris serviront à 3 expérimentations. Les résultats des différents groupes de TP seront poolés et exploités lors de TPs de statistique. Ceci permettra de comparer les groupes de souris "jeunes" versus "vieilles". Ils pourront ainsi voir la variabilité des données selon le nombre d'animaux par lot utilisé.
Raffinement
Durant tout leur séjour au sein de notre établissement, les souris auront à disposition et sans restriction de la nourriture et de l'eau. Elles seront également visités tous les jours soit par la personne habilité pour cela au sein de l'établissement soit par les étudiants dans le cadre de l'expérimentation n°1. Selon l'âge et la corpulence des souris "vieilles", elles pourront être répartie non pas dans 4 cages mais dans 5 cages (4 cages de 7 souris + 1 cage de 8 souris). Au cours de ces visites, les animaux seront observés pour détecter tout comportement de souffrance, d'anxiété, etc... De plus, notre établissement a acquis des objets d'enrichissement tels que des tubes/ tunnel, ruban de carton. De la même façon les étudiants au cours de leur suivi pourront eux mêmes apporter des objets d'enrichissement.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle d'étude pour ce projet pour plusieurs raisons : 1- c'est l'un des modèles les plus utilisés en recherches bio-médicales et pharmacologiques (75%) 2- c'est un modèle (globalement) représentatif de la physiologie humaine (proximité phylogénétique entre les espèces). 3- leur comportement face à la manipulation, aux injections de molécules est bien documenté et des dispositifs expérimentaux sont disponibles pour le mesurer. 4- c'est une espèce facile à maintenir en captivité Les animaux utilisés auront au moins 2 mois. Il s'agira donc d'adultes car ils possèdent, théoriquement à ce stade, toutes les capacités exploratrices, psychiques et locomotrices. Cependant comme évoqué précédemment, nous aurons 2 groupes d'âge : souris "jeunes" environ 2 mois et souris "vieilles" d'au moins 4 mois et ayant eu déjà au moins 1 gestation (souris de réforme). Ce choix permettra aux étudiants d'observer le comportement de souris d'âge et de vécu différents.
Comparaison de la neurotoxicité de la radiothérapie par photons versus la protonthérapie sur le cerveau de la souris adolescente
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
368 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, à l'âge de 21 jours pour modéliser des patients adolescents. Elles reçoivent une irradiation cérébrale sous anesthésie, par protons ou par rayons X, dont le porteur attend l'apparition de troubles neurocognitifs. Quatre-vingts souris sont tuées entre six et vingt-quatre heures après l'irradiation pour des analyses, les 288 autres transférées vers un autre établissement pour des tests comportementaux puis tuées à leur tour. Le projet compare la neurotoxicité des deux techniques, le porteur indiquant que ces effets cognitifs restent à analyser à dose égale.
Objectifs
Le développement de troubles neurocognitifs complique fréquemment les radiothérapies cérébrales, notamment chez l’enfant. En effet, ces types de traitement consiste en l’utilisation de rayonnements ionisants classiquement des photons ou des électrons pour traiter les tumeurs. La principale limite de ce traitement va être l’apparition de toxicités au niveau des tissus sains adjacents. La protonthérapie permet de minimiser l’irradiation des tissus sains entourant les tumeurs. La protonthérapie représente ainsi une avancée significative pour le traitement des tumeurs pédiatriques. Elle n’en reste pas moins responsable d’effets neurocognitifs (défaut de concentration, d’attention, mémorisation à l’origine de difficultés scolaires et d’insertion) et, au final, si l’épargne cérébrale liée à la distribution de dose en profondeur des protons est évidente, la comparaison des toxicités cérébrales pour une même dose reçue (en radiothérapie conventionnelle versus protonthérapie) reste à analyser. Le but de ce projet est de comparer les effets induits par une irradiation cérébrale conventionnelle versus par protonthérapie chez des souris âgées de 21 jours pour modéliser l’irradiation de patients adolescents. Les conséquences cognitives et comportementales des irradiations seront évaluées à l’aide d’une batterie de tests biologiques et comportementaux. En contribuant à mieux connaître les effets neurotoxiques de la protonthérapie et ses avantages par rapport à la radiothérapie conventionnelle, notre projet devrait permettre le développement de nouvelles stratégies préventives et/ou thérapeutiques limitant les atteintes neurocognitives.
Bénéfices attendus
En contribuant à mieux connaître les effets neurotoxiques de la protonthérapie (PRT) et ses avantages par rapport à la radiothérapie conventionnelle à rayons X (XRT), notre projet devrait permettre le développement de nouvelles stratégies préventives et/ou thérapeutiques limitant ses atteintes neurocognitives.
Procédures
Pour la procédure d’irradiation du cerveau, la seule intervention prévue sera l’irradiation en elle-même accompagné d’une anesthésie pour éviter tout mouvement. La durée de cette dernière est estimée entre 15 à 20 minutes par animal. - Une partie des animaux seront anesthésiés très profondément pour fixation de leurs organes (anesthésie sans réveil
Impact sur les animaux
Bien que l’irradiation en elle-même ne soit pas douloureuse ni invasive, les souris seront anesthésiées tout au long des procédures pour éviter tout mouvement. Les nuisances seront issues des effets des irradiations : - Les seuls effets indésirables attendus après irradiation du cerveau au vu des doses employées sont l’apparition de troubles neurocognitifs.
Devenir
Un lot de 80 souris maximum sera euthanasié entre 6h et 24h après irradiation pour des analyses post-mortem. Les autres souris (288 souris maximum) seront transférées vers le CEA pour passer des tests de comportement. Ces souris seront suivies et euthanasiées au CEA.
Remplacement
L’étude de la radiotoxicité cérébrale avec des tests explorant notamment l’inflammation et les fonctions neurocognitives ne peut se faire par définition que sur des animaux vivants.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d'un outil statistique
Raffinement
- l’irradiation sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse à l’isoflurane. Cette procédure est indolore et non invasive mais les souris devront rester immobiles dans leur système de contention tout le long de la procédure. - dès l’irradiation, l’alimentation des souris sera complétée par des aliments gélifiés distribués directement dans le fond de cage pour faciliter la prise alimentaire - les animaux seront surveillés quotidiennement pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal être (grille de score). Les souris seront pesées 2x/semaine et mises à mort si on constate une perte de poids supérieure à 20% par rapport au poids le plus haut de l’animal ou autres signes tels que décrit dans la grille de score. Les doses utilisées n’entrainent pas de toxicité aiguë telle que la radiodermite (Ren et al 2021). Un délai minimum d’une semaine est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement.
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé pour les expériences menées en biologie : les souches sont parfaitement décrites et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. Les souris seront irradiées à l’âge de 3 semaines, âge reflétant le début de l’adolescence chez l’humain, période du pic de fréquence des tumeurs cérébrales.
Détermination de nouveaux biomarqueurs en imagerie TEP chez la souris pour prédire l’efficacité de thérapies innovantes contre le cancer du poumon.
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système respiratoire
612 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules tumorales sont injectées dans leur poumon par chirurgie, puis elles reçoivent des agents d'imagerie radioactifs et subissent jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie ainsi que des prélèvements sanguins et des traitements anticancéreux. À la fin, toutes sont tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à valider par imagerie TEP cinq biomarqueurs prédictifs de l'efficacité de thérapies, le porteur renvoyant le bénéfice pour les patients au transfert clinique ultérieur.
Objectifs
Les cancers bronchiques non à petites cellules (CBNPC) représentent environ 75 à 80 % des cancers bronchiques. Des progrès significatifs dans la compréhension des dérèglements moléculaires sous-jacents aux CBNPC ont ouvert de nouvelles opportunités de thérapies ciblées et plus personnalisées. Celles-ci nécessitent d’utiliser des indicateurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique, quantifiables au cours du temps, ce que l’on appelle des biomarqueurs (ce peut être un gène, une protéine, un mécanisme cellulaire…). Ces biomarqueurs prédictifs permettront de cibler au mieux le choix thérapeutique en fonction des patients et de leur pathologie. L’une des méthodes employées pour évaluer un biomarqueur d’une tumeur consiste à effectuer des prélèvements de tissus tumoraux (biopsie) et/ou sanguins et à y quantifier le biomarqueur. La méthode est invasive et complique la prise en charge du patient. De plus, les prélèvements effectués ne sont pas nécessairement représentatifs ni de l’intégralité du volume tumoral, ni de l’évolution au cours du temps de la tumeur. L’imagerie moléculaire, notamment l’imagerie hautement quantitative par tomographie par émissions de positon (TEP) permet une visualisation corps entier, au cours du temps de ces biomarqueurs d’intérêt. L’objectif du projet est d’évaluer par imagerie TEP couplée avec l’imagerie IRM ou optique cinq nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité de thérapies ciblées antitumorales, particulièrement les inhibiteurs de point de contrôle immunitaire (tels que des immunothérapies associés à des chimiothérapies et/ou à de la radiothérapie interne ou externe). Cette évaluation se fera en utilisant des modèles de cancers pulmonaires chez la souris. Les biomarqueurs évalués seront soit tumoraux soit liés au système immunitaire qui joue un rôle clé dans l’efficacité de ces thérapies ciblées. L’évaluation de ces nouveaux biomarqueurs en y associant des ligands spécifiques aux biomarqueurs d’intérêt en imagerie TEP permettra d’apporter des preuves suffisantes de l’importance de ce couple biomarqueur et imagerie TEP pour un transfert chez l’humain. Les résultats de ce projet devraient permettre de valider cette approche pour ensuite transférer au niveau clinique la méthodologie.
Bénéfices attendus
Ce projet doit permettre de valider de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique d’un traitement donné, essentiels pour améliorer la prise en charge des patients. Malgré des résultats prometteurs des différents axes thérapeutiques, que ce soit l’immunothérapie, la radiothérapie et les thérapies ciblées (i.e. ciblant spécifiquement certaines protéines, afin de bloquer des mécanismes tumoraux), seulement une partie de la population bénéficie de l’efficacité de ces thérapies : de multiples facteurs liés à la tumeur elle-même (son sous-type) et au patient (le stade de sa maladie, son système immunitaire, des facteurs génétiques…) font que le pronostic d’efficacité ne sera pas le même pour deux patients. Pour soigner le plus grand nombre, il faudrait pouvoir répartir les patients en sous-groupes homogènes pour lesquels on pourrait prédire quelle thérapie est la plus adaptée. Cette meilleure stratification des patients est largement facilitée par l’utilisation de biomarqueurs prédictifs de l’efficacité thérapeutique. Actuellement, la quantification des biomarqueurs prédictifs repose principalement sur des techniques invasives et locales, telles que l’immunohistochimie sur des biopsies de patient. L’imagerie TEP est une technique corps entier, très faiblement invasive, dynamique et hautement quantitative. L’objectif du projet est de valider ainsi des couples biomarqueurs et radioligands à base d’anticorps ou de peptides pour de l’imagerie TEP afin de prédire l’efficacité thérapeutique, offrant ainsi un outil décisionnel complémentaire aux biopsies à l’oncologue pour mieux personnaliser le traitement.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : La mise en place du modèle tumoral (30 minutes d’intervention, une seule injection par animaux) : des cellules tumorales seront injectées dans le poumon pour la formation de tumeurs dans l’environnement primaire de la lignée cellulaire. L’injection d’agents d’imagerie radioactifs (imagerie par tomographie par émission de positon), fluorescents (imagerie optique) et/ou IRM pour le ciblage de biomarqueurs d’intérêt et pour le suivi du volume tumoral, réalisée via une injection systémique (temps d’injection 5 minutes, nombre d’injection total par souris : maximum 3). Une anesthésie lors des différentes sessions imageries (temps d’anesthésie durant l’imagerie entre 15 minutes et 70 minutes, en comptant un maximum de 8 sessions d’imagerie à des dates différentes pour un suivi dynamique du traceur dans le cas de l’imagerie par tomographie). Un prélèvement sanguin sur animaux sous anesthésie (maximum 5 minutes, 2 fois maximum par session d’imagerie à des jours différents).
Impact sur les animaux
La mise en place de modèles tumoraux peut induire une gêne au niveau du site d’implantation de la tumeur. Un suivi régulier des animaux sera réalisé. Les effets indésirables prévus sur les animaux : • L’injection des radioligands en intra veineux peut induire une courte douleur (moins de 5min). • Les souris seront endormies lors des sessions d’imagerie (1h30 maximum) par voie gazeuse (isoflurane 1,5% à 2,5%). Lors du réveil les souris peuvent être désorientées et stressées. • Le geste chirurgical induira une douleur au niveau du thorax. L’acte chirurgical durera 20min. Les traitements (radiothérapie, chimiothérapie, immunothérapie et thérapie ciblée) peuvent avoir une toxicité non spécifique au niveau des organes sains. La durée des traitements ne dépassera pas plus de 3 semaines. Cette toxicité sera limitée par l’utilisation de dose thérapeutique décrite et validée dans la littérature.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure. Ceci permettra de prélever les organes afin de pouvoir effectuer les analyses ex-vivo sur ceux-ci.
Remplacement
Dans une première approche, toutes les stratégies thérapeutiques sont testées sur des cultures cellulaires et des organoïdes afin de déterminer leur pertinence et pour certains biomarqueurs, leur surexpression au niveau des tumeurs. Les tests in vitro préliminaires mis en place permettront de définir au préalable la stratégie appliquée in vivo afin de réduire le nombre d’animaux que nous utiliserons pour l’évaluation sur le modèle murin. Cependant, le microenvironnement tumoral est difficilement reproductible in vitro. Afin de valider les biomarqueurs et la stratégie associée par imagerie, les tumeurs doivent être implantées dans l’organe cible, ici le poumon.
Réduction
L’imagerie permet des études longitudinales en pharmacocinétique et par conséquent ne nécessite pas l’utilisation d’animaux à chaque temps, réduisant drastiquement le nombre de groupe d’animaux nécessaires pour des études classiques en pharmacologie. Chaque donnée d’imagerie individuellement ou globalement permettra après analyses de définir la distribution des agents thérapeutiques de manière longitudinale en gardant la puissance statistique de l’étude.
Raffinement
Toutes les interventions invasives, à savoir les injections systémiques, seront réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse complétée par une anesthésie locale et des soins post-opératoires adaptés afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Un suivi régulier et des points limites permettront d’éviter toute souffrance animale. Les souris seront hébergées par 4 ou 5 en milieu enrichi.
Choix des espèces
Ce projet a comme objectif d’évaluer de nouveaux biomarqueurs prédictifs selon quatre axes thérapeutiques prometteurs (les immunothérapies, la radiothérapie, la chimiothérapie couplé à l’immunothérapie et les thérapies ciblées). La souris est l’animal de choix pour la mise en place de modèle tumoraux, ayant une taille adaptée pour la manipulation et l’imagerie corps entiers. Les modèles permettant une implantation de la tumeur dans son environnement d’origine sont largement utilisés pour examiner le microenvironnement tumoral essentiel pour valider les stratégies thérapeutiques et les biomarqueurs prédictifs. Les souris utilisées dans ce projet auront atteint un stade jeune adulte (5 semaines) à adulte ( 8 semaines). Cette tranche d’âge permet d’être représentative des cancers pulmonaires chez les patients majoritairement à l’âge adulte.
Etude des effets et du mécanisme d’action d’un Peptide sur l’interaction gamétique et le développement embryonnaire murin 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
2 136 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les femelles reçoivent des injections hormonales pour stimuler l'ovulation, et une partie subit une microchirurgie de réimplantation d'embryons sous anesthésie suivie d'un suivi échographique jusqu'à la mise bas. Toutes sont ensuite tuées pour récolter les embryons ou compter les souriceaux nés. Le projet teste un peptide breveté censé augmenter les taux de fécondation en assistance médicale à la procréation, le porteur affirmant qu'il n'est "pas possible de contourner le recours au modèle animal".
Objectifs
Les troubles de la fertilité et leurs incidences sur les sociétés humaines sont un problème majeur de santé publique et un enjeu économique substantiel pour l’avenir. Depuis cinquante ans, nous assistons à une chute de la fécondité des couples surtout dans les pays industrialisés en raison notamment de l'âge plus avancé des femmes pour leur premier accouchement (30 à 35 ans aujourd'hui versus 23 ans il y a 30 ans) qui induit une moindre qualité de l'ovule et des problèmes de développement embryonnaire. Une molécule qui permettrait de pallier cette baisse de qualité ovulaire et embryonnaire et d’augmenter les taux de succès de l’AMP (Assistance Médicale à la Procréation) serait donc prometteuse. Un peptide a été découvert lors d’études faites sur l’interaction gamétique. Ajouté au milieu d’insémination, il augmente les taux de fécondation chez la souris et les index de fusion chez l’humain. Sur la foi de cette propriété, un brevet a été pris pour cette molécule. Des tests ultérieurs ont démontré un effet sur la maturation des ovocytes humains immatures et le développement préimplantatoire d’embryons humains donnés pour la recherche. Nous souhaitons développer la recherche fondamentale nécessaire au développement du peptide, pour préciser à quel(s) stade(s) du processus de fécondation il agit, son mode d’action et ses applications possibles. Ce projet nécessite l'utilisation de 1296 souris au total sur une durée de 5 ans.
Bénéfices attendus
Les résultats de nos travaux devraient permettre d’identifier les mécanismes moléculaires liés aux effets du Peptide en fécondation in vitro et d’améliorer, à plus long terme, les taux de naissance lors des tentatives d’AMP (Assistance Médicale à la Procréation).
Procédures
Les animaux seront soumis à 2 types d'intervention. La stimulation hormonale de souris donneuses d'embryons par injection intrapéritonéale -de moins de 10s- à 46-48h d'intervalle de 2 hormones : Hormone n°1 : pour stimuler la maturation des follicules ovariens / Hormone n°2 : pour provoquer l’ovulation 46-48h après l’injection de la première hormone. Un autre groupe d'animaux (femelles pseudo gestantes)sera soumis à la microchirurgie de réimplantation d’embryons et un suivi gestationnel (2 échographies, à J7.5 post coït et J11.5 post coït) par échographie.Les femelles seront conservées jusqu'à la mise bas. La micro-chirurguie se fait sous anesthésie générale et dure entre 15 à 20 minutes pour chaque souris.
Impact sur les animaux
Certains effets indésirables peuvent apparaître lors de la micro-chirurgie effectuée: - une infection ou un suintement au niveau de la zone incisée. - une souffrance propre à l'acte chirurgical.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récolter les embryons produits ou pour dénombrer le nombre de souriceaux nés à l'issue de la mise bas, suivant la procédure concernée.
Remplacement
Il n’est pas possible de contourner le recours au modèle animal pour la production de spermatozoïdes et d’ovules.Des études in vitro ont déjà menées permettant de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire. A chaque fois que cela est possible, des tests et des lignées cellulaires traitées avec le Peptide seront utilisées pour des étapes annexes afin de réduire au strict minimum le nombre de souris utilisées.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit au minimum. La stimulation hormonale permet de réduire le nombre de souris femelles donneuses d'ovocytes et d'embryons utilisées. Le suivi échographique des femelles réimplantées permet d'optimiser le nombre de femelles nécessaires dans le cadre du suivi gestationnel. Les nombres d'expérience demandées tiennent compte des variables de production connues en ce qui concerne la stimulation hormonale, les taux de fécondation, et des éventuelles non gestations des femelles receveuses après réimplantation des embryons. Il est donc possible que le nombre d'expériences sur lesquels les calculs du nombre de souris se basent soit plus faibles que le nombre initialement prévu dans le projet. Le nombre de souris a été déterminé en tenant compte du nombre nécessaire d’embryons à obtenir, en se basant sur des expériences déjà réalisées de stimulation hormonale et des tests de puissance statistique adaptés.
Raffinement
Une grille de suivi et des points limites ont été définis pour chaque procédure. Les souris réimplantées sont anesthésiées et l'analgésie adéquate est apportée.
Choix des espèces
Les études impliquant l’espèce humaine sont particulièrement encadrées par les autorités compétentes. Ainsi avant d’engager des personnes dans des protocoles de recherche incluant potentiellement la naissance d’enfants, il est demandé des études préalables dans les espèces animales au mode de reproduction analogues. La souris constitue de ce point de vue un modèle d’étude particulièrement efficace alors qu’il n’existe pas de modèle cellulaire alternatif. En effet, grâce aux connaissances acquises ces dernières années sur la génétique de la souris et du fait de la conservation entre l’homme et la souris de la majorité des gènes impliqués dans la formation des gamètes, la fécondation et le développement embryonnaire, la souris représente actuellement le modèle de choix pour étudier les troubles de l’infertilité. Pour ce projet, des souris de 6 à 12 semaines maximum, jeune adulte et adulte ayant atteint la maturité sexuelle, seront nécessaires pour fournir les ovocytes ou les zygotes après accouplement. Des souris de 8 à 16 semaines seront utilisées pour recevoir les embryons transférés. Des femelles âgées de 1 an seront également utilisées. Le peptide est supposé agir à tout âge mais devrait être d’autant plus efficace que l’altération des ovocytes est moindre. Il est essentiel de savoir dans quelles mesures les améliorations des taux de fécondation et d’implantation seront efficaces chez des femelles plus âgées et éventuellement les posologies et mode d’administration du peptide à employer.
Etude de l’effet de l’hypoxie sur la thrombose veineuse profonde
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
72 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie abdominale de 40 minutes dont le résumé ne décrit pas le geste, passent le lendemain six heures en hypoxie hypobare ou à l'air et à la pression normaux, puis sont opérées une seconde fois sans réveil, 24 heures après la première chirurgie, pour prélever leur caillot et leur sang. Quatre doses d'antidouleur encadrent la première opération, qui peut entraîner des douleurs dans les heures suivant le réveil. Le dispositif doit reproduire l'exposition des passagers d'un vol long-courrier, et le porteur écrit que cette approche "permettrait" d'identifier les acteurs cellulaires de la thrombose et de révéler "à terme" des cibles thérapeutiques pour les personnels de bord et les grands voyageurs.
Objectifs
Evaluation en préclinique des effets de l’hypoxie sur la thrombose veineuse profonde. L'’intérêt est d'’identifier les acteurs cellulaires et protéiques impliqués dans la formation du thrombus après une exposition à un environnement hypoxique hypobare similaire à un vol d’avion long-courrier (minimum de 4 heures)
Bénéfices attendus
Ce projet d’expérimentation permet de reproduire in vivo la formation d’un thrombus sous l’effet d’une hypoxie hypobare et donc de simuler au mieux les conditions environnementales auxquelles sont exposées les passagers d’un vol long-courrier. Cette approche permettrait d’identifier les acteurs cellulaires par lesquels l'hypoxie joue son rôle pro-thrombotique et donc de révéler à terme de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant être spécifiques pour les personnels de bord et les « grands voyageurs ».
Procédures
Les animaux sont dans un premier temps soumis à une chirurgie abdominale avec réveil. 24 heures après ces mêmes animaux sont soumis à une deuxième chirurgie qui cette fois est sans réveil permettant le prélèvement du thrombus et du sang. Les deux chirurgies ainsi que les prélèvements ne sont réalisés qu'une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Cette procédure est une procédure avec réveil et nécessite une chirurgie abdominale qui peut engendrer des douleurs post-opératoires les heures suivants le réveil des animaux. Les chirurgies ont une durée de 40 minutes et l'exposition à l'hypoxie hypobare ou normoxie normobare dure 6 heures.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure après prélèvement sanguin et prélèvement de caillot sanguin.
Remplacement
A ce jour l’étude in vitro des neutrophiles, des plaquettes et des cellules endothéliales ne permet pas à elle seule de reproduire l’intégralité du vaisseau sanguin. De plus, l'induction de l'hypoxie à l'échelle cellulaire ne reproduit pas la complexité des pathologies thrombotiques veineuses auxquelles sont exposés les passagers d’un avion.
Réduction
Dans le cas où une différence significative est obtenue entre deux groupes expérimentaux avant l’utilisation de la totalité du lot, nous ne réaliserons pas d’expérimentations supplémentaires. L’analyse du thrombus et des composés sanguins sera réalisée dans les mêmes animaux afin de respecter la règle des 3R (Reduction).
Raffinement
Les animaux seront utilisés 7 jours après leur arrivée dans l'animalerie pour leur laisser le temps de s'acclimater. Afin de limiter le stress, les animaux seront transférés 24h avant la chirurgie dans la cage qui les hébergera tout le long de la procédure. Ceci aura pour but de les habituer à leur nouvel habitat et de les acclimater à la prise d'eau gélifiée. Au cours de la chirurgie, les animaux suivants attendront dans une pièce d’hébergement afin de ne pas être perturbé par la chirurgie en cours. Les animaux seront opérés sur un tapis chauffant (37°C) afin de maintenir leur température pendant la chirurgie. Pour améliorer les conditions de réveil, les animaux seront placés sur une bouillotte dans la cage pour les maintenir au chaud. Une surveillance accrue sera réalisée après la chirurgie toute la journée ainsi que pendant l'exposition à l'hypoxie hypobare pour le groupe concerné pour évaluer le bien-être des animaux et détecter rapidement tout signe de souffrance. Une première dose d'anti-douleur sera administrée aux animaux 30 minutes avant la chirurgie et une deuxième dès la fin de la chirurgie. Une troisième dose est injectée à la fin de la journée afin de limiter les douleurs durant la nuit. Le lendemain matin, soit 12 heures après, une dernière injection d'anti-douleur est réalisée avant de placer les souris en normoxie normobare ou en hypoxie hypobare. En cas de signes de souffrances chez un animal une nouvelle injection d'anti-douleurs lui sera administré.
Choix des espèces
Le modèle murin est un excellent modèle de thrombose à la fois artérielle et veineux et reproduit au mieux les mécanismes de thrombose présents chez l'humain. Les animaux seront utilisés entre 5 et 12 semaines afin d’avoir un système immunitaire et vasculaire fonctionnel.
Evaluation de l’efficacité de plusieurs vecteurs AAV dans le cadre de la mise en place d’une approche de thérapie génique dans un modèle murin de la maladie d’Alzheimer
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Troubles nerveux
Après une injection unique d'un virus modifié (AAV), soit dans une veine par voie rétro-orbitale sous cinq minutes d'anesthésie gazeuse, soit directement dans le cerveau lors d'une craniotomie de 70 minutes, des souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer passent un test en labyrinthe en Y d'une journée et le test de la piscine de Morris, quatre à huit jours d'entraînement suivis d'un jour de test. 172 souris, issues de couples reproducteurs commerciaux, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue. Le virus doit faire produire à leur cerveau une "protéine X" que le résumé ne nomme pas, et le porteur cite parmi les effets attendus une douleur possible à la pose des barres d'oreille, un risque de saignement, une infection de l'œil après l'injection rétro-orbitale et une perte de poids de 5 à 7 %. Le jour de leur mise à mort, leur sang et leur liquide céphalo-rachidien sont prélevés sous anesthésie, et les souris de l'élevage de la lignée sont tuées sans prélèvement.
Objectifs
Aucun traitement n'étant aujourd'hui en mesure de combattre de façon efficace la progression des maladies neurodégénératives, nous avons pour objectif de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. Comment ? En nous tournant vers la thérapie génique, qui consiste à introduire du matériel génétique (ADN) dans des cellules du cerveau dans le but de limiter la progression de la maladie. Cette approche s’est révélée efficace dans la maladie d'Alzheimer (MA) dans un modèle murin de la maladie. Des preuves de concepts ont été établies par des injections intracérébrales (directement dans le cerveau) d’un virus modifié (AAV) permettant de délivrer l’ADN au cœur même des cellules. Cependant, dans l’optique d’une application clinique chez l’Homme, l’administration intracérébrale peut induire des risques additionnels dans un cerveau déjà en dégénérescence et atrophié par la maladie. Dans ce projet nous avons développé des nouveaux AAV modifiés de façon à les rendre plus efficaces à passer la barrière protégeant le cerveau (la barrière hématoencéphalique) après une injection intraveineuse et ainsi permettre d’atteindre les cellules du cerveau. Le but est de prévenir une approche invasive d'injection intracérébrale en la remplaçant par une injection intraveineuse chez un modèle murin de la maladie MA. Les objectifs de l’étude sont : 1) Démontrer la fonctionnalité de l’AAV et donc de confirmer l’efficacité thérapeutique de l’administration intracérébrale. 2) Comparer l’efficacité thérapeutique de deux AAV par administration intracérébrale ou intraveineuse. L’objectif final est de poursuivre toutes les étapes précliniques permettant de proposer cette approche thérapeutique chez les patients atteints de la MA.
Bénéfices attendus
Le bénéfice recherché est de remplacer la voie intracérébrale (connue pour être efficace chez la souris) par l’administration intraveineuse de vecteurs AAV codant pour la protéine X, afin de pouvoir l’appliquer à l’Homme, et plus précisément chez les patients atteints de maladies neurodégénératives.
Procédures
Les animaux modèles de la maladie d’Alzheimer avec phénotype dommageable seront utilisés. Les couples reproducteurs commerciaux seront utilisés. Les animaux seront injectées une seule fois : soit par voie intraveineuse (5 minutes d’anesthésie gazeuse), ou par voie intracérébrale (70 minutes sous anesthésie gazeuse avec injection d'analgésique en pré-operatoire ,et application d'analgésique sur le site incisé. Des études comportementales (le test du labyrinthe d'expérimentation en Y ou Y-maze, et le test de la picine de Morris) seront réalisées afin d’évaluer les effets des vecteurs injectés sur les déficits cognitifs. le test du Y-maze sera realisé en une session d'une jounrée. Le test de la piscine de Morris comprend des sessions d'entrainement de 4 à 8 jours, puis un test effectué en une journée, juste apres la session d'entrainement. Le jour d'euthanasie, un prélèvement du liquide céphalo-rachidien et sanguin sera realisé sous anesthésie.
Impact sur les animaux
Parmis les effets indésirables attendus sur les animaux nous pouvons noter les éléments suivants : 1)Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, 2) Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. 3) Un risque de traumatisme mécanique locale relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le cerveau des souris. 4) Un risque anesthésique pouvant entrainer des séquelles chez l’animal. 5) Un risque d’infection oculaire peut-être observé après les injections intra-veineuses en retro-orbitale. 6) Une perte de poids dûe à l’injection d'AAV pourrait être observée (5 à 7% du poids de référence total de l’animal, selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées soient déjà évaluées in vitro dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris.7) un stress lié à la manipulation de des animaux lors des tests comportements
Devenir
l’ensemble des animaux seront euthanasiés à la fin des actes prévues que ce soit pour l’élevage (sans prélèvement) de la lignée ou à l’issue des procédures (avec prélèvement pour analyse).
Remplacement
Remplacement: Le recours aux modèles animaux est essentiel, car aucun type de culture cellulaire ou système synthétique ne permet à ce jour de reproduire la complexité architecturale des cellules du cerveau en particulier leurs interactions structurelles et fonctionnelles. Les animaux utilisés dans le cadre de ce projet sont nés et élevés en captivité dans des élevages agrées.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir résultats statistiquement pertinents. Leur nombre (172) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. La taille des effectifs a donc été établie grâce à un calcul de puissance. Afin de limiter le nombre total d’animaux essentiels au projet, les tests de comportement et les analyses histologiques, biochimiques et moléculaires post-mortem seront dans la mesure du possible réalisés sur les mêmes animaux. Le design expérimental a pour but d’obtenir un maximum d’informations en utilisant un minimum d’animaux. Les différents paramètres (comportementaux, biochimiques, histologiques, etc) seront analysés grâce à des essais appropriés en fonction des demandes/exigences expérimentales.
Raffinement
Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance. La douleur/souffrance des rongeurs utilisés dans cette étude sera diminuée par l’injection locale d’analgésique et par protocole analgésique pour les procédures chirurgicales. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. Un gel ophtalmique sera appliqué immédiatement après l’injection. Une surveillance particulière de l’œil sera faite en post opératoire pour vérifier l’absence d’infection oculaire. Le geste de l’injection intraveineuse est maitrisé par l’applicateur. L’anesthésie générale sera assurée par une anesthésie gazeuse. L’application de critères d’arrêts standards en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé la semaine suivant la chirurgie puis celui-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf à l’approche de points limites qui auront été définis préalablement. De plus, les tests comportementaux étant réalisés de façon hebdomadaire sur plusieurs jours, favorisent un suivi renforcé et une habituation des souris à la salle et à l’utilisateur. Un environnement enrichi constitué d’un nestlet pour la fabrication du nid et d'un igloo sera ajouté dans chaque cage. Les animaux seront hébergés en groupe.
Choix des espèces
Afin de tester différentes approches thérapeutiques pour traiter les différentes maladies neurodégénératives, il est nécessaire de disposer d'animaux modèle. A ce jour, seules les souris transgéniques pour la maladie d'Alzheimer permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie. C’est pourquoi nous les utilisons dans des études d’efficacité de nouvelles cibles thérapeutiques, comme l'évaluation de la surexpression de la protéine X. Dans ce projet des animaux jeunes adultes (souris : 4-8 semaines) seront utilisés. Chez ce modèle murin, les défauts neuropathologiques apparaissent dès 6 semaines puis ces défauts progressent ensuite de manière exponentielle. Nous réaliserons les injections stéréotaxiques ou intraveineuses de manière précoce (4-8 semaines) afin de maximiser les effets bénéfiques du traitement sur la neuropathologie et le comportement).
Etude du rôle des proteines du deuterosomes dans la différentiation des cellules multiciliées chez la souris
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
360 souris nouveau-nées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit vers la naissance une électroporation du cerveau sous anesthésie, puis est tué entre deux et quinze jours plus tard pour prélèvement du cerveau. Le projet étudie les mécanismes de production des cils dans les cellules du cerveau. Le porteur affirme n'avoir jamais observé d'effet nuisible de cette technique et juge les cultures cellulaires insuffisantes pour reproduire ce contrôle in vivo.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’identifier les mécanismes moléculaires qui contrôlent la production des centrioles et des cils dans les cellules multiciliées épendymaires dans le cerveau des souris au stade postnatal. Dans ce contexte nous étudierons la fonction de protéines que nous avons préalablement sélectionnés à partir d’expériences réalisées in vitro en culture cellulaire. Des animaux de phénotype sauvage (CD1) seront utilisés pour étudier l’impact de la surexpression ou de l’inhibition de cette protéine en utilisant la technique d’électroporation in vivo de cerveaux postnataux.
Bénéfices attendus
Notre projet est d'une grande pertinence pour le domaine des cellules multiciliées (MCC) : - Un des grands défis dans ce domaine de recherche concerne le contrôle du nombre final de cils dans les MCC individuelles, qui est la clé de l'émergence de leur fonction physiologique. La réponse à cette question ne sera possible que lorsque les mécanismes de production et d'élimination des centrioles seront bien compris. Ce projet fera la lumière sur ces processus de ouvrant de nouvelles voies pour aborder la façon dont le nombre de centrioles est contrôlé. - La multiplication des centrioles dans les MCC et la duplication des centrioles au cours du cycle cellulaire font intervenir des principes de régulation communs. Ainsi, le domaine plus large de la biologie des centrioles bénéficiera à l'avenir d'études sur les MCC comme celle proposée ici. Notre projet est également pertinent pour la santé humaine : - Les maladies respiratoires chroniques, tuent plus de 4 millions de personnes chaque année. Malgré la mortalité associée à ces maladies, une compréhension de la pathogenèse reste incomplète. Nos résultats fourniront des informations importantes sur les mécanismes qui sous-tendent ces pathologies. - La compréhension des règles qui contrôlent le nombre de centrioles dans les MCCs pourrait également être tout à fait pertinente dans le domaine du cancer ou une multiplication aberrante de centrioles est parfois observé.
Procédures
Les nouveaux-nés P0-P1 anesthésiés seront soumis à une procédure d’électroporation in vivo du cerveau afin de modifier l’état génétique des précuseurs des cellules multiciliées. Cette procédure dure 1 à 2 min et sera réalisée une fois par animal sur 360 animaux.
Impact sur les animaux
Les procédures sont appliquées sur des animaux nouveaux-nés qui sont euthanasiés entre 2 et 15 jours après. Nous pratiquons l’électroporation de cerveau en routine depuis une douzaine d’année et nous n’avons jamais observé d’effets nuisibles conséquents à cet acte sur la santé et le bien-être des animaux. L’électropration que nous utilisons dans ce projet induit la diminution de l’ARN cible seulement dans quelques cellules du cerveau après la naissance, ce qui n’entraine aucun effet dommageable sur l’animal.
Devenir
A la fin de la procédure (P5 ou P15), les animaux seront euthanasiés pour prélèvement du cerveau et analyse des paramètres des cellules multiciliées par immunofluorescence.
Remplacement
Les modèles de lignées cellulaires de cellules multiciliées (Cellules epitheliales de trachée humaine, culture primaire de cellules épendymaires de souris, culture primaire de cellules de trachée de souris) ne récapitulent pas le contrôle sticte de production des centrioles multiples observé in vivo. Notamment le nombre de centrioles généré par les cultures de cellules ependymaires sont deux à trois plus élevé que le nombre de centriole observés in vivo. Ainsi, la production des centrioles multiples est contrôlée par des facteurs intrinsèques mais également par des facteurs extrinsèques. Ce contrôle cellulaire non autonome lié à l’environnement cellulaire ne permet pas d’utiliser des systèmes de culture cellulaire in vitro pour étudier ce processus en contexte physiologique. Il est donc nécessaire d’effectuer des approches fonctionnelles in vivo chez la souris. Avant le début des analyses fonctionnelles in vivo, la présence de nos candidats dans les structures cellulaires relevantes pour le processus de production des centrioles multiples a été évaluée par des approches biochimiques sur des lignées cellulaires.
Réduction
Nous utiliserons une approche expérimentale simple et rapide qui permet de modifier l’information génétique des cellules multiciliées dans le cerveau de souris nouveau-nés sans avoir besoin de créer des animaux transgéniques. Cette approche par électroporation in vivo est utilisée depuis plusieurs années dans le laboratoire. Grâce à notre expérience et notre maitrise de cette technique, notre taux de réussite est optimal et nous pouvons estimer au plus juste le nombre d’animaux suffisants à utiliser pour avoir des résultats reproductibles et tenant compte du taux d’échec des expériences réalisées par la suite sur les échantillons biologiques. Les groupes témoins et les groupes tests seront constitués à partir de mêmes portées, sans distinction de sexe, afin de limiter le nombre d’animaux utilisés. Le nombre d’animaux nécessaires est estimé afin d’atteindre une différence significative (p
Raffinement
Les souris sont élevées en groupes sociaux, dans des environnements enrichis par la présence de tunnel en carton, carré de coton et dôme pour la nidification, au sein d’une animalerie exempte de pathogènes et dont les paramètres physiques et sanitaires sont strictement contrôlés. 6 personnes sont dédiées à l’organisation, l’entretien des élevages et le soin aux animaux. Pendant l’expérimentation, les souris sont traitées par des soins pré-opératoires (pommade lidocaïne) et la phase de réveil post-anesthésie se fait en condition de température optimale. Après l’expérimentation, les souris sont hébergées au calme dans une salle post- opératoire dédiée avec un suivi clinique quotidien. Les souriceaux d’une portée continuent d’être élevés tous ensemble avec leur mère. Ils font l’objet d’une surveillance quotidienne par les opérateurs pour vérifier la récupération dans les jours qui suivent l’application de la procédure. En cas de souffrance détectée (grille d’évaluation en Annexe 1), des antalgiques sont administrés (buprenorphine 0,1mg/kg, voie intra-péritonéale). Si les signes de souffrance persistent les animaux seront euthanasiés. Tout au long de l’expérimentation nous nous attacherons à reconnaître douleur et anxiété, agir lorsque les points limites prédéfinis sont atteints, noter les observations faites et les actions entreprises.
Choix des espèces
La souris est le modèle mammifère utilisé par la communauté́ scientifique pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans la différenciation des cellules multiciliées et qui sont conservés chez l’homme. De plus il permet des manipulations génétiques, soit par l’utilisation d’animaux transgéniques soit par modification ciblée de l’information génique des précurseurs des cellules multiciliées in vivo dans le cerveau. Les animaux seront utilisés au stade post-natal P0/P1 car Les précurseurs des cellules multiciliées ne sont accéssibles qu’aux stades P0-P1. Les animaux seront analysés à différents temps après électroporation de P5 à P15 correspondant aux différentes étapes de maturation des cellules multiciliées.
Criblage de principes actifs pour la recherche d’Immunothérapie dans des modèles de lymphome du système nerveux central
- Recherche appliquée
- Cancers
158 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur greffe des cellules tumorales dans le cerveau sous anesthésie, avec prélèvements sanguins réguliers et traitements, la tumeur pouvant provoquer perte de poids, ataxie et apathie. Le projet crible des molécules d'immunothérapie contre le lymphome cérébral. Le porteur indique qu'un criblage in vitro a limité le nombre de molécules testées, mais qualifie les expériences in vivo d'indispensables avant tout essai clinique.
Objectifs
Les lymphomes primitifs du système nerveux central (LCP) sont des lymphomes qui se développent dans le cerveau. Ils peuvent être associés à une atteinte de l’œil, des méninges et du liquide céphalo-rachidien. Ce sont des lymphomes rares de mauvais pronostic avec les traitements actuels. Dans le cerveau, les tissus (microenvironnement) entourant le lymphome ne peuvent développer que des réactions immunologiques peu efficaces. . Cette caractéristique peut être responsable d’une mauvaise efficacité des traitements anti-lymphomateux et en particulier des immunothérapies qui représentent un progrès majeur pour le traitement des lymphomes systémiques (se développant en dehors du système nerveux central). Dans ce projet, notre collaborateur procèdera au criblage de nombreuses molécules de notre partenaire industriel sur des modèles in vitro afin de sélectionner les molécules candidates à tester sur des modèles in vivo. Ceci permettra de limiter le nombre d’animaux utilisés. Nous évaluerons l’efficacité clinique de cette sélection de molécules sur nos modèles de LCP murins. L’objectif de cette étude est d’évaluer l’efficacité thérapeutique de molécules et de combinaison de molécules, et d’évaluer leur impact sur le microenvironnement immunologique cérébral. La perspective de ce travail est de développer des essais thérapeutiques cliniques.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait nous permettre d’une part, d’identifier des molécules et/ou associations de molécules innovantes efficaces contre le lymphome cérébral et documenter comment ces molécules modulent le microenvironnement immunologique cérébral. A partir des connaissances ainsi acquises, des essais cliniques pourront ensuite être proposés chez les patients avec l’objectif d’améliorer le pronostic de cette maladie.
Procédures
Dans une première procédure, des cellules tumorales seront greffées dans le cerveau des animaux sous anesthésie générale (environ 40min). Des prélèvements sanguins seront réalisés tous les 15 jours sur ces animaux (durée du geste
Impact sur les animaux
L’implantation de tumeur cérébral entraine, chez les animaux implantés dont la tumeur a pris, les symptômes suivants (possiblement) : perte de poids, ataxie, apathie. Les traitements par chimiothérapie peuvent également entrainer des effets secondaires en fonction de leur nature qui vont principalement se traduire par une perte de poids. L’état général des animaux sera évalué dès l’apparition des premiers symptômes en regard avec la grille de score. Pour limiter au maximum leur souffrance, les animaux recevront des soins supports ou seront euthanasiés.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem
Remplacement
Le criblage initial sur des modèles in vitro permettra de limiter le nombre de molécules/association de molécules à tester sur des modèles in vivo, et limitera ainsi le nombre d’animaux nécessaires pour les expérimentations in vivo. Ces expérimentations in vivo restent néanmoins indispensables en amont des essais cliniques chez les patients et pour étudier le microenvironnement cérébral.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés au plus bas tout en s’assurant de résultats fiables et statistiquement significatifs, nous avons déterminé le nombre d’animaux à inclure dans chaque groupe expérimental à l’aide d’un outil statistique.
Raffinement
Pour limiter la souffrance des animaux, les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale associée à des analgésiques adaptés aux interventions chirurgicales mises en place. Les animaux seront observés 5 fois par semaine pour permettre la détection de signes précoces de détresse ou de mal être. Pour limiter le stress des animaux, un délai minimal de 3 jours est respecté entre la réception des animaux et la mise en place des procédures expérimentales pour leur permettre de s’adapter à leur nouvel environnement. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine minimum afin d'assurer leur bien-être et les expérimentations seront arrêtées avant l’apparition de signes de souffrance des animaux tels que décrits dans la grille de score.
Choix des espèces
La souris est le modèle communément utilisé en cancérologie : les souches sont parfaitement définies et la parenté biologique des souris avec l’Homme va nous permettre d’obtenir des informations extrapolables à la pratique clinique humaine. L’existence de souches immunodéprimées nous intéresse particulièrement pour l’établissement de modèles tumoraux à partir de xénogreffes. Nous travaillerons sur des souris adultes âgées de 6 semaines chez qui le cerveau est totalement développé.
Etudes de toxicité subaigue et sub-chronique
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 5500
8 500 animaux non-humains vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 3 000 souris et 5 500 rats. Ils reçoivent chaque jour une substance par gavage pendant des périodes allant jusqu'à quatre-vingt-dix jours, avec prélèvements de sang et d'urine, puis sont tués pour analyse des organes. Le projet évalue la toxicité de composés dans le cadre d'études réglementaires. Le porteur indique que les essais in vitro et in silico ne renseignent ni sur les effets à long terme ni sur la gravité, et présente le rat et la souris comme les espèces les plus appropriées.
Objectifs
Ce projet comprend une série d’études permettant d’évaluer la toxicité, et de fournir des informations sur les dangers pour la santé qui peuvent résulter d’une exposition à une substance d’essai par voie orale pendant une période courte ou moyenne. En effet l’exposition à un composé est souvent multiple (doses répétées) et peut produire des effets immédiats ou plus tardifs (par accumulation de la substance d’essai ou par sa biotransformation par exemple). Le projet est utilisé pour fournir des informations sur le potentiel toxique d’un produit lors de son développement. Ces études d’une durée inférieure ou égale à 90 jours permettent de définir les doses qui pourront être utilisées dans des études chroniques sans induire d’effets sévères.
Bénéfices attendus
Les bénéfices et objectifs de ces études sont de déterminer et d’évaluer le potentiel toxique d’un composé pour chercher des effets ou constater l’absence d’effets toxiques, déterminer la concentration sans effet nocif observé, identifier des organes cibles et évaluer les changements biologiques provoqués par l'administration du produit, évaluer la concentration plasmatique du produit et de ses métabolites, et de certains biomarqueurs (tyrosine par exemple), évaluer le profil de bioaccumulation du produit dans certains organes, apporter des informations sur la sélection des doses pour les études ultérieures. Il permet également d'obtenir des informations importantes sur le mode d'action de la molécule. Les études les plus précoces permettent de mettre en évidence le profil toxicologique du produit et de pouvoir arrêter le développement de molécules qui pourraient présenter des alertes importantes et ainsi éviter des études plus longues avec plus d'animaux. Les études de 90 jours sont des études réglementaires demandées par les autorités.
Procédures
Un seul prélèvement d'urine en cage à diurèse pendant un maximum de 16h par étude. Un Gavage journalier tout au long de l'étude à l'aide de sondes souples adaptées à la taille et à l’âge des animaux. Des pPrélèvements sanguins d’un volume réduit sur la première journée (en général 4) et un volume plus important en une seule fois sur la dernière journée. Les volumes des prélèvements sanguins ne dépasseront pas les limites calculées en fonction du volume de sang circulant en laissant respectivement 1, 2 ou 3 semaines de récupération en cas de prélèvements multiples ou 15% en cas de prélèvement unique ) soit un maximum de 1.2ml par semaine pour un rat de 250g ou 100µl pour une souris de 25g.
Impact sur les animaux
Les effets toxiques attendus sur les animaux sont modérés car des études préliminaires de tolérabilité et de choix de doses ont déjà été réalisées. Certains signes de toxicité peuvent néanmoins apparaitre en cours d'études. Afin de les mettre en évidence, les animaux sont observés quotidiennement y compris le week-end et au moins une fois par semaine ils font l'objet d'une observation clinique détaillée, leur poids, consommation alimentaire sont mesurés. Deux types de points limites ont été définis et sont détaillés dans les procédures internes : les signes cliniques nécessitant la surveillance rapprochée des animaux et les signes cliniques sévères ou critères majeurs nécessitant une action immédiate et justifiant à eux seuls l’euthanasie de l’animal (critères d’arrêt). La présence d’un seul de ces critères d’arrêt nécessite de prévenir immédiatement le directeur d’étude et doit conduire à l’euthanasie de l'animal. En cours d’étude, plusieurs échantillons de sang peuvent être prélevés au cours d'une période de 24h pour l’analyse des concentrations de la substance à tester. Les prélèvements peuvent être faits via la veine caudale ou la veine saphène. Ces derniers peuvent induire de petits hématomes, qui disparaissent rapidement. Lors des prises d'urine les animaux sont isolés une nuit. Pour certains prélèvements les rats peuvent être soumis à un jeune de 16h maximum.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort en fin d'étude pour évaluer l’effet de la molécule sur les organes en particulier grâce aux analyses histologiques. Les animaux excédentaires exclus de l'étude après randomisation peuvent être gardés en vie et être replacés ou seront intégrés dans le processus de formation du personnel aux gestes techniques.
Remplacement
De nombreux essais in silico et in vitro sont utilisés pour identifier/confirmer des mécanismes d’action préalablement au recours aux études animales. Mais ils ne peuvent prendre en compte l’intégralité des mécanismes conduisant ou pas à l’apparition d’effets toxiques et ils ne peuvent pas donner d’informations concernant les effets à long terme ni la gravité des effets qui suit l'exposition au produit. De même, pour comprendre le mode d'action d'une toxicité spécifique, un enchaînement d’évènements biologiques au niveau moléculaire et tissulaire doit être identifié et caractérisé.
Réduction
Ces études se font dans le respect des 3Rs avec un nombre restreint d'animaux. L'utilisation du microsampling permet de mesurer sur un nombre restreint d'animaux des taux de biomarqueurs et la concentration plasmatique en matière active. Le nombre d'animaux est justifié par les recommandations des guidelines internationales, ils doivent permettre une analyse statistique suffisante. Les tests statistiques utilisés ont été définis par un statisticien interne ou par un consultant externe spécialisé en analyse statistique et correspondent aux tests classiquement utilisés et acceptés en toxicologie.
Raffinement
Dans ces études, les animaux sont hébergés en groupe (ou individuellement, temporairement ou si nécessaire dans le cas des études inférieure à 90 jours) avec un enrichissement du milieu adapté à leur âge et leur espèce. Les animaux sont alimentés par une nourriture contrôlée et adaptée, les certificats concernant cette nourriture sont archivés par le laboratoire. Les animaux sont observés quotidiennement y compris les week-ends. Ils sont pesés à intervalle régulier pour vérifier leur croissance ou leur bien-être. La consommation de nourriture est également mesurée à intervalle régulier. Toutes ces mesures sont réalisées par des techniciens confirmés qui suivent des périodes de reformation régulière. Des points limites ont été identifiés qui peuvent nécessiter la mise à mort précoce de l’animal qui sera demandée par le directeur d’étude. En cas de problème un vétérinaire est présent sur le site pour assurer un traitement. En cours d’étude si besoin des prélèvements sanguins seront réalisés en fonction des recommandations du NC3R National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research). A la fin de chaque étude, un résumé est réalisé et une évaluation du bien-être animal est réalisée par la structure du bien-être animal et le comité d’éthique.
Choix des espèces
Les études sur les animaux décrites précédemment ont été validées chez le rongeur (mâle et femelle) et font l’objet de lignes directrices internationales. Il y a par conséquent, suffisamment de données pour indiquer que le rat et la souris sont les espèces les plus appropriées pour étudier les aspects abordés dans le projet actuel. Les données générées chez ces espèces peuvent être extrapolées à l’homme. Toutes les études décrites dans ce projet utilisent en général de jeunes adultes conformément aux recommandations pour les études de toxicité réglementaire. Pour les études non réglementaires des animaux jeunes ou adultes de 6 à 13 semaines sont utilisés.
Etude de l’effet antitumoral d’une combinaison de nanoparticules activées par la radiothérapie avec un agent immunothérapeutique chez les souris BalB/C et C57 Black6
- Recherche appliquée
- Cancers
11 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chaque animal porte deux tumeurs greffées et reçoit des injections répétées et des séances d'irradiation, le développement tumoral pouvant provoquer nécrose et automutilation. Le projet teste des nanoparticules activées par radiothérapie associées à des immunothérapies contre le cancer. Le porteur affirme que ces mécanismes immunitaires dans un organisme entier ne peuvent être reproduits en culture cellulaire, un tri in vitro ayant précédé les greffes.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’évaluer un traitement sur des souris possédant un système immunitaire intact et porteuses de deux tumeurs (une sur chaque flanc droit et gauche, pouvant être de nature identique ou différente). Le principe sera d’étudier la réduction du volume tumoral sur la tumeur gauche non-traitée, à la suite du traitement de la tumeur droite et de mettre en exergue l’effet à distance du traitement appliqué via le système immunitaire de l’organisme (effet abscopal). Le traitement de la tumeur droite sera induit par l’injection de nanoparticules activées par radiothérapie, ou par de la radiothérapie seul, ou par une combinaison de ces traitements avec un agent immunomodulateur. Les immunomodulateurs (AIM) peuvent agir à différents niveaux dans le cadre de la réponse immunitaire antitumorale. Par conséquent, il sera intéressant de regarder l’effet de nos nanoparticules sur les différents niveaux de fonctionnement du système immunitaire, c’est pourquoi différents AIM seront évalués en combinaison avec les nanoparticules et la radiothérapie pour ce projet.
Bénéfices attendus
Les nanoparticules activées par la radiothérapie ont démontré leur capacité à tuer les cellules cancéreuses plus efficacement que la radiothérapie seule. D’autres données ont montré que ces nanoparticules sont capables de rendre la tumeur plus attractive pour les cellules immunitaires, par rapport à la radiothérapie seule. Cela permet donc une meilleure réponse immunitaire contre la tumeur. Ces observations font le lien avec les raisons justifiant l’utilisation des nanoparticules activées par la radiothérapie en association avec des agents immunothérapeutiques. Les traitements de patients par des agents immunomodulateurs (AIM) ne fonctionnent que dans 10 à 30% des cas. Dans la majorité des cas (70-90%), l’utilisation de ces agents ne fonctionne peu ou pas, car les tumeurs traitées ne présentent quasiment pas de réponse immunitaire anti-tumorale avant le traitement (au contraire des patients répondants). Ceci souligne la nécessité d’une réponse immunitaire anti-tumorale déjà présentes pour que ces traitements fonctionnent.
Procédures
Injection sous-cutanée : sous anesthésie locale, sur tous les animaux des procédures. 2 injections le même jour (flanc gauche et droit). Réinjection possible une fois, si disparition des greffes tumorales. Maximum 1min/animal. Injection intra-veineuse : animal vigile en contention dans un système permettant l’accessibilité à la veine caudale de l’animal. 1 injection/animal. Maximum 5min/animal. Injection intra-tumorale : sous anesthésie générale de courte durée sur tous les animaux des procédures impliquant l’injection de nanoparticules (ou glucose). 1 injection/animal. Maximum 2 min/animal. Injection intra-péritonéale : lors des procédures précisant l’administration d’agents immunomodulateurs ou lors de traitements de soin pouvant être répéter le cas échéant. Maximum 1 min/animal. Irradiation des tumeurs sous-cutanées : animal vigile en contention et protégé dans un système adapté permettant l’irradiation de la tumeur uniquement. 1 irradiation/jour sur une durée de 1 à 5 jours. Maximum 20 min/animal. Prélèvements sanguins : 1) Une fois avant traitement par ponction de la veine caudale. 2) Juste avant l’euthanasie, un prélèvement pourra être effectué au niveau de la veine mandibulaire sous anesthésie générale par ponction. Maximum 5min/animal.
Impact sur les animaux
Bien que l’animal soit dans un système de contention permettant uniquement l’exposition de la tumeur aux radiations, la radiothérapie peut parfois provoquer une perte de poids, une difficulté à se nourrir, liées à l’irradiation du système digestif de l’animal. L’injection des cellules tumorales en sous cutané et l’injection intra-tumorale sont des gestes pouvant occasionner une angoisse ou de la douleur pour l’animal. Bien qu’aucune toxicité ou effet secondaire ne soit attendue, les composés utilisés peuvent potentiellement occasionner de la douleur pour l’animal. Le développement tumoral peut également provoquer des nuisances pour la souris notamment avec l’apparition de nécrose et la mutilation de l’animal (ronge les zones nécrotiques).
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés dés lors d’une atteinte d’un des points limites, ou lorsque l’animal arrive à la fin d’une des procédures décrites pour analyses. Les différents prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem et cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux.
Remplacement
L'étude porte sur des mécanismes complexes qui ont lieu dans un organisme entier et implique la réponse immunitaire. Il n'est pas possible de remplacer par une culture cellulaire ou un organoïde. En revanche, les lignées cellulaires cancéreuses ont d'abord été testées in vitro pour sélectionner les plus pertinentes pour être greffées sur des animaux.
Réduction
Les données des publications scientifiques avec les nanoparticules en combinaison avec la radiothérapie sur les cellules cancéreuses utilisées (prise de greffe, croissance tumorale, courbes de survies) ainsi que sur les agents immunomodulateurs (mode d’administration, dose efficace, toxicité) nous ont permis de réduire au maximum le nombre d’animaux requis pour cette étude. L'expérience acquise et un calcul de puissance de test statistique ont contribués à limiter au strict minimum dans l’étude le nombre d’animaux nécessaire afin d'optimiser l’évaluation du traitement, soit 11520 au maximum sur 5 ans. Il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupe de 5 animaux/cage, dans des conditions apyrogènes (nourriture stérilisée et eau disponible à volonté), dans des portoirs ventilés avec température et humidité ambiante contrôlées. Du coton et ou du kraft sera mis à disposition dans la cage afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des maisonnettes qui leur servent d’abri. L'inconfort, la douleur ou l'angoisse des animaux potentiellement liés à la toxicité du composé (bien qu’aucune toxicité ne soit attendue) seront traités par des médicaments adaptés. Aussi, pour éviter toute souffrance aux animaux, ils seront sous anesthésie générale lors des procédures d’injections intra-tumorale et sous anesthésie locale lors des procédures d’injections sous-cutanées. Une habituation des animaux sera mise en place pour les systèmes de contention en amont des injections intra-veineuse et des irradiations. Enfin, des points limites adaptés seront mis en place pour permettre de limiter la douleur à son minimum tout au long des procédures expérimentales. Tout animal présentant une perte de poids par rapport au poids initial sans reprise sera euthanasié. Une dégradation de l’état général (signe de faiblesse, poil hérissé, refus de s’alimenter) entraînera l’isolement de l’animal. Des mesures thérapeutiques seront mises en place telles que l’administration de compléments nutritifs. Si malgré les traitements mis en place les signes cliniques persistent ou progressent, l’euthanasie sera réalisée. Tout animal présentant une nécrose ulcérant de la tumeur ou un volume tumoral total trop important sera euthanasié.
Choix des espèces
La sélection de cette espèce de rongeur est basée sur le fait que les modèles de tumeurs greffées chez des souris immunocompétentes (ayant un système immunitaire pleinement fonctionnel) sont très répandues pour l’étude de traitements anti-cancéreux à travers toute la recherche en immuno-oncologie. Les lignées cellulaires choisies sont issues soit de la souche BalbC (ex : cellules CT26), soit de la souche Black6 (ex : cellules B16F10). Ces souris ayant un système immunitaire pleinement fonctionnel, il est nécessaire d’injecter les lignées cellulaires dans la souche de souris d’origine afin d’éviter tout rejet de greffe. Des souris de 7-8 semaines, jeunes adultes, ont été sélectionnées. Pour des raisons techniques, le poids des animaux doit être au minimum de 20 grammes afin d’assurer de bonnes conditions de traitement par radiothérapie. Pour les irradiations localisées, les animaux sont disposés dans des systèmes de contention exposant uniquement la zone d’intérêt. Ces systèmes sont adaptés à des souris de taille adulte.