Souris
Colite : Evaluation de l’efficacité de composés chimiques ou biologiques sur l’inflammation du colon induite par administration d’agents chimiques ou de bactéries, par injection d’anticorps, ou par transfert de cellules chez le rongeur.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
Rats : 2000
8 000 souris et 2 000 rats, soit 10 000 rongeurs, vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, tous tués à l'issue pour prélever de grands volumes de sang et de la peau. L'équipe provoque chez eux une colite par du DSS dans l'eau de boisson, jusqu'à trois cycles de cinq jours, par du TNBS administré dans le rectum après 12 à 16 heures de jeûne, par la bactérie Citrobacter rodentium, ou, chez des souris immunodéficientes, par un anticorps ou des cellules immunitaires, avec une diarrhée parfois hémorragique et des pertes de poids marquées attendues. Les composés testés, présélectionnés sur des cellules humaines et destinés à la maladie de Crohn ou à la rectocolite hémorragique, leur sont administrés par toutes les voies, y compris par minipompe implantée, et les rongeurs peuvent subir endoscopies, biopsies de peau et jeûnes de huit heures. Le porteur affirme employer le "nombre minimum suffisant" et explique l'effectif par le "nombre d'études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés", sans dire combien de composés sont visés.
Objectifs
La colite inflammatoire se traduit par une diarrhée chronique consécutive à l’inflammation des parois de l’intestin. Elle peut être provoquée par des bactéries, des parasites, la prise de médicaments, le traitement par radiothérapie, la rectocolite hémorragique ou la maladie de Crohn. La rectocolite hémorragique est caractérisée par une inflammation de la muqueuse et sous-muqueuse du rectum et du colon. La maladie de Crohn entraîne plus de complications, car l’inflammation peut toucher le tube digestif entier, de la bouche jusqu’à l’anus, et créer une obstruction partielle de l’intestin. La colite post-radiothérapie s’observe surtout après irradiation dans la zone abdominale et pelvienne dans le cas de traitement anti-cancéreux. Les parasites et bactéries provoquent des colites spontanément résolutives, mais certains d’entre eux peuvent produire des lésions qui ressemblent à une maladie inflammatoire primitive. Ce projet a pour but de tester in vivo des composés chimiques ou biologiques dont le potentiel anti-inflammatoire aura été déterminé au préalable dans des tests in vitro. Pour cela, il est nécessaire de disposer d’un modèle rongeur où il est possible de créer un état inflammatoire du colon tel qu’on peut l’observer chez l’homme. Actuellement, l’arsenal thérapeutique disponible, notamment les anti-inflammatoires, ne permet pas de soigner correctement ces pathologies lourdes, et de multiples interventions chirurgicales sont nécessaires pour retirer au fur et à mesure les portions lésées de l’intestin. Malgré leur efficacité, les anti-TNF doivent être utilisés avec précaution dans ces pathologies car ils augmentent la survenue de maladies infectieuses. Il existe clairement un besoin thérapeutique pour soigner les colites inflammatoires. Pour réaliser ce projet, un travail important est réalisé au préalable in vitro sur des cellules humaines, ceci dans le but de sélectionner les meilleures molécules à progresser. Cependant, étant donnée la complexité des mécanismes impliqués dans les pathologies inflammatoires du colon, il est difficile de prédire le potentiel thérapeutique d’une molécule uniquement sur la base de résultats in vitro. Il est donc nécessaire d’utiliser un modèle animal qui reproduit les différents aspects de ces maladies, afin de pouvoir évaluer in vivo les meilleurs composés identifiés.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif ou en curatif sur plusieurs maladies inflammatoires digestives : maladie de Crohn, rectocolite hémorragique, colite ulcéreuse... A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour ces maladies pour laquelle les options sont pour le moment limitées et imparfaites.
Procédures
Une colite pourra être induite par l’administration de Dextran sulfate sodium (DSS) dans l’eau de boisson des animaux soit pendant 7 jours, combiné ou non à des anticorps (2 injections par semaine, 5 minutes par injection). Ces études dureront au maximum 4 semaines. Il est aussi possible d’administrer le DSS dans l’eau de boisson trois fois 5 jours, avec 5 jours sans DSS entre les cycles. Ces études dureront au maximum 8 semaines. Le Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) pourra aussi être administré 1 ou 2 fois par voie intra-rectale (sous anesthésie générale, acte d’1h), après 12 à 16h à jeun. Ces études dureront 2 semaines au maximum. Des bactéries Citrobacter Rodentium (administration durant 5 minutes) pourront être administrées. Ces études dureront au maximum 3 semaines. Chez des souris immunodéficientes, le modèle aigu de colite (sur 8 jours) est induit par administration d’un anticorps (injection unique, prenant 5 minutes). En utilisant les mêmes souris immunodéficientes, un modèle chronique de colite est inductible par injection de cellules immunitaires humaines ou murines (injection prenant 5 minutes). Les études dureront au maximum 16 semaines. Des modèles de souris développant spontanément une colite peuvent aussi être utilisés. Ces études dureront au maximum 22 semaines. Les animaux seront pesés deux fois par semaine avant induction, puis une fois par jour à partir de l’induction ou de l’apparition des signes cliniques dans les modèles spontanés (5 minutes). Des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par voie : intranasale et intratrachéale (anesthésie, 1h), intramusculaire et intradermique (anesthésie, avec analgésie, 1h), orale sur animaux vigiles (1 minute), sous cutanée et intrapéritonéale (anesthésié, 1 heure, ou vigile, 1 minute), ou par minipompe osmotique posée lors d’une chirurgie sous anesthésie générale avec analgésie au préalable (anesthésié 1 heure). Des prélèvements de sang ou d’urine ou de fécès pourront être réalisés (3 minutes sur animal vigile, 1 heure si anesthésie). Des biopsies de peau pourront éventuellement être réalisées, sous anesthésie générale avec analgésie (1h30). Des endoscopies digestives pourront être réalisées, après de 8h de mise à jeun, sous anesthésie générale (1h environ). Les animaux pourront aussi être mis à jeun avant et pendant l’administration puis la digestion de Dextran Isothiocyanate de fluorescéine (FITC) afin de mesurer la perméabilité digestive (mise à jeun totale de 8h).
Impact sur les animaux
Dans ces modèles de maladies inflammatoires digestives, de la diarrhée, potentiellement hémorragique, est attendue. Des pertes de poids marquées sont attendues. Les animaux pourront recevoir des traitements par toutes voies et avec toutes les fréquences d’administrations possibles, dans le respect des recommandations vétérinaires. Des prélèvements de sang pourront être effectués dans le respect des recommandations de voies et de volume. Pour induire la colite, les animaux pourront recevoir du TNBS par voie intrarectale, une à deux fois, après mise à jeun 12 à 16H. Des endoscopies pourraient être réalisées, sous anesthésie générale, avec mise à jeun de 12h. Dans le cas où du Dextran FITC serait administré, les animaux seront mis à jeun 12h maximum.
Devenir
Après les deux procédures, les animaux seront mis à mort afin de pouvoir procéder à la récupération de la peau et de grands volumes de sang, nécessaires pour évaluer l’efficacité des composés testés sur les maladies d’intérêt.
Remplacement
Toutes les molécules chimiques ou biologiques qui seront évaluées dans ce projet auront été si possible au préalable sélectionnées dans des tests in vitro afin de s’assurer de leur efficacité, de leur spécificité et de leur absence de toxicité. Elles auront aussi si possible été sélectionnées in vivo chez le rongeur sur leurs propriétés pharmacocinétiques (vérification de la compatibilité avec une efficacité dans la maladie visée). L’ensemble de ces données est souvent insuffisant pour prédire l’efficacité in vivo des molécules, car recréer in vitro une pathologie complexe est difficile, notamment lorsque différents types cellules et/ou tissus sont impliqués. L’efficacité réelle des meilleures molécules devra donc être vérifiée chez le rongeur en choisissant le modèle animal se rapprochant le plus de la pathologie telle que décrite chez l’homme.
Réduction
Le nombre minimum suffisant permettant d’observer des différences significatives sur les paramètres d’intérêt est systématiquement utilisé. En pratique, ces nombres ont été déterminés sur la base de la littérature sur le sujet et d’expériences préalables dans nos laboratoires. Dans tous ces modèles, il a été démontré que 8 à 11 animaux sont nécessaires en fonction des paramètres d’intérêt, afin d’observer des différences sur ces paramètres, sauf dans les modèles spontanés sur souris transgéniques dans lesquels 10 à 12 animaux seront nécessaires. Le nombre élevé d’animaux prévu est lié au nombre d’études élevé prévu pour tester un grand nombre de composés et de schémas d’administration et au nombre d’animaux par étude. Dans la mesure du possible, le maximum d’analyses compatibles sera effectué sur les mêmes tissus afin d’éviter de multiplier les animaux nécessaires. Afin d’éviter de multiplier les groupes contrôles, dans la mesure du possible si plusieurs composés doivent être testés ils le seront au cours de la même étude.
Raffinement
La diarrhée et le sang dans les selles seront suivis quotidiennement à partir de l’induction. Dans les modèles spontanés, ils seront suivis deux fois par semaine jusqu’à apparition des signes cliniques puis une fois par jour. Le poids des animaux sera suivi deux fois par semaine jusqu’à l’induction puis une fois par jour. Dans les modèles spontanés, le poids sera suivi deux fois par semaine avant apparition de signes cliniques / pertes de poids puis une fois par jour dès l’induction. Les actes douloureux seront réalisés avec analgésie. Les actes moins stressants (autres administrations et prélèvements) seront réalisés sous anesthésie sauf si la contention génère moins de stress ou si l’anesthésie n’est pas possible (administration orale). Pour évaluer d’une façon sensible l’état de souffrance et établir les points limites, la spécificité des modèles et des procédures est prise en compte. Les expérimentateurs sont formés pour reconnaître ces signes. Les personnes en charge du bien-être et du soin des animaux veillent au respect des points limites. Un système d’alerte est mis en place pour statuer sur la mise à mort de l’animal. Les principaux points limites concernent l’état général de l’animal et sont listés en détail dans les procédures. Des points limites supplémentaires seront ajoutés en cas de détection d’effets non prévus de l’induction des maladies et/ou en cas de mise en place de méthodes plus raffinées d’évaluation de la souffrance des animaux.
Choix des espèces
-L’administration du DSS ou du TNBS peut être réalisée sur des souris ou des rats, et est très bien documentée dans la littérature. -Pour créer un modèle de colite d’origine auto-immune, il faut utiliser des souris immuno-déficientes qui ne possèdent pas de lymphocytes T et B matures. -Les études de toxicité pour toute nouvelle molécule chimique ou biologique devant être réalisées à minima sur une espèce rongeur (rat ou souris), la connaissance de la dose active dans un modèle rongeur est une donnée critique qui permet de calculer la fenêtre thérapeutique entre la dose active sur la pathologie et la dose toxique dans la même espèce. Seuls des animaux sevrés seront utilisés (jeunes adultes et adultes, 6 semaines minimum), étant donné que les modèles d’inflammation digestive d’intérêt sont bien décrits dans la littérature sur des animaux sevrés de plus de 6 semaines.
Etude pilote du rôle d’IL4I1 sur la croissance d’un modèle de cancer du sein triple négatif.
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
94 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules de cancer du sein triple négatif leur sont greffées dans la glande mammaire sous anesthésie, puis la tumeur est mesurée trois fois par semaine, pour cette étude pilote sur le rôle de l'enzyme IL4I1. Le porteur indique que 20 à 30 % des souris peuvent développer une ulcération ou une nécrose de la tumeur, et fixe un volume de 1 500 mm³ comme point limite. Il justifie la mise à mort par une croissance tumorale "inéluctable" et affirme que le contrôle de la tumeur par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro.
Objectifs
Rationnel : IL4I1 est une enzyme immunosuppressive (elle empêche le système immunitaire de fonctionner). Sa production dans les tumeurs est associée à des paramètres de mauvais pronostic ou une survie diminuée des patients atteints de différents types de cancers. Nos données préliminaires montrent qu’elle est présente dans les cancers du sein dits « triple-négatifs », une forme agressive de cancer mammaire, pour laquelle les traitements actuels sont peu efficaces, y compris les nouvelles immunothérapies. L’inhibition d’IL4I1 (par invalidation du gène qui code l’enzyme ou administration d’un inhibiteur chimique de l’activité enzymatique) réduit la croissance tumorale dans différents modèles murins, en particulier, l’inhibition d’IL4I1 freine la croissance de modèles de cancer du pancréas et de mélanome. Objectif : Dans cette étude pilote, nous souhaitons vérifier la pertinence de l’invalidation d’IL4I1 pour améliorer le contrôle de la croissance tumorale des cancers du sein triple-négatifs, en utilisant une lignée tumorale murine modèle de ces tumeurs (EO771). Stratégie envisagée : Nous allons greffer des cellules tumorales EO771 dans la glande mammaire de souris syngéniques afin de développer un modèle orthotopique immunocompétent. Nous testerons l’effet de l’invalidation d’IL4I1 sur la croissance tumorale en comparant les courbes de croissance des tumeurs développées chez les souris de la souche naturelle (WT) à celles des tumeurs développées chez les souris déficientes en IL4I1 (IL4I1-/-).
Bénéfices attendus
L’étude pilote permettra de valider l’intérêt d’étudier le rôle d’IL4I1 dans le développement du cancer du sein triple négatif. Dans un deuxième temps (saisine future), une fois cette preuve de concept obtenue, le projet permettra de mettre au point chez la souris un modèle de traitement reposant sur l’inhibition d’IL4I1 avec un composé chimique et d’étudier les mécanismes immunitaires sur lesquels repose l’effet thérapeutique.
Procédures
Injection lente et continue d’une suspension cellulaire en tampon salin dans la glande mammaire (volume = 100 microlitres) sous anesthésie à l’isoflurane. L’injection dure moins d’une minute. Mesure de la tumeur (croissance superficielle) avec un pied à coulisse sur animal vigil, 3 fois par semaine pendant 2 semaines. La mesure dure moins d’une minute par animal.
Impact sur les animaux
L’anesthésie limite le stress lié à la contention et améliore la précision de l’injection. Une injection précise permet une croissance harmonieuse et localisée de la tumeur et ainsi limite le risque de souffrance. Malgré ces précautions, dans 20 à 30% des effectifs, il peut apparaitre une ulcération, une nécrose ou un suintement localisé au niveau de la tumeur qui représente un point limite. Un volume tumoral de 1500 mm3 (atteint habituellement 3 semaines après injection) est également considéré comme un point limite.
Devenir
La croissance tumorale est inéluctable, les animaux doivent donc être mis à mort en fin d’expérimentation.
Remplacement
Le contrôle de la croissance tumorale par le système immunitaire ne peut pas être modélisé in vitro, car il implique de très nombreuses interactions cellulaires et moléculaires coordonnées au cours du temps dans l’organisme entier. Bien qu’imparfait, le modèle murin reste d’utilisation courante pour ce type d’étude.
Réduction
Nous souhaitons observer une réduction d’au moins 20% de la croissance tumorale dans le groupe de souris IL4I1-/- (souche invalidée pour l’expression d’IL4I1) par rapport au groupe contrôle (souche naturelle), de façon à pouvoir considérer cette diminution comme biologiquement significative. Si on considère que cet effet devra être visible lorsque la tumeur du groupe contrôle aura atteint un volume de 500 mm3 (environ 18 jours après injection de 0,25x10E6 cellules), la variance habituelle à cette date étant de 150 mm3, le nombre de souris à tester par groupe est de 36. Les animaux qui seraient mis à mort avant la fin de l’expérimentation ne pourraient pas être pris en compte. Sachant que jusqu’à 30% des animaux auront atteint un point limite avant J18 du fait de lésions au niveau de la tumeur, il faut prévoir 30% d’animaux supplémentaires par groupe, soit 0,3x36 + 36 = 47 animaux par groupe. Des courbes d’incidence de l’apparition des tumeurs et de survie (Kaplan-Meier) seront réalisées en parallèle. L'estimation du nombre d'animaux nécessaires sur la base d'une différence de 30% de la survie est de 45 animaux par groupe en tenant compte des 30% d'animaux non évaluables. Dans le cas où cette différence atteindrait 40%, 28 animaux par groupe seraient suffisants. La totalité de cet effectif ne sera pas inclus dans une seule expérimentation, permettant d'adapter le nombre d'animaux inclus aux résultats obtenus. Habituellement, nous incluons 8 à 12 animaux par groupe et par expérimentation. Ainsi, la procédure sera arrêtée dès qu'une différence statistique entre les deux groupes sera obtenue.
Raffinement
Les animaux bénéficient de mesures d’enrichissement du milieu. L’injection des cellules tumorales sera faite sous anesthésie (isoflurane, 4% pour induction, 2% pour maintien), ce qui limite le stress pour les animaux et augmente la précision de l’injection dans la glande mammaire. Le suivi des souris sera réalisé 3 fois par semaine par le même opérateur, à partir du huitième jour après injection. La taille des tumeurs sera mesurée avec un pied à coulisse. Le comportement et l’aspect général des animaux ainsi que l’aspect de la tumeur seront évalués de façon à détecter précocement des signes de souffrance (tels que ralentissement des mouvements, tremblements, perte de poids) ou un point limite (tel que nécrose de la tumeur) qui nécessiteraient d’interrompre l’expérimentation pour cet animal.
Choix des espèces
Notre projet s’intéresse au contrôle de la croissance du cancer du sein triple négatif par le système immunitaire (précisément par l’enzyme IL4I1 qui joue un rôle de frein de la réponse immunitaire contre le cancer). Seule la souris permettra d’étudier la croissance d’une lignée murine reconnue comme modèle de cancer du sein triple négatif. Souris adultes (plus de 6 semaines). Le cancer du sein est une tumeur de l’adulte.
ETUDE DES MECANISMES REGULANT LE REMODELAGE VASCULAIRE AU COURS DE L’HYPERTENSION CHEZ LA SOURIS
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes, subissent une chirurgie de 15 à 20 minutes pour induire une hypertension puis des mesures de pression et une échocardiographie sous anesthésie, pour étudier le remodelage des vaisseaux. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer douleur, infection et hémorragie et que l'anesthésie peut entraîner un arrêt cardiaque, tout en affirmant que l'hypertension induite reste indolore. Sur le remplacement, il affirme que la régulation de la pression artérielle ne peut être évaluée qu'in vivo et impose le modèle murin.
Objectifs
L’objectif de notre recherche est de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans l'altération de la structure des vaisseaux et le développement de l’hypertension artérielle. Plusieurs travaux ont corrélé l’activation d’un récepteur membranaire avec l’augmentation de la pression artérielle plus particulièrement chez les mâles. Notre objectif est de démontrer que cette voie régule la pression artérielle et la structure des vaisseaux, de comprendre quelles cellules vasculaires sont affectées et quelle est l'origine de l'effet dépendant du sexe.
Bénéfices attendus
L'identification de nouveaux acteurs régulant la structure des vaisseaux et jouant un rôle dans le développement de l'hypertension va permettre de mettre à jour de nouvelles cibles potentielles pour le traitement des hypertensions résistantes aux traitements actuels (environ 15% des malades).
Procédures
Au total 600 souris seront utilisées pour 3 procédures légères ou modérées. Dans les procédures modérées 1 et 2, les 480 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine puis 2 fois par semaines pendant 5 semaines. Elles seront soumises à une procédure chirurgicale de 15 à 20 min pour mettre en place des modèles d’hypertension. La chirurgie sera effectuée sous anesthésie et sous analgésique donné en préventif mais aussi en post-chirurgical. La pression sera mesurée à la queue de façon hebdomadaire. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées. Dans la procédure 3 légère, les 120 souris seront soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes durant 1 semaine. La pression sera mesurée à la queue toutes les 2 semaines pendant 3 ou 6 mois. Les souris seront aussi étudiées par échocardiographie effectuée sous anesthésie légère quelques jours avant la fin de la procédure où la pression sera mesurée dans la carotide sous anesthésie puis les souris seront euthanasiées.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront certains actes chirurgicaux qui pourront entrainer de la douleur péri et post-opératoire. Les procédures chirurgicales ou d’injection peuvent aussi conduire à des infections. Lors de la chirurgie, il peut y avoir une hémorragie. L’anesthésie peut aussi entrainer un arrêt cardiaque. L'hypertension induite dans les modèles utilisés n'est pas très forte et sera indolore pour les animaux. Selon notre expérience, les modèles transgéniques, utilisés à l'état adulte, n’entrainent pas de phénotype douloureux pour les animaux.
Devenir
Les 600 animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés en fin d’expérimentation à l’issue d’une mesure de la pression artérielle sous anesthésie. Les animaux sont utilisés à des fins expérimentales qui nécessitent leur euthanasie afin de pouvoir mesurer leurs paramètres hémodynamiques et vasculaires et étudier les tissus.
Remplacement
Dès que possible, les voies et les molécules impliquées seront étudiées in vitro sur des cellules en culture (progéniteurs en culture, cellules vasculaires en culture), cependant la régulation de la pression artérielle et la participation de cellules au remodelage vasculaire ne peuvent être évalués qu'in vivo, c'est pourquoi ce projet nécessite des modèles murins.
Réduction
Ce projet implique 600 souris au total avec des lots de 10 et 15 animaux. La taille des effectifs des différents lots a été déterminée grâce à un calcul de puissance et il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques pour une interprétation fiable des résultats. A notre connaissance, ces expériences n'ont jamais été réalisées ni en France, ni dans le monde, par d'autres équipes dans un protocole expérimental semblable.
Raffinement
Les volumes injectés sont les plus petits possibles en accord avec le poids de l’animal. Le poids des animaux est suivi tout au long des procédures. Les animaux seront stabulés en portoirs ventilés avec eau et nourriture ad libitum et une température et hygrométrie constantes. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour (6h-18h). Les animaux sont hébergés à plusieurs et le milieu est enrichi. Pendant l’ensemble des procédures, une surveillance quotidienne sera effectuée et le poids des animaux sera mesuré régulièrement. Les points limites seront évalués selon une grille de suivi. En post-opératoire, les souris seront observées quotidiennement et pesées tous les 2 jours pendant 1 semaine. La douleur sera soulagée par l’administration d’analgésique systémiques en péri-opératoire et à 24h et 48h en post-opératoire et pourra être renouvelée en cas de souffrance de l’animal. Si le comportement d'un animal est altéré, il sera pesé avec un point limite à 20% de perte de poids. Une perte de sang importante, des signes de souffrance (prostration, poil hérissé, yeux fermés) qui se maintiennent, une prostration, une incapacité à se déplacer, des yeux larmoyants et exorbités constituent également des points limites. Les infections éventuelles seront traitées localement par application de crème antibiotique ou par administration d’antibiotique.
Choix des espèces
Nous effectuons des expériences avec des souris modifiées par transgénèse afin de permettre la modification de l'expression de certains gènes ou de marquer des cellules par immunofluorescence. Seuls des modèles de souris existent pour ces altérations géniques. De plus la souris est un modèle couramment utilisé pour l'étude des mécanismes cellulaires impliqués dans le développement de l'hypertension artérielle. Les études sur le rôle de la voie ciblée sur le remodelage vasculaire et la pression artérielle seront effectuées au stade adulte, lorsque le développement vasculaire et cardiaque est fini, après l'âge de 8 semaines. De plus, la voie étudiée est importante pour le développement de la souris, donc nous utiliserons les souris à l'âge adulte (entre 8 et 15 semaines) afin de ne pas perturber leur développement en modulant la voie étudiée.
La voie PIWI/piRNA dans la maintenance de l’intégrité génomique des cellules souches hématopoiétiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyser leur moelle osseuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles subissent des injections répétées de LPS ou de 5-FU, des irradiations aux rayons X et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital sous anesthésie, pour étudier la voie PIWI/piRNA dans les cellules souches du sang au cours du vieillissement. Le porteur indique que la transplantation ou les injections répétées peuvent provoquer une aplasie de la moelle osseuse, et fixe un point limite de perte de poids de 20 % déclenchant la mise à mort. Sur le remplacement, il affirme que l'obtention de ces cellules impose des prélèvements invasifs et rend le modèle murin "indispensable".
Objectifs
Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à l’origine de toutes les cellules du sang et assurent leur renouvellement en continue. Afin de répondre à l’homéostasie ou à un stress, ces cellules peuvent sortir de leur état latent, proliférer et se différencier. L’induction de la prolifération des CSH peut conduire à un vieillissement précoce. La voie PIWI/piRNA a été montré pour être nécessaire pour limiter la perte de fonction des cellules souche intestinale chez la drosophile en réponse a un stress induisant la prolifération. Nous souhaitons donc utiliser différents modèles de stress prolifératifs afin d’analyser l’importance de la voie PIWI/piRNA dans les CSH.
Bénéfices attendus
Le projet est un projet de recherche fondamentale. Le contrôle de l’intégrité génomique des CSH est indispensable afin de maintenir une hématopoïèse efficace. En effet, l’apparition de dommages de l’ADN comme ceux pouvant être engendrer par les éléments transposables, peuvent conduire soit à une senescence et donc à une diminution de la production de cellules sanguines soit au contraire à l'apparition de clones leucémiques. Il est donc important de bien connaitre les acteurs permettant de contrôler ces éléments transposables, tel que la voie PIWI/piRNA.
Procédures
Ce projet compte 10 procédures différentes comprenant des injections en intrapéritonéale notamment de LPS ou de 5-FU et des irradiations par rayon X sur animaux vigiles, des injections en sous-cutanées et en retro-orbitale ainsi que des prélèvements de sang en retro-orbitaux sous animaux endormis. Chacune de ces procédures est très rapide (de l'ordre de quelques secondes ou de quelques minutes pour l'irradiation), elles sont indolores au moment de la manipulation car au besoin elles sont réalisées sous anesthésie générale par isofluorane (1-3 mn en boîte à anesthésie isofluorane 4%, débit 2L/mn). Certaines injections en intrapéritonéales seront réalisées plusieurs fois (entre 1 et 10 fois tous les 2 à 14 jours d'intervalle selon la procédure).
Impact sur les animaux
Les animaux pourront être soumis à des irradiations par rayon X, une transplantation par injection intraveineuse de cellules hématopoïétiques, des injections en intrapéritonéale ou sous cutanées. Chacune de ces procédures est très rapide (de l'ordre de quelques secondes ou de quelques minutes pour l'irradiation), elles sont indolores au moment de la manipulation car au besoin elles sont réalisées sous anesthésie générale par isofluorane. Cependant, la transplantation ou des injections répétées de 5-FU ou de LPS peuvent entrainer une aplasie médullaire des animaux. Ces animaux seront donc surveillés quotidiennement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de chacune des procédures afin de pouvoir analyser les cellules souches hématopoiétiques présentes dans la moelle osseuse.
Remplacement
Dans l'impossibilité d'obtenir des échantillons de cellules souches hématopoiétiques (nécessitant des prélèvements invasifs), l'utilisation de modèles animaux est indispensable. De plus, la seule manière d'aborder de manière efficace et pertinente les questions que nous posons est de combiner des expériences in vivo, en utilisant les différents modèles de souris génétiquement modifiées. Ne pouvant donc pas remplacer le modèle murin, nous réduirons l'utilisation de souris au nombre minium possible.
Réduction
Sur la base de nos données préliminaires, nous calculerons le nombre minimum de souris nécessaire pour chaque expérimentation permettant d’obtenir un résultat statistiquement significatif (calcul du n avec un test unilateral pour une différence de 10%, un risque alpha de 5%, une puissance beta de 80%). Nous inclurons dans nos groupes expérimentaux aussi bien les males que les femelles afin de limiter au strict minimum le nombre d’animaux produits pour l’expérimentation. Ainsi, pour ce projet, nous utiliserons 600 animaux.
Raffinement
Les expérimentations seront optimisées dans l’optique de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les souris afin d'améliorer le bien-être de l'animal pour obtenir des données fiables. Nous vérifierons l’état de santé des souris quotidiennement : tout changement dans leur comportement ou l’apparition de signes cliniques (posture, prostration, difficultés à se déplacer et à s’alimenter, déshydratation) sera relevé et évalué grâce à une grille d'évaluation de la douleur. Lorsque les souris présenteront une perte de poids supérieure ou égale à 20% de leur poids maximum ou si des signes de souffrances apparaissaient, les animaux seront mis à mort. Durant l’ensemble de l’étude, les souris seront hébergées dans des conditions conformes à la réglementation européenne en vigueur (environnement contrôlé : température et ventilation régulées, lumière avec un cycle de 12h, hygrométrie), avec un accès continu à la nourriture et à l’eau. Les souris seront maintenues en groupes de 3 à 5 animaux par cage. L’environnement sera enrichi par des dômes en carton ou du coton.
Choix des espèces
Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme. Animal de petite taille et à reproduction rapide. Bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. De nombreuses souches d'animaux génétiquement modifiés (que nous ou d'autres ont créées) permettant de poser les questions biologiques qui nous intéressent existent déjà. Des souris adultes entre 6 semaines et 20 mois seront utilisées car nous analysons l'importance de la voie PIWI au cours du vieillissement des CSH.
Analyse de l’effet de molécules thérapeutiques dans le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte
- Recherche appliquée
- Troubles immunitaires
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
810 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées à 8 grays, greffées avec de la moelle osseuse et des lymphocytes T sous anesthésie, puis reçoivent des injections quotidiennes d'anticorps et des prélèvements de sang dans le sinus rétro-orbital, pour tester des traitements de la maladie du greffon contre l'hôte. Le porteur indique que les souris développent perte de poids, poil terne, atteintes cutanées et posture voûtée, qu'aucun antalgique n'est administré car il modifierait le système immunitaire, et que les animaux atteignant un score clinique de 5 sont mis à mort. Sur le remplacement, il affirme que les expériences in vitro ne peuvent pas répondre à son hypothèse in vivo.
Objectifs
Les lymphocytes T régulateurs sont des cellules immunitaires avec un rôle d’inhibition de la réponse immune. Dans le cas de la maladie du greffon contre l’hôte ces cellules peuvent jouer un rôle important en freinant la réponse immune contre le greffon et diminuant le rejet de greffe par conséquence. Ainsi cibler ces cellules est une des stratégies développées par notre équipe dans l’objectif d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l’hôte. Dans ce sens l’objectif de ce projet sera de tester l’efficacité clinique d’anticorps thérapeutiques ciblant cette population spécifiquement. Nous utiliserons des anticorps dirigés contre le CD25 et le TNFR2, des molécules exprimées par les lymphocytes T régulateurs et ayant un rôle dans leur fonction. Nous étudions également l’effet de ces anticorps directement sur les cellules responsables de la maladie qui peuvent temporairement et sous certaines conditions d’activation exprimer les mêmes molécules ou d’autres comme le CD38.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’améliorer le traitement de la maladie du greffon contre l'hôte chez l'homme, une maladie qui requiert aujourd'hui de nouveaux traitements permettant la prise en charge des patients réfractaires aux traitements classiques et de soulager ainsi la souffrance des patients. Dans ce projet, nous allons valider des molécules thérapeutiques pour lesquelles nous avons obtenu des résultats importants.
Procédures
Les souris seront irradiées en 2 fois 5 minutes chacune à raison de 0,8 Gy/min pour un total de 8 Gy. Elles seront ensuite injectées sous anesthésie gazeuse isofluorane avec de la moelle osseuse seul ou de la moelle osseuse avec des lymphocytes T provenant de souris donneuses dans un volume total de 100ul par souris. Ces souris seront traitées selon le schéma choisi (traitement curatif ou préventif) avec 5 injections quotidiennes pendant 5 jours suivi de 5 injections répartis sur 10 jours avec des molécules thérapeutiques dans un volume final de 100ul d’anticorps dilués dans une solution saline et administré par injection intrapéritonéale. Des prélèvements sanguins dans le sinus rétro-orbital seront réalisés sous anesthésie gazeuse isofluorane à raison d'une à deux fois maximum par expérience. Le premier prélèvement sera effectué 14 jours après le début de l’expérience, le deuxième au moment du sacrifice qui tombe en moyenne à 60 jours après le début de l’expérience. Le volume maximale prélevé sera de 100ul.
Impact sur les animaux
Les animaux vont développer des signes cliniques de la maladie du greffon contre l'hôte caractérisés par une perte de poids associée à un pellage terne, possiblement mais pas systématiquement à des atteintes cutanées voire à une posture voutée de l’animal. Les signes cliniques seront classés suivant un score établi de 1 à 5 avec 5 les signes les plus graves. L’évaluation clinique des animaux (score) se fait de la façon suivante : un score de 1 correspond à la présence d’un des signes suivants et qui peuvent apparaître sans ordre précis : une perte de poids de 10%, une posture voutée, une atteinte des poils, une desquamation de la peau, une diarrhée. Les scores s’additionnent pour arriver à un maximum de 5. Si les souris atteignent un score de 5, elles seront euthanasiées. Il est à noter que quand la perte de poids atteint 20% et en absence d’autre signe clinique, les souris seront aussi euthanasiées. Les animaux seront suivis 3 fois par semaine pour établir le score, mais seront surveillés tous les jours pour vérification de leur état par rapport au jour d’avant. Les souris ayant une aggravation de situation seront alors euthanasiées. Ce score a été évalué par nos pairs spécialiste de la greffe de moelle osseuse, publié dans une revue internationale.
Devenir
Les animaux dont la perte de poids aura atteints 20% du poids initial ou bien un score clinique de 5 seront euthanasiés ainsi que les animaux qui n'auront pas atteints les points limites deux mois après l'irradiation. Les animaux restant à la fin des 2 mois d'expériences seront mis à mort car nous savons par expérience que leur état n'évoluera plus.
Remplacement
Le but de ce projet est d'étudier l'effet de molécule thérapeutique sur le développement de la maladie du greffon contre l'hôte in vivo. Dans ce cadre, les expériences in vitro ne pourront pas remplacer l'utilisation des animaux et ne pourront pas répondre à l'hypothèse émise. Toutefois, toutes expériences pouvant donner des informations sur le mode d'action de la molécule en question sans avoir recours à l'expérimentation in vivo sera réalisée.
Réduction
Dans le but de réduire le nombre d'animaux utilisés au maximum, les expériences seront regroupé dans le maximum possible. Ainsi, nous testerons par exemple les traitements en préventif et en curatif dans une seule expérience, ceci nous permettra de réduire le nombre d'animaux contrôles nécessaires pour chaque expérience.
Raffinement
Afin d’éviter la souffrance des animaux, les souris ayant atteint un score de 5 soit une perte de poids de 20% seront sacrifiées. Cette méthode impose une analyse fine 3 fois par semaine de chaque animal afin d’établit le score clinique associée à un suivi quotidien de l’état général des souris dans le but d’abréger toute sorte de souffrance. Les drogues antalgiques peuvent agir directement sur le système immunitaire et modifier les résultats, elles ne seront donc pas utilisées dans nos expériences. Toutefois, les animaux seront sacrifiés quand leur état ne permet pas d'envisager une amélioration. Enfin il existe une surveillance quotidienne des animaux greffés par les zootechniciens de la plateforme, lesquels sont informés de la nécessité d'une surveillance accrue des animaux du fait de leur engagement dans une expérience. Des enrichissements sont placés dans les cages à raison de 3 par cage afin de réduire l’angoisse des animaux. Lors de l’injection des cellules et du prélèvement sanguin dans le sinus rétro-orbitale, les souris seront anesthésiées sous isofluorane réduisant ainsi la douleur.
Choix des espèces
La maladie du greffon contre l'hôte a été étudié depuis longtemps dans plusieurs milliers d'études publiées. La disponibilité de modèle génétiquement modifié représente un atout non présent dans les autres espèces et qui nous permet de mieux étudier la réponse immune et de se rapprocher au plus de la maladie chez l'homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte préférentiellement entre 8 et 12 semaines. A cet âge, il possèdent un système immunitaire bien développé et sont suffisamment matures pour supporter les doese d'irradiations auquelles ils seront soumis.
Évaluation comparative de vecteur Adéno-associé modifié chimiquement pour le ciblage spécifique de cellule du foie chez la souris et l’évaluation de l’efficacité après injection intramusculaire
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses post mortem, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection unique de vecteur viral AAV par voie intraveineuse ou intramusculaire sous anesthésie, un prélèvement sanguin et des séances hebdomadaires d'imagerie par bioluminescence, pour tester des capsides modifiées ciblant le foie. Le porteur indique n'attendre qu'une légère douleur au point d'injection. Sur le remplacement, il affirme que les modèles in vitro ne reproduisent pas la complexité des interactions in vivo, une réduction des doses chez le patient étant renvoyée au conditionnel.
Objectifs
La thérapie génique consiste à introduire un gène thérapeutique dans des cellules pour traiter une maladie. Pour véhiculer ce gène, les vecteurs viraux, et en particulier les virus adéno-associés (AAVr) constituent des outils de choix. Une seule injection d’AAVr permet une expression à long terme du gène thérapeutique. Néanmoins, malgré de récents succès, plusieurs facteurs majeurs pouvant limiter l’efficacité du transfert de gène proviennent de la large biodistribution des AVV après injection mais également de la réponse immunitaire dirigée contre ce vecteur pouvant engendrer la destruction des cellules transduites. Cette réponse immune délétère s'explique, en partie, par le fait que les humains sont naturellement infectés au cours de leur vie par des virus AAV sauvages. Ces limites nécessitent d’injecter de fortes doses chez le patient. L’objectif de ce projet repose sur le potentiel de la chimie organique pour améliorer « l’activité spécifique » et « l’index thérapeutique » d'une particule AAV recombinante choisie. Ces améliorations, non explorées jusqu'à présent, vont être obtenues par l’emploi de ligands ayant des propriétés de ciblage. Ces modifications chimiques accentueront le ciblage vers un organe ou un tissu spécifique, comme le foie, ce qui en retour permettra une réduction de la quantité d’AAV à administrer au patient. Différents ligands ayant un ciblage spécifique des hépatocytes présents au niveau du foie, seront couplés sur la surface de la capside d’AAV. Au-delà de l’augmentation du tropisme cellulaire, ces capsides modifiées chimiquement pourraient également diminuer l’effet de la réponse immunitaire. Ces mêmes vecteurs chimiquement modifiés seront également injectés en intramusculaire afin d’évaluer le pouvoir de diffusion de ces vecteurs. Cette voie d’injection pourrait permettre le développement de futurs vaccins utilisant ce mode d’administration.
Bénéfices attendus
Les modifications apportées à ces vecteurs pourraient permettre d’augmenter « l’activité spécifique » ou encore « l’index thérapeutique » de la particule virale recombinante. Parmi les conséquences souhaitées, ces particules virales modifiées par voie chimique pourraient favoriser la transduction spécifique du foie et celle du muscle. Cette dernière propriété, s’il elle était démontrée, ouvrirait notamment des possibilités de réduction des doses administrées.
Procédures
Les souris recevront une injection unique de PBS ou d’AAV en Intra Veineuse ou en Intra musculaire. Les animaux seront anesthésiés. La durée totale d’intervention est d’environ 5 à 10 mn. Un prélèvement sanguin sera réalisé la semaine avant les injections. Les animaux seront anesthésiés. Le temps d’intervention est d’environ 5 mn. L’imageur photon utilisé pour réaliser les imageries par bioluminescence nous permettra de réaliser des images sur 5 souris simultanément. Les animaux seront injectés en Intrapéritonéale avec de la luciférine. Au bout de 5 mn, les souris seront anesthésiées. Le temps d’acquisition est de 1 minute. L’imagerie de bioluminescence sera réalisée une fois par semaine sur 6 semaines.
Impact sur les animaux
Les différents produits ont tous déjà été administrés chez la souris à des doses supérieures ou égales à ce qui est envisagé dans ce projet, sans observation de signe clinique. Pour les injections en intra veineuse, en intra musculaire et le prélèvement sanguin, la souris sera sous anesthésie gazeuse. Une légère douleur au point de prélèvement due à la piqure peut être ressentie après le réveil. L’injection en intra péritonéale engendre une légère douleur due à la piqure. Pour l’euthanasie, les souris seront sous anesthésie gazeuse que ce soit pour la dislocation des cervicales (point limite) ou la décapitation.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure pour des études post mortem.
Remplacement
Les modèles in vitro ne peuvent s'approcher de la complexité des interactions entre le vecteur et l’environnement biologique in vivo et rendent donc difficile la reproductibilité de ces résultats in vivo. L’utilisation de la souris est donc justifiée pour évaluer la biodistribution de ces vecteurs une fois injectés ainsi que la possible réponse immunitaire.
Réduction
Des premiers tests d’efficacité seront effectués in vitro sur différents types de cellules en culture pour évaluer l’effet de la modification chimique sur le vecteur, le nombre d’animaux à utiliser en sera donc réduit. La technique de l’imagerie par bioluminescence nous permettra d’avoir rapidement de premiers résultats. Ainsi, le nombre d’animaux utilisé pourra être réduit si certains résultats se montrent négatifs, notamment dans les groupes avec injections en IM.
Raffinement
Le bien-être animal et le raffinement des procédures passera par de bonnes conditions d’hébergements, un suivi quotidien des animaux, l’instauration de points limites pertinents et précoces ainsi que la mise en place de mesures adaptées (anesthésie, analgésie etc.).
Choix des espèces
Comme dans la majorité des études portant sur la thérapie génique, une espèce mammifère est requise pour avoir une pertinence clinique. L'utilisation de la souris est justifiée à la fois par l'existence de plusieurs modèles murins ainsi que par la possibilité de constituer des groupes d'animaux suffisamment larges (n=5 par groupe) pour pouvoir effectuer des calcul statistiques (test statistique non paramétrique Mann-Whitney). Le modèle murin envisagé (Balb-c) est couramment utilisé dans le domaine de la thérapie génique et plus particulièrement dans celui des AAVr. Il s’agit d’un modèle souvent utilisé pour étudier la biodistribution de différents vecteurs. Ce modèle nous apparaît donc comme étant pertinent pour ce projet. Nous évaluerons nos vecteurs sur des animaux ayant fini leurs croissances. Afin d’être en corrélation avec des études similaires, notre protocole démarrera donc chez des souris adultes âgées de 8 semaines.
Induction de tumeurs de cancer pulmonaire pour des études de compréhension ou d’évaluation de l’efficacité thérapeutique par imagerie in vivo.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
1 600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une tumeur pulmonaire leur est greffée puis suivie par imagerie répétée sous anesthésie, jusqu'à 39 manipulations par animal, une plateforme réalisant ces études "à la demande de chercheurs extérieurs". Le porteur indique que les tumeurs peuvent provoquer une perte de poids et une gêne respiratoire, et que les organes sont prélevés après la mort "à la demande du client". Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne peut remplacer "l'animal entier" et écarte le poisson zèbre, jugé peu adapté à ses appareils d'imagerie.
Objectifs
Au niveau mondial, le cancer pulmonaire représente le type de cancer avec la plus forte mortalité. Parmi les sous-types de cancer du poumon, le cancer broncho-pulmonaire non à petites cellules (ou CPNPC) représente 87% des cas de cancer du poumon avec un pronostic des plus sombres parmi tous les cas de cancers pulmonaires. La majorité des patients avec ce type de cancer sont malheureusement diagnostiqués à un stade avancé, voire très avancé. Notre lanoratoire est une plateforme de services et de R&D spécialisée dans l'imagerie préclinique. Sa mission est de répondre aux besoins d'imagerie de la communauté scientifique, particulièrement dans le domaine de l'oncologie expérimentale. Ce projet a pour but de réaliser, à la demande de chercheur extérieurs à notre laboratoire, des études sur des modèles murins de cancer pulmonaire afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la progression tumorale ou d’évaluer l’efficacité de nouveaux traitements.
Bénéfices attendus
En fonction des études clients, les bénéfices attendus sont: - Une meilleure connaissance des cancers pulmonaires. - L'étude de nouveaux traitements contre le cancer pulmonaire.
Procédures
Dans le cas des souris induites en sous-cutanée (procédure 1) : Les animaux seront anesthésiés lors de l’induction par piqure d’aiguille. Ensuite, chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence suivi d’une mesure au pied à coulisse de la tumeur et d’une imagerie échographique. (soit 3 manipulations/sem x 12 semaines = 36 manipulations). Les autres imageries (photoacoustique, radioisotopique) pourront être mises en oeuvre ponctuellement en fonction des résultats obtenus en cours d'étude soit 3 manipulations supplémentaires. Au maximun 1 souris sera soumise à 39 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines. Dans le cas des souris induites par dépôt pulmonaire, les inductions se font sous anesthésie chimique et sur animal vigile pour l’induction par voie intraveineuse (Procédure 2). Chaque animal aura au maximum, un suivi hebdomadaire par imagerie de bioluminescence auquel peut s'ajouter 2 scanners espacés de minimum 2 semaines, 2 imageries radioisotopiques espacés de minimum 2 semaines. ((soit 2 manipulations/sem x 12 semaines) +4 =28 manipulations sur 12 semaines)12 BLI + 2+2 = 16 manipulations sous anesthésie sur 12 semaines Procédure 1 et 2 : Dans le cas où il faudrait injecter des candidats médicaments, suivant la voie d’administration il y aura au maximum 5 traitements par semaine sur souris vigiles (pour IP IV, SC, per Os) ou anesthésiées (pour intranasale ou intratrachéale) sur 12 semaines d’étude Ces administrations seront réalisées par du personnel formé et entraîné Nous pourrons être amené à prélever du sang sur animal vigile au niveau sub mandibulaire: du sang sera prélevé 3 fois en 24h.
Impact sur les animaux
Les nuissances ou effets indésirables attendus sur les animaux sont: - La perte de poids. - La gène respiratoire occasionnée par les tumeurs se développant au niveau de la trachée.
Devenir
Procédure 1: Modèle sous-cutané: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs sous cutanées ainsi que différents organes seront prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie. Procédure 2: Modèle orthotopique: A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort. Les tumeurs pulmonaires ainsi que différents organes pourront être prélevés à la demande du client pour des études histologiques complémentaires qui complèteront les résultats d'imagerie.
Remplacement
Aucun modèle in vitro n'est à même de remplacer l'animal entier étant donné la complexité des processus mis en jeu, notamment les interactions avec le microenvironnement tumoral. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle in vitro permettant d’étudier la biodistribution d'un composé dans tous les organes d'un individu. Le recours à l'animal entier, vivant, est indispensable. Avant de débuter les études chez l’animal, des tests d’efficacité in vitro seront effectués par nos clients sur des cellules de cancer pulmonaire en culture. Ainsi, les molécules qui ne présentent pas d’effet in vitro ne seront pas testées in vivo.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, nous mettons en œuvre des techniques d’imagerie qui permettent de réaliser un suivi longitudinal des animaux et ainsi de réduire le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement pertinents et reproductibles, évitant ainsi de refaire plusieurs fois les mêmes expérimentations. Des tests non paramétriques seront utilisés pour comparer les valeurs obtenues pour les différents lots de souris. Nombre d’animaux utilisé dans ce projet : Sur 5 ans nous prévoyons 20 études qui seront réparties ainsi : -Pour le modèle sous-cutanée (procédure 1), 10 études, 800 souris sur 5 ans. -Pour le modèle orthotopique (procédure 2): 10 études, soit par induction en intraveineuse, soit par dépôt pulmonaire 800 souris sur 5 ans. Soit un total de 1600 animaux pour ce projet sur 5 ans. Ce nombre pourra être revu à la baisse en fonction des études clients.
Raffinement
Pour ces procédures expérimentales, la stratégie d’observation des animaux retenue est l’étude comportementale des animaux. La bonne connaissance de l’état clinique normal de la souche de souris utilisée nous permettra d’observer précisément et d’interpréter rigoureusement les signes cliniques de souffrance des animaux. Les souris seront suivies par inspection visuelle chaque jour de la semaine et les critères comportementaux, et tumoraux pris en comptes pour l’évaluation du palier de douleur. Lorsqu’un des points limites est atteint, l’animal est mise à mort afin d’arrêter sa souffrance car elle ne peut être ni diminuer ni stopper. Ces point limites sont présentés dans chacune des procédures. Les animaux seront étudiés par imagerie in vivo non invasive qui n'induit pas de douleur supérieure à celle d’une piqure d’aiguille et permet de réduire le stress infligé au cours de l’expérimentation puisque les animaux sont anesthésiés durant les examens d'imagerie.
Choix des espèces
Les modèles de cancer humain et murins sont classiquement mis en oeuvre chez la souris pour les études de tumorigenèse, de progression tumorale et métastatique. Les modèles orthotopiques de carcinome pulmonaire H460, LL-2, A549, 4T1 et mélanome B16 sont uniquement disponibles chez cette espèce animale. Le modèle zebrafish utilisé en cancérologie pour les xénogreffes pourrait être intéressant car de moindre degré de douleur mais le poisson reste peu adapté aux modalités d'imagerie mises en oeuvre dans notre établissement qui ne dispose pas d'un agrément pour ce modèle . Par ailleurs, la transplantation orthotopique n'est pas possible chez le poisson pour des cellules issues de cancer du poumon et du sein. (Raby et al., "Bulletin du cancer", Vol 107, janv 2020) Modèle de cancer réalisable chez le jeune animal (6 à 10 semaines). A ce stade, la croissance et le développement des tumeurs sont optimaux. Sur des animaux plus âgés, il est possible qu’une légère immunocompétence apparaisse, augmentant ainsi le risque de rejet de greffe tumorale. Ce modèle est validé au laboratoire depuis 10 ans.
Imagerie de la neuroinflammation par ultrasons, chez la souris nouveau-né et la jeune souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 506 souris, dont des souriceaux de 5 jours, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent une injection de molécule pro-inflammatoire dans le péritoine ou directement dans le cerveau, subissent une ouverture de la boîte crânienne sous anesthésie et des séances d'imagerie par ultrasons, pour étudier la neuroinflammation du cerveau en développement. Le porteur indique que l'injection provoque un retard de croissance et peut entraîner des troubles comportementaux et moteurs, et décrit trois tests évaluant la communication sociale, la reconnaissance de l'odeur maternelle et le stress. Les retombées annoncées pour le nouveau-né humain prématuré sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant l'imagerie du cerveau enflammé.
Objectifs
La neuroinflammation est une réaction inflammatoire (réaction de l'organisme aux lésions et infections) qui se produit dans le cerveau. Lorsqu’elle survient peu avant ou après la naissance, la neuroinflammation peut impacter des phases critiques du développement du système nerveux central et avoir des conséquences à long terme sur la santé de l’individu (handicaps moteurs, troubles comportementaux, déficits cognitifs…). Cette étude vise à mieux comprendre l’impact de l’inflammation sur le développement cérébral. Nous nous intéressons ici à trois caractéristiques du cerveau : la connectivité entre différentes régions cérébrales lorsqu'elles sont activées, l’architecture vasculaire et la rigidité. La connectivité analyse l’activation simultanée de plusieurs aires cérébrales structurellement différentes. La neuroinflammation engendre des défaillances de cette connectivité fonctionnelle. L’inflammation modifie également les vaisseaux sanguins de la zone touchée, puisqu’elle se traduit par un afflux important de sang à cet endroit. L’architecture vasculaire à l’échelle des microvaisseaux fera l’objet d’une partie de cette étude. Enfin, la neuroinflammation, de par ses conséquences au niveau vasculaire notamment, pourrait modifier la rigidité du cerveau, et nous chercherons à quantifier cette modification. Les ultrasons biomédicaux, utilisés à des fins d’imagerie diagnostique, sont un moyen parfaitement adapté à l’étude de ces trois caractéristiques. L’essor considérable qu’ils ont connu au cours des dernières années a permis d’augmenter le niveau de détail des images, spatialement et temporellement, et leur sensibilité. Dans notre étude, trois techniques d’imagerie ultrasonore seront utilisées : les ultrasons fonctionnels pour étudier la connectivité fonctionnelle, l’imagerie superrésolution pour cartographier l’architecture cérébrale à l’échelle des microvaisseaux, et l’élastographie pour mesurer la rigidité du cerveau inflammé. L’effet de la neuroinflammation sur le comportement sera également étudié. Trois tests comportementaux seront mis en œuvre pour évaluer la communication sociale des animaux, la reconnaissance de l’odeur maternelle par les souriceaux et le stress des animaux.
Bénéfices attendus
Ce projet contribue à enrichir les recherches faites sur la neuroinflammation chez le souriceau, en utilisant une méthode jusque-là peu utilisée pour étudier ce sujet : l’imagerie par ultrasons. En particulier, l’étude de l’impact possible de l’inflammation sur la rigidité du cerveau constitue la principale avancée de ce projet. A plus long terme, les données collectées serviront à la recherche sur le nouveau-né humain prématuré. La neuroinflammation est en effet une conséquence de la prématurité des enfants, dans 20 à 40% des cas. Elle est à l’origine de la plupart des lésions dans le cerveau du nourrisson, regroupées sous le terme d’encéphalopathie du prématuré. Mieux comprendre les modifications de vascularisation, de connectivité et de rigidité induites par la neuroinflammation contribuera à élargir les outils pronostiques de la prématurité, afin de pouvoir mettre en place des interventions plus précoces et ouvrir la voie à de nouveaux traitements.
Procédures
- Les animaux recevront une injection (à travers le péritoine, sans anesthésie, 1 min ; ou directement dans le cerveau, avec anesthésie, environ 30 min) d’une molécule pro-inflammatoire, à deux stades de croissance différents (5 jours et 30 jours après la naissance). - Les animaux au 30ème jour après la naissance nécessitent une opération chirurgicale d'ouverture de la boîte crânienne, au cours de laquelle ils seront placés sous anesthésie générale (environ 1h). - Toutes les mesures d’imagerie ultrasonore (imagerie fonctionnelle, élastographie, imagerie superrésolution) sont réalisées sous anesthésie générale (durée variable en fonction des mesures à effectuer : entre 15 min et 1h30). - L'imagerie superrésolution nécessite en plus l'injection de microbulles dans la circulation sanguine, réalisée sous anesthésie, à l'aide d'une seringue très fine, adaptée à la taille de l'animal (environ 2 min).
Impact sur les animaux
- L’administration intra-péritonéale (i.e., dans le péritoine) ou intra-cérébroventriculaire (i.e., directement dans le cerveau) peut créer une infection locale dans la zone d’injection. - L’injection de molécule inflammatoire engendre un retard de croissance chez les animaux concernés, qui se traduit morphologiquement par une taille et un poids inférieurs à la normale. De plus, les animaux injectés sont susceptibles de développer des troubles comportementaux (caractère asocial, hyperactivité, préférence maternelle non visible…) et moteurs. - Une dose mal estimée d’anesthésie au cours des acquisitions en imagerie peut engendrer le réveil des animaux si trop faible, ou leur mort si overdose, ce qui justifie une étape préalable d'ajustement des doses. - La manipulation des animaux au cours des injections, ainsi que l’injection elle-même, et les tests de comportement sont sources de stress pour les animaux.
Devenir
Pour toutes les procédures, les animaux seront euthanasiés. Ils auront en effet reçu des injections et/ou subi une craniotomie donc ne pourront pas être maintenus en vie.
Remplacement
Notre étude s’intéresse à des caractéristiques du cerveau en activité, entier et fonctionnel, qu’il est par conséquent impossible de reproduire ex vivo (i.e., en-dehors de l'organisme), in vitro (i.e., en milieu artificiel) ou in silico (i.e., par des modèles informatiques).
Réduction
Au total, notre projet nécessitera au maximum 1506 animaux. Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique.
Raffinement
- Des grilles de scoring en fonction de l’âge des animaux seront proposées pour s’assurer du bien être des animaux et déterminer les points limites. Durant la période d’injection de la molécule inflammatoire, on surveillera la fréquence respiratoire, la recoloration des extrémités et le tonus des animaux. Suite à l’inflammation, on surveillera régulièrement la prise de poids et l’apparition éventuelle de troubles comportementaux (isolement, agressivité) : la molécule inflammatoire sera injectée le matin, puis les animaux seront surveillés 1h, 6h, 10h, 22h et 24h après l’injection (deux personnes se relaieront pour la surveillance). Si l’un de ces points limites est atteint, et/ou à la fin de l’étude, les animaux seront euthanasiés. - Les cages des animaux seront enrichies avec du papier doux et absorbant pour la réalisation du nid, comme dans leur milieu naturel. - Pendant les chirurgies nécessaires pour la mise en place des appareils d’imagerie, les animaux seront anesthésiés et surveillés : si l’animal présente une difficulté respiratoire, une variation importante de sa fréquence cardiaque ou une hypothermie importante, la procédure de chirurgie sera interrompue et l’animal euthanasié. - Au cours des acquisitions en imagerie, sous anesthésie générale, les constantes physiologiques suivantes seront mesurées en continu : fréquence cardiaque, fréquence respiratoire, température.
Choix des espèces
Dans le cas de l’étude de la neuroinflammation, la littérature montre que la souris est une espèce très fréquemment utilisée pour la réalisation de modèles de lésions dans le cerveau. Par ailleurs, ce modèle a l’intérêt de modéliser le cerveau en développement d’un prématuré (un souriceau à 5 jours de vie correspond approximativement à un foetus humain de 24-30 semaines de gestation) ; il pourra donc, à plus long terme, être appliqué au cas du nouveau-né humain. L’objectif de ce projet est d’étudier l’impact de la neuroinflammation sur certaines caractéristiques du cerveau, à différents stades de croissance : les animaux seront utilisés au cours du développement, à un stade encore immature du cerveau (5 jours après la naissance), et à plus long terme, lorsque le cerveau a atteint sa maturité (30 jours après la naissance).
Etude du métabolisme et de la thermogénèse d’un modèle murin Knock-Out.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
72 souris knockout vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour des analyses physiologiques et moléculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des prélèvements de sang par incision du bout de la queue et une exposition au froid à 10 puis 4 °C, un groupe étant exposé à 4 °C sans nourriture. Le porteur indique que ces procédures peuvent provoquer une baisse de la température corporelle et une perte de poids, et que l'isolement en cage individuelle représente un facteur de stress. Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de "système cellulaire pertinent" pour étudier ces deux gènes exprimés dans le cerveau, un nouveau modèle préclinique de la maladie étant renvoyé au long terme.
Objectifs
Dans le cadre de cette demande, nous souhaitons aborder les conséquences physiologiques de la perte de fonctions deux gènes in vivo, en utilisant la souris comme modèle d’étude (souris knockout,KO). Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau, avec une expression marquée dans les neurones. Chez l'humain, des données cliniques montrent que des anomalies dans l’expression de ces gènes sont liées à une maladie rare, associée à des troubles métaboliques. Comprendre la fonction de ces gènes, très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel et devrait contribuer à améliorer notre compréhension de l’étiologie de la pathologie. A ce jour, il n’existe pas de système cellulaire pertinent permettant d’aborder leurs fonctions. Plus précisément, nous souhaitons tester si l’invalidation de ces gènes que nous étudions influence de potentielles perturbations du métabolisme qui sont caractéristiques de la pathologie chez l’humain.
Bénéfices attendus
Notre programme de recherche vise à combiner génétique inverse et exploration phénotypique pour parfaire notre compréhension de l’importance physiologique de ces deux gènes d'interêt. De nature fondamentale, les expériences proposées sont susceptibles d’avoir des retombées dans le domaine biomédical puisque les données cliniques les plus récentes indiquent que la perte d’expression de l'un deux, et aussi probablement de l'autre, joue un rôle déterminant dans la physiopathologie du syndrome. Cette maladie rare s’accompagne de nombreuses altérations dont métaboliques. Un trait saillant de ce syndrome est une hyperphagie obsessionnelle accompagnée par une baisse de la dépense énergétique qui, le plus souvent, se traduit par une obésité morbide. Comprendre la fonction de ces gènes très conservés entre humains et souris, représente un réel enjeu conceptuel. A court terme, ce travail permettra de mieux définir la contribution des ces gènes dans le contrôle du métabolisme. A plus long terme, notre souris knockout pourrait représenter un nouveau modèle pré-clinique de la maladie.
Procédures
Procédure 1 (N=24 souris): Deux prélèvements de sang sont réalisés par une fine incision à l'extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang, dont le volume total est égal à 100uL (durée quelques minutes). Ils seront réalisés une seule fois durant cette procédure. Le premier pour déterminer la glycémie et la cétonémie. Une goutte de sang est déposée sur une bandelette d'un glucomètre et sur une bandelette d'un lecteur de β-Ketone. Puis le deuxième prélèvement de sang est effectué afin de doser les acides gras libres. Procédure 2 (N=48 souris): Deux prélèvements de sang sont réalisés par une fine incision à l'extrémité de la queue pour prélever une goutte de sang, dont le volume total est égal à 100uL (durée quelques minutes) seront réalisés à T0h, T11h et T24h. Le premier pour déterminer la glycémie et la cétonémie. Une goutte de sang est déposée sur une bandelette d'un glucomètre et sur une bandelette d'un lecteur de β-Ketone. Puis le deuxième prélèvement de sang est effectué afin de doser les acides gras libres (uniquement à T0h et T24h).
Impact sur les animaux
Pour la procédure 1 et 2, les animaux sont individualisés dans des cages, cela peut représenter un facteur de stress durant les premières heures d'isolement. Les deux procédures expérimentales consistent à challenger le métabolisme des souris en les exposants au froid (10°C ou 4°C). Une des nuissances attendues est la diminution de la température corporelle. Pour la procédure 2, un groupe de souris par génotype (WT et KO) est exposé au froid (4°C) sans nourriture. Les nuissances attendues sont la perte de poids et la diminution de la température corporelle. Pour les deux procédures expérimenatles une douleur est occasionnée lors des prélèvements de sang par incision du bout de queue.
Devenir
A l'issue de chaque procédure expérimentale, l'ensemble des animaux (soit 72 au total) sera mis à mort pour poursuivre les investigations physiologiques, histologiques, cellulaires et moléculaires.
Remplacement
Nous comptons explorer la fonction biologique de ces deux gènes d'interêt. Ces gènes, retrouvés uniquement chez les mammifères placentaires, sont exprimés uniquement dans le cerveau. Il n’existe pas de modèle cellulaire simple permettant d’aborder la fonction de ces derniers, notamment leurs rôles dans le contrôle du métabolisme.
Réduction
L’équipe avec laquelle nous collaborons, dispose d’un recul important concernant le nombre d’animaux à utilisés. Compte tenu de la variabilité des profils métaboliques observée au sein d’un groupe d’animaux, 12 animaux par groupe suffiront pour ces tests afin de réaliser des statistiques fiables sur nos résultats.
Raffinement
Les animaux sont placés en salle d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place des carrés de ouate dans les cages pour amoindrir le stress du transport. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les cages sont passées en revue quotidiennement et les animaux sont observés en détail au moins 3 fois par semaine (2 changes par les zootechniciens, 1 fois par les expérimentateurs). Des points limites ont été définis. Tous les signes de souffrance lors des observations quotidiennes tels que des blessures éventuelles, un comportement anormal (isolement, pas de reflexe de fuite lorsque l'on vient attraper l'animal), maigreur (une perte de poids >20%), problème de dentition ou une altération de l'état du pelage conduiront à la mise à mort des animaux en accord avec le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Tous les modèles animaux de cette maladie génétique décrits à ce jour sont réalisés chez la souris. Nous pourrons donc comparer directement nos observations avec celles de la littérature. Cela permet aussi d’éliminer les mises au point potentielles, et donc réduire l’utilisation de souris. Stade adulte. Nous souhaitons nous affranchir de la période de croissance des animaux.
Etude de la diversité, de l’origine et des fonctions des macrophages du tissu adipeux brun
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
6 846 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leur tissu adipeux brun, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des gavages, des injections intrapéritonéales répétées jusqu'à 18 jours, des prélèvements sanguins et un hébergement individuel à 4 °C, pour comprendre le rôle des macrophages du tissu adipeux brun. Le porteur indique que l'exposition au froid peut provoquer perte de poids et hypothermie, une hypothermie sévère pouvant s'accompagner de prostration et de léthargie, et que l'isolement induit un stress. Sur le remplacement, il revendique le caractère "indispensable" des études in vivo, les retombées thérapeutiques contre l'obésité et le diabète étant renvoyées au conditionnel.
Objectifs
Il existe deux types de graisse corporelle (tissu adipeux) chez les mammifères : le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun, dont les rôles sont différents. Le tissu adipeux blanc stocke les calories en excès sous forme de graisses et constitue la principale réserve d’énergie de l’organisme. Le tissu adipeux brun, au contraire, est spécialisé dans la thermogenèse adaptative : il brûle les graisses et le sucre en produisant de la chaleur. Ce phénomène permet ainsi de maintenir la température corporelle lors de l’exposition au froid mais aussi de réguler la quantité de graisses et de sucre dans l’organisme. L’activation du tissu adipeux brun a donc émergé comme une stratégie thérapeutique pour lutter contre les maladies métaboliques comme l’obésité et le diabète. En plus des cellules adipeuses, le tissu adipeux contient aussi de nombreuses cellules immunitaires, dont certaines s’appellent macrophages. Alors que le rôle des macrophages dans le tissu adipeux blanc est largement étudié, leur rôle dans le tissu adipeux brun reste à déterminer. Ce projet a pour objectif de comprendre l’origine, la diversité et la fonction des macrophages du tissu adipeux brun.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de comprendre comment les macrophages présents dans le tissu adipeux brun contrôlent la thermogenèse adaptative. Cela pourrait permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour brûler les graisses et le sucre et lutter contre les maladies métaboliques.
Procédures
Les interventions réalisées sur animaux vigiles seront l’une des suivantes : un gavage unique, des injections intrapéritonéales un jour sur deux pendant une semaine ou des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant 18 jours maximum. De plus, un prélèvement de sang sera effectué juste avant la mise à mort. Des animaux ayant été soumis à des injections intrapéritonéales un jour sur deux pendant une semaine seront ensuite anesthésiés pour recevoir une injection sous-cutanée dans le coussinet de la patte et une injection intraveineuse.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales répétées et une inflammation peut se développer au niveau des sites d’injection. Lors d’un gavage, une introduction accidentelle de liquide dans la trachée ou les poumons peut se produire entrainant une détresse respiratoire. Lors des tests de tolérance à l’exposition au froid, les animaux seront hébergés individuellement à une température de 4°C. L’isolement social peut induire un stress. L’exposition au froid peut entrainer une perte de poids et une hypothermie. Une hypothermie sévère peut s’accompagner d’une perte du réflexe de redressement, d’une prostration ou d’une léthargie.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de prélever le tissu adipeux brun dans le but de l'analyser.
Remplacement
Pour satisfaire au remplacement, les études in vitro seront réalisées sur des lignées cellulaires au lieu de cellules isolées à partir des animaux. Cependant, pour comprendre la diversité, l’origine et les fonctions des macrophages du tissu adipeux brun, il est indispensable de réaliser des études in vivo car les études in vitro ne permettent pas de reproduire les interactions complexes qui existent entre les différents organes et entre les différents types cellulaires présents dans le tissu adipeux brun.
Réduction
Pour satisfaire à la réduction, les souris « sauvages » seront commandées chez un fournisseur agréé afin de ne pas générer d’animaux surnuméraires. Pour les élevages, nous utiliserons des schémas de croisement qui permettent d’éviter la génération d’animaux inutiles. De plus, nous utiliserons indifféremment les souris mâles et femelles. Chaque procédure sera réalisée sur un nombre d'animaux minimum mais nécessaire pour réaliser des études statistiques pertinentes.
Raffinement
Pour satisfaire au raffinement, nous serons particulièrement attentifs à tout changement physique ou de comportement. Dans les différentes procédures, le suivi pondéral des souris sera également un bon indicateur de leur état général. Il est important de préciser que les souris utilisées dans ce projet ne présentent pas de phénotype dommageable. Dans le cas d’injections intrapéritonéales répétées, nous effectuerons une rotation des sites d’injection et surveillerons quotidiennement l’aspect des sites d’injections. Le suivi sanitaire quotidien et nos visites régulières (au moins une fois par semaine en fonction des procédures) permettront de déceler précocement tout signe de douleur, de souffrance ou d’angoisse et d'appliquer les points limites que nous avons définis. Des grilles d’observation ont été établies et des critères d’arrêt précis et précoces ont été définis pour chaque procédure.
Choix des espèces
Nous avons choisi d’utiliser la souris car notre expertise nous permet d’avoir des locaux d’hébergement et des conditions d’expérimentation appropriées à cette espèce. D’autre part, la similitude de son patrimoine génétique avec celui de l’Homme nous permet, dans la mesure du possible, d’extrapoler les résultats et en tirer des conclusions valables pour l’Homme. De plus, nous étudions les macrophages du tissu adipeux brun et nous disposons déjà des modèles génétiques murins permettant l’expansion du tissu et la déplétion spécifique des différentes populations de macrophages. Enfin, les données in vivo de la littérature sont obtenues essentiellement sur des souris et cette espèce permet d'obtenir assez de "matériel" pour faire les différentes analyses biologiques. Aucune autre espèce ne peut donc être utilisée. L’étude des caractéristiques et de la localisation des macrophages dans le tissu adipeux brun se fera sur des souris adultes (âgées d’au moins 8 semaines). Afin d’étudier l’origine développementale des macrophages du tissu adipeux brun, nous aurons recours à des femelles gestantes et des souris adultes. Afin de définir les fonctions des macrophages dans le tissu adipeux brun à l’état basal et au cours de l’exposition au froid, nous utiliserons des souris âgées de 3 à 28 semaines.
Contribution des différentes cellules musculaires à la régénération
- Recherche fondamentale
- Système musculosquelettique
400 souris vont être utilisées, toutes tuées au plus tard 28 jours après la lésion pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un gavage de tamoxifène puis, sous anesthésie, des injections de chlorure de baryum dans les muscles pour provoquer une lésion et étudier la régénération musculaire. Le porteur affirme n'attendre aucun effet indésirable majeur, tout en fixant des points limites comme la paralysie ou la nécrose de la patte qui déclenchent la mise à mort. Sur le remplacement, il indique avoir mené des études préliminaires sur des lignées cellulaires mais conclut que l'étude au sein d'un "organisme dans son ensemble" reste nécessaire.
Objectifs
Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables : il présente un développement et une croissance prodigieuse et possède de grandes capacités régénératrices. Ces capacités de croissance et de régénération font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. Ces cellules sont mises en place au cours du développement. Le développement et le maintien de ces cellules par cet environnement est crucial à l’équilibre et à la régénération musculaire et déterminé par les gènes Hira, Pax3 et Pax7. Nous souhaitons étudier la fonction spécifique de chacun de ces gènes dans les cellules satellites pendant la régénération musculaire. Dans un but de suivre le principe des 3R et de réduire et remplacer l’utilisation excessive d’animaux impliqués dans les expériences in vivo, nous avons établi des lignées cellulaires dérivées de muscles pour les expériences préliminaires. Nous avons caractérisé et étudié ces lignées in vitro pour cibler les expériences les plus pertinentes à développer chez la souris pour la validation in vivo. Les deux procédures principales visent à analyser et caractériser les fonctions d’Hira, Pax3 et Pax7 au cours de la régénération musculaire. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après la procédure d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux qui peuvent présenter une mobilité réduite pendant cette période. Notre étude fera appel à un maximum de 400 souris au total reparties sur 2 procédures expérimentales.
Bénéfices attendus
Il a été récemment montré que l’absence de la protéine Hira dans les cellules souches musculaires adultes (cellules progénitrices, caractérisées par expression du gène Pax7) a pour conséquence une inhibition de la régénération musculaire. De plus, il a été démontré que Hira est un facteur clé pour garder l’identité myogénique des cellules satellites pendant la régénération du muscle. Ce projet permettra de comprendre si cette cascade régulatrice est spécifique des cellules satellites ou bien à un rôle général dans le maintien de l’identité cellulaire d’autres types cellulaires composant du muscle squelettique nous proposons de développer ce projet.
Procédures
Pour la procédure 1, 240 de la totalité des animaux (400) seront soumis au gavage de tamoxifène 2 fois avec un intervalle d’une semaine. Le geste de gavage ne prend que quelques secondes. Pour la procédure 2, 300 de la totalité des animaux (400) seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%, maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux). Les 100 autres animaux seront analysés en homéostasie, donc non-soumis à des injections.
Impact sur les animaux
Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte des génotypes utilisés, du traitement de tamoxifène par gavage ou de la lésion musculaires. Les animaux des differents génotypes sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. Donc, à ce jour, nous ne nous attendons pas à un phénotype associé à ces procédures.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire pour prélèvement des tissues nécessaires à l’analyse.
Remplacement
Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Par conséquence, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des tests préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.
Réduction
Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 10 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.
Raffinement
Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 8 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude qui presente l’allèle CreErt2. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de la régénération musculaire.
Etude par imagerie d’un marqueur de neuroinflammation dans un modèle de trisomie 21 chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Souris transgéniques modèles de trisomie 21 et témoins, elles reçoivent un cathéter dans la veine caudale sous anesthésie puis une heure d'imagerie TEP avec traceur radioactif, avant d'être tuées 48 heures plus tard pour prélever le cerveau. Le porteur cherche à valider cette méthode d'imagerie de la neuroinflammation dans ce modèle. Il affirme qu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier et qu'aucune méthode alternative ne peut s'y substituer.
Objectifs
L'objectif est de développer une nouvelle stratégie thérapeutique pour la trisomie 21 basée sur des nouveaux composés capables d'agir sur l'inflammation du cerveau. Dans une 1ère étape, les propriétés anti-inflammatoires de ces nouveaux composés ont été évaluées par différents tests in vitro, permettant de sélectionner les plus performants. A ce stade, les études alternatives (in-silico/ in-vitro/ex-vivo) ne permettent plus de répondre à l'objectif puisqu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier (barrière hématoencéphalique, environnemement vasculaire métabolisme hépatique etc) mimant la maladie. Les composés sélectionnés ont été évalués chez l'animal afin de confirmer (ou non) leurs effets bénéfiques ainsi que le schéma expérimental optimal (dose, administration, etc) par l'un des partenaires du projet, dans un modèle animal de trisomie 21 (souris transgénique). Les modalités mises au point précédemment seront utilisées dans le même modèle animal dans notre laboratoire. Nous disposons d'une méthode d'imagerie in vivo chez l'animal qui permet de quantifier l'inflammation cérébrale à l'aide d'un traceur radioactif utilisé dans différents modèles animaux ainsi que chez l'humain. Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro car l’objectif final est d’utiliser ces mêmes traceurs en imagerie clinique. Dans la demande présente, nous souhaitons valider la méthode d'imagerie que nous avons prévue dans ce modèle animal de trisomie 21, ce qui n'a jamais été réalisé jusqu'à présent. C'est pourquoi notre demande porte sur l'exploration par imagerie d'un groupe d'animaux transgéniques ("Tg", porteur de la trisomie 21) comparé à un groupe de souris témoins ("wildtype",WT, non porteur de la trisomie 21), afin de vérifier que notre méthode permet bien de mesurer l'inflammation cérébrale des animaux "trisomie 21". Cette étape permettra d'évoluer vers un protocole de traitement avec les composés sélectionnés, protocole pour lequel nous ferons une nouvelle demande d'autorisation. Cette neuroinflammation sera explorée par imagerie in vivo en TEP (tomographie par emission de positons), avec une méthode parfaitement maîtrisée au laboratoire.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats du présent projet permettront d’établir le schéma expérimental qui sera utilisé dans la suite du programme ANR : dose de traitement(s), durée, délai entre traitement et imagerie. A plus long terme, le bénéfice attendu est de progresser dans la mise eu point d’un nouveau traitement pour la trisomie 21.
Procédures
Cette procédure durera environ 1h10, elle sera réalisée une seule fois sur l’animal sous anesthésie générale. Les animaux seront soumis à la mise en place d’un cathéter à la veine caudale sous anesthésie générale, la durée est de 10 min. Les souris seront ensuite imagées pendant 60 min. Pour la mise au point du geste technique, l'expérimentateur aura 3 essais pour la veine caudale de l'animal . La souris sera anesthésiée, , une crème anesthésiante sera appliquée sur la queue de l'animal avant le geste technique. La durée du geste sera d'une durée max de 15 min.
Impact sur les animaux
Le stress est minimisé par l’implication d’un personnel qualifié pour l’expérimentation animale. Les souris sont facilement stréssées, la contention nécessaire à l’induction de l’anesthésie rajoute une source de stress supplémentaire. Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à être sortis de leur cage et à être manipulés en préhension. Les nuisances ou effets indésirables de la procédure 1 peuvent-être des hématomes suite à la l'introduction du cathéter dans la veine de la queue et un stress suite à la préhension et les bruits ambiants de la salle d'expérimentation. Les animaux seront habitués pendant la phase d'acclimation à la salle de l'imageur. Durant l'expérimentation la respiration, la température et le poids seront mesurés. Les souris seront observées deux fois par jour par la personne en charge de l’étude.
Devenir
A l'issue de la procédure, les animaux sont réveillés et surveillés. A la suite de la décroissance radioactive (48h ), les souris seront mis à mort. En effet, il est indispensable de prélever les cerveaux 48h après l'imagerie afin de confirmer les résultats obtenus en imagerie avec des mesures ex-vivo ( immunohistochimie et autoradiographie).
Remplacement
A ce jour aucune expérience de ce type n'a été réalisée dans l'espèce humaine. Ce type d’étude ne peut être substitué par une méthode alternative in vitro ou sur cellules. Le recours à l'expérimentation animale est donc nécessaire, et cela d'autant plus que les études alternatives (in-silico/ in-vitro/ex-vivo) ne permettent plus de répondre à l'objectif puisqu'il est indispensable de tester les composés dans un organisme vivant entier (barrière hématoencéphalique, environnemement vasculaire métabolisme hépatique etc) mimant la maladie de la trisomie 21.
Réduction
L’utilisation de méthode d’imagerie au cours de ce protocole va permettre de réduire le nombre d’animaux utilisé qui est néanmmoins dicté par les groupes expérimentaux réquis pour l’obtention de résultats permettant de répondre à la question scientifique posée (degré de neuroinflammation). De plus, les animaux pourront être suivis par imagerie de manière longitudinale dans les prochaines étapes du projet, afin d’évaluer au mieux les nouveaux traitements en utilisant un nombre réduit d’individu.
Raffinement
Après la phase d’acclimatation, les animaux seront habitués à la salle d’expérimention pour diminuer leur stress. Ils seront hébergés en groupe avec présence d’enrichissement (bâton à ronger, papier absorbant, maison ou tube en plastique). Les souris seront observées une à 2 fois par jour. Toutes les stratégies d'analgésie, d'anesthésie et de soin seront mises en oeuvre pour réduire au maximum tout inconfort qui pourrait être induit par le modèle. Les animaux seront anesthésiés à 4% dans une cuve d’induction. Lors de l’imagerie les animaux seront maintenus à 2%. Une protection occulaire sera apliquée lors de l’installation du cathéter à la veine caudale. Nous appliquerons également une crème anesthésiante sur la queue de l’animal. L’animal sera maintenu durant toute l’expérimentation sur un tapis chauffant. Nous assurerons une surveillance accrue du rythme respiratoire et de la température corporelle de l’animal. En cas de detresse respiratoire, l'anesthesie est arrêtée et l'animal réveillé. Si l'animal est en hypothermie, nous procéderons à une augmentation de la température du lit thermorégulé de l'imageur. Si malgré ces actions, l'état général de l'animal ne s'améliore pas, nous arrêterons l'expérimentation.
Choix des espèces
La souris Tg Dp1Yey est actuellement le meilleur modèle animal de trisomie 21. De plus, la taille du cerveau de la souris est compatible avec la sensibilité et la résolution spatiale de la caméra microTEP (environ 1 mm). Adulte afin d'avoir une taille de cerveau compatible avec la technique d'imagerie utilisée dans ce protocole.