Souris
Évaluation des composés diagnostiques ou thérapeutiques sur des animaux porteurs de tumeurs de poumon localisées
- Recherche appliquée
- Cancers
Rats : 1000
1 000 souris et 1 000 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une tumeur pulmonaire leur est greffée par ouverture d'un espace intercostal, un geste que le porteur décrit lui-même comme sévèrement douloureux, avec irradiation et traitements répétés. L'établissement, prestataire de services précliniques, propose ces modèles à des clients pour tester des composés avant l'humain. Il affirme que les méthodes sans animaux ne permettent pas de prévoir l'efficacité in vivo.
Objectifs
Au niveau mondial, il a été constaté une forte augmentation de l’incidence du cancer du fait du vieillissement de la population et de facteurs environnementaux qui se dégradent. En 2020, quelque 19,3 millions de nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués et 10 millions de décès sont à déplorer des suites de cette maladie, selon des données publiées par le Centre international de recherche contre le cancer (CIRC). Second cancer le plus souvent diagnostiqué (2.21 millions de cas recensés en 2020), le cancer du poumon est à ce jour le plus meurtrier (1.8 million de décès en 2020). Selon l’OMS, une personne sur cinq souffrira d’un cancer dans sa vie. Un homme sur huit et une femme sur onze en décèderont. Le cancer se caractérise par une dégradation pathologique des processus contrôlant la prolifération cellulaire, la différenciation et la mort programmée de certaines cellules. Tous les tissus ou organes peuvent être atteints. Bien que possédant des caractéristiques communes, différents types de cancers ont des causes très éloignées et répondent de façon extrêmement différente à un traitement. L’objectif de ce projet est de développer un modèle de cancer de poumon orthotopique monocentrique chez les rongeurs (rats ou souris), le plus prédictif possible afin de refléter la pathologie cancéreuse et de pouvoir évaluer des composés thérapeutiques dans un contexte pathologique le plus proche possible de l’homme et d’arriver, avant les essais cliniques, à établir une réelle évaluation de l’efficacité de cette molécule destinée à traiter les tissus cancéreux localisés chez l’homme. Une fois le modèle établi, une évaluation de la toxicité, de la pharmacocinétique et de la biodistribution des traitements pourra aussi être réalisée en plus de l’évaluation de l’efficacité antitumorale.
Bénéfices attendus
Notre société, prestataire de services en recherche préclinique propose un large panel de modèles in vivo nécessaires à l’évaluation de nouveau composés thérapeutiques pour la recherche contre le cancer. Cependant, pour certaines applications thérapeutiques, de nouveaux modèles précliniques les plus prédictifs possibles doivent être établis afin de pouvoir transposer l’utilisation de ces molécules chez l’homme lors d’essais dans différentes phases cliniques. L’animal, représente un système d’essai physiologiquement proche de l’homme, permettant d’évaluer l’efficacité, la toxicité, la pharmacocinétique et la pharmacodynamique de nouveaux composés afin d’éviter ces essais directement chez l’homme. Au cours des expériences réalisées, il sera possible d’étudier les mécanismes de croissance d’une tumeur pulmonaire dans un environnement mimant la pathologie chez l’homme, d’étudier les mécanismes de résistance après des traitements avec de nouvelles molécules ou des molécules déjà utilisées en clinique, et les mécanismes de progression tels que la formation de métastases. Grâce à ces études dans un environnement adapté, il sera aussi par exemple possible de suivre la réaction du système immunitaire de l’hôte face à la progression de la maladie, de moduler et/ou orienter le système immunitaire afin de donner à l’organisme les moyens de se défendre contre le cancer.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : Ils seront identifiés par implantation d’un transpondeur ou clips aux oreilles ou tatouage, sous anesthésie (moins de 1 minute). Les animaux seront irradiés après un court transport (durée totale moins de 30 minutes, les animaux restant dans leur cage de stabulation). La greffe tumorale sera une procédure chirurgicale d’une trentaine de minutes environ et sera réalisée sous anesthésie et analgésie pré- et post-opératoire. L’acte douloureux de la chirurgie (ouverture intercostale) durera moins d’une minute. Les animaux pourront recevoir des traitements par voie intramusculaire (IM) ou intradermique (ID) sous anesthésie et analgesie (1 minute). Les animaux vigiles et sous contention pourront recevoir des traitements par voies intra-péritonéale (IP), intra-veineuse (IV), sous-cutanée (SC), intra-nasale (IN), intra-trachéale (IT) ou orale (1 minute) Des prélèvements sanguins pourront être réalisés (1 minute) sur animaux vigiles sous contention si nécessaire ou si possible sous anesthésie. Si un suivi par une technique d’imagerie est envisagé, il sera réalisé sous anesthésie générale pour une durée maximale d’1 heure.
Impact sur les animaux
Pour ces modèles la greffe (injection de suspension de cellules ou greffe de fragments) de la tumeur est réalisée dans un lobe pulmonaire (modèle orthotopique). La douleur liée à cet acte est sévère en particulier du fait de l’ouverture d’un espace intercostal. L’évolution du volume tumoral pourra entrainer des troubles respiratoires généralement modérés tels qu’un essoufflement des animaux et une modification de la posture, ainsi qu’une perte de poids et une diminution de motricité en particulier. Ces effets seront évalués plus en détail lors de la première étude.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l’issue de chaque procédure (la méthode utilisée étant l’une de celles autorisées par la Directive 2010/63). Les animaux étant porteurs de tumeur et ayant fait l’objet de gestes techniques et reçu des traitements, aucune autre utilisation ne peut être envisagée.
Remplacement
Les méthodes alternatives ne permettent pas, à ce jour, de prévoir l’efficacité in vivo de potentiels candidats-médicaments, car les étapes nécessaires au développement d’un médicament pour lesquelles il est nécessaire d’étudier les interactions du médicament dans un contexte globale ne peuvent pas être étudiées dans un système alternatif (in vitro par exemple). Des méthodes alternatives de reconstruction d’organes ou de tumeurs en 3D sont utilisées mais reste toutefois marginales et les résultats obtenus restent à ce jour difficilement transposable à l’homme.
Réduction
Dans chaque étude, les animaux seront répartis en groupes expérimentaux selon le(s) critère(s) défini(s). Le nombre de groupes contrôles sera ajusté à la question scientifique posée et des paramètres étudiés. Les variations de ces paramètres et de la mortalité entre les groupes contrôles et traités seront comparées pour évaluer les composés testés. La validité scientifique nécessite d’utiliser un nombre minimum d’animaux par groupe pour que les tests statistiques soient valides et représentatifs d’éventuelles variations inter-individus. Une étude peut être composée de 2 à 10 groupes. Le nombre d’animaux par groupe variera généralement entre 3 (biodistribution) à 15 (dans le cas de multiples paramètres d’efficacité à évaluer) par dose de produit. Jusqu’à 10% d’animaux excédentaires pourront être inclus initialement (avant randomisation) afin de plus facilement constituer des groupes homogènes au moment de la randomisation. Si de la mortalité est constatée au moment de la chirurgie de greffe lors de la première étude, le nombre d’animaux excédentaires pourra augmenter du pourcentage de décès à la chirurgie. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ces procédures, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et des techniques faiblement invasives d’imagerie chez le petit animal.
Raffinement
La greffe sera réalisée sous anesthésie générale avec administration préalable d’un analgésique opiacé et d’un alpha2 agoniste. En fin puis durant 2 jours suivant la chirurgie, un anti inflammatoire non stéroidien sera administré. 4h, 8h, et 24h après la chirurgie, les animaux recevront un analgésique opiacé. La chirurgie sera réalisée stérilement, avec maintien de la température corporelle, et surveillance post-opératoire jusqu’au réveil puis toutes les 2h sur 6h au total. Les actes douloureux (thoracotomie en cas d’exsanguination terminale par section d’un vaisseau thoracique, flush des organes au PBS en intracardiaque) seront réalisés sous anesthésie profonde avec Kétamine/Xylazine et analgésie 30min avant l’acte (Buprénorphine). Les injections IM/ID sont réalisées avec analgésie (opiacés) préalable. Les autres administrations/prélèvements seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress (IV, prélèvement d’urine) ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer spécifiquement l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Une sgrille de scoring est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Au début, le scoring avec pesée est réalisé 3 fois par semaine minimum, puis tous les jours dès que certains animaux présentent des signes cliniques, y compris des pertes de poids (voir procédure). Un gel nutritif ou de l’eau gélifiée et de la nourriture seront placés au fond de toutes les cages dès une perte de poids >5% observée sur certains animaux. Les scores cliniques les plus élevés et l’accumulation de scores intermédiaires constitueront un point limite (voir plus loin). Une perte de poids élevée ou prolongée constituera un point limite. Dans le cas de modèles cachectiques, le point limite de perte de poids sera adapté et de la nourriture enrichie sera apportée dès l’induction. En cas de toxicité sur l’animal, afin de limiter la souffrance des animaux une procédure sous forme d’un arbre décisionnel sera suivi par l’équipe projet. Pour raffiner, il sera toujours proposé d’utiliser des biomarqueurs et de l’imagerie faiblement invasives permettant d’atteindre l’objectif plus tôt et de sortir l’animal de la procédure. De l’enrichissement est utilisé.
Choix des espèces
Les petits rongeurs, outre l’avantage lié à leurs caractéristiques physiologiques, sont les seules espèces animales disponibles pour l’expérimentation présentant un statut immunodéprimé (avec des mutations spontanées ou génétiquement modifiées) indispensable à l’implantation de cellules tumorales humaines dans le cadre de la recherche en oncologie. De plus, diverses souches de souris et rats immunocompétents sont également disponibles pour l’établissement de modèles tumoraux syngéniques. De plus, les rats et les souris autorisent une variété de techniques d’administration, de prélèvement et de chirurgie présentant des analogies avec ce qui peut être réalisé en recherche clinique sur l’homme. Les animaux seront utilisés après sevrage à l’âge de jeunes adultes (7 semaines minimum). Toutefois, il pourrait arriver que les animaux soient reçus à partir de l’âge de 5 semaines, mais les procédures ne débuteront pas avant 7 semaines d’âge.
Modèle d’hépatite alcoolique aigue sévère chez la souris et transplantation de microbiote intestinal
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
1 675 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Des femelles gestantes puis leurs petits sont gavés quotidiennement d'alcool sous régime gras pour reproduire une hépatite alcoolique aiguë, avec transplantation de microbiote fécal. Le porteur indique que le protocole peut entraîner une perte de poids importante et qu'aucun antalgique ne peut être administré, en raison de son effet sur le microbiote. Il affirme qu'aucun modèle cellulaire n'existe et que la modélisation animale est indispensable.
Objectifs
L’Hépatite Alcoolique Aigüe sévère (HAA) est l’une des formes les plus graves de maladie du foie liée à la consommation chronique et excessive d’alcool. La mortalité attribuable à l’HAA est de 40 à 45% à 6 mois. La corticothérapie, seul traitement recommandé, améliore la survie à court terme. Cependant elle peut s’accompagner de complications infectieuses avec 25,6% des patients atteints d’HAA présentant une infection qui les rend inéligibles au traitement et se trouvent sans alternative thérapeutique. L’identification précoce des non-répondeurs aux corticoïdes est un enjeu thérapeutique pour éviter un traitement inutile et risquer une infection. De plus, dans le cas de résistance à la corticothérapie (30% des cas) la mortalité s’élève à plus de 75%. Récemment, le rôle du microbiote intestinal (MI) a été mis en lumière. En effet, le MI d’un patient ayant une HAA est différent de celui d’un patient sans HAA. De surcroit, le transfert du MI d’un patient avec une HAA sur un modèle de souris germ-free (dépourvue de microbiote) peut induire une inflammation hépatique. La transmission d’inflammation est réversible par une nouvelle transplantation d’un MI provenant d’un humain n’ayant pas développé de HAA, suggérant un concept de traitement de l’HAA par la Transplantation de Matière Fécale (TMF). Utiliser un modèle préclinique d’HAA chez des souris conventionnelles afin d’identifier les mécanismes immunomodulateurs de la TMF et comprendre les mécanismes physiopathologiques de réponse ou de résistance à la corticothérapie est crucial. Le rôle d’une TMF seule comme traitement d’une HAA ne peut être investigué en clinique pour des raisons éthiques car les patients ne peuvent pas ne pas recevoir les corticoïdes (traitement de référence). Ce modèle préclinique pourra être le modèle de référence pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements pour soigner l’HAA.
Bénéfices attendus
Le modèle préclinique développé pourrait, à court terme, être le modèle de référence pour évaluer l’efficacité de nouveaux traitements pour soigner l'HAA. La TMF seule comme traitement d’une HAA ne peut être investiguée en clinique pour des raisons éthiques. La démonstration de son efficacité dans ce modèle préclinique pourrait, à plus long terme, faire progresser les connaissances sur le bénéfice de la TMF dans le traitement de l’HAA et ainsi encourager de nouveaux essais cliniques. De plus, le traitement par TMF proposé dans ce travail se présente sous forme de gélules orales auto-administrées, cela ouvre de nombreuses perspectives d'utilisation pour de nombreuses pathologies démontrant une dysbiose. La démontration de l’efficactié de la TMF ouvre des perspectives thérapeutiques cruciales pour des patients se trouvant en impasse thérapeutique et où il n’existe pas d’alternatives thérapeutiques.
Procédures
Sur animaux vigiles: -Différents prélèvements non invasifs (urinaires, féces) sont réalisés hebdomadairement pendant toute la durée du protocole. -Au maximum 3 injections et des gavages quotidiens par animal seront réalisés.
Impact sur les animaux
La manipulation des mères gestantes peut induire un stress important. Les antibiotiques n'induisent pas de nuisance chez les souris gestantes. La répétition de gavages et d'injection peut induire un stress et une douleur modérée, notamment sur les femelles gestantes pour lesquelles le stress pourrait être plus important. Les prélèvement invasifs et non invasifs pourraient provoquer un léger stress chez les souris. Les précédentes études sur la procédure d'induction de l'HAA a montré qu'il pouvait induire une perte de poids importante.
Devenir
L'ensemble des animaux seront mis à mort pour réaliser différentes analyses biologiques et histologiques.
Remplacement
Il n’existe aucun modèle dans la littérature de modèlisation cellulaire de l’HAA. De plus, pour vérifier l’efficacité du traitement, la modèlisation animale est une étape indispensable. Dans ce projet, le modèle préclinique permet de tester l’efficacité d'un nouveau traitement qui ne peut être investigué en clinique pour des raisons éthiques.
Réduction
Une expérience préliminaire sera réalisée pour définir le meilleur modèle de la HAA pour notre étude. L’utilisation du modèle développé permettrait de réduire le nombre de gavages et de manipulations dans l’établissement du microbiote intestinal d’intérêt. Le nombre de souris par groupe a été évalué via une étude statistique. Nous comparerons les traitements au sein de chaque groupe à l'aide de tests statistiques adéquates. Nous procéderons à 5 répétitions du protocole retenu (5 donneurs différents pour chaque groupe) mais une évaluation de la significativité sera effectuée à 3 répétitions pour réduire le nombre de souris. A la suite de l’expérience préliminaire. Au total 150 femelles gestantes et 750 femelles et 750 mâles seront nécessaires au développement du modèle d'HAA.
Raffinement
Les animaux seront mis avec présence d’enrichissement (litière foisonnante, roue d’activité motrice) et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Les conditions d’hébergement ont été optimisées pour réduire le stress des animaux : présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés et/ou coton), et maintien des animaux en groupes de 6 afin d’éviter le stress de l’isolement. Dès leur arrivée à l’animalerie et jusqu’à leur mort, nos animaux seront surveillés de manière régulière, pesés 2 fois par semaine. Durant ce protocole, les animaux seront surveillés au moins une fois par jour pour s’assurer de leur bonne santé. Si une détérioration de l’état des animaux est observée, une grille de notation sera réalisée pour s’assurer que celle-ci ne dépasse pas les points limites. En cas de souffrance l’expérimentateur habilité appliquera les soins appropriés, soit une réhydratation par injection de solution glucosée à 5%, ou l’euthanasie de l’animal si nécessaire. il sera impossible de lui administrer des antalgiques en raison de leur impact sur le MI. Chaque mère sera mise dans une cage seule, avec présence d’enrichissement (litière foisonnante, roue d’activité motrice) et un accès ad libitum à l’eau et la nourriture.
Choix des espèces
La souris est l’espèce de référence dans l’étude de la maladie alcoolique du foie. Des femelles gestantes au dernier tiers de gestation puis les femelles allaitantes seront gavées avec le microbiote d'intérêt afin de mimer la transmission du microbiote de la mère au nouveau-né. Après le sevrage, les souris sevrées sont séparées en fonction de leur sexe et seront nourries, dès qu’ils atteindront le poids de 19g pour les femelles et 20g pour les mâles, de manière chronique avec un régime gras contenant de l'alcool et des gavages quotidiens d'alcool. Après induction de l'HAA , les souris recevront le traitement. Il faut noter, comme le précise les études antérieures que ce protocole peut induire une perte de poids importante, seules des souris de poids supérieurs à 19-20g recevront le régime gras contenant de l'alcool .
Efficacité thérapeutique des cellules stromales mésenchymateuses d’origine adipocytaire sur des modèles murins de sclérodermie systémique
- Recherche appliquée
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
Des souris sont rendues malades par une injection intradermique cinq jours par semaine pendant quatre à six semaines, soit 20 à 30 injections de bléomycine ou d'acide hypochloreux, qui provoquent une fibrose de la peau et des poumons censée reproduire la sclérodermie systémique. 134 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent aussi une injection unique de cellules souches issues du tissu adipeux dans la veine de la queue, et le porteur décrit des démangeaisons, de petites plaies au point d'injection et une fibrose pulmonaire qui, selon lui, "n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires". Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur sang, leurs poumons, leur rate et leur peau.
Objectifs
L’objectif du projet est d’évaluer la possibilité d’utiliser des cellules stromales mésenchymateuses d'origine adipocytaire (ASCs) en clinique (traiter des patients atteints de sclérodermie systémique). Ainsi, nous évaluerons leurs effets thérapeutiques (réduction de l’inflammation et de la fibrose cutanée et /ou pulmonaire), leurs interactions avec différents types de cellules immunitaires et le(s) mécanisme(s) impliqué(s) dans leurs effets thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le bénéfice du projet sera de valider si la thérapie cellulaire de cellules stromales et en particulier d'origine adipocytaire (ASCs) est efficace pour contrer les troubles majeurs de la sclérodermie systémique que sont la fibrose cutanée et pulmonaire et, dans une moindre mesure, la production d’anticorps et d’apporter de nouvelles connaissances sur leurs effets thérapeutiques.
Procédures
Les souris seront soumises à une injection intra-dermique (5 jours/semaine) pendant 4 semaines (procédure N°1 et N°2 ) ou pendant 6 semaines (procédure N°3) et à une seule injection intraveineuse dans la veine caudale de cellules souches stromales d'origine adipocytaire (ASCs).
Impact sur les animaux
L'injection intra-dermique de Bléomycine ou d'acide hypochloreux peut entrainer une gène (démangeaisons) dans les 2-3 minutes post-injection et aussi parfois des petites plaies ou des irritations cutanées au point d'injection. Ces souris développent une fibrose cutanée au point d'injection et une fibrose pulmonaire modérée, limitée à la région sous-pleurale qui n'entraine pas de signes de difficulté ou de souffrance respiratoires.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser des prélèvements de tissus et d'organes (sang, poumons, rate et peau)
Remplacement
Il est important de voir les effets thérapeutiques des cellules mésenchymateuses stromales au niveau de l’animal entier portant une maladie surtout quand celle-ci touche plusieurs tissus ou organes et qu’elle est caractérisée par une autoimmunité (présence d’auto-anticorps dans la circulation sanguine), impossible à reproduire in vitro. La souris possède de nombreuses caractéristiques physiopathologiques communes avec l’homme, indispensables à l’extrapolation des résultats.
Réduction
Afin de réduire le nombre d'animaux pour ce projet, nous testerons la tolérance des souris à l'injection des cellules souches stromales adipocytaires (ASCs) uniquement dans la procédure N°1 et sur un nombre réduit de souris c'est à dire 5 souris/groupe au lieu de 10 pour les groupes de souris malades.
Raffinement
Les procédures ont été travaillées pour limiter le stress et la souffrance des animaux. Les souris seront au maximum 5 dans des cages enrichies. Une observation quotidienne des souris sera réalisée (apparence physique, comportement), une pesée sera réalisée une fois par semaine et, si des signes de souffrance sont détectés chez les animaux, des sédatifs ou anti-douleurs adaptés (après avis du vétérinaire) pourront être leur être administré.
Choix des espèces
Parmi les rongeurs, il n'existe pas d'autres modèles de sclérodermie systémique que le modèle murin. Par ailleurs, le modèle murin est indispensable pour suivre l'apparition des effets systémiques et en particulier l'autoimmunité caractérisée par la production d'autoanticorps. Les souris seront adultes car la sclérodermie systémique est une pathologie qui affecte les adultes
Etude de l’expression de la SELENOT et effets du peptide PSELT dans la régulation périphérique et centrale de l’homéostasie énergétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
Des souris rendues obèses et hyperglycémiques par un régime riche en graisses reçoivent pendant environ deux mois des injections intrapéritonéales de peptides, ou une mini-pompe implantée sous anesthésie pour un mois de traitement, et passent des tests de sécrétion d'insuline de deux à quatre heures, avec jusqu'à dix prises de sang à la queue en une demi-journée. 365 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré ou menées sous anesthésie sans réveil, toutes tuées à l'issue, certaines pour des prélèvements d'organes ou de grandes quantités de sang. L'équipe cherche à savoir si le peptide PSELT et trois analogues agissent sur l'obésité associée au diabète de type 2, et le porteur dit n'attendre "pas de manifestations particulières" chez ces souris. Le résumé ne précise ni la durée du régime gras ni la fréquence des injections de peptides sur deux mois.
Objectifs
La SELENOT est une nouvelle thiorédoxine impliquée dans le contrôle du stress du reticulum endoplasmique (RE) des cellules neuroendocrines. Elle est notamment impliquée dans la production de la proopiomélanocortine ou POMC et de l’insuline, suggérant que cette protéine anti-oxydante pourrait jouer un rôle dans le maintien de l’homéostasie énergétique et qu’un défaut de son activité pourrait contribuer au développement de l’obésité et ses comorbidités. En effet, il est maintenant bien établi que le cerveau obèse est stressé et que le stress du RE dans l'hypothalamus joue un rôle central dans la résistance à la leptine et le développement de l'obésité. Récemment, l'hypothèse selon laquelle le stress du RE dans l’hypothalamus est causalement lié à la résistance à la leptine et à l'obésité a été étayée par de nombreuses preuves expérimentales. En effet, lors d'un régime riche en graisses (high fat diet, HFD) chronique, les neurones hypothalamiques développent un stress du RE qui induit une résistance à la leptine et à l'insuline, et conduit à un gain de poids. L'effet anorexigène de l'alpha-MSH, peptide dérivé de la POMC, joue un rôle déterminant dans le contrôle de l'équilibre énergétique et du poids corporel. Ces données ont permis d’établir que le développement des neurones POMC et la maturation de la POMC en alpha-MSH sont altérés par le stress du RE qui est associé à l'obésité, entraînant une diminution de la production et de la sécrétion d'alpha-MSH, le régulateur central de l'homéostasie énergétique. Ces observations suggèrent que les neurones POMC pourraient être avantageusement ciblés pour le traitement des dysfonctionnements des neurohormones causés par le stress du RE et associés à l'obésité. L'identification d'un agent unique capable de cibler ce processus physiopathologique dans des tissus contrôlant le métabolisme tels que l'hypothalamus et le pancréas est un objectif majeur. Dans ce contexte, il est donc important d’étudier les variations de l’expression de la SELENOT dans l’hypothalamus de souris suite à un régime HF et de déterminer les effets du peptide en dérivant, le PSELT et quelques analogues (3 autres peptides analogues modifiés chimiquement pour supprimer, contrôle, ou améliorer l’activité) au cours de l’obésité et du diabète de type 2 associé car ces recherches pourraient ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques dans le traitement de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra, pour la première fois, de répondre à la question de la régulation de l’expression hypothalamique de la SELENOT, nouvel acteur potentiel dans la régulation centrale et périphérique du métabolisme énergétique et de l’application thérapeutique du PSELT pour le traitement de l’obésité associée au diabète de type 2. Cette étude a l’avantage d’aborder, en parallèle, les effets du PSELT aussi bien en périphérie que dans le cerveau en condition physiologique et physiopathologique.
Procédures
Les 4 procédures correspondant au test de sécrétion d'insuline, préparation d'explants, prélévements de tissus et biodistribution du PSELT) dureront 2-4 h (sécrétion d'insuline et biodistribution du PSELT). Des prélévements de sang seront effectués à partir de la queue des animaux vigiles comme décrit dans les différentes procédures (10 maximum par animal sur une demi-journée, chacun des prélévements prendra moins d'une minute). L'implantation de mini-pompes Alzet sera effectuée sur souris anesthésiées et toutes les précautions d'usage seront suivies pour minimiser la douleur. Au total, l'intervention durera 10 min par souris. Les mini-pompes Alzet sont implantées pour des traitements d'un mois. Les traitements avec administration intrapéritonéale des peptides dureront environ 2 mois.
Impact sur les animaux
Le protocole de nutrition qui sera utilisé entraine un surpoids et une hyperglycémie chez la souris constituant un modèle d'obésité et de diabète de type 2 chez l'animal. Ce modèle est très largement utilisé dans la littérature scientifique. Les analyses d'expression de la SELENOT ne présentent pas de difficulté supplémentaire pour l'animal et le traitement par le peptide PSELT n'a pas montré d'effets indésirables ou de nuisancs chez la souris dans d'autres études antérieures de l'équipe. Par conséquent, nous n'attendons pas de manifestations particulières chez les animaux qui seront utilisés dans ces études.
Devenir
Les souris utilisées pour les tests physiologiques seront maintenus en vie pour le suivi des analyses postérieures aux différents tests. A la fin de ces différents tests, ces animaux seront sacrifiés. Les animaux prévus pour des prélévements d'organes ou de grande quantité de sang seront sacrifiés.
Remplacement
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du PSELT dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme.
Réduction
En accord avec des expériences antérieures et pour limiter le nombre d'animaux utilisés, les processus physiologiques étudiés seront analysés sur des lots de 12 souris par condition de traitement. Ces effectifs nous assureront d’obtenir des données statistiquement analysables. L’effectif des groupes d’animaux pourra être diminué à 10 lors des études concernant la régulation de la SELENOT tout en conservant des données statistiquement fiables. De plus, les procédures, n’impliquant pas d’effet néfaste à long terme, pourront être menées successivement sur les mêmes animaux intercalées avec des périodes de repos de 5 jours au cours desquelles les paramètres physiologiques et le bien-être des souris seront régulièrement évalués. D'autre part, plusieurs analogues peptidiques seront examinés d'abord in vitro dans des cultures de neurones hypothalamiques (lignée mHypo-POMC) pour leur activité neuroprotectrice et activatrice de la production de POMC avant de sélectionner quelques analogues qui seront étudiés chez la souris obèse. Cette approche réduira sigificativement le nombre d'animaux qui seront utilisés.
Raffinement
Les conditions d’élevage et de manipulation des animaux seront raffinées pour réduire au maximum leur souffrance éventuelle. Ainsi, dans le cas de procédures ayant un impact sévère sur l’animal des mesures permettant de palier le handicap généré seront mises en place. Par exemple, l’ensemble des actes pouvant entrainer une douleur sera réalisé sous anesthésie (locale ou générale) et la douleur au réveil sera traitée par des analgésiques. C’est notamment le cas lors de l’implantation de mini-pompes Alzet après laquelle les souris seront étroitement surveillées pour prévenir l’apparition de tout signe de mal-être. Enfin, certaines procédures nécessitant des prélèvements de structures (ex : explants hypothalamiques et analyse de l’expression hypothalamique de SELENOT et autres marqueurs du stress du RE) sont classées sans réveil.
Choix des espèces
Seule l’utilisation d’un modèle mammifère intégré, donc in vivo chez l’animal entier, peut nous permettre de comprendre, de façon globale, les effets du PSELT dans la dérégulation de l’homéostasie énérgétique au cours de l’obésité associée au diabète de type 2 et d’établir des comparaisons pertinentes avec des données qui pourraient être obtenues chez l’homme. Des souris seront étudiées d'une part parce que les mécanismes de l'obésité et du diabète ont été largement étudiés chez cette espèce dont la physiologie présente certaines similitudes avec celle de l'homme et parce que des modèles transgéniques appropriés peuvent aisément être obtenus chez cette espèce. La souris présente plusieurs avantages en élévage: coût d'entretien réduit et forte performance en reproduction. Des souris adultes seront utilisées car nous souhaitons comprendre les mécanismes de l'obésité et du diabète chez le sujet adulte principalement.
Etude des mécanismes de passage du tPA vasculaire dans le compartiment cérébral et de son interaction avec les macrophages périvasculaires.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent une injection intraveineuse puis, sous anesthésie, une injection chirurgicale dans le liquide céphalo-rachidien, avant que leur cerveau soit prélevé. Le projet vise à comprendre par quels mécanismes le tPA vasculaire, molécule utilisée contre l'AVC, passe vers le cerveau. Le porteur affirme que les méthodes sans animaux ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information et retient la souris comme le meilleur compromis.
Objectifs
L’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) est une protéase sécrétée par l’endothélium vasculaire. Le tPA est surtout connu pour son rôle dans la fibrinolyse mais il est aussi présent dans le parenchyme cérébral. Il est sécrété par les neurones et par d’autres types cellulaires tels que les astrocytes, les microglies et les oligodendrocytes. Le tPA cérébral est impliqué dans de nombreuses fonctions non fibrinolytiques comme l’homéostasie de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Le tPA est également un médicament, seul traitement pharmacologique à la phase aigüe de l’accident vasculaire cérébral ischémique (AVC). Cependant, l’injection intraveineuse de tPA recombinant chez des patients victimes d’AVC peut entrainer des effets secondaires sur les cellules nerveuses déjà compromises par l’AVC. Les vaisseaux sanguins du cerveau sont entourés d’un compartiment rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR) nommé espace périvasculaire. Dans cet espace à l’interface entre le compartiment vasculaire et le cerveau, on retrouve une population cellulaire spécifique : les macrophages périvasculaires (PVM). Le rôle des PVM dans les maladies cérébrovasculaires reste à ce jour peu étudié. Il a été démontré qu’en condition physiologique, le tPA vasculaire est capable de passer du compartiment vasculaire vers le cerveau et que les PVM expriment des récepteurs LRP ("Low density lipoprotein receptor-related protein") . Le tPA possède un domaine de liaison à LRP : le domaine finger, et il a déjà été démontré que le tPA cérébral pouvait être endocyté par les astrocytes via un mécanisme LRP-Finger dépendant. Notre hypothèse est donc que le tPA vasculaire passe dans le compartiment cérébral via un mécanisme LRP-finger dépendant, qu’il peut être endocyté par les PVM également via ce mécanisme. Ce projet vise donc à déterminer les mécanismes par lesquels le tPA vasculaire passe dans le parenchyme cérébral et quels effets ce tPA peut avoir sur les différents types cellulaires et notamment sur les macrophages périvasculaires. Comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacent présente un intérêt à la fois pour une meilleure compréhension de la physiologie du système nerveux et de ces interactions avec le compartiment sanguin, mais également pour améliorer la prise en charge des patients victimes d’un AVC, et traités avec du tPA recombinant en injection intraveineuse.
Bénéfices attendus
Une meilleur compréhension des interractions sang cerveau, et une amélioration de la prise en charge des patients victimes d’un AVC ischémique, en limitant les effets secondaires délétères causés par la thrombolyse avec du tPA .
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie, analgésie puis à une seule injection intraveineuse (duréé : 40min). Les animaux seront soumis à une anesthésie, analgésie puis à une procédure chirurgicale permettant une injection dans le liquide céphalo rachidien (durée : 30min)
Impact sur les animaux
Stress lié à la contention, l'induction et le maintient de l'anesthésie. Douleurs eventuelles liées à la chirurgie (prises en charge par un traitement analgésique adéquat)
Devenir
La mise à mort est nécessaire pour le prélèvement du cerveau, afin de procéder à des analyses immunohistologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. La souris est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine des mécanismes d’action du tPA au niveau du cerveau. La physiopathologie est donc globalement établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. L’ensemble des acquis et des connaissances dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. Le marquage des différentes protéines avec deux fluorochromes permet une co-injection des protéines recombinantes deux à deux et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les weekends et jours fériés et cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce de référence de l’étude de la physiopathologie cérébrale dans la littérature. Les mécanismes d’action du tPA, l’anatomie, la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour notre étude Les souris utilisées dans cette étude seront âgées de 8-12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude des mécanismes physiopathologique du tPA.
Rôle du métabolisme glucidique sur la fonction testiculaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
96 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections quotidiennes sous la peau pendant quinze jours, un test de tolérance au glucose après une période de jeûne, et deux prélèvements sanguins. Elles sont ensuite tuées et autopsiées pour analyser le testicule et d'autres organes. Le projet étudie l'effet de deux molécules régulant le glucose sur la fertilité masculine, le porteur indiquant qu'aucune méthode de remplacement ne permet d'intégrer les effets sur l'organisme entier.
Objectifs
Dans le monde nous estimons que 2 à 12% des hommes sont infertiles. Des facteurs génétiques mais aussi des changements de mode de vie (peu de sport, alimentation riche) peuvent conduire à une baisse de la fertilité à l'âge adulte. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en glucides ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de son patrimoine génétique sont altérés. Toutefois, après l'arrêt de la consommation de haute teneur en fructose, le nombre de spermatozoïdes retourne à une valeur normale. Dans cette étude, nous allons essayer de mieux comprendre comment le métabolisme glucidique peut affecter la fertilité masculine en utilisant deux classes de molécules (médicaments) utilisées pour réguler la voie des glucides. Nous utiliserons une molécule qui va favoriser l’entrée des glucides dans la cellule (molécule anti-diabetique) ; et la seconde molécule est une hormone produite par le foie . Cette hormone est actuellement étudié pour le traitement de maladies métaboliques (obésité, diabète), mais nous ne connaissons pas ses effets sur la reproduction. L’objectif du projet est d’identifier les effets de ces modulateurs des glucides sur la fonction testiculaire. Ainsi, au cours de cette étude, nous exposerons 2 groupes de souris mâles adultes (saines ou en surpoids suite à un régime riche en lipides) avec soit 1/ l'hormone et 2/ soit avec une molécule qui agit comme sensibilisateur aux glucides (anti-diabetique).
Bénéfices attendus
L’obésité peut conduire à l’apparition de pathologies telles que les maladies cardiovasculaires, ou l’infertilité. Ainsi, dans le cas d’un apport riche en fructose ou dans le cas de diabète sucré chez l’adulte, la qualité du sperme et de l’ADN des spermatozoïdes est détériorée. Les mécanismes d’actions des glucides sur le testicule ne sont pas clairement connus et posent des questions sur les nouveaux traitements thérapeutiques régulant le métabolisme glucidique et leur innocuité sur la fertilité masculine. Le fait que récemment, il a été mis en évidence des taux plasmatiques d'une hormone négativement corrélés aux taux sériques en testostérone chez les patients atteints d’obésité, suggère qu'elle peut agir directement ou indirectement sur plusieurs cellules du testicule et modifier leurs activités . Est ce que ces molécules agissent sur la fonction testiculaire et quels effets peuvent elles avoir ? Les données permettront de mieux comprendre l'importance 1/ du métabolisme glucidique et de sa dérégulation dans la fonction testiculaire et 2/ d'identifier les effets sur le testicule de ces médicaments.
Procédures
La moitié des males auront pendant 15 jours des injections journalières en sous-cutanée avec soit l’hormone, soit du sérum physiologique, l'autre moitié des males auront une administration dans l'eau de boisson. L'ensemble des males auront un test de tolérance au glucose qui nécessite une période à jeûn de 4 à 6h suivi d'une injection de glucose puis de mesures répétées du glucose dans une goutte de sang sur une période de 2h. Enfin les animaux auront 2 prises de sang au cours de l'expérimentation pour vérifier les effets des traitements sur le métabolisme du glucose et sur des marqueurs de la fonction testiculaire.
Impact sur les animaux
Les molécules utilisées ont déjà été etudiées aux concentrations que nous souhaitons utiliser. Elles sont en cours d'essais chez l'Homme. Elles ont montré avoir un effet benefique sur le métabolisme glucidique en cas d’hyperglycemie. Les tests decrivent une "innocuité et tolérance bonnes, similaires au placebo" . Les autres nuisances potentielles sont les injections sous-cutanée qui peuvent potentiellement conduire à une infection, mais les solutions seront preparées sous hotte stérile ainsi que l'apparition d'hematome lors des prises de sang.
Devenir
A la fin de l'experimentation, l'ensemble des males seront euthanasiés et autopsiés pour analyser les effets des molécules (analyse histologique et analyse fonctionnelle moléculaire du testicule, hypophyse, foie, tissu adipeux).
Remplacement
A l'heure actuelle, il n’y a aucune méthode de remplacement, puisque les essais in vitro ont été réalisés. L'analyse proposée, nécessite d'intégrer les effets sur l’organisme en entier (notamment en prenant en compte le métabolisme glucidique par le foie, le tissu adipeux et les muscles) sur la fonction testiculaire. Les effets des molécules ont déjà été caractérisés in vitro sur 2 lignées de cellules et aucun effet toxique (mortalité cellulaire) n’a été observé.
Réduction
Des conditions sont mises en place afin de réduire le nombre d’animaux utilisés ainsi nous utilisons qu’une seule dose des médicaments qui est la dose efficace en se basant sur les données de la littérature et du developpeur. Nous optimisons également les analyses au niveau moléculaire, afin d'utiliser peu d'echantillon.Toutefois, pour faire face à la variabilité individuelle, nous avons besoin d'un nombre minimal d'animaux par groupe (12) pour avoir une analyse statistique fiable. Les tests statistiques seront menés pour tester les différences entre le groupe contrôle et le groupe traité de 12 animaux.
Raffinement
Afin de reduire au minimum les effets sur le bien-être animal, les animaux seront élevés dans les meilleures conditions d’élevage avec la présence d’un enrichissement (une cabane en carton pour se cacher et des morceaux de cartons "crinklets" pour faire leur nid), une surveillance accrue sera réalisée les jours suivants la prise de sang ou le test de tolerance au glucose. Si toutefois, un animal présentait un des points limites sur l'apparence, poids, ou le comportement, ou une combinaison de signes cliniques inquiétant, le vétérinaire référent ou un responsable bien-être local serait consulté et/ou les animaux euthanasiés. Dans le cadre des procedures, pour limiter la douleur, nous utiliserons un anesthesique pour les prises de sang et et un analgesique pour le test de tolerance au glucose et pour limiter la possibilité d'hematome nous effectuerons un point de compression. Pour limiter le stress, les animaux resteront au maximum dans leur cage d'hebergement habituelle.
Choix des espèces
Les souris sont des petits mammifères qui ont une vitesse de reproduction rapide (il ne faut que 30 jours pour produire un spermatozoïde à partir d’une cellule souche, contre 80 jours chez l’homme), et la durée de gestation est de 21 jours. De plus les marqueurs et paramètres du métabolisme glucidique ont été très bien caractérisés et facilement mesurables. Cette espèce est donc un très bon modèle pour étudier les effets des composés agissant sur le métabolisme sur la fonction testiculaire, chez les mammiferes. A l’heure actuelle, aucune donnée sur la reproduction n’est connue pour ces molécules. à partir de 6 semaines, les souris peuvent être considérées comme jeune adulte (fin de la puberté), et peuvent se reproduire. Nous utiliserons des animaux avec un âge supérieur à 6 semaines (8 semaines ).
Le rôle de PRL2 dans les métastases lymphatiques et les lymphoedèmes
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent six injections de tamoxifène, une greffe de cellules tumorales, et pour une partie une chirurgie d'ablation des ganglions lymphatiques, avec un suivi par imagerie sous anesthésie deux fois par semaine. Elles sont ensuite tuées pour prélever plusieurs organes. Le projet étudie le rôle d'une protéine dans les métastases et le lymphœdème, le porteur affirmant que l'étude d'un "organisme entier" ne peut être reproduite in vitro.
Objectifs
Le projet vise à déterminer le rôle de notre protéine d’intérêt, une phosphatase, dans les vaisseaux lymphatiques dans deux contextes liés au cancer : (1) les métastases d’origine lymphatique et (2) les lymphoedèmes post-résection des ganglions lymphatiques. Les métastases représentent la dissémination d’une tumeur dans le corps. Les lymphoedèmes sont des accumulations de fluide dû à un défaut des vaisseaux lymphatiques pour évacuer le surplus de fluide. Dans certains cancers, la résection des ganglions, soit l’opération de retirer les ganglions lymphatiques proches de la tumeur, est souvent nécessaire pour prévenir la formation des métastases. Malheureusement, cela peut avoir des effets négatifs tels que le lymphoedème. Par cette étude, nous voudrions répondre aux questions suivantes : (1) est-ce que l’expression de cette protéine dans les cellules lymphatiques joue un rôle majeur dans le développement de métastases, notamment dans la lymphangiogenèse associée ? (2) Cette protéine est-elle impliqué dans la formation de lymphoedème suite à une résection de ganglions lymphatiques ?
Bénéfices attendus
Les résultats préliminaires in vitro montrent que notre protéine d’intérêt, une phosphatase, a un effet sur la prolifération, la migration et le bourgeonnement des cellules endothéliales lymphatiques. Ceci suggère que cette protéine pourrait donc avoir un rôle dans la régulation de la formation des vaisseaux lymphatiques (lymphangiogenèse). Si cela est aussi observé in vivo, ce projet nous permettra d’ajouter un nouveau régulateur dans le processus et également une meilleure compréhension du rôle des phosphatases dans la lymphangiogenèse. La formation des vaisseaux lymphatiques est un processus important pour le bon fonctionnement de l’organisme et un dérèglement de ce processus entraîne souvent le développement ou l’aggravation d’une pathologie comme par exemple les lymphoedèmes (accumulation de fluide dans une partie du corps) ou les métastases (dissémination de cellules tumorales). Ainsi, tout régulateur de la lymphangiogenèse peut devenir une cible thérapeutique pour activer ou inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques afin de prévenir ou de guérir les pathologies. Par exemple, dans le cas des cancers avec un risque de métastase, les deux voies les plus probables pour les cellules tumorales sont les vaisseaux sanguins et lymphatiques. Donc, en inhibant la formation de ces vaisseaux à la périphérie de la tumeur, le risque de métastase diminue. Ainsi, l’utilisation d’un inhibiteur de lymphangiogenèse comme traitement additionnel pourrait améliorer le traitement des cancers. On observe déjà ce type de traitement pour inhiber la formation de vaisseaux sanguins autour de la tumeur. Cependant, pour inhiber la lymphangiogenèse, il est nécessaire de mieux comprendre le mécanisme de formation des vaisseaux pour pouvoir cibler les régulateurs. Dans notre cas, notre protéine d’intérêt pourrait devenir une cible pour inhiber la formation des vaisseaux lymphatiques dans les tumeurs. Cela pourrait également devenir une cible thérapeutique contre la formation de lymphoedème qui a aussi pour origine un dysfonctionnement des vaisseaux lymphatiques.
Procédures
Avant chaque procédure, tous les animaux (soit 320 max) recevront 6 injections de tamoxifen réparties sur 2 semaines. Chaque injection dure moins d’une minute par souris. Pour chaque procédure, les animaux sont anesthésiés sous isoflurane (un gaz) ou par injection d’anesthésiants. Pour l'injection de cellules tumorales en sous-cutanée, les animaux recevront une application d'analgésique local avant l'injection de cellules. Les animaux subissant une chirurgie plus importante recevront une injection d’analgésique avant chirurgie. 160 souris auront une injection de cellules tumorales (mélanome ou cancer du poumon) en sous-cutané, 80 souris auront une injection de cellules du cancer du sein au niveau des glandes mammaires et 80 souris subiront une chirurgie pour retirer les ganglions lymphatiques de la patte. Chaque chirurgie n’excède pas 5 minutes par souris. Après chirurgie, tous les animaux seront gardés en observation pendant le développement de la maladie jusqu’à la mise à mort. Si nécessaire, les souris recevront 1 ou 2 injections supplémentaires d’analgésique contre la douleur ou l’application d’un désinfectant cutané contre le risque d’infection. Les souris ayant reçu une injection de cellules tumorales auront un suivi du développement de la tumeur par imagerie 2 fois par semaine. Pour cela, les souris seront anesthésiées par isoflurane et recevront une injection d’un composé permettant la localisation des cellules tumorales avant d'être placé dans un imageur adapté pour une acquisition d’image sur animal vivant. L'acquisition d'image prend 6 à 25 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront suivis quotidiennement avec une fiche de suivi hebdomadaire et une pesée 3 fois par semaine. L’apparence et le comportement des animaux seront marqués sur la fiche de suivi. Pour chaque expérience, les animaux pourront présenter une perte de poids, des signes de douleur ou de gêne avec possible prostration, cachexie, tremblement ou isolement (voir chaque procédure pour plus de détails). Tous ces critères sont considérés comme des points limites lorsqu’ils dépassent un certain seuil. Le seuil est déterminé par le personnel de l’animalerie qui a une longue expérience de ce type de procédure. Lorsqu’un point limite est atteint, l’animal est immédiatement euthanasié pour éviter toute souffrance inutile.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus nécessaires aux analyses visant à déterminer s’il y a une différence au niveau de la formation des métastases et de lymphoedème. Ainsi plusieurs tissus et/ou organes seront prélevés sur chaque animal.
Remplacement
Le projet vise à caractériser le rôle d’une protéine spécifique au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro. L’étude des métastases demande un organisme entier puisque les cellules tumorales circulent d’un organe à un autre en utilisant le système circulatoire de l’organisme. Le lymphoedème est également une pathologie qui s’étudie à l'échelle d'un corps entier. Il est également important de noter que des interactions complexes entre différents types cellulaires est nécessaire pour l’observation de ces phénomènes.
Réduction
Pour être statistiquement significatif et scientifiquement irréprochables, un nombre de 10 souris par génotype sera nécessaire pour chaque expérience et les expériences seront répétées 4 fois (1 expérience pour ajuster les protocoles et 3 expériences pour prouver la reproductibilité des résultats) pour chaque procédure. La variabilité entre les expériences et entre les animaux pouvant être importante, un nombre d’animaux suffisant et plusieurs expériences permet d’avoir des résultats scientifiquement robustes. Nos 2 génotypes d’intérêt sont les souris avec une délétion inductible de notre protéine et les souris sans délétion inductible. Nous avons optimisé nos croisements pour n’obtenir que les génotypes d’intérêt à chaque portée pour limiter le nombre d’animaux. Donc 2 x 10 souris = 20 souris/expérience. Donc pour la procédure 1, où nous avons 2 lignées cellulaires différentes : 20 souris x 4 expériences x 2 lignées cellulaires = 160 souris. Pour la procédure 2 : 20 souris x 4 expériences = 80 souris. De même pour la procédure 3. Donc, nous estimons le nombre maximal d’animaux à 320. Pour la procédure 2, nous n’utiliserons que des souris femelles pour l’étude sur le cancer du sein. Afin de ne pas perdre les mâles des mêmes portées, nous les utiliserons pour les autres procédures en essayant de garder quand même une certaine mixité. Le ratio femelle/mâle des procédures 1 et 3 sera donc plus de l’ordre du 1 pour 3 que du 1 pour 1 dans certaines expériences en parallèles avec celles de la procédure 2. Les études statistiques seront réalisées avec les tests statistiques adaptés aux résultats.
Raffinement
Une surveillance d’une grande attention sera faite après chaque geste expérimental. Pour les injections de tamoxifen de chaque procédure, 10 minutes d’observation et une vérification 1h après. En cas d’inconfort ou de souffrance, l’animal sera tout de suite pris en charge par les soigneurs et sacrifié si son état est trop grave. En cas de saignement grave au niveau du site d'injection, l’animal sera immédiatement sacrifié. Pour chaque acte chirurgical, les souris seront anesthésiées et placées sur un tapis chauffant (37°C) avec une application de gel ophtalmique sur les yeux pour prévenir le dessèchement oculaire. Lors de l’injection des cellules tumorales en sous-cutané (procédure 1), un analgésique local sera utilisé pour prévenir la douleur dû à l’injection. Lors de l’injection des cellules tumorales dans la glande mammaire (procédure 2) et l'opération de retrait des ganglions lymphatiques (procédure 3), un analgésique et un désinfectant cutané seront utilisés pour réduire la douleur et prévenir les infections. Après chirurgie/implantation, les souris sont remis dans leurs cages avec leurs congénères (5 souris/cage) et observées jusqu’à leur réveil avec une vérification 1h après. Les cages seront enrichies en accord avec la procédure expérimentale. Des tunnels seront présents dans chaque cage. De la nourriture humide sera mise à disposition dans les cages si nécessaire, par exemple pour aider à l’alimentation suite à la chirurgie. Pour toutes les procédures expérimentales, il y aura un suivi quotidien des animaux et chaque changement physique ou comportemental sera noté sur une fiche de suivi quotidienne. Tout comportement anormal grave comme la prostration ou des tremblements entraînera l’euthanasie immédiate de l’animal. Pour des changements plus légers, l’avis d’un vétérinaire sera demandé et une décision sera prise en concertation avec le vétérinaire, les soigneurs et le responsable du projet pour définir la meilleure prise en charge de l’animal. Les soins seront toujours effectués par les mêmes expérimentateurs pour réduire le stress des animaux et tout le personnel de l’animalerie impliqué dans ce projet a les compétences et l’expérience nécessaire pour la partie expérimentale. Au cours du projet, nous nous maintiendrons informer des possibles améliorations de raffinement adaptables à nos procédures.
Choix des espèces
Le projet vise à caractériser le rôle de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques lors de métastases (dissémination de cellules tumorales) et de lymphoedème (accumulation de fluide dans une partie du corps). Ceci nécessite donc l’utilisation d’un modèle in vivo car il n’est pas possible de reproduire ces conditions in vitro puisque cela demande une conformation 3D à l’échelle d’un organisme entier, mais également des interactions complexes entre différents types cellulaires. L’implantation de tumeur chez la souris est par ailleurs une expérience couramment utilisée pour l’étude de la formation des métastases. La lignée de souris de notre projet, déjà existantes, permettra de déléter spécifiquement notre protéine au niveau des vaisseaux lymphatiques. Ce modèle nous permettra d’étudier l’implication de l’expression de notre protéine d’intérêt au niveau des vaisseaux lymphatiques dans les cas de métastases et de lymphoedème. Les souris sont également immunocompétentes car les cellules immunitaires peuvent avoir une grande influence sur les vaisseaux lymphatiques, notamment dans les cas de cancers où le microenvironnement est important. Nous commencerons les expériences sur des souris âgées entre 6 et 8 semaines afin d’avoir une bonne induction de la délétion de la protéine. L’utilisation de jeunes animaux permet également une croissance tumorale optimale et un système immunitaire performant. En effet, dans notre étude, il se peut que le système immunitaire ait un rôle important en lien avec les vaisseaux lymphatiques que nous étudions. Ces expériences d’implantation de tumeur peuvent prendre plusieurs semaines à plusieurs mois, particulièrement pour l’observation de métastases, donc il est mieux de commencer le plus tôt possible.
Etude du rôle des vésicules de membrane externe bactériennes dans l’induction et l’aggravation de sepsis.
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
1 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent des injections de vésicules bactériennes qui provoquent un sepsis, un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel suivi par un score clinique jusqu'à une perte de 20 % du poids. Une moitié est tuée à un stade précoce, l'autre gardée pour l'étude des séquelles avant d'être tuée à son tour. Le projet étudie le rôle de ces vésicules dans la gravité du sepsis, le porteur indiquant que les modèles animaux restent "essentiels" pour tester les traitements à l'échelle de l'"organisme entier".
Objectifs
Le sepsis est un problème majeur de santé publique, défini comme un dysfonctionnement d'organe potentiellement mortel causé par une réponse dérégulée de l'hôte face à une infection. Les sepsis dus à une infection par des bactéries Gram-négatif sont associés à une mortalité plus élevée que ceux associés à une infection par des bactéries Gram-positif. Cependant, les mécanismes qui sous-tendent la pathogénicité des souches septiques ne sont pas encore totalement compris. Nous avons montré que les bactéries Gram-négatives Escherichia coli (E.coli) pathogènes et responsables de sepsis produisent des vésicules à partir de leur membrane externe, appelées OMV pour outer membrane vesicle en anglais, ayant des propriétés particulières qui contribuent à la virulence de ces souches. En effet, ces OMV spécifiques ont la capacité d'induire seules un sepsis particulièrement grave. Nous postulons donc que ces OMV jouent un rôle majeur dans la sévérité des infections bactériennes et notamment du sepsis. Notre objectif est de comprendre comment ces OMV contribuent à la physiopathologie des infections par des infections à Gram négatif et au sepsis en particulier (mise en place et aggravation / séquelles à court et moyen terme).
Bénéfices attendus
Ces résultats devraient permettre de mieux appréhender le rôle et l’impact des OMV d’E. coli dans l’induction et l’aggravation du sepsis et ses conséquences néfastes à court et moyen terme. Ces résultats apporteront donc des informations à la fois fondamentales dans la connaissance de la physiopathologie des sepsis mais aussi donneront des pistes pour adapter les traitements de supports à utiliser chez les patients septiques admis en unité de soin intensif.
Procédures
Les animaux se subiront aucune intervention vigile autres que des injection intra-péritonéales, intra-veineuse ou sous-cutanées, à une fréquence faible (2 fois sur toute la procédure). Les animaux qui se verront administrer les OMV par voie intra-vésicale seront au préalablement anesthésiés par anesthésie injectable (Ketamine-100mg/kg/Xylazine- 10mg/kg, i.p., 10ml/kg) ou anesthésie gazeuse (4% isoflurane) durant toute la durée de l'intervention, qui durera environ 5 minutes. Ces animaux seront privés d’eau 2h avant cette instillation et jusqu’à 2h après cette procédure. Sur tous les animaux, nous procéderons à une anesthésie terminale par injection de 100μl d’un mélange de rompun/ketamine 1000 (2 ml de ketamine, 500μl de Rompun QSP10ml NaCl 0,9%) avant une prise de sang à la veine cave d’un volume de 700µL à 1mL en environ 15 secondes et qui sera suivie par l'euthanasie de l'animal par dislocation cervicale.
Impact sur les animaux
Certaines procédures expérimentales prévues chez la souris peuvent entraîner une souffrance chez l'animal avec des effets systémiques (sepsis). Ainsi, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) seront observés et quantifiés toutes les heures pendant 8 heures le jour de l’administration des OMV puis quotidiennement à partir du deuxième jour et jusqu’à la fin des expériences (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant impact des OMV et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%.
Devenir
A l'issue des procédures 1 et 2, la moitié des animaux sera euthanasiée pour évaluer l'impact des OMV sur les temps précoces après induction d'un sepsis afin d'établir leur rôle dans la phase aigüe. L'autre moitié des animaux sera gardée en vie et utilisée pour la procédure 3 qui vise à évaluer le rôle des OMV dans l'apparition de séquelles à court et moyen terme après apparition du sepsis. A l'issue de la procédure 3, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser un score lésionnel macroscopique et microscopique.
Remplacement
Des expérimentations alternatives in vitro ont été préalablement réalisées pour démontrer l'effet des OMV sur les cellules impliquées dans l’induction du choc septique (plaquettes sanguines, neutrophiles, macrophages, cellules endothéliales) et valider ainsi la preuve de concept du projet. Cependant, les modèles animaux sont des éléments essentiels de la recherche sur le sepsis pour étudier de manière exhaustive les différentes étapes de l’induction d’un sepsis et pour tester l’effet des traitements habituellement prescrits à l’échelle d’un organisme entier.
Réduction
Le modèle d’injection des OMV par voie systémique, par voie intrapéritonéale et par voie intra-vésicale ainsi que les infections par des E. coli ont été validés dans l’équipe, ce qui facilite les étapes d'optimisation réduisant ainsi le nombre d'animaux requis pour ce projet. Nous utiliserons 10 animaux par groupes (et 5 animaux pour le groupe contrôle). Ce nombre a été estimé en fonction des tests statistiques qui seront utilisés.
Raffinement
Les souris sont hébergées dans des cages à 20-24°C et 30-50% d’hygrométrie, en portoirs ventilés (dans des cages d’une superficie de 500cm2 avec un nombre de 5 animaux par cage), avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois par semaine. Du coton ou du sopalin sont ajoutés pour leur permettre de faire un nid. Les animaux ont deux semaines d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Pour les procédures d’injection des OMV par voie systémique, les animaux seront surveillés de manière permanente jusqu’au sacrifice (qui aura lieu entre 2 à 12h après l’injection des OMV). Pour les autres procédures, les paramètres cliniques (aspect du poil [score 1], posture courbée [score 2], défaut de mobilité [score 3]) et la mesure du poids (perte de poids 20% [score 3]) observés et quantifiés quotidiennement (sauf les pesées qui seront réalisées seulement 2 fois par semaine) et serviront d’une part comme paramètres expérimentaux validant l’efficacité du traitement et d’autre part comme critères d’évaluation objectifs de la souffrance de l’animal. Ceci nous permettra de déterminer un point limite : score≥ 3 et/ou perte de poids > 20%. Le dépassement de ces points limites conduira à l’euthanasie de l’animal concerné selon le décret N°2013-18 du 1er février 2013 relatif à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable et le modèle plus décrit pour l’étude du sepsis. Les doses d’OMV à utiliser sont déjà validées dans cette espèce. Souris de 7 à 8 semaines pour toutes les procédures sauf la procédure 3. Dans la littérature, les souris utilisées pour l’étude du sepsis sont classiquement âgées de 5 à 6 semaines, âge auquel elles sont considérées comme adultes. Nous prenons une marge de deux semaines pour permettre l’acclimatation.
Evaluation de l’efficacité d’un traitement anti-cancéreux à base de cellules NK produites ex vivo dans un modèle murin xénogénique
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
314 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe d'un lymphome que le porteur décrit comme envahissant les tissus et aboutissant à la mort de l'animal, puis des injections de cellules et jusqu'à huit séances d'imagerie sous anesthésie. Toutes sont tuées par dislocation cervicale pour prélever leurs tissus. Le projet évalue des cellules NK humaines produites selon un procédé breveté comme immunothérapie anticancéreuse, en vue d'un dossier réglementaire pour un essai clinique.
Objectifs
Nous produisons des lymphocytes « Natural Killer » humains à partir de cellules souches hématopoïétiques de sang de cordon, en passant par un stade de précurseur lymphoïde, selon une technique brevetée, qui permet d’obtenir en 2 à 3 semaines de très grandes quantités de lymphocytes NK immatures, présentant un degré de pureté supérieur à 90. Nous avons également montré que nous pouvions combiner la culture à une modification génétique par transduction lentivirale, qui permet d’apporter des propriétés antitumorales supplémentaires (par exemple un récepteur antigénique chimérique appelé CAR, dirigé contre un antigène tumoral). Les lymphocytes produits sont fonctionnels in vitro. Notre objectif est de caractériser in vivo la biodisponibilité et la fonction de ces cellules lymphocytaires, non modifiées ou modifiées génétiquement pour exprimer un CAR, et à les comparer à des lymphocytes matures du sang et des lymphocytes dérivées de cellules souches hématopoïétiques selon un protocole qui ne passe pas par l’étape précurseur lymphoïde. Ces deux sources de lymphocytes sont utilisées dans le cadre d’essais cliniques, mais présentent un certain nombre des défauts (résistance à la transduction, expansion limitée, apparition précoce de marqueurs d’épuisement). Nous utiliserons comme modèle une souris immunodéficiente humanisée et suivrons des schémas expérimentaux publiés. Nous répondrons à la question de la biodisponibilité in vivo des lymphocytes après greffe chez la souris. Nous validerons dans une étape pilote le modèle tumoral. Enfin, nous explorerons la capacité des lymphocytes armées avec un CAR à détruire des cellules tumorales par imagerie sur souris anesthésiée. Ce projet nous apportera les réponses scientifiques et les preuves précliniques du potentiel de ces cellules en immunothérapie anti-cancéreuse.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider la capacité des cellules NK produites dans nos conditions (brevetées) à persister après greffe. Il permettra également de valider la fonctionnalité des cellules NK. Au terme du projet, s’ils sont positifs, les résultats seront utilisés pour documenter le dossier exigé qui sera soumis aux autorités réglementaires pour la mise en place d’un essai clinique de phase I/II pour le traitement des lymphomes B. Les schémas expérimentaux et les résultats serviront de base à l’exploration de l’efficacité des cellules NK pour traiter des tumeurs solides.
Procédures
Aucun prélèvement sur animaux vigiles, ni procédures chirurgicales n'est prévu dans l'étude. Les interventions se limiteront à : 1) Injection d'agent de conditionnement. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. L’ensemble des souris (314) sont injectées 1 fois avec cet agent. Durée de l’intervention : 30 secondes/souris. 2) 3 jours après l’injection de l'agent de conditionnement, injection(s) de l'agent théeapeutique NK et/ou des cellules cancéreuses après anesthésie générale : 172 souris injectées 1 fois; Durée de l’intervention 5 minutes/ souris. 142 souris injectées 2 fois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 3) Injection de molécule pour permettre le suivi par bioluminescence après anesthésie générale. Maintien de l’anesthésie gaseuze durant l’aquisition au lecteur de bioluminescence. 164 souris injectées et anesthésiées 8 fois maximum pendant 1 mois. Durée de l’intervention : 15 min/souris. 4) Prélèvement de sang après anesthésie générale : 150 souris, 1 prélèvement par souris juste avant la mise à mort. Durée de l’intervention : 10 min/souris. 5) Mise à mort par dislocation cervicale immédiatement après le prélèvement de sang. Toutes les souris (314) sont concernées. Durée de l’intervention : 1 minute/souris. Au total, 150 souris subiront 4 injections et 1 prélèvement de sang. Les 22 aurtes souris subiront 12 injections et 8 séances d’imagerie. Les 142 souris restantes subiront 13 injections, 8 séances d’imagerie et 1 prélèvement de sang.
Impact sur les animaux
Le modèle tumoral est un modèle d’un lymphome de Burkitt, une tumeur liquide qui envahit les tissus hématopoïétiques (moelle osseuse, rate) et aboutit à la mort de l’animal. Les cellules NK ne provoquent pas d'effets indésirables. Les injections intrapéritonéales et intraveineuses par voie caudale provoquent une douleur localisée légère. Les injections intraveineuses par voie rétro-orbitaire provoquent une douleur localisée et un stress.
Devenir
Tous les animaux du projet (314) seront mis à mort pour prélèvement de tissus et leurs analyses (à J4 ou J7). Ces dernières nous permetteront d'étudier la biodisponibilté.
Remplacement
Notre protocole de production de cellules NK est, en soit, une méthode de Remplacement partiel, puisque nous partons de cellules souches humaines isolées de sang de cordon ou ou de donneurs adultes pour produire et expandre des cellules NK ex vivo avec un système complètement in vitro, sans nécessité de faire maturer les cellules humaines chez la souris. Les expériences chez l’animal interviennent au terme d’un long développement et s’inscrivent dans le cadre d’une validation in vivo de l’effet thérapeutique de ces cellules avant un développement clinique. Les cellules NK produites selon le nouveau procédé ont été complètement caractérisées phénotypiquement et fonctionnellement. Toutefois, les expériences in vitro ne permettent pas d’évaluer la biodisponibilité, des cellules NK dans les différents organes immunitaires, ou leur capacité à migrer dans les tumeurs, et à les détruire. L’efficacité des approches de thérapie cellulaires ne peut être évaluée in fine que in vivo dans un modèle mimant la maladie humaine. Les expériences sur l’animal sont donc justifiées avant leur application chez l’homme.
Réduction
Pour répondre à des questions de biologie cellulaire et moléculaire, nous utiliserons des cultures primaires, ce qui réduit fortement l’utilisation d’animaux. Cependant, les cultures cellulaires ne peuvent pas remplacer les études in vivo pour les réponses physiopathologiques liées à une manipulation génétique ou traitement pharmacologique. Le nombre total de souris impliquées dans les expériences a été réduit au minimum nécessaire pour obtenir des données suffisantes tout en s’assurant d’une interprétation statistique fiable des résultats pour évaluer l’effet thérapeutique des produits testés. Afin de réduire le nombre d’animaux, les scores d’évaluation clinique les plus objectifs, prédictifs et robustes seront privilégiés.
Raffinement
Afin de limiter la souffrance et le stress infligés aux animaux, une surveillance rapprochée et l’utilisation d’antalgiques sont prévues. Des points limites ont été établis afin d’anticiper la mise à mort de l’animal si nécessaire. Dans le modèle tumoral en particulier, dans le cas où l’induction de la tumeur est à l'origine de douleurs visibles, de détresse ou de signes de toxicité (diminution des mouvements, perte d'appétit, perte d'intérêt de l'exploration, perte de poids, comportement stéréotypique lié au stress), l’expérience sera interrompue et l'animal mis à mort. Pour réduire le stress éventuel engendré par la procédure, les animaux seront hébergés dans un environnement exempt d’organisme pathogène, enrichi à l’aide de coton (pour la nidification), de tunnels de polycarbonate (pour les activités journalières) et de bâtons en bois (pour développer leurs exigences naturelles comme ronger, grimper et se cacher). D’autres outils seront disponibles à la demande pour éviter l’ennui si des animaux se retrouvent seuls dans les cages. Si une souffrance est avérée avec un score supérieur à 6 défini dans les procédures, les NSG-IL15 seront mises à mort pour une étude macroscopique des organes et/ou de l’immunohistochimie et/ou une analyse du statut sanitaire.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus utilisé car sa génétique est proche de celle de l’homme et elle permet d’avoir des nombres d’animaux suffisants pour faire des tests statistiques. Par ailleurs, il existe de nombreux outils (ex : anticorps) qui sont développés parfois exclusivement chez la souris. Les essais précliniques sur animaux sont exigés par les autorités réglementaires dans tout dossier préalable à la demande d’un essai clinique chez l’homme. Il est à noter que seuls les protocoles mis au point et validés in vitro seront testés chez l’animal. Les animaux utilisés seront au stade adulte, entre 10 et 12 semaines de vie. Ce choix se base sur l’âge auquel les lymphomes B se déclarent chez l’Homme et sur un protocole ayant montré des résultats encourageants.
Étude de l’efficacité de dendrimères anti-inflammatoires pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle murin d’arthrite spontanée IL-1ra -/- (Interleukin-1 Receptor antagonist Knock-Out)
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
370 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie porte une mutation qui provoque une arthrite spontanée avec inflammation et douleurs articulaires dès l'âge de quatre semaines et jusqu'à la fin du protocole à vingt semaines, pendant lequel elles reçoivent les molécules testées durant douze semaines. Elles sont ensuite tuées pour des prélèvements. Le projet évalue des dendrimères contre la polyarthrite rhumatoïde, le porteur invoquant le "besoin" de nouveaux traitements et le caractère difficilement modélisable in vitro de la maladie.
Objectifs
La polyarthrite rhumatoïde est une maladie chronique, inflammatoire qui affecte principalement les articulations, induisant de forte douleur et une réduction de la mobilité articulaire. Dans la polyarthrite rhumatoïde, un réseau de médiateurs inflammatoires favorise l’inflammation chronique et la destruction osseuse. L’objectif de ce projet est d’utiliser le modèle animal basé sur la délétion d’un gène impliqué dans la résolution de l’inflammation, IL-1ra, pour étudier l’efficacité thérapeutique de nouveaux candidats médicaments dans le traitement de la polyarthrite rhumatoïde. Ce modèle animal conduit à un développement spontané et rapide d’une arthrite inflammatoire dont les caractéristiques tissulaires sont fortement similaires à la polyarthrite rhumatoïde humaine. Ce modèle animal a déjà été utilisé pour évaluer l’efficacité d’une molécule anti-inflammatoire pour le traitement de la polyarthrite rheumatoïde. Notre équipe étudie ces nouvelles molécules ayant une activité modulatrice du système immunitaire en ciblant plusieurs cellules inflammatoires. Nous avons validé ces propriétés anti-inflammatoires sur des cellules humaines et, pour certains, dans des modèles animaux en prouvant l’efficacité thérapeutique de ces nouvelles molécules dans d’autres modèles de maladies inflammatoires chroniques et aigües. Dans ce projet, ayant recours à 370 animaux, notre objectif est d’évaluer leur potentiel thérapeutique pour traiter la polyarthrite rhumatoïde dans le modèle IL1ra -/-, seuls ou en combinaison avec un traitement de référence pour cette maladie, le méthotrexate.
Bénéfices attendus
Dans la polyarthrite rhumatoïde, le système immunitaire attaque les tissus de l'organisme affectant principalement les articulations, ce qui peut entraîner de graves lésions articulaires, de fortes douleurs et un véritable handicap pour les patients. Cette maladie affecte près de 150 000 personnes en France et 10 % des patients montrent une invalidité grave en moins de 2 ans. Les traitements, dits de fond, pour cette maladie tels que le méthotrexate présentent une efficacité limitée et présentent de conséquents effets secondaires. Plus récemment, les biothérapies ciblées mises au point permettent l’obtention d’une réponse favorable dans près de 75% des cas, mais ces traitements sont très couteux et n’entrainent une rémission prolongée que chez 25% des patients. Ainsi, ces données, bien qu’encourageantes, montrent la nécessité du développement de nouveaux traitements ayant peu d’effets secondaires, peu couteux et entrainant des réponses durables. Des résultats préliminaires laissent à penser que les dendrimères PPH que nous avons développés pourraient répondre à ce besoin. Ainsi, les bénéfices attendus de ce projet sont de démontrer l’activité anti-inflammatoire et l’efficacité thérapeutique des dendrimères PPH sur un nouveau modèle de polyarthrite rhumatoïde. Cette étude - en combinaison avec nos datas confirmant l’activité immuno-modulatrice de nos composés obtenus dans d’autres modèles (in vitro et in vivo) et des études de toxicologie menées chez le rongeur et chez des primates non humains montrant que notre molécule candidate principale ne présente pas de toxicité - permettra d’avancer considérablement notre étude pré-clinique dans le but de mener par la suite des études cliniques chez l’Homme.
Procédures
Les animaux recevront des injections ou des administrations par voie orale des molécules à tester pendant 12 semaines (S8 à S19). Ces gestes, rapides et indolores pour les souris, seront réalisés sur animaux vigiles.
Impact sur les animaux
Les souris IL-1ra -/- peuvent subir une inflammation et des douleurs articulaires dès l’apparition des symptômes à l’âge de 4 semaines jusqu’à la fin du protocole expérimental (âge de 20 semaines). Si les animaux présentent des signes de douleur, nous administrons une analgésique. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids trop importante est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées. De plus, pour limiter le stress des animaux, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage) et des objets enrichissants (du coton et des tubes en cartion) seront disposés dans les cages.
Devenir
À l'issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des pélèvements seront effectués pour les dosages biochimiques et les analyses histologiques.
Remplacement
Le travail de notre équipe s’inscrit dans la recherche et le développement de nouveaux médicaments pour combattre les maladies inflammatoires. Le processus de développement d’un nouveau médicament comporte plusieurs étapes. L’étude préclinique est la seconde étape fondamentale de ce processus. Elle fait généralement appel à l’expérimentation animale. C’est un pré-requis obligatoire pour justifier l’investigation et la première administration chez l’Homme. Ces expériences in vivo ont une valeur prédictive supérieure à celles réalisées in vitro. En outre, la polyarthrite rhumatoïde est une pathologie complexe qui résulte de l’action concertée de plusieurs acteurs cellulaires et, de fait, est difficilement modélisable in vitro ou ex vivo.
Réduction
Nous avons planifié les expériences dans l’optique de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés. Nous réaliserons à l’issue des traitements des analyses anatomiques (histologie des articulations), cellulaires (analyses des cellules immunitaires dans les articulations et circulantes) et moléculaires (dosage de cytokines) à partir d’échantillons prélevés sur un même animal. Le nombre d'animaux à inclure sera déterminé, et nos résultats analysés, avec des analyses statistiques appropriées. Enfin, le modèle d’arthrite choisi est robuste (incidence élevée) et reproductible, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux nécessaires par groupe.
Raffinement
Nous avons conçu nos expériences dans l’optique de réduire le stress et la douleur pour les animaux. Pour limiter le stress, les souris seront hébergées avec d’autres animaux tout au long du protocole (5 souris par cage). Du coton et des tubes en carton seront disposés dans les cages comme objets enrichissants. Si les animaux présentent des altérations physiques signes de douleur (flan creusé/dos voûté, yeux enfoncés/vitreux, anomalie respiratoire sévère, comportement anormal extrême tel qu’une aphasie ou un grattage excessif) un analgésique sera administré. Si cela n’améliore pas leur état ou si une perte de poids de plus de 20% est observée, l’expérimentation sera immédiatement arrêtée et les souris concernées seront euthanasiées.
Choix des espèces
Les souris sont fréquemment utilisées pour modéliser la polyarthrite rhumatoïde et, en particulier, avec le modèle expérimental (IL-1ra -/-), que nous avons sélectionnées. Le choix d’utiliser des souris a aussi été conforté par le fait qu’il existe un plus grand nombre d’outils d’analyse disponibles (dont les réactifs immunologiques), par rapport aux autres espèces comme le rat. Nous avons choisi la souris IL-1ra -/-. Cette souche mutée pour l’antagoniste au récepteur à l’IL-1, est adaptée pour étudier l’efficacité de nouveaux candidats médicaments pendant une longue durée. La souris BALB/cA sera utilisée comme contrôle non arthritique. Les souris seront âgées de 8 semaines ce qui est en conformité avec les précédentes études.
Evaluation des effets secondaires d’une molécule après administration intra cérébrale chez la souris
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une partie est génétiquement modifiée pour développer des symptômes de maladies neurodégénératives, comme une démarche altérée et des tremblements, et toutes subissent une chirurgie d'injection dans le cerveau puis sont isolées pendant toute l'expérience. Elles sont tuées soit par prélèvement d'organes incompatible avec leur survie, soit à cause des effets indésirables des produits testés. Ce projet réglementaire évalue la tolérance de candidats médicaments injectés dans le cerveau, le porteur affirmant qu'il n'existe pas de méthode de substitution suffisante.
Objectifs
Ce projet a pour objectif d'évaluer si les futurs candidats médicaments sont bien tolérés après leur injection dans le cerveau. Les souris utilisées pourront être soit des animaux non génétiquement modifiés, soit des animaux génétiquement modifiés pour rentrer dans le cadre de certaines pathologies. Dans ce dernier cas, on évaluera la tolérabilité des molécules visant à atténuer l'expression d'une protéine humaine liée à un gène inséré dans le génotype de la souris. 3 souches de souris transgéniques pourront être utilisées permettant d’étudier des symptômes apparaissant dans les pathologies suivantes : maladie de Machado-Joseph, ataxie cérébelleuse de type 2 ou bien maladie de Parkinson. Ces modèles animaux reproduisent de façon plus fidèle la physiopathologie humaine. Pour ces 3 pathologies, l'accumulation anormale de la protéine va entrainer la mort des neurones dans des zones du cerveau contrôlant la motricité.
Bénéfices attendus
A long terme, les bénéfices attendus sont la découverte de nouveaux médicaments qui seront bien tolérés par l'homme et permettant de traiter de nombreuses maladies neurodégénératives comme la maladie de Machado-Joseph, une pathologie humaine ayant une incidence de 1-2 personnes sur 100 000 et qui peut être plus élevé chez certaines ethnies, l'ataxie cérébelleuse de type 2 A qui a une prévalence de 1 à 2 sur 100 000 personnes, ou la maladie de Parkinson qui touche jusqu'à 8.5 millions de personnes dans le monde. Les bénéfices attendus sont de démontrer que le composé testé est toléré (avec l'utilisation d'animaux non génétiquement modifiés et génétiquement modifiés).
Procédures
Les animaux seront soumis à une anesthésie et une chirurgie sous anesthésie (45 minutes) pour réaliser l'administration du produit dans le cerveau, des administrations d'anti-douleur (jusqu'à 5 administrations, moins de 30 secondes pour chaque administration), des prélèvements de sang sur animaux vigiles (2 minutes) ou anesthésiés (pas de réveil après le prélèvement).
Impact sur les animaux
Les animaux seront anesthésiés pour réaliser l'injection des candidats médicaments dans le cerveau et ils recevront jusqu'à 5 injections d'anti-douleur. Pour les animaux génétiquement modifiés, des symptomes liés à l'expression de la proteine humaine se développeront (par exemple une démarche altérée, des tremblements, une baisse de l'activité, une éventuelle perte de neurones dans des structures précises). Les animaux seront isolés pendant toute la durée de l'expérience.
Devenir
Euthanasie des animaux pour réaliser des prélèvements d’organe/ fluides corporels à un volume ne permettant pas la survie de l’animal, ou euthanasie des animaux suite aux effets indésirables provoqués par le(s) produit(s)/ modèle chez les animaux.
Remplacement
Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments, ce projet est réalisé chez la souris car il n’existe pas de méthode de substitution (in vitro ou in silico) pour évaluer les effets d’une nouvelle molécule après son injection dans le cerveau. Ou si elles existent, elles ne sont pas suffisantes pour répondre aux objectifs scientifiques du projet. Or, avant toute administration à l’homme, l’animal constitue un passage obligatoire pour l’évaluation de l’efficacité, la toxicité et la pharmacocinétique d’un candidat médicament. A ce jour, la souris est l’espèce qui est la plus adaptée à ce type de modèle d’étude.
Réduction
Un nombre minimal et suffisant d’animaux par groupe est utilisé afin d’analyser de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences. Une analyse statistique pourra éventuellement être envisagée et sera adaptée au modèle. Aucune analyse statistique ne sera réalisée sur la grille d'observation.
Raffinement
Dans ce projet, le raffinement sera obtenu par : • la mise au point de procédures rigoureuses, • la formation du personnel, • un suivi quotidien de l’état de santé des animaux, • le recours à des procédures les moins invasives possibles, • Le suivi d’éventuel signes cliniques, • La détermination des points limites, • Le recours aux procédures d’euthanasie dès que nécessaire, • Un protocole analgésique adapté pour la chirurgie et la période post-opératoire. Un raffinement spécifique à cette étude sera réalisé par la mise en application d'une grille d'observation spécifique à l'espèce permettant d'objectiver la contrainte subie par l'animal.
Choix des espèces
La souris est l'une des espèces les plus pertinentes et les plus couramment utilisées pour évaluer les effets d'un produit sur une pathologie précise dont certains symptomes sont induits après modification génétique de l'expression d'une proteine, qui peut être par exemple impliquée dans la maladie; ou bien pour évaluer la tolérabilté d'un candidat médicament. Animaux adultes. Ce projet n’a pas pour objectif d’étudier les effets du produit sur l’animal à d’autres stades de développement .
Bases neurobiologiques du vieillissement de la mémoire déclarative chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie cérébrale sous anesthésie, une privation alimentaire contrôlée avec isolement, et un conditionnement par trois chocs électriques d'une seconde. Elles sont tuées entre cinq et quatre-vingt-dix minutes après ce conditionnement pour des analyses du cerveau. Le projet cherche à distinguer le vieillissement normal de la mémoire de la maladie d'Alzheimer, en comparant des souris jeunes et des souris de vingt à vingt-deux mois.
Objectifs
La réalisation du présent projet intervient dans le cadre d’un besoin sociétal croissant concernant la prise en charge des individus vieillissants. En effet, le vieillissement de la population de nos sociétés occidentales est en train de devenir un problème de santé publique. Le nombre de personnes atteintes de formes pathologiques de vieillissement, comme la Maladie d’Alzheimer, est en croissance constante et se traduit par une augmentation parallèle des dépenses de santé. Cependant, un des problèmes majeur des études s’intéressant au vieillissement est qu’une grande majorité de ces dernières s’attachent à étudier les mécanismes altérés dans des cas pathologiques, dont le plus répandu est la Maladie d’Alzheimer. De ce fait, de nombreux aspects du vieillissement normal (qui semblent plus subtils) et les altérations qui en découlent restent méconnues et/ou peu caractérisées, ce qui pose le problème de la distinction entre les modifications dues à la senescence ou à la pathologie. Ainsi, il convient de distinguer les altérations de la mémoire relevant du vieillissement normal de celles relevant du vieillissement pathologique afin de développer des approches thérapeutiques plus adaptées en fonction du type de vieillissement. L'objectif de ce projet est d’améliorer la caractérisation des déficits de mémorisation liés au vieillissement normal, afin de le distinguer plus clairement de la maladie d’Alzheimer, forme de vieillissement pathologique la plus répandue.
Bénéfices attendus
L'objectif de ce projet est d’améliorer la caractérisation des déficits de mémorisation liés vieillissement normal, afin de le distinguer plus clairement du vieillissement pathologique. Cette distinction plus fine permettrait de développer des approches thérapeutiques plus adaptées en fonction du type de vieillissement considéré.
Procédures
Les animaux sont soumis à une procédure chirurgicale sous anesthésie générale qui dure environ 45 min. Les animaux sont soumis à une procédure comportementale (1 seule fois) où il recevront 3 chocs électriques (0.3 mA, de 1 seconde).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables chez les animaux sont liés à : - une chirurgie - une privation alimentaire - un isolement pour contrôler de manière fine la quantité de nourriture de chaque animal - un très court effet nociceptif dû à la procédure de conditionnement. Néanmoins, afin de réaliser nos études neurobiologiques, les animaux sont mis à mort rapidement (90 min ou 5 min) à la suite de ce conditionnement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après les procédures comportementales, en vue de la réalisation d’analyses.
Remplacement
L’utilisation de ces animaux se justifie pour plusieurs raisons : 1) Aucune alternative ne permet de se passer de l’utilisation de modèles animaux lorsqu’il s’agit d’étudier les processus de mémorisation. En effet, ce type d’étude repose sur l’analyse du comportement animal et nécessite d’avoir une espèce suffisamment proche de l’espèce humaine pour en extrapoler les résultats. 2) L'organisation du système nerveux central de ces animaux est suffisamment proche de celle de l'homme pour permettre une extrapolation acceptable des résultats obtenus à l'espèce humaine. 3) Le modèle comportemental a été établi chez la souris et l’ensemble des appareils comportementaux que nous utiliserons sont dimensionnés pour cette espèce.
Réduction
Concernant la réduction, l’effectif se justifie par l’utilisation d’un nombre suffisant d’animaux dans chaque condition expérimentale afin que les analyses statistiques envisagées puissent être concluantes. Nous avons en effet déterminé ce nombre suites aux expériences précédentes utilisant les mêmes tests comportementaux. Nous avons aussi effectué au préalable des analyses ex vivo afin d’améliorer au mieux la sensibilité de chaque technique immunohistochimique.
Raffinement
Pour les procédures avec restriction alimentaire, les animaux sont isolés une semaine avant le début de la restriction, afin de contrôler le rationnement alimentaire de chaque animal. Ces animaux sont surveillés et pesés quotidiennement à partir du moment où les animaux sont en restriction alimentaire et la quantité quotidienne de nourriture sera adaptée en fonction de leur poids. Leur perte de poids (95 à 88 % de leur poids de base) est ainsi progressive et contrôlée. Si la perte de poids dépasse les 12%, alors on augmente la ration alimentaire. Si l’animal continue à perdre du poids, alors on rajoute de la nourriture en poudre. Si malgré ces mesures conservatoires, l’animal ne reprend pas son poids initial, ceci est considéré comme un point limite et l’animal est sacrifié. Lors de l’isolement, un tube en carton est rajouté dans la cage pour augmenter l’enrichissement. De plus, on vérifie tous les jours que les cages avec des animaux seuls sont collées les unes aux autres pour augmenter les interactions olfactives et visuelles. Outre le poids, d’autres indices seront surveillés quotidiennement durant tout le temps des procédures et des points limites précis et adaptés ont été définis. En cas de présence d’individus agressifs avec leurs congénères, l’individu agressif est isolé. Les animaux présentant des lésions cutanées reçoivent une pulvérisation d’un spray antiseptique sur la zone concernée, ainsi qu’une injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien pour atténuer la douleur. Au cours des procédures expérimentales, si un des points limites est atteint, l’animal reçoit une injection sous-cutanée d’un anti-inflammatoire non-stéroïdien pour atténuer la douleur. Si nous n’observons pas d’amélioration, nous ferons intervenir la vétérinaire responsable. En cas d’absence d’amélioration après traitement, il sera mis à mort par dislocation cervicale. Si après 24h l’état de l’animal s’est amélioré, avec une reprise de poids, celui-ci est conservé dans l’étude.
Choix des espèces
La souris: -est un mammifère présentant une proximité phylogénétique avec l’espèce humaine et certains de ses comportements peuvent être rapprochés de ceux de l’espèce humaine. L’essentiel des données de l’équipe concernant la mémoire émotionnelle ont été obtenues chez la souris: pour une comparaison des résultats, l’étude des mécanismes neurobiologiques responsables du passage d’une mémoire normale à une mémoire traumatique implique l’utilisation de cette espèce -permet des approches invasives (approches pharmacologiques etc.) permettant d’étudier l’effet de molécules sur le système nerveux central et les phénomènes de mémorisation via l’étude comportementale -offre la possibilité d’être manipulée génétiquement par injection de virus ce qui permettra l’analyse des modifications neuromorphologiques. Tous les animaux utilisés seront adultes. Cependant, il y aura deux conditions d’âge. Il y aura tout d’abord des animaux jeunes adultes (âgés de 3 à 4 mois) qui serviront de groupe contrôle pendant le test, les animaux jeunes ne devant pas présenter de déficit de mémorisation. Ensuite, il y aura des animaux âgés (20 à 22 mois) qui, selon les données antérieures, présentent un déficit de mémorisation dans la tâche comportementale utilisée.