Souris
Caracterisation par IRM de la réponse inflammatoire microgliale postprandiale dans le contrôle de la prise alimentaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des examens d'imagerie sous anesthésie pouvant durer jusqu'à deux heures et demie, une partie recevant une injection abdominale déclenchant une inflammation ou une diète enrichie en gras. Le projet cherche à comprendre le rôle de l'inflammation cérébrale dans la prise alimentaire et l'obésité. Le porteur affirme s'être assuré de l'absence d'approche in vitro capable de reproduire cette interaction multicellulaire.
Objectifs
Ce projet vise à caractériser, par Imagerie par Résonance Magnétique, la réaction inflammatoire cérébrale survenant après un repas standard ou un repas enrichi en gras. Ces expériences s’inscrivent dans le cadre plus large d’un projet multidisciplinaire, où il a été suggéré par d’autres méthodes, que cette inflammation cérébrale était faible et presque indétectable après un repas standard mais exacerbée après un repas enrichi en gras. Cette inflammation apparaît en particulier dans les cellules immunitaires du cerveau, dans l’hypothalamus, structure impliquée dans la régulation de la prise alimentaire. L’hypothèse est que cette réponse inflammatoire pourrait influencer le comportement alimentaire, en modifiant par exemple la sensation de satiété. Cependant, dans un contexte de suralimentation, d’apports trop riches en graisses, cette inflammation devient chronique et n’a plus d'effet bénéfique sur la prise alimentaire. Ce projet consistera à étudier et caractériser la réponse inflammatoire par Imagerie par Résonance Magnétique, dans le cerveau après un repas standard ou un repas enrichi en gras.
Bénéfices attendus
L'ensemble de l'étude vise à comprendre comment les cellules immunitaires du cerveau particient au contrôle de la prise de nourriture et à la perception de satiété, et, à long terme, comment ce méchanisme participe au développement de l'obésité.
Procédures
Les souris seront exposées à des tests d'imagerie médicale pour une durée maximale de 2H30, anesthésie incluse. Les souris peuvent subir un ou plusieurs tests d'imagerie. Une partie des animaux seront soumis à un traitement pharmacologique par une injection dans l'abdomen, d'une durée d'environ une minute.
Impact sur les animaux
Une partie des animaux vont subir une injection dans l'abdomen qui induira un début d'inflammation générale, mais dont les effets n'apparaitrons que lorsque les animaux seront sous anesthésie. Une partie des animaux aura une diète enrichie en gras, supposée induire une inflammation cérébrale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure.
Remplacement
Nous nous sommes assurés de l'inexistence d'approches alternatives in vitro qui pourraient être utilisées pour reproduire l'interaction entre inflammation microgliale et alimentation. En effet les méthodes in vitro basées sur la culture cellulaire ne présentent pas les systèmes de communication multicellulaires nécessaires pour ce projet.
Réduction
Plusieur mesures sont appliquées pour permettre la réduction du nombre d'animaux utilsés dans ce projet : - une etude préliminaire sur un nombre restreint d'animaux pour s'assurer d'un déroulement efficace des expériences et - l'utilisation de tests statistiques optimaux, pour avoir le nombre d'animaux minimal sans compromettre la validité de nos résultats.
Raffinement
Conditions d’hébergement : Les animaux sont soumis à un cycle inversé d’alternance jour nuit 12h - 12h et ont accès à volonté à la nourriture et à l’eau. Le cycle inversé est utile pour notre étude car les animaux mangent la nuit et jeune le jour. Pour étudier la prise de nourriture, nous avons besoin que les animaux se nourrissent le jour. Une période d’acclimatation est respectée pendant laquelle ils sont habitués au cycle inversé de l'animalerie, à la préhension et à la présence de l’expérimentateur. Les souris sont stabulées dans un environnement enrichi selon le protocole défini par l'animalerie. Suivi des animaux : L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur. Cela nous permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance (notamment, suppression de la douleur grâce à l’administration d’antalgiques).
Choix des espèces
La souris représente l’espèce la plus adaptée au type de recherche que nous menons. En effet, le cerveau de souris permet une analyse neuroanatomique de haute résolution concernant les réseaux cellulaires activés en fonction de différents signaux métaboliques. Sa taille est compatible avec la microdissection d’aires cérébrales d’intérêt permettant des analyses biochimiques ou moléculaires. Cet animal nous permet également d’obtenir des analyses fines du comportement alimentaire. La réalisation de différents tests fonctionnels permettant l’analyse des paramètres métaboliques est aussi possible chez cet animal. Enfin, cette espèce a été bien étudiée par la communauté scientifique et nous disposons maintenant d’outils génétiques spécifiques à cette espèce et d’intérêt dans notre projet. Les animaux seront adultes, pour travailler sur un cerveau mature et stable.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques dans un modèle d’acné chez la souris
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. On leur injecte dans l'oreille une bactérie provoquant une inflammation locale, suivie d'imagerie sous anesthésie, un point limite étant fixé à 20 % de perte de poids. Le projet teste des molécules contre l'acné humaine. Le porteur qualifie ce modèle d'indispensable et affirme n'y recourir qu'en dernier recours, après des criblages in vitro qui ne remplacent pas complètement la peau vivante selon lui.
Objectifs
L'acné touche en France environ 15 millions de personnes : majoritairement des adolescents, mais aussi près de 20 % des femmes adultes. L’acné est une maladie de la peau caractérisée par l’éruption de boutons rouges, de points noirs et de kystes. Elle touche le plus souvent le visage et le thorax, mais aussi le dos, le torse voire le cuir chevelu. L’acné est une pathologie chronique du follicule pilosébacé, évoluant de façon fluctuante dans le temps et dont la physiopathologie implique 3 étapes : (1) hypersécrétion sébacée, (2) formation des lésions rétentionnelles (3) formation des lésions inflammatoires. L'acné est un vrai enjeu de santé publique : c'est la maladie de la peau qui a les répercussions psychologiques les plus importantes chez les patients. Parce qu'elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Il est donc important d’avoir un modèle préclinique prédictif de l'acné et afin d’évaluer l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques (non cosmétiques), il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle.
Bénéfices attendus
L'acné est une maladie de la peau qui a des répercussions psychologiques très importantes chez les patients car elle modifie l'image corporelle des individus à des moments clés de la vie (l'adolescence, la femme jeune) et parce qu'elle atteint le visage, elle interfère alors dans la relation avec les autres. Les personnes touchées sont en proie au mal-être et ont tendance à se replier sur elles-mêmes. Les bénéfices de ce projet, si une molécule se révélait efficace, serait de mettre sur le marché cette molécule permettant aux patients atteints d'acné de guérir de l'acné et de son inflammation, réduisant ainsi les conséquences physiques et les répercussions psychologiques impactées par cette maladie de peau.
Procédures
Injection en intradermique au niveau de la face externe de l'oreille à l'aide d'une aiguille (durée d'intervention
Impact sur les animaux
L'injection de la souche bactérienne P. acnes dans les oreilles est très bien tolérée par les animaux, elle induit uniquement une inflammation locale et très transitoire chez l'animal. Il est possible que les molécules testées par voie topique peuvent assécher localement de façon excessive la peau des oreilles. Si tel était le cas, les fréquences de traitement seraient espacées.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort après les procédures 1 et 2 car ils ne pourront pas être réutilisés du fait du prélèvement des tissus chez ces derniers.
Remplacement
Nous n'utiliserons le modèle animal d'inflammation provoquée par l'acné qu'en dernier recours après des tests préalables de criblage et d'efficacité in vitro. Il est indispensable de tester ces molécules dans ce modèle pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas vraiment de modèle in vitro d'inflammation provoquée par l'acné pouvant remplacer complètement la peau en tant que tissu biologique vivant. Il existe cependant des modèles in vitro qui permettent d’effectuer un premier criblage d’efficacité de molécules, mais cette efficacité doit ensuite être confirmée chez l’animal. - Ces modèles in vitro ne permettent pas de tester des produits thérapeutiques ou des dispositifs médicaux destinés à être appliqués sur la peau (voie dermique / topique) - L’efficacité ne pouvant être complètement testée in vitro, des premières preuves d’efficacité in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme).
Réduction
Le nombre de souris nécessaires a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience. L'utilisation de l'imagerie de Tomographie en Cohérence Optique (OCT) permettra aussi d'augmenter le raffinement (finesse de l'analyse, suivi longitudinal,...) et entraîne une réduction du nombre d'animaux utilisés grace au suivi longitudinal du même animal. Cette approche permet donc de réduire le nombre d’animaux de 50 % au moins comparé à une technique telle que l'histologie qui aurait nécessité le sacrifice des animaux à différents temps.
Raffinement
Evaluation des points finaux quotidiennement (poids, état d'hydratation, comportement de l'animal, état des lésions induites...), enrichissement du milieu dans les cages (igloo, buchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, les points limites établis en concertation avec le Comité de Suivi du Bien-Être Animal (SBEA) de notre établissement, sont les suivants : - Défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation ; - Perte de poids supérieure à 20 % du poids normal maintenue sur 72h ; - Hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger ; - Difficulté respiratoire, avec augmentation du rythme respiratoire ; - Plaie nécrosée, purulente ou exsudative - Complication sur le site d’application de la molécule topique. Si l'un de ces points limites est atteint, les animaux seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
La souris s'est rapidement imposée au cours du temps comme un modèle fondamental dans la recherche biomédicale. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives à l'évaluation de l'inflammation provoquée par l'acné dans ces espèces. De plus, elle présente certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés entre 6 et 10 semaines, nous permettant ainsi d’avoir un point de comparaison par rapport aux résultats issus de la littérature relative à ce modèle.
Etude des séquelles de la malaria cérébrale par neuroimagerie
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et sévère. Elles sont infectées par un parasite provoquant une malaria cérébrale, une partie n'étant pas traitée et développant perte de poids, hypothermie et troubles neurologiques avant d'être tuées, les autres suivies par IRM sous anesthésie pendant six mois puis soumises à des études comportementales non détaillées. Le projet étudie les séquelles cérébrales de la maladie. Le porteur affirme que le recours à l'animal est incontournable, aucune méthode in vitro ou in silico n'existant selon lui.
Objectifs
La malaria est une cause majeure de morbidité et de mortalité avec 241 millions de cas cliniques et plus de 627000 morts en 2020 (OMS). Elle est causée par un parasite du genre Plasmodium inoculé par le moustique Anophèle. La majorité des décès survient chez les enfants de moins de 5 ans en Afrique sub-saharienne. La malaria cérébrale, complication la plus létale de l’infection par Plasmodium falciparum, se traduit par une encéphalopathie accompagnée de convulsions, de pertes de conscience, et d’un coma conduisant au décès dans 15 à 20 % des cas, tandis que des déficits neurologiques peuvent subsister chez les survivants. Il n’existe à ce jour aucun traitement efficace de cette complication. Dix à 20 % des sujets survivant à une malaria cérébrale présentent des troubles neurologiques importants immédiatement après la maladie (cécité corticale, parésie, hypotonie, ataxie, épilepsie, troubles de la mémoire, de l’élocution etc...) qui peuvent régresser ou persister. Chez d’autres sujets, sans séquelles apparentes après la maladie, des atteintes neurologiques telles qu’une épilepsie, ou une hyperactivité avec déficit de l’attention se manifesteront plus tardivement. Alors que les séquelles de la complication cérébrale contribuent au coût humain, social et économique de la malaria en compromettant le développement et l’éducation des enfants qui en sont atteints, elles ne sont que très peu étudiées. Malgré l’autorisation en 2021 d’un vaccin contre la malaria (RTS,S/AS01) destiné à la population pédiatrique, il est peu probable qu’il conduise à l’éradication de la maladie et de sa complication la plus létale, puisqu’on estime qu’il ne permettra de réduire que 30% de la mortalité résultant des formes sévères de malaria. Nous utiliserons un modèle de malaria cérébrale avec survie obtenu chez la souris infectée par Plasmodium Berghei ANKA et traitée par un antimalarique dès l’apparition des signes neurologiques (504 souris seront utilisées). Ce modèle nous permettra d’étudier sur le long terme l’évolution des séquelles cérébrales sur les plans anatomique, métabolique, vasculaire et fonctionnel. Nous mettrons en œuvre des techniques d’imagerie non-invasives (IRM) réalisées sous anesthésie. Ces études permettront d’obtenir une information sur la distribution spatiale et temporelle des lésions, et de vérifier différentes hypothèses comme l’atteinte persistante des capillaires ou l’altération des connexions neuronales (connectome) aux niveaux structural et fonctionnel.
Bénéfices attendus
Cette étude repose sur l’emploi d’un modèle de malaria cérébrale chez la souris très utilisé en pathologie car présentant de nombreux points communs avec la maladie pédiatrique. Elle s’appuie aussi sur des méthodes avancées de neuroimagerie transposables à l’homme qui permettent l’exploration non-invasive du cerveau. L’étude par imagerie de la malaria cérébrale chez la souris a permis d’identifier pour la première fois en 2005 l’œdème cérébral ischémique comme principale caractéristique de la maladie et cause de décès. Ces résultats ont été confirmés 10 ans plus tard par deux études conduites sur des cohortes pédiatriques en Afrique, les enfants malades ayant bénéficié d’un examen clinique par neuroimagerie. L’objectif de notre projet est l’identification des lésions ou anomalies sous-tendant les déficits neurologiques chez les sujets ayant survécu au syndrome cérébral. Ces travaux réalisés sur un modèle expérimental très proche de la maladie humaine devraient permettre de mieux comprendre la nature des séquelles cérébrales chez les animaux ayants survécu à une malaria cérébrale qu’elles soient structurales, métaboliques, vasculaires, ou fonctionnelles. Notre étude est susceptible de fournir des marqueurs diagnostiques/pronostiques transposables à l’homme qui permettraient d’améliorer le suivi des patients et d’évaluer l’efficacité d’interventions thérapeutiques.
Procédures
Inoculation du parasite : les animaux induits pour la malaria cérébrale seront inoculés avec le parasite par une unique injection intrapéritonéale à l’état vigile, l’intervention n’est pas douloureuse et ne dure que quelques secondes. Examen clinique : le suivi des animaux induits pour la malaria et non traités par un antimalarique inclura 2 prélèvements sanguins pour suivi de la parasitémie. Le prélèvement d’une goutte de sang au niveau de la queue sera réalisé à l’état vigile, sans contention. Les animaux malades et traités subiront 3 prélèvements. Traitement : les souris induites pour la malaria et traitées recevront une injection intrapéritonéale quotidienne à l’état vigile du traitement anti-malarique pendant 10 jours. Les groupes contrôles recevront une injection quotidienne à l’état vigile d’une solution saline ou du traitement antimalarique selon les groupes. Imagerie cérébrale: les animaux seront imagés sous anesthésie, la durée de l’examen sera inférieure à 1h30. Les animaux contrôles et les animaux induits pour la malaria cérébrale et traités subiront 7 examens au total sur une période de 6 mois. Les souris induites pour la malaria cérébrale mais non traitées seront imagées deux fois (une semaine avant inoculation et une fois pendant la maladie). Les animaux contrôles et les animaux induits par la malaria cérébrale seront soumis à deux études comportementales, une fois à la fin du suivi de six mois.
Impact sur les animaux
Les animaux contrôles seront examinés par IRM avant administration d’une solution saline ou de chloroquine (selon les groupes), puis une fois par mois pendant 6 mois après la fin du traitement. La solution saline et la chloroquine seront administrées en ip une fois par jour pendant 10 jours. Elles ne produisent aucun effet délétère détectable par examen clinique ou monitoring physiologique. L’examen IRM sera conduit sous anesthésie gazeuse. Les seules nuisances ou effets indésirables possibles pour ces deux groupes sont essentiellement la défaillance cardiorespiratoire sous anesthésie, très rare avec l’isoflurane administré à faible dose. L’utilisation d’un monitoring physiologique permet en général de détecter les premiers signes de défaillance et d’interrompre immédiatement l’anesthésie ce qui permet le réveil rapide des animaux. Les animaux induits pour la malaria cérébrale et non traités seront examinés par IRM avant l’injection du parasite. Quatre à 6 jours après l’injection, les animaux présenteront les premiers signes de la maladie (perte de poids, poil hérissé, yeux mi-clos, léthargie). Puis, 6 à 8 jours après l’inoculation, les manifestations neurologiques apparaitront (hypothermie, diminution de la coordination et de la motricité) pouvant conduire au coma et à la mort. Les animaux seront imagés lors des premières manifestations neurologiques et euthanasiés sous anesthésie. L’examen par IRM et l’euthanasie auront lieu avant la survenue d’une hypothermie sévère, de convulsions et du coma. Les animaux induits pour la malaria cérébrale et traités à la chloroquine seront examinés par IRM avant l’injection du parasite. Ils seront traités dès l’apparition des premières manifestations neurologiques. Ils seraient euthanasiés s’ils présentaient une aggravation de leur état, la chloroquine étant inefficace à un stade avancé de la maladie. Les animaux traités efficacement par la chloroquine seront suivis comme les groupes contrôles par IRM pendant 6 mois. Les animaux ayant eu une malaria cérébrale sont moins actifs que les sujets contrôles. Les autres effets indésirables possibles sont liés au risque anesthésique pendant les examens IRM.
Devenir
A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront euthanasiés afin de prélever le cerveau en vue d’analyses biochimiques ou immunohistochimiques selon les cas.
Remplacement
Le recours à l’animal est incontournable car la détection des séquelles cérébrales et le suivi de leur évolution au cours du temps ainsi que leur impact sur la fonction cérébrale ne peuvent être réalisés que sur des animaux vivants. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro ou in silico. Notre projet étudiera l’évolution de plusieurs paramètres cérébraux comme le métabolisme, le débit sanguin, le connectome structural, et le connectome fonctionnel. Le suivi de ces paramètres nous permettra d’identifier la nature des séquelles de la malaria cérébrale et de mieux comprendre leur impact sur la fonction cérébrale à divers âges de la vie.
Réduction
L’utilisation de techniques d’imagerie non invasive permettra de réduire le nombre d’animaux grâce au suivi longitudinal de chaque individu ce qui permettra le recueil d’un grand nombre de données anatomiques, métaboliques et fonctionnelles sur un même animal dans des conditions de stress minimal.
Raffinement
Le raffinement concernera toutes les procédures du projet ainsi que les conditions d’hébergement des animaux et devrait permettre de réduire le stress, l’angoisse et la douleur. En ce qui concerne l’induction de la malaria cérébrale et son traitement, un examen clinique quotidien permettra de déceler sans retard des signes d’aggravation neurologiques qui nécessiteraient de recourir à l’euthanasie. Tous les examens cliniques par imagerie seront réalisés sous anesthésie gazeuse avec surveillance physiologique. Un délai d'acclimatation minimum de 14 jours et une habituation à l'expérimentateur seront assurés. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec cycle jour/nuit, nourriture et boisson ad libitum et enrichissement environnemental. Les cages contiendront des rondins de bois à ronger, du coton pour la nidification, un refuge en plastique, et une roue fast-track avec igloo afin de diminuer les comportements agressifs, réduire l’ennui, et favoriser l’expression d’un maximum de comportements naturels.
Choix des espèces
L’inoculation du parasite murin Plasmodium Berghei ANKA chez la souris est un modèle validé et reconnu de malaria cérébrale pédiatrique qui a permis des avancées majeures dans la compréhension des mécanismes pathogéniques de cette maladie. Dans la majorité des études utilisant le modèle obtenu par inoculation de PbA, les souris induites pour la malaria cérébrale sont de jeunes adultes (entre 8 et 12 semaines). Plusieurs études ont montré une résistance au développement de la malaria cérébrale chez des animaux plus âgés. Nous induirons donc la malaria cérébrale chez des animaux âgés de 8 semaines.
Effets de la dapagliflozine orale ou du dulaglutide sous-cutané sur le remodelage cardiaque dans un modèle murin de cardiomyopathie liée au diabète
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
192 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Ces souris développent un diabète et une cardiomyopathie, puis subissent prélèvements sanguins répétés, mesures de pression, échographies et examens IRM ou TEP avec injection d'un traceur, avant d'être tuées pour prélever le tissu cardiaque. Le projet compare deux antidiabétiques quant à leurs effets sur le cœur. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes de remplacement pour l'étude du diabète, mais affirme que ces mécanismes dans un organisme entier restent difficiles à reproduire et que le modèle de souris est unique.
Objectifs
L'objectif du projet est de comparer l'effet d'un SGLT2i (dapagliflozine) et d'un GLP-1 RA (dulaglutide), deux agents antidiabétiques au mécanisme d'action très différent, sur la gestion du glucose cardiaque. En effet, alors que SGLT2is ne présente pas d'effet direct sur la sécrétion d'insuline ni sur la sensibilité, les GLP-1 RA augmentent la sécrétion d'insuline, entraînant potentiellement une augmentation de la captation du glucose par les cellules et notamment les cardiomyocytes. Notre hypothèse est que l'effet du SGLT2i sur la réduction de la glucotoxicité cardiaque est spécifique et pourrait, au moins partiellement, expliquer son action bénéfique sur l'insuffisance cardiaque. D'autre part, l'effet de sécrétion d'insuline du GLP-1 RA pourrait augmenter le flux de glucose dans les cardiomyocytes, conduisant potentiellement à l'effet différentiel observé entre ces deux classes de médicaments sur l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de mieux comprendre 2 traitements distincts du diabète sur l'insuffisance cardiaque. Avec ces connaissances, les traitements du diabète pourront être adapté en fonction des pathologies annexes du patient.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélevement sanguins au niveau de la queue pendant 1 semaine pour surveiller leur glycémie (2 min par prélevement par animal). La pression artérielle sera également prise au niveau de la queue de l'animal pendant 1 semaine, cette procédure prend environ 15 minutes par animal. Les animaux seront également soumis à de l'imagerie (1 échographie et 1 IRM/TEP par animal). Pour la TEP, pour chaque animal une injection d'environ 100 µL de 18FDG (traceur) en intrapéritonéale est prévue avant l'examen d'imagerie. L'échographie dure en moyenne 5 à 10 minutes et l'IRM/TEP environ 30 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux SKO développent une lipodystrophie dès leur plus jeune âge et présentent par la suite un phénotype diabétique à partir de 8 semaines. Tout cela va conduire à une cardiomyopathie entre 10 et 12 semaines qui va s'aggraver avec le temps. Les différents traitements administrés ne devraient pas produire d'effets indésirables sur les animaux au contraire.
Devenir
Les animaux seront gardés en vie à l'issue de la procédure d'entretien de la lignée, l'euthanasie des animaux aura lieu à la fin de la procédure comprennant les divers examens d'imageries pour le prélévement des tissus cardiaques.
Remplacement
Malgré l'existence certaine de méthode de remplacement pour les études sur le diabète. Ici le projet a pour but d'étudier 2 traitements du diabète et leurs actions au niveau cardiaque. Tout cela implique des mécanismes divers et variés dans un organisme entier qu'il est très difficile de reproduire in vivo ou in situ. Le modèle de souris SKO est un modèle diabétique unique qui ne permet pas son remplacement.
Réduction
Le principe de réduction a été appliqué au début du projet par l'équipe de Nantes. De nombreuses études pilotes ont permises de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Des techniques d'imageries non invasives seront utilisés pour limiter au maximum les nuissances sur le bien-être des animaux. Un suivi cardiaque et respiratoire sera effectué pour surveiller du mieux possible les animaux durant ces procédures. L'anesthésie préalable sera effectuée de manière progressive pour limiter le stress chez les animaux. L'administration des différents traitements sera effectué avec précaution et un suivi post-traitement sera effectué pour s'assurer du bien-être des animaux.
Choix des espèces
La lignée de souris Bscl2-/- est unique en son genre de par l’absence de lipotoxicité et ne peut donc pas être substituée par une autre espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 12 semaines. Cela s'explique par les souris SKO qui présente un phénotype diabétique à partir de 8 semaines et une cardiomyopathie à partir de 12 semaines. Comme nous souhaitons travailler sur ces pathologies, il est nécessaire d'attendre le temps qu'elles apparaisent.
Impact des polluants atmosphériques sur le phénotype évolutif du syndrome de détresse respiratoire aiguë
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
9 144 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant jusqu'à sévère. Elles reçoivent des instillations intranasales et trachéales de polluants atmosphériques et de LPS, provoquant une inflammation pulmonaire aiguë qui peut entraîner perte de poids, léthargie et fermeture des yeux, les souris atteignant 20 % de perte de poids étant mises à mort. Le projet vise à montrer l'impact des polluants sur la défaillance respiratoire aiguë. Le porteur indique qu'une partie des expériences se fait in vitro ou in silico, mais conclut au recours à la souris pour reproduire la maladie.
Objectifs
Les défaillances respiratoires aiguës inflammatoire sont une cause fréquente d'admission en réanimation. Il s'agit d'affections graves, responsables de nombreuses complications et d'un risque de décès élevé. L'exposition aux polluants atmosphériques fait partie des facteurs aggravants pouver expliquer l'évolution défavorable retrouvée chez certains patients atteints de défaillances respiratoires. Néanmoins, cette relation de cause à effet reste peu étudiée et mal comprise à ce jour. Le but de ce projet est donc d'explorer le rôle de l’exposition aux polluants atmosphériques sur l’évolution de la défaillance respiratoire aiguë inflammatoire.
Bénéfices attendus
Le but de ce projet est démontrer l’impact défavorable des polluants atmosphériques sur l'évolution des patients atteints de défaillance respiratoire aiguë inflammatoire. Si l’hypothèse de notre projet était confirmée, il s’agirait d’un argument supplémentaire en faveur de la réduction des polluants atmosphériques dans l’environnement. Ces données permettraient d'étayer l'argumentaire scientifique supportant les politiques de santé publique visant à réduire l'exposition aux polluants atmosphériques. Ce projet vise en outre à comprendre les mécanismes par lesquels les polluants atmosphériques sont susceptibles d'impacter l'évolution des patients de réanimation souffrant de défaillance respiratoire aiguë inflammatoire. Ceci devrait permettre d'identifier des cibles thérapeutiques visant à réduire le risque de décès chez ces patients.
Procédures
1. Instillation intranasale de PBS / PUF / NP-B[a]P / DEP : • 1 procédure / animal • Durée : 1 minute. 2. Instillation trachéale de PBS / LPS : • 1 procédure / animal • Durée : 1 minute. 3. Mesures de compliance pulmonaire par Flexivent : • 1 procédure / animal concerné • Durée : 3 minutes
Impact sur les animaux
L’inflammation aiguë pulmonaire peut entraîner, selon son intensité, une détérioration plus ou moins rapide de l'état clinique général de la souris qui se manifeste par une perte de poids, une réduction de la mobilité, une catarrhe oculaire, une fermeture des yeux et un poil hirsute.
Devenir
Les procédures expérimentales nécessitent la collecte d’échantillons biologiques (lavages broncho-alvéolaire, poumons), ou la réalisation de mesures invasives de la fonction respiratoire rendant nécessaire la mise à mort des animaux.
Remplacement
Une partie des expérimentations visant à comprendre l’effet des polluants atmosphériques sur l’évolution de la défaillance respiratoire aiguë inflammatoire sont réalisées sur cellules cultivées en laboratoire (in vitro) ou par méthode bioinformatique (in silico), permettant de remplacer certaines expérimentations animales
Réduction
Le nombre de souris utilisées est réduit au minimum nécessaire afin de mettre statistiquement en évidence les effets des polluants atmosphériques.
Raffinement
Afin de réduire stress et souffrance, un enrichissement de l’environnement est pratiqué dans notre animalerie (maison rouge dans toutes les cages, possibilité de rajouter des lanières de papier). De plus, une surveillance régulière (journalière ou bi-hebdomadaire en fonction des protocoles) des animaux est effectuée, et la mise à mort par injection létale de pentobarbital réalisée en cas de souffrance identifiée par des caractéristiques telles que : prostration, poils hirsute, perte de poids (égale ou supérieure à 20% du poids initial). Toute administration par voie intranasale ou intratrachéale sera précédée par l’administration d’un anesthésique/analgésique.
Choix des espèces
Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres observés au cours de la défaillance respiratoire aiguë inflammatoire. En outre des souches de souris génétiquement modifiées existent, permettant d’identifier les molécules ou cellules impliquées dans le développement de cette pathologie.
Etude de l’effet d’administration de souches bactériennes probiotiques sur la colonisation néonatale du tube digestif murin par des souches bactériennes pathogènes
- Recherche appliquée
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système urogénital
3 640 souris, dont des femelles gestantes et leurs souriceaux, vont être utilisées, toutes tuées par dislocation cervicale à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les nouveau-nés sont colonisés par une bactérie E. coli puis gavés quotidiennement pendant trois à six semaines avec une suspension bactérienne, pour tester des souches probiotiques contre des bactéries résistantes aux antibiotiques. Le porteur indique que le gavage provoque un stress mais qu'il n'entraîne qu'extrêmement rarement une réponse délétère, et prévoit un surplus de souriceaux dont seuls les mieux colonisés sont conservés. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune expérience in vitro ne peut reproduire la colonisation intestinale in vivo.
Objectifs
Escherichia coli est une bactérie qui colonise le tube digestif de l’Homme et des animaux à sang chaud, dès les premières heures qui suivent la naissance. Un sous-groupe d’E. coli est responsable de maladies telles que les méningites néonatales, les septicémies et les infections urinaires. Le traitement de ces infections passe par l’administration d’antibiotiques. Cependant, dans un contexte de multiplication de résistance bactérienne aux antibiotiques, la recherche d’autres voies de lutte contre ces agents infectieux est nécessaire. Parmi plusieurs stratégies, l’usages de bactéries issues d’un autre sous-groupes de E. coli possèdant des propriétés bénéfiques, notamment la capacité de combattre les souches potentiellement pathogènes, est décrit.
Bénéfices attendus
Le projet vise à amorcer le développement d'une stratégie de lutte contre les bactéries pathogènes multirésistantes aux antibiotiques trouvant leur réservoir dans le tube digestif des mammifères sans utiliser d'antibiotique.
Procédures
- Récolte de fèces sur animaux vigiles - Gavage oral qutodiein pendant 3 à 6 semaines avec 100 uL d'une suspension bactérienne (non visqueuse, non irritante) ou du PBS Administration antibiotique dans l'eau de boisson. Contamination par contact des nouveau-nés par la souche d'intérêt.
Impact sur les animaux
La procédure expérimentale, basée sur un gavage oral des souris avec une suspension bactérienne, implique une nuisance (stress) pour l'animal. Cependant, le gavage oral des souris par des E. coli commensales et pathogènes n’occasionne qu’extrêmement rarement une réponse délétère pour l’animal. Lors de l'expérimentation pilote, aucun individu n'a présenté de signe imputable à la colonisation bactérienne initiale ni aux gavages quotidiens. Le prélèvement de féces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur. Cependant un léger stress peut être provoqué par la préhension de l'animal avant le prélèvement, il sera limité par l'habituation et dure 1 à 2 minutes le temps du prélèvement.
Devenir
L'ensemble des animaux est euthanasié par dislocation cervicale à l'issu de la procédure expérimentale.
Remplacement
Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. Des expérimentations in vitro de diminution du nombre et de la croissance de notre bactérie cible ont été effectués au laboratoire en réponse à notre souche probiotique. Différentes doses et combinaisons (mutants, souches expérimentales) ont pu être testées permettant de sélectionner la souche probiotique la plus efficace et pertinente in vitro. Cependant, l'objectif du projet étant de démontrer l'efficacité de la souche probiotique Nissle à réduire le portage intestinal d'une souche multirésistance, les systèmes in vitro (tube à essai) ne nous permet pas d'appréhender cette question. Seule une approche in vivo nous permettra de prendre en compte la complexité de l'organisme et l'effet de l'administration quotidienne par gavage de la souche probiotique sur le portage de la souche multirésistante dans l'intestin.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaires est calculé au plus juste en tenant compte des éléments suivants : - Une expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains animaux (n= 4 animaux par groupe dans cette expérience obtenus à partir de différentes femelles gestantes) pour deux souches probiotiques sélectionnées après 28 jours de gavage. Les résultats obtenus ont permis de sélectionner une souche probiotique pertinente à tester sur un plus grand nombre d'animaux pour conclure sur son efficacité. - Notre expérience montre que les femelles Swiss font des portées comprenant en moyenne 12 souriceaux. Afin de garantir 10 mâles et 10 femelles colonisés par groupe, 7 femelles gestantes sont nécessaires, avec un attendu de 84 souriceaux. Le surplus de souriceaux permettra de ne conserver que les animaux dont la colonisation est suffisament élevé (au moins 10^8 log(CFU/g de fèces)) et stable entre les 2 points initiaux de mesure, ainsi que de compenser un sexe-ratio différent de 1 (données imprévisibles). L'expérimentation pilote a permis de montrer que pour constituer notre effectif final de 64 souris, 7 mères gestantes étaient nécessaires. 91 individus seront nécessaires par expérimentation (7 femelles gestantes + 84 souriceaux). Nous serons amenés à reproduire ce protocole pour valider nos données (répétition) et utiliser différents probioiques (nombre estimé à 6) contre différents variants de E. coli pathogènes (nombre estimé à 10). Ainsi, nous pensons sur la période de 5 ans utiliser 3640 souris (dont 280 femelles gestantes). - Les résultats obtenus sont comparés avec le logiciel Prism GraphPad 8, en utiliant le test du Chi-2 (comapraison des moyennes de charges bactériennes dans les fèces en CFU/g de fèces) ou le test exact de Fischer (comparaison des proportions de souris toujours excrétrices de bactéries pathogènse par rapport au nombre total de souris).
Raffinement
Le suivi expérimental repose sur des techniques non-invasives. Le prélèvement de fèces sur animaux vigiles n'induit pas de douleur mais une habituation à la contention par l'expérimentateur sera réalisée avant les prélèvements. La contention des animaux lors des gavages oraux et des récoltes de selles s'effectue par du personnel qualifié et expérimenté dans la manipulation des souris. Les gavages sont réalisés avec des sondes souples. La solution de gavage est de volume limité (100 uL maximum par administration). Celle-ci n'est ni visqueuse, ni irritante. Compte-tenu de la fréquence des gavages, ceux-ci sont réalisés uniquement par du personnel qualifié, en veillant à ne pas placer la sonde trop profondément dans l'oesophage, et l'administration se fait lentement. Durant cette phase, les souris sont évaluées individuellement à l'aide de critères cliniques et pesées 2 fois par semaine, opérations effectuées par des personnels formés et habitués à la manipulation de souris notamment dans le cadre de ce modèle expérimental. Nous serons attentifs à d'éventuels signes de souffrance et mettrons en place une grille d'évaluation. La grille d'évaluation comprendra les points suivants: - qualité du poil (lisse/hérissé; propre/sale), - perte de poids éventuelle (supérieure ou pas à 15%), prostration: l'animal sera mis sur la main de l'expérimentateur (mesure de la vivacité: curieux (redresse la tête, sens en alerte) / prostré (mise en boule, recroquevillé), mesure de la mobilité: mouvement exploratoire se déplaçant sur la main / pas de mouvement), qualité et aspect des selles (normales, molles, présence de diarrhées ou sang). Si un point limite est atteint alors la procédure s'arrêtera et l'animal sera euthanasié. Les animaux seront hébergés en présence d'un enrichissement (même quantité de coton dans toutes les cages) en présence d'une petite maison en plastique rouge transparente pour leur permettre de se faire un nid tout en nous permettant de les observer sans les déranger.
Choix des espèces
La souris est le mammifère le plus facilement manipulable pour l’étude de l’établissement de la colonisation intestinale. Aucune expérimentation alternative ne peut remplacer l'aspect in vivo de ce projet. L'administration de bactéries à effet probiotique s'effectue par gavage quotidien. Une administration par voie orale d'une culture fraîche à cette fréquence offre toutes les chances d'une efficacité rapide. L'expérimentation pilote a permis de montrer que des résultats positifs pouvaient être observés chez certains gavage. Femelles reproductrices et souriceaux agés de moins de 2 jours pour la colonisation via l'environnement de la souche pathogène (absence de contact). Souriceaux âgés de J21 à J70 pour le suivi de la colonisation dans les selles et gavages avec le probiotique
Utilisation d’une supplémentation en acide gras à chaine courte afin de limiter les effets indésirables d’un médicament anti-rejet de greffe
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
96 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent par gavage un immunosuppresseur destiné à provoquer une entéropathie, puis un acide gras dans l'eau de boisson, pour tester si celui-ci limite les lésions digestives. Le porteur indique que les animaux traités peuvent développer perte de poids, diarrhée, sang dans les selles et douleurs digestives. Sur le remplacement, il affirme que les cultures cellulaires ne reproduisent pas la complexité du tube digestif et qu'une étape in vivo est nécessaire pour prouver l'effet protecteur.
Objectifs
La transplantation d’organe est un traitement de choix pour certaines pathologies chroniques ; la greffe améliore la qualité de vie et la survie des patients. Ces dernières années, l’augmentation de la survie du greffon est attribuée à l’utilisation des traitements immunosuppresseurs qui inhibent la réponse immunitaire responsable du rejet. Le recours aux immunosuppresseurs, en fragilisant le système immunitaire, provoque l’émergence d’infections et d’atteintes tumorales, en plus de leurs nombreux effets indésirables. Une meilleure gestion de ces effets pourrait contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des transplantés. L'acide mycophénolique (MPA) est l'un des médicaments immunosuppresseurs les plus utilisés dans les transplantations d'organes solides, comme le rein ou le foie. Le traitement au MPA est associé à des effets indésirables, parmi lesquels les troubles gastro-intestinaux constituent une préoccupation majeure. En effet, plus de 30 % des patients présentent des effets indésirables gastro-intestinaux, allant des nausées aux érosions du tractus gastro-intestinal et aux ulcérations hémorragiques, qui mettent en jeu le pronostic vital. La seule option thérapeutique actuelle consiste en une réduction de la dose ou de la fréquence d'administration, ou à un remplacement par d’autres molécules moins efficaces, ce qui augmente le risque de rejet de greffe. Le MPA est responsable d’altérations du microbiote intestinal, appelées dysbiose. Le microbiote intestinal, qui est constitué de microorganismes comme des bactéries, est nécessaire au processus de digestion et, à travers la production d’acides gras à chaine courte (AGCC) particuliers, il protège la paroi intestinale. Nous émettons l’hypothèse qu’une supplémentation en AGCC spécifique des bactéries pourrait limiter les lésions associées à l’entéropathie induite par le MPA. Notre objectif est d’étudier l’effet d’AGCC donnés dans l’eau de boisson sur une entéropathie modérée provoquée par le MPA chez la souris.
Bénéfices attendus
Le MPA est l’immunosuppresseur le plus utilisé pour éviter le rejet de greffes d’organes solides. L’entéropathie induite par le MPA touche aujourd’hui plus de 30% des patients transplantés : sont proposés à ces patients une diminution de la dose de MPA ou une substitution de cet immunosuppresseur par une autre classe thérapeutique moins efficace sur le maintien et la tolérance de la greffe. La supplémentation en AGCC, déjà testée et proposée à certains patients au cours de la prise en charge de la maladie digestive de Crohn, pourrait amener une amélioration de la qualité de vie pour les patients transplantés en limitant les effets indésirables du MPA.
Procédures
- Préhension pour pesée (animal vigile, tous les animaux, moins de 30 secondes par animal, 17 fois par animal) - Contention pour habituation au gavage (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 9 fois par animal) - Gavage (animal vigile, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 7 fois par animal) - Prélèvement sanguin (animal anesthésié, tous les animaux, moins de 1 minute par animal, 1 fois par animal). Les modes d’administration utilisés (eau de boisson pour l’AGCC et l’administration par voie orale à l’aide d’une canule) ont été décrites dans la littérature pour ces molécules, et sont reconnues efficaces.
Impact sur les animaux
Des effets indésirables sont attendus pour les animaux traités à l’immunosuppresseur comme une perte de poids, de la diarrhée, la présence de sang dans les selles, des douleurs digestives et des altérations du comportement.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever différents organes et tissus nécessaires aux analyses.
Remplacement
L’utilisation de cellules in vitro a permis de démontrer certains effets intéressants du médicament immunosuppresseur MPA et des AGCC. Cependant, les études in vitro ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du tube digestif et des tissus qui l’entourent. Or les effets globaux du MPA et des AGCC, s’ils existent, résulteront de l’interaction du médicament et des AGCC avec différentes cellules au sein de différents tissus et organes. A ce stade des travaux, les études in vitro doivent être complétée par des études sur l’animal afin d’apporter la preuve définitive de l’effet protecteur des AGCC vis-à-vis de l’entéropathie induite par le traitement immunosuppresseur chez les greffés.
Réduction
Dans le but de réduction du nombre d’animaux, le projet comprend 2 étapes : une étude pilote pour déterminer la dose de MPA à utiliser et l’étude à proprement parler des AGCC sur l’entéropathie induite par le MPA. Cette stratégie en deux étapes permet de limiter le nombre d’animaux utilisés dans l’étude de l’effet des AGCC. De plus, un test statistique de puissance a été réalisé afin de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser pour avoir des résultats exploitables. Enfin, des tests statistiques seront réalisés pour analyser les données.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des conditions conformes à l’espèce et qui respectent leur bien-être : densité animale, température, hygrométrie contrôlées, présence d’enrichissement, eau et nourriture à volonté. Les animaux seront habitués aux expérimentateurs et aux manipulations. L’état général des animaux sera surveillé quotidiennement, voire deux ou trois fois par jour si l’état le nécessite. La douleur sera abrégée sans délai via l’administration d’antalgique dérivé de la morphine, ou si l’état le justifie, l’animal sera euthanasié. Les personnes qui manipuleront et observeront les souris sont expérimentées.
Choix des espèces
La souris est un modèle de référence pour l’étude des entéropathies que l’Homme développe. Les animaux utilisés seront des souris adultes d’un poids moyen de 24-26 g âgées de 8-10 semaines au début du projet. A ce stade de développement les souris présentent des caractéristiques physiologiques stables. De plus, ce stade de développement est celui utilisé dans les publications de référence pour le projet.
Implication du co-transporteur KCC2 dans les perturbations de la neurotransmission inhibitrice dans l’hippocampe d’une souris transgénique modèle de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus cérébraux, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Ces souriceaux reçoivent des injections quotidiennes dans l'abdomen à partir du 14e jour après la naissance et pendant quinze jours, avant une anesthésie sans réveil, pour étudier un transporteur dans un modèle de maladie d'Alzheimer. Le porteur indique qu'une souffrance liée aux injections répétées peut apparaître et que la mère peut perturber le nid ou refuser de nourrir ses petits. Sur le remplacement, il affirme que le modèle ne peut pas être remplacé par des cultures cellulaires et justifie le recours à des souris transgéniques développant des plaques amyloïdes.
Objectifs
L'objectif de notre projet de recherche est de corriger les perturbations de la neurotransmission dans l'hippocampe d'une souris modèle de la maladie d'Alzheimer
Bénéfices attendus
Il n’existe à l’heure actuelle, aucun traitement capable de guérir la maladie d’Alzheimer ou de ralentir son évolution dans le cerveau. Toutefois quatre médicaments sont actuellement sur le marché. Ces traitements ont pour but de traiter les problèmes d'apprentissage et de mémorisation de la personne malade. Ils n’empêchent cependant pas la progression de la maladie et l’efficacité varie largement d’un patient à l’autre. De plus, ils présentent de nombreux effets indésirables. Il semble donc important non seulement de traiter les symptômes mais également et surtout, d’empêcher l’initiation et la progression de la maladie. Notre objectif de cibler la maladie à ses débuts devrait offrir de nouvelles perspectives de traitement.
Procédures
Les animaux seront injectés quotidiennement dans l'abdomen à partir du 14ème jour post-natal et ceci pendant 15 jours. Les animaux subiront une anesthésie sans réveil pour effectuer des prélèvements.
Impact sur les animaux
Une souffrance liée à la répétition des injections peut être mise en évidence. Nous pourrions également observer une perturbation du nid et un éventuel refus de la mère de nourrir ses petits.
Devenir
La mise à mort de l'ensemble des animaux se justifie par le besoin d'obtenir les tissus cérébraux afin de mieux comprendre les mécanismes du traitement concerné dans ce projet
Remplacement
Ce modèle ne peut pas être remplacé par des modèles de culture cellulaire. Ce choix du modèle souris est également justifié par le fait que nous utiliserons des souris transgéniques modèles de la maladie d'Alzheimer. Ces souris transgéniques développent des plaques amyloïdes au niveau du cerveau et manifestent les mêmes troubles touchant la mémoire et la cognition que l'homme.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés sera réduit au maximum tout en garantissant la validité statistique des résultats obtenus.
Raffinement
Nous serons particulièrement attentifs au bien-être animal et nous surveillerons les animaux quotidiennement. Les animaux seront hébergés dans des cages enrichies et dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l'hébergement des animaux de l'annexe II du 01 février 2013 de l'arrêté fixant les conditions d'agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l'environnement. Pour limiter un éventuel refus de la mère de les nourrir, nous mettrons dans le nid le matériel utilisé pour les injections pour habituer la mère à leur odeur. Les petits abandonnés seront replacés avec une autre mère ayant une portée du même âge. Les injections seront faites avec des aiguilles très fines. Ce geste n'induit pas de saignement et correspond à une douleur légère (introduction d'une aiguille). Les seringues et aiguilles sont changées pour chaque souris. Nous surveillerons et pèserons les animaux avant chaque injection.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus adéquate car il existe un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau anatomique et fonctionnel des circuits de l'hippocampe. De plus, l'existence de modèles de souris exprimant des mutations humaines de deux protéines permet de mimer la pathologie humaine et de les étudier dès l'âge de 1 mois à un stade précoce, sans symptômes de la maladie.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
5 280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Une tumeur leur est greffée puis elles reçoivent chimiothérapie et immunothérapie deux fois par semaine, avec des prélèvements sanguins répétés, pour valider un anticorps neutralisant une cytokine avant un programme clinique. Le porteur indique que la croissance tumorale peut entraîner des difficultés de locomotion, une ulcération et un état moribond au-delà d'un certain volume. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité des interactions entre système immunitaire et cellules tumorales et juge ces preuves de concept "indispensables".
Objectifs
Les avancées en termes d’immunothérapies dans les cas de cancers sont très encourageantes mais une recherche accrue est toujours de mise afin d’une part de découvrir de nouvelles cibles mais également d’améliorer les traitements déjà existants. Ce projet a ainsi pour but de continuer à approfondir nos données sur les actions et les efficacités de la neutralisation de notre cible, une cytokine (protéine messagère et régulatrice du système immunitaire naturellement présente dans chaque organisme) et ce dans un contexte de développement tumoral (multiplication des cellules tumorales) chez la souris. Après avoir mis en évidence dans un précédent projet, l’intérêt de bloquer cette cible afin d’améliorer la survie des animaux, il s’agit maintenant de trouver les meilleures conditions afin de valider notre outil bloquant (un anticorps thérapeutique) et de le présenter par la suite dans un programme clinique chez l’Homme. Pour cela, différents types de modèles cancéreux seront utilisés comme les mélanomes, les fibrosarcomes, les cancers mammaires, colorectaux, pancréatiques, du poumon ou encore du col de l‘utérus. Grâce à ces modèles de développement tumoraux, nous pourrons analyser chez les souris l’impact du blocage de cette cytokine en synergie (effet cumulé) avec d’autres immunothérapies et chimiothérapies déjà connues en clinique. Ce projet nous permettra également de valider les meilleurs anticorps possibles qui pourront ainsi devenir des candidats pour de futurs essais cliniques antitumoraux.
Bénéfices attendus
Ce projet a pour but principal de valider la preuve de concept d’inhibition de notre cible pour induire des effets antitumoraux et de comprendre les mécanismes d’action et les voies de signalisation impliquées. Plusieurs bénéfices seront alors apportés par l’avancement de ce projet. L’utilisation de modèles où le gène de la cytokine a été invalidé (supprimé) d’une part et d’outil inhibant (bloquant) la cible d’autre part permettre de confirmer l’implication de la cible dans des mécanismes de développements tumoraux. Les différents protocoles de traitements testés, détermineront les conditions optimales d’utilisation des outils afin d’arrêter la croissance tumorale. Enfin, les études de suivi de la cible en présence ou absence d’anticorps expliqueront les cinétiques d’action de ces différentes molécules. Toutes ces approches sont indispensables pour pouvoir amener ces technologies dans des essais précliniques réglementaires puis des essais cliniques chez l’Homme.
Procédures
L’ensemble des animaux de ce projet seront greffés une fois en injection sous-cutanée (SC) sur animal vigil (15 secondes/souris avec contention) ou en injection intra-mammaire (IM) pour le modèle de cancer du sein sur animal anesthésié (4 minutes/souris comprenant l’anesthésie). Pour les procédures 1 et 2, les animaux subiront ensuite une injection de chimiothérapie (en intrapéritonéale (IP) : 10 secondes ou en intraveineuse (IV) dans certains cas rares : 3 minutes) suivis des traitements par les immunothérapies (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas rares : 3 minutes), cela 2 fois par semaine. Les animaux de la procédure 3 recevront en plus un traitement par les anticorps cibles 2 à 3 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en injection SC : 10 secondes, ou en injection IV dans certains cas rares : 3 minutes). Certains animaux des procédures 1, 2 et 3 subiront des prélèvements sanguins sur animal vigil à la veine mandibulaire maximum une fois par semaine (0,11mL par prélèvement) sur maximum 5 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute. Les animaux des procédures 4, 5 et 6 subiront des traitements séquentiels en commençant par l’injection de la cible (la cytokine) (en IP : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). L’anticorps dirigé contre la cible sera ensuite injecté jusqu’à 3 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). Dans certains cas (qui seront connus à l’issu des procédures 1, 2 et 3), les souris auront également une l’injection de la chimiothérapie en dose unique (en IP : 10 secondes ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes) suivie de l’immunothérapie 2 fois par semaine (en IP dans la plupart des cas : 10 secondes, en SC : 10 secondes, ou en IV dans certains cas rares : 3 minutes). Ces animaux subiront des prélèvements sanguins sur animal vigil à la veine mandibulaire en gestes répétés sur 24h (volume maximum de 0,11mL) ou une fois par semaine (0,11mL par prélèvement) sur 4 semaines. La durée de chaque prélèvement est estimée à 1 minute / souris avec contention. Certains animaux subiront un prélèvement de sang en terminal à la veine cave (animal sous anesthésie profonde et sans réveil) afin de collecter un volume de sang suffisant.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont ceux inhérents à la croissance des tumeurs chez la souris avec un problème de locomotion possible au-delà d'un certain volume ou une ulcération de la tumeur pouvant entrainer un état moribond de l’animal si elle évolue trop rapidement. Les injections de chimiothérapie et d’immunothérapie observées lors des études précédentes ne montrent quant à elles aucun effet délétère observable sur l’état clinique de l’animal.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de l'expérimentation, soit parce qu'ils ont atteint le point limite de volume tumoral ou tout autre point limite listé, soit avant pour prélever la tumeur et les organes immunitaires périphériques afin de réaliser une analyse des mécanismes impliqués suite aux effets des médicaments (à l’aide de technique d’histologie, de cytométrie ou encore de biologie moléculaire).
Remplacement
Il s’agit du suivi de croissance tumorale, il n’existe pas de méthode alternative à ces expériences in vivo. Ces preuves de concept et ces études de mécanismes d’action ne peuvent s’établir que sur de véritables modèles précliniques dans un contexte de tumeur solide similaire à celui que l’on trouve chez l’homme. Ce projet s’inscrit dans une démarche globale qui a démarré par des études bibliographiques, suivies d’études In Vitro approfondies ayant permis d’affiner et de réduire efficacement les pistes de recherches. Cependant, compte tenu des avancées actuelles, à ce stade du projet, il n’est pas possible de substituer l’animal par un modèle in vitro pour continuer ces recherches. Ce dernier ne peut pas retranscrire la complexité des interactions entre le système immunitaire et les cellules tumorales pour tester nos traitements antitumoraux.
Réduction
L’analyse statistique permettant de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, est réalisée en collaboration avec une unité de biométrie, spécialisée dans les études de biostatistique. L’étude de l’efficacité antitumorale induit deux types d’analyse : -modélisation de la croissance tumorale (en fonction du nombre de jours post-greffe) et comparaison entre les deux groupes de traitement en utilisant un modèle linéaire mixte permettant un delta de 200 mm3. -analyse de survie en considérant le délai nécessaire pour atteindre la médiane (50 % de survie) un delta de 5 jours. Compte tenu de cette analyse et des données obtenues lors de précédentes expériences réalisées au sein du laboratoire le nombre de souris est limité à 10 par groupe et chaque étape est reproduite une fois afin de supprimer le biais pouvant être induite par un problème technique de greffe de cellules ou d’injection de molécule et ainsi avoir un résultat de deux expériences indépendantes.
Raffinement
Les animaux seront hébergés à 20-24°C, 30-50% d'hygrométrie, en portoirs de cages à couvercle filtrant, avec une alternance jour/nuit de 12h/12h. La nourriture et l'eau de boisson sont fournies ad libitum. Un système d’enrichissement adapté à la souris est mis en place afin de réduire le stress des animaux. Il comporte la présence dans chaque cage d’un tunnel ou d’un dôme en cellulose, de briques Aspen et de carré de cellulose afin que les animaux établissent un nid végétal. Des souris femelles sont utilisées dans nos protocoles expérimentaux car elles présentent un système immunitaire exacerbé, facilitant les mises en évidence d’efficacité pro-immunitaire et anti-cancéreux. Tout au long du déroulement des expériences de croissance tumorale, une observation systématique de l’état clinique des animaux et notamment de l’évolution de la taille des tumeurs est réalisée par du personnel formé et compétent. Les conditions d’utilisation sont encadrées par la règlementation en vigueur et ont pour but de réduire le stress, l’inconfort et la douleur que l’animal pourrait ressentir. Une habituation des animaux sera mise en place en ce qui concerne la contention manuelle (immobilisation de l’animal par l’expérimentateur pour pouvoir l’injecter sans risque) et le placement dans les tunnels de contention (en vue des injections intraveineuses). Ces habituations seront effectuées en amont du début des études et des injections afin de diminuer le stress de l’animal. L’état des animaux sera surveillé quotidiennement pour vérifier l’aspect de la tumeur ou l’apparition de signes cliniques Dans les conditions expérimentales définies (limite du volume tumoral), les animaux ne souffriront d’aucune difficulté à se mouvoir et à s’alimenter. De plus, au cours de nos expériences antérieures, parmi les paramètres listés ci-dessus, nous n’avons jamais observé de signe de diarrhée, de déshydratation ou de problème respiratoire.
Choix des espèces
La souris immunocompétente de type C57Bl/6 constitue un modèle expérimental de référence. Ces souris dont le système immunitaire est fonctionnel sont greffées avec des cellules tumorales murines de même fond génétique. Ce modèle a déjà permis d’obtenir les premiers résultats à l’origine de ce projet, nous avons ainsi un recul important sur le comportement et les caractéristiques de ce modèle. Il est indispensable pour réaliser les étapes 1 et 2 de ce projet. La 3ème étape nécessite différents modèles de souris immunocompétentes afin de comprendre le rôle du système immunitaire et de suivre la cinétique de la cible au sein de la tumeur et dans la circulation sanguine. Le choix s’est porté sur les modèles les plus caractérisés et sur lesquels nous avons déjà un recul important : C57Bl/6, BalbC. Références bibliographiques : (Rondepierre F et Al. Melanoma Res. 2010 Apr;20(2):77-84, Bertrand et Al. Cancer Res. 2015 May, Eslahi NK et al.Cancer Gene Ther. 2001 Jan;8(1):55-62, Morikane K at al. Int Immunol. 2001- Feb;13(2):233-40, Hannani D et al.Cell Death Differ. 2014;21(1):50-8).
Utilisation de modèles murins d’asthme : Contrôle environnemental de la réponse immunitaire pulmonaire dans l’asthme
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système respiratoire
7 260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des instillations intranasales d'allergènes jusqu'à cinq fois par semaine et, pour la mesure de la fonction respiratoire, sont anesthésiées, curarisées puis trachéotomisées avant des aérosols de méthacholine, une intervention terminale. Le porteur affirme que les modèles d'asthme "n'induisent pas d'effets indésirables particuliers". Sur le remplacement, il indique que les cibles thérapeutiques ne peuvent être définies qu'in vivo, tout en mentionnant des coupes de poumon cultivées qui remplacent certaines expériences de mise au point.
Objectifs
L’asthme est une maladie complexe et chronique associée à une hyperréactivité bronchique, une inflammation pulmonaire, et un remodelage des voies respiratoires. L’asthme allergique est un problème mondial : en 2014, le nombre d’individus atteints était estimé à 334 millions. En France, 20 à 25% de la population générale souffre d’une maladie allergique, et la prévalence de l’asthme atteint 7%. Cette maladie entraîne 2000 décès par an, dont environ 200 parmi les enfants, les adolescents ou les adultes de moins de 45 ans. L’asthme provient de l’interaction complexe entre des facteurs génétiques et des agents environnementaux comme les allergènes, les pathogènes respiratoires ou encore les polluants. En outre, des observations cliniques et expérimentales suggèrent que des perturbations du microbiote gastrointestinal , ainsi que des perturbations du rythme circadien peuvent rompre des mécanismes de tolérance immunologique et pourraient influencer la capacité de l’hôte à développer ou non de l’asthme. Ces données suggèrent que l’environnement pourrait donc intervenir à la fois dans l’induction et l’amplification de l’asthme allergique. Le projet vise à étudier le rôle de l’environnement sur le contrôle de la réponse immune dans l’asthme allergique. Des interventions thérapeutiques sous forme de d’antagonistes de l’immunité innée, des anti cytokines ou récepteurs de cytokines ou des vaccins seront également testées.
Bénéfices attendus
1. Evaluation du rôle de certains récepteurs de l’immunité innée, cytokines, cellules innées, dont le rôle dans la physiopathologie de l’asthme allergique est totalement inconnu. 2. Elucidation du rôle des polluants de type HAP dans le développement des asthmes sévères caractérisés par une forte composante Th17 et Th22 et dans la régulation cytokinique. 3. Implication de certaines populations cellulaires dans le lien reliant le rythme circadien et l’asthme. 4. Implication de certaines populations cellulaires dans l’exacerbation de l’asthme induite par les agents pathogènes 5. Identification de nouvelles thérapeutiques dans l’asthme
Procédures
Les animaux reçoivent des intra nasales d’allergènes de 1 à 5 fois par semaine (durée 5 à10 minutes) ou d’autres produits (administration non invasive) de 1 à 5 fois par semaine (durée 5 à10 minutes), pour lesquels une anesthésie par isofluorane est pratiquée. Pour les groupes pour lesquels une analyse de la fonction respiratoire est prévue (Flexivent), les animaux sont anesthésiés et curarisés avant la trachéotomie et le branchement à l’appareil de mesure. Quatre aérosols de méthacholine sont effectués à différente concentrations, et la procédure dure 30 minutes. Cette intervention est terminale.
Impact sur les animaux
Les modèles d’asthmes n’induisent pas d’effets indésirables particuliers. Le retentissement sur la fonction pulmonaire est évalué sur animaux avec anesthésie létale.
Devenir
L’analyse des résultats obtenus dans les différentes expériences nécessite d’avoir accès aux organes (dosage des protéines, des gènes, coupes de poumon en gel, évaluation histologique) et au sang (réponse humorale) et de pouvoir analyser la réponse fonctionnelle respiratoire. Toutes ces procédures nécessitent une anesthésie létale afin d’empêcher toute souffrance de l‘animal.
Remplacement
Les alternatives non animales de ce projet sont l’homme lui même. Cependant, si des prélèvements périphériques (sang) et même bronchiques peuvent être obtenus chez l’homme, les expériences in vivo visant à définir de nouvelles cibles thérapeutiques dans l’asthme restent cantonnées aux animaux. Il s’avère à l’heure actuelle impossible d’évaluer l’implication de certaines populations cellulaires ou molécules cibles thérapeutiques in vivo chez l’homme, sans avoir en amont un solide background des effets potentiellement bénéfiques de ces voies/molécules dans cette pathologie. Par contre on peut envisager des remplacements partiels de certaines parties expérimentales. Ainsi, nous avons mis au point un système de coupes de poumon frais cultivables dans du milieu permettant une évaluation ex vivo par exemple de la meilleur dose d’antagoniste ou de la meilleure cinétique à utiliser, ce qui permet de remplacer un certain nombre d’expériences animales de mise au point.
Réduction
Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux, dans la plupart de nos protocoles, un seul groupe témoin est utilisé et permet la comparaison avec les différentes souris génétiquement modifiées. De plus les analyses statistiques effectuées dans nos travaux précédents nous ont permis de déterminer le nombre minimal d’animaux à utiliser, soit 6 souris par groupe, en répétant l’expérience 3 fois afin d’obtenir suffisamment de cellules à analyser pour la cytométrie en flux, 8 souris par groupe pour l’analyse des résistances des voies aériennes par flexivent (indépendamment de la cytométrie en flux car il a été montré que l’acétylcholine (dont un équivalent : la métacholine, est utilisée pour mesurer l’hyperréactivité bronchique au Flexivent®) induisait l’activation des cellules immunitaires comme les lymphocytes (augmentation rapide et transitoire du Ca2+ intracellulaire), ce qui pourrait modifier l’analyse de l’activation et de la production de cytokines des différentes cellules immunitaires analysées dans nos protocoles), et 4 souris par groupe pour l’histologie (de nouveau indépendamment des autres mesures car les lavages bronchoalvéolaires ou le flexivent endommage considérablement la structure du poumon).
Raffinement
Afin de réduire stress et souffrance, un enrichissement de l’environnement est pratiqué dans notre animalerie (maison rouge dans toutes les cages, maximum 4 souris par cage, possibilité de rajouter du carton). De plus, une surveillance régulière journalière des animaux est effectuée, et la mise à mort par injection létale de pentobarbital réalisée en cas de souffrance identifiée par des caractéristiques telles que : prostration, poils hirsute, perte de poids (égale ou supérieure à 15% du poids initial).
Choix des espèces
Les modèles animaux souris reproduisent les différents paramètres de la pathologie asthmatique allergique. En outre de nombreuses souris génétiquement modifiées ou anticorps spécifiques existent permettant d’identifier des molécules ou cellules impliquées et des cibles thérapeutiques pertinentes chez l’homme. Les souris seront utilisées à l’âge adulte (6-8 semaines) comme dans la majorité de la littérature sur le sujet.
Caractérisation de lignées épileptiques de souris génétiquement modifiées pour la voie mTOR
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une souris qui fait une crise de plus de cinq minutes, ou plus de dix crises par jour pendant les enregistrements, atteint un point limite et est mise à mort. 450 souris de lignées génétiquement modifiées sur la voie mTOR, sujettes à des crises d'épilepsie spontanées, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées, au plus tard à un an pour celles qui ne font aucune crise. Elles sont génotypées par un prélèvement au bout de la queue à une semaine, puis, selon les groupes, subissent l'implantation d'électrodes dans le crâne suivie d'un isolement pour des enregistrements vidéo-EEG d'une semaine, répétés après une à deux semaines de repos, ou jusqu'à sept tests de comportement de dix minutes à une heure. Le résumé ne nomme aucun de ces tests, destinés à repérer des "altérations comorbides à l'épilepsie".
Objectifs
Le projet a pour but de caractériser les conséquences fonctionnelles de mutations de la voie mTOR retrouvé chez l’homme, qui conduisent à des phénotypes épileptiques. Nous créerons de nouveaux modèles de souris génétiquement modifiées afin de faire un suivi de leur phénotype, ainsi qu’une caractérisation électrophysiologique et comportementale (altérations comorbides à l’épilepsie).
Bénéfices attendus
Le projet permettra de valider les modèles murins d’épilepsie, afin de comprendre les mécanismes à l’origine des crises d’épilepsies et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Ces avancées sont urgentes en raison de la pharmacoresistance élevée des patients avec une dysplasie focale corticale liée à ces mutations, et la nécessité du recours à la chirurgie de l’épilepsie pour contrôler les crises.
Procédures
**Les lignées maintenues dans le cadre de ce projet peuvent présenter des crises d'épilepsies spontanées. Une chirurgie sous anesthésie et analgésie (1h maximum) sera pratiquée pour l’implantation d’électrode intracrânienne puis isolement et enregistrement EEG (Electro-encéphalographique) afin d’enregistrer l’activité électrique cérébrale sur animal vigile (session d’une semaine séparée par 1-2 semaine de repos) pour détecter des crises d’épilepsie spontanées. Des études de comportement sur animal vigile (7 tests maximum, tous les 2-3 jours, d’une durée minimale de 10 min et maximale d’1h par test) seront réalisées. **
Impact sur les animaux
**Les nuisances attendues sont : 1) Le développement prédit d’un phénotype épileptique avec des crises spontanées dont la fréquence reste à définir (quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle selon les modèles), 2) La chirurgie due à l’implantation intra crâniale d’électrodes (douleur, inconfort), et l’isolement des animaux prévus pour l’enregistrement vidéo-EEG de l’activité électrique cérébrale 3) Un stress lié à l’analyse comportementale des animaux.**
Devenir
**Maintien et suivi de lignées dommageables : les animaux implantés seront euthanasiés dès qu’un point limite sera atteint, ou à l’âge d’un an maximum si aucune crise ne survient. Analyse vidéo-EEG (enregistrement de l’activité électrique cérébrale) : les animaux seront euthanasiés à la suite de la détection de crises épileptiques, ou à l’âge d’un an maximum si aucune crise ne survient. Les animaux étant implantés avec des électrodes, nous ne pouvons pas utiliser les animaux pour le comportement car les électrodes pourraient avoir un impact. Des prélèvements pourront être réalisés pour études biochimiques (Western blot). Analyse comportementale : Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure.**
Remplacement
L’utilisation d’animaux est justifiée car: (1) Les modifications cérébrales nécessaires ne peuvent être étudiées chez l’humain. (2) La culture cellulaire ne reproduit pas certaines propriétés des crises d'épilepsie dans un cerveau entier. (3) La modélisation in silico nécessite des données expérimentales encore manquantes
Réduction
**Nous veillerons à générer le minimum d'animaux nécessaires à la fois pour le maintien de nos lignées et pour leur utilisation dans des expériences en vue de produire des conclusions scientifiques statistiquement fiables. La taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance, nous procèderons à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. Le calcul de puissance sera ajusté selon les premiers résultats, car nous ne pouvons pas encore prédire les différences de moyennes et de variabilité entre nos groupes. Nous avons prédit un minimum de 10 animaux par groupe (n=450). **
Raffinement
**Les animaux sont hébergés selon les normes en vigueur et les cages enrichies d’un nid de coton, et d’une maison en cas d’inconfort (animal isolé) ou pour les souris gestantes. Si un animal fait une crise de plus de 5 minutes (par observation dans la cage), cela constituera un point limite. De plus, lors des enregistrements vidéo-EEG (enregistrement de l’activité électrique cérébrale) : si un animal fait plus de 10 crises par jour, cela constituera un point limite. Les animaux feront donc l'objet d'une surveillance étroite par le personnel de soin animalier. Le poids, l'apparence physique et des changements de comportement seront les facteurs pris en compte. Suite à la procédure d’implantation d’électrodes, on administre un analgésique. Ce traitement pourra être prolongé jusqu’au rétablissement de l’animal (si aucun point limite n’est atteint). L'expérimentateur pèsera les animaux chaque jour suivant la chirurgie pendant une semaine, puis une fois par semaine, et évaluera objectivement l'apparence physique de l'animal (convulsions, dos voûté) et son comportement (lenteur des mouvements) au moins une fois par semaine. D'autre part, les animaux feront l'objet d'un suivi postopératoire avec une surveillance rapprochée de l'expérimentateur jusqu'au réveil complet de l'animal et surveillance quotidienne étroite de l'expérimentateur et du personnel de soin animalier pendant les deux semaines suivant la chirurgie. Les mouvements, le poids, la respiration et les réflexes tels que le retrait de la patte seront observés. S'ils révèlent une dégradation ou une souffrance de l'animal, celui-ci sera euthanasié afin d’arrêter la douleur.**
Choix des espèces
**Nous travaillerons sur une espèce animale: la souris. Notre choix a été motivé par des raisons scientifiques: (1) Nos études portent sur des modèles génétiques d'épilepsie nécessitant des modifications génétiques ciblées, possibles chez ces animaux (CRE/lox). (2) L'établissement de lignées pures avec un fond génétique stable et homogène utilisées dans les laboratoires du monde entier permet la reproductibilité et la comparabilité des résultats et donc la réduction du nombre d’animaux. (3) Ces deux espèces sont majoritairement utilisées pour modéliser les crises d’épilepsies. Elles ont donc été explorées de manière exhaustive de la molécule au comportement, permettant une solide base scientifique sur laquelle baser nos travaux. (4) Les rongeurs ont un cerveau suffisamment élaboré pour générer des activités épileptiques dont les mécanismes pathologiques aux niveaux cellulaire et moléculaire sont similaires à l'humain. Les animaux seront génotypés par biopsie d’un bout de queue (environ 1 mm) à l’âge de 1 semaine (avant la queue est trop peu développée pour permettre le prélèvement). Pour le suivi, les animaux seront observés dès l’âge de 15 jours (une fois le génotype établi). L'épilepsie apparaissant généralement à l'âge juvénile-jeune adulte Pour les autres procédures, les souris seront utilisées à partir de l’âge 3 semaines (après sevrage). Pour la même raison que l'âge d'observation des animaux, de plus la procédure n°2 impose un isolement des animaux après chirurgie, or cela n'est pas possible avant sevrage.**
Evaluation de l’efficacité de composés pharmacologiques dans un modèle d’épilepsie néonatale liée au gène Kcnq2.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Traitées par l'alimentation, par gavage ou par injection intrapéritonéale, pendant un à trois jours ou chaque jour de leur 25e à leur 90e jour de vie, des souris porteuses d'un variant du gène Kcnq2 font des crises d'épilepsie spontanées et passent des tests d'apprentissage et de mémoire que le résumé ne nomme pas. 960 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leur système nerveux central. L'équipe prévoit de tester 20 molécules, et un résultat favorable servirait de base à une demande d'essai clinique chez l'enfant. Le porteur écrit qu'aucun "effet indésirable particulier n'est attendu", puis qu'une crise spontanée peut conduire "à la mort de l'animal".
Objectifs
Des variants pathogènes dans le gène KCNQ2 provoquent une épilepsie dans l'espèce humaine. Cette épilepsie se manifeste par de fréquentes crises survenant durant les tous premiers mois de vie (avant l'âge de 3 mois). Cette activité épileptique est accompagnée d'une détérioration des fonctions cognitives et motrices. Il n'existe pas de traitement et les anti-épileptiques classiques sont inefficaces. Nous étudions une souris modèle knock-in porteuse d'un variant récurrent du gène KCNQ2 (T274M). La souris hétérozygote pour ce variant reproduit les caractéristiques principales de la maladie humaine. Ce modèle permet de mieux comprendre la pathophysiologie de la maladie et de tester de nouvelles approches thérapeutiques. Ce modèle est le premier (et le seul pour le moment) qui puisse permettre de tester des approches thérapeutiques sur organisme entier dans un contexte valide par rapport à la pathologie humaine. Le projet comporte la stabulation d'animaux à phénotype dommageable, leur traitement par des candidats médicaments et l'évaluation de leur phénotype sur le plan des crises d'épilepsie et des capacités cognitives. A l'heure actuelle, il existe des molécules qui vont atténuer les crises d'épilepsie chez les enfants présentant une épilepsie liée au gène KCNQ2 (par exemple la carbamazépine). La multiplicité des traitements subis par ces enfants et leur hétérogénéité (clinique et génétique) ne permet cependant pas d'établir clairement si les traitements efficaces sur les crises le sont aussi sur le développement neurologique. Il s'agit pourtant d'une question essentielle. Pour l'ensemble de ce projet, nous envisageons de tester 20 molécules. Nous avons pour objectif d'identifier des molécules qui apporteront un bénéfice en terme de neurodéveloppement. Si le traitement est efficace, nos souris modèle devront présenter moins de crise mais aussi avoir un neurodéveloppement le plus normal possible.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'évaluer l'efficacité de candidats médicaments dans un modèle unique d'encéphalopathie épileptique. Si un candidat médicament s'avère efficace pour diminuer les crises d'épilepsie et pour améliorer les déficits cognitifs dans le modèle, les résultats serviront de base à une demande d'essai clinique dans l'espèce humaine.
Procédures
Traitements pharmacologiques par l'alimentation, par gavage ou injection intrapéritonéale en fonction des candidats médicaments. Traitements aigus (1 à 3 jours) ou chroniques (entre P25 et P90) en fonction de la pharmacocinétique des composés testés. Prélèvements sanguins en fin de protocole pour estimer la biodisponibilité des composés ou de leurs métabolites et confirmer l'exposition.
Impact sur les animaux
Etant donné que les molécules administrées sont censées avoir un effet antiépileptique, nous attendons une amélioration du phénoptype des anilmaux (moins de crises, meilleures capacités d'apprentissage). Aucun effet indésirable particulier n'est attendu. Dans le pire des cas, les candidats médicaments n'auront pas d'efficacité. S'ils aggravent le phénotype (voir suivi des animaux ci-dessous), les traitements seront alors immédiatement interrompus. Dans ce modèle, il est également possible que les animaux présentent une crise spontannée conduisant à la mort de l'animal.
Devenir
Les animaux sont conservés pendant la durée de la procédure (traitement, évaluation des améliorations phénotypiques, prélèvement sanguin) puis euthanasiés en fin de procédure afin de prélever le système nerveux central pour réaliser des analyses histologiques, transcriptomiques et protéomiques.
Remplacement
Les épilepsies sont provoquées par des décharges inadaptées de cellules excitables en réseau. Les crises ainsi générées se traduisent, le plus souvent, par des mouvements anormaux. Pour étudier la pathologie dans toutes ses dimensions et espérer pouvoir produire des résultats qui seront transférables à l'espèce humaine, il est nécessaire d'avoir recours à un modèle animal car les cellules isolées ne récapitulent pas ce qui se passe dans un cerveau entier. Le gène Kcnq2 est très conservé entre la souris et l'Homme. Les tests phénotypiques sont bien développés dans cette espèce. Le modèle que nous utilisons est le premier et le seul disponible pour le moment pour cette pathologie. Avant que le modèle vivant ne soit utilisé, les médicaments candidats ont été testés sur des modèles cellulaires in vitro et dans des neurones dérivés de modèles iPS avant d'en préciser les caractères de d'efficacité et de toxicité éventuelle. L'étude des capacités d'apprentissage et de mémorisation ne peut être effectuée que sur l'animal vivant.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisé sera optimisé et calculé de façon à ce que les effets attendus puissent être détectés avec un niveau de significativité suffisant tout en garantissant la sécurité des résultats s'ils doivent être utilisés ultérieurement pour justifier un essai clinique pédiatrique.
Raffinement
L'hébergement est adapté aux besoins physiologiques des animaux et permet l'expression de leur gamme normale de comportements. La méthode d'administration des traitements la moins contraignante possible sera utilisée (dans les croquettes servant d'alimentation à chaque fois que cela est possible). Des points limite clairs sont définis et les animaux seront euthanasiés lorsqu'ils atteindront les critères d'interruption.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont un modèle qui permet de modéliser une pathologie humaine car il s'agit de mammifères disposant d'un répertoire génétique très similaire à celui de l'espèce humaine. La technologie de recombinaison homologue utilisée pour générer le modèle utilisé est parfaitement au point dans cette espèce et a permis de générer des centaines de modèles pertinents pour étudier les maladies humaines et pour développer des traitements spécifiques. Les souris seront traitées au moment où apparaissent les crises d'épilepsie spontanées dans ce modèle et uniquement chez des animaux sevrés (entre P25 et P30). La suppression des crises d'épilepsie est le premier critère de jugement d'efficacité de la molécule testée. Le traitement pourra se poursuivre quotidiennement jusqu'à P90 où l'évaluation finale de leur comportement sera effectuée (tests d'apprentissage et mémorisation). Dans l'espèce humaine, la maladie est sporadique (sans histoire familiale) et n'est donc détectée chez un nourrisson qu'au moment où les premières crises apparaissent. Nous nous placerons donc dans ce même cas de figure avec les animaux modèles étudiés ici, traités au moment où leur pathologie se manifeste.