Souris

256 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine porte, pour certaines couplée à la suppression d'une voie nerveuse spinale, puis une perfusion de solution sucrée sur 24 heures, avant la mise à mort pour analyse du cerveau. Le porteur reconnaît des risques d'hémorragie et de troubles de la motilité intestinale liés à la chirurgie. Il étudie comment l'intestin signale le glucose au cerveau et affirme que ces dialogues entre organes ne peuvent s'étudier sur cellules ou organoïdes.

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La dérégulation de la glycémie, notamment chez des personnes diabétiques ou obèses, est un problème majeur de santé publique nécessitant une recherche constante quant aux thérapies proposées. Les études précédentes ont mis en évidence que la production de glucose (sucre) par l’intestin exerce des effets bénéfiques sur l’équilibre glucidique et énergétique. En effet, le glucose sécrété dans la veine porte (localisée à la sortie de l’intestin) induit un signal nerveux - appelé signal « glucose-portal » - qui cible les régions du cerveau du contrôle de la prise alimentaire et de la dépense énergétique. Différents circuits nerveux entourent la veine porte et permettent la détection des informations nutritionnelles et leur transmission au cerveau. La détection du glucose dans la veine porte pourrait impliquer les nerfs qui utilisent le transmetteur CGRP (Calcitonin gene related protein). Une partie de ces nerfs passe par une chaine ganglionnaires qui longe la colonne vertébrale pour apporter les informations au cerveau (voie nerveuse spinale). Les objectifs de ce projet sont de déterminer comment la détection du glucose est réalisée dans la veine porte et quelle est la voie nerveuse impliquée. Plus précisément, l’objectif de ce projet est de déterminer : 1/ Le rôle du neurotransmetteur CGRP dans la transmission du signal depuis la veine porte jusqu’au cerveau 2/ L’implication de la voie nerveuse spinale dans cette transmission Pour cela, nous étudierons si une augmentation de glucose dans la veine porte chez des souris transgéniques invalidées pour le neurotransmetteur CGRP, ou chez des souris non transgéniques dont la voie nerveuse spinale est altérée, active les zones du cerveau connues pour réguler la prise alimentaire ou l’équilibre de la glycémie.

Bénéfices attendus

Les mécanismes moléculaires par lesquels la production intestinale de glucose exerce ses effets bénéfiques sur l’obésité, le contrôle glycémique et l’accumulation de graisses dans le foie ne sont pas connus. Les résultats issus de ce projet nous permettrons d’identifier comment le glucose est détecté dans la veine porte et comment le cerveau reçoit et intègre informations nutritionnelles envoyées par l’intestin. Ce projet nous permettra d’identifier comment la production intestinale de glucose active le cerveau. Trouver des agents agissant sur ces mécanismes pourrait représenter une cible thérapeutique intéressante pour lutter contre l’obésité et ses complications.

Procédures

- A l’âge de 12 semaines, 32 souris recevront un régime enrichi en protéines et seront mise à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, 64 souris subiront une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte sous anesthésie et analgésie. Après une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris recevra une perfusion de solution sucrée et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde. - A l’âge de 12 semaines, un groupe de 32 souris subira une chirurgie sous anesthésie et analgésie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une suppression de la voie nerveuse spinale. Un autre groupe de 32 souris subira une chirurgie permettant la pose d’un cathéter dans la veine porte et une intervention semblable mais qui ne touche pas la voie nerveuse spinale. Après au moins une semaine de soins post-opératoires, la moitié des souris de chaque groupe recevra une perfusion de solution sucré et l'autre une perfusion de solution physiologique pendant 24 heures, à l'état vigile. Puis les souris seront mises à mort après analgésie et anesthésie profonde.

Impact sur les animaux

Il est possible de rencontrer des difficultés lors de la pose des cathéters en veine porte. Les souris subissant cette chirurgie pourront présenter une détérioration du vaisseau ou l’apparition d’une hémorragie. La suppression d'une partie de la voie spinale peut conduire à une altération de la motilité intestinale et des sécrétions et provoquer plus de défécation.

Devenir

A l’issue de chacune des procédures, les animaux seront mis à mort dans le but de mesurer l’expression des transporteurs de glucose dans la veine porte en utilisant plusieurs techniques d’imagerie et de quantification. Pour déterminer comment les informations nutritionnelles issues de la veine porte activent le cerveau, l’activation du cerveau sera mesurée par des marquages spécifiques sur des coupes histologiques de cerveaux fixés, obtenus après mis à mort d’animaux profondément anesthésiés.

Remplacement

Le glucose produit par l’intestin est détecté par des senseurs de glucose dans le circuit sanguin situé entre l'intestin et le foie (veine porte). Cette détection va être transmise par un signal nerveux de la veine porte vers le cerveau. En réponse, le cerveau va émettre des signaux nerveux vers la périphérie pour contrôler l'équilibre énergétique. La production de glucose par l'intestin et la détection du glucose dans la veine porte ont donc des impacts sur l’ensemble du métabolisme et impliquent des dialogues entre organes. Pour comprendre comment ces fonctions régulent l'organisme, les étude ne peuvent donc pas être réalisées sur cellules ou organoïdes. Pour comprendre précisément le rôle du signal nerveux entre intestin et cerveau, les études seront réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant un neurotransmetteur.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des modèles animaux et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept, soit au maximum 16 souris par groupe. Ce nombre a été établi sur différents paramètres prenant en compte les seuils de détection des techniques utilisées, l’analyse statistique et la variabilité entre individus Au total, ce projet nécessitera au maximum 256 souris mâles transgéniques et contrôles.

Raffinement

Les souris contrôles C57BL6J seront commandées à l’âge de 5 semaines et auront ainsi une longue période d’acclimatation avant le début des procédures à l’âge de 12 semaines. Pendant cette phase d’acclimatation, des pesées hebdomadaires seront réalisés et les animaux seront observés et manipulés quotidiennement. L’implantation du cathéter dans la veine porte pour la perfusion de glucose sera réalisée sous anesthésie gazeuse avec un traitement analgésique et antalgique adapté pendant plusieurs jours afin de limiter la souffrance, la douleur et le stress de l’animal pendant et après cette chirurgie. Les animaux seront observés et pesés régulièrement. L’apport de nourriture et d’eau sera particulièrement suivi et adapté pour palier à un excès éventuel de défécation, qui pourrait être induit par la suppression du système nerveux spinal. Des signes de maladie, de perte de poids, de souffrance, de lésions ou de détérioration de l’état de santé général constituent des points limites au-delà desquels, si aucun moyen de prévention/correction de la douleur n’a été efficace, les souris sont mises à mort.

Choix des espèces

Le rôle de l’intestin, organe capable de produire du sucre entre deux repas ou lors de jeûne, sur le métabolisme glucidique et énergétique a été étudié chez les rongeurs. Les études réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que les mammifères. Ces études sont réalisées afin de fournir des bases fondamentales à la recherche clinique humaine et la souris est un modèle dont les systèmes de régulation sont semblables à l’Homme. Deplus, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles (anticorps, kit biochimiques…). Les animaux seront tous utilisés à l’âge adulte, entre 12 et 15 semaines. A cet âge, les individus présentent un meilleur rétablissement post-chirurgical.

48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un télétransmetteur implanté sous la peau, sont isolées en cage individuelle trois semaines pour l'enregistrement de l'électrocardiogramme, puis subissent une exploration électrophysiologique par voie transœsophagienne sous anesthésie avant d'être tuées sans réveil, pour étudier les effets de la suralimentation postnatale sur le cœur. Le porteur classe l'isolement en cage individuelle comme une atteinte modérée. Il affirme que ce projet, reposant sur des échanges entre plusieurs organes, doit être conduit sur un animal entier.

Objectifs

Les maladies liées au surpoids sont en constante augmentation non seulement dans nos sociétés occidentales mais aussi dans les pays émergeants. Ces pathologies associent des désordres cardiovasculaires (hypertension artérielle, athérosclérose, coronaropathies, néphropathies) à des anomalies métaboliques majeures (dyslipidémies, diabète). Leurs origines, plurifactorielles, sont bien entendu à rechercher dans une inadaptation de notre patrimoine génétique aux modifications profondes de l’alimentation et du niveau d’activité physique, liées aux changements de nos sociétés. Des travaux récents tendent à montrer que des altérations précoces de l’environnement, notamment nutritionnel, pourraient infléchir durablement l’orientation pondérale, métabolique et cardiovasculaire des individus et participer à l'augmentation du risque cardiovasculaire observée dans les pays développés. Préciser et comprendre les mécanismes responsables de la survenue de ces altérations cardiovasculaires et métaboliques induites par des modifications précoces de l’alimentation, et mieux comprendre l’origine de cette plus grande susceptibilité du cœur à ces situations pathologiques permettraient d'améliorer les actions de prévention et même de prise en charge de ces pathologies.

Bénéfices attendus

Ce projet a pour but une meilleure connaissance des conséquences cardiaques des modifications précoces de prise alimentaire et d'éventuelles altérations des interactions neuro-cardiaques issues de ces troubles alimentaires. Les laboratoires impliqués dans ce projet procéderont ultérieurement en fonction de leurs résultats à l'identification de cibles thérapeutiques potentielles et tenteront une stratégie de traitement (prévention des altérations neuro-cardiaques).

Procédures

L'ensemble des animaux sera soumis à 2 interventions successives : l'implantation de télétransmetteurs en position sous-cutané pour mesurer l'électrocardiogramme, puis l'exploration électrophysiologique transoesophagienne pour tester la vulnérabilité du coeur à faire des arythmies cardiaques. L'ensemble des expérimentations est réalisé sous anesthésie générale. Les animaux seront équipés du dispositifs de mesure de l'électrocardiogramme pendant 3 semaines, durée de leur mise en cage unique.

Impact sur les animaux

La caractérisation fonctionnelle des animaux repose d'une part sur l'enregistrement de l'électrocardiogramme par système holter implanté. Ces animaux implantés devront être isolés en cage unique pour des raisons techniques et de bien-être afin d'éviter les blessures entre animaux. L'implantation du holter en sous cutanée est bien maitrisée et aucune nuisance supérieure à une sévérité légère n'est attendue par l'acte chirurgical (implantation sous-cutanée necessitant seulement 3 petites incisions de la peau). L'isolement sera pris en compte pour le suivi journalier de l'animal et est classé comme sévérité modérée. L'exploration électrophysiologique trans-oesophagienne a été choisie car elle est réalisée sous anesthésie générale de l'animal et ne nécessite pas de chirurgie, à l'inverse de l'exploration intracardiaque et, n'induit pas de lésion ni de douleur. L'animal ne se révveille pas suite à cette expérimentation.

Devenir

Après avoir effectué l'enregistrement ECG par télémétrie, puis effectuer l'exploration électrophysiologique trans-oesophagienne, les animaux seront mis à mort sous anesthésie gazeuse (sans réveil).

Remplacement

Ce projet de recherche, qui repose sur des interactions entre différents organes (tissu adipeux, cerveau, foie, cœur et vaisseaux) ne peut pas être approché par des techniques reposant sur la culture cellulaire et les modèles in silico. Il nécessite d’être conduit sur un animal entier, de sa naissance à sa maturité.

Réduction

N’existant pas de méthode substitutive qui puisse éviter de recourir à l’usage d’animaux, cette étude sera réalisée en accord avec le principe des 3R avec notamment le but de réduire le nombre d’animaux (utilisation d'un même animal pour plusieurs mesures). Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, transoesophagien), compatibles entre elles permettant de réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'informations sur chaque animal. Au niveau statistique, le nombre d’animaux a été déterminé par le logiciel G*Power avec un risque Alpha de 0.05 et une puissance de 0.95 ( avec une différence absolue attendue de 20 à 30% entre les groupes). Les résultats seront comparés entre les souris des 2 groupes (alimentation normale / suralimentation) par un test de comparaison de pourcentages et tests de comparaison de moyennes. Un nombre de 24 animaux maximum par groupe sera utilisé, soit 48 animaux au total.

Raffinement

L'ensemble de la procédure d'implantation du capteur de télémétrie sera réalisé sous anesthésie générale gazeuse. L'animal est monitoré jusqu’à son réveil complet puis placé dans une couveuse en cage unique pour récupérer. Le jour de la procédure, des visites régulières sont effectuées. Des soins per- et postopératoires appropriés serontégalement réalisés: analgésie locale puis injection d'analgésique avant le réveil pour prévenir la douleur. Une injection d'analgésique sera effectuée si un signe de douleur persiste dans les 2 jours suivant l’implantation. Une grille d'évaluation clinique de l'animal permettra son suivi et le respect des points limites. Les animaux seront hébergés en présence d'outils de raffinement (nid en cellulose et carré de cellulose).

Choix des espèces

Notre équipe de recherche a une longue expérience de projets expérimentaux conduits chez la souris. Nos appareils de mesure sont adaptés à la souris. La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. Les animaux que nous utiliserons auront un âge de 6 mois, stade d'âge avancé, où la suralimentation devrait générer des troubles fonctionnels cardiaques.

100 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris normales ou myopathes, elles subissent une blessure musculaire aiguë et des injections sous-cutanées, intrapéritonéales puis intramusculaires, avant le prélèvement du tissu musculaire. Le porteur reconnaît que le cumul des actes induit un stress et une douleur transitoire. Il indique tester in vivo une molécule anti-inflammatoire déjà jugée bénéfique in vitro, censée à terme accélérer la régénération du muscle.

Objectifs

Le muscle squelettique peut se réparer complètement après une blessure grâce au processus de régénération musculaire. Ce processus, habituellement efficace, peut être compromis dans certaines conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies). Les mécanismes cellulaires qui contrôlent la régénération musculaire sont bien connus, mais les effecteurs moléculaires sont encore peu nombreux à avoir été identifiés. Des travaux précédents ont montré qu'une molécule joue un rôle important au cours de la régénération musculaire en contrôlant les cellules de l'immunité (en stimulant les cellules souches musculaires qui permettent la régénération des fibres musculaires). Ces résultats ont été montrés grâce à une stratégie d'inhibition. L'objectif de l'étude est de réaliser une approche gain de fonction, en ajoutant la molécule dans le muscle au cours de la régénération musculaire. Le projet se base sur des travaux in vitro montrant un rôle bénéfique de la molécule. Le projet prévoit l'utilisation de souris normales qui subissent une blessure musculaire aigue, et des souris myopathes, qui présentent une régénération musculaire permanente. A terme, l'utilisation de cette molécule pourrait être envisagée pour un traitement permettant d'accélérer le processus de régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Le processus de régénération musculaire, bien qu'habituellement très efficace, peut être ralenti ou empêché dans différentes conditions (maladies métaboliques, vieillissement, myopathies, etc). La connaissance des déterminants moléculaires du processus de régénération pourrait ouvrir des voies thérapeutiques afin d'aider ce processus en cas de défaillance. L'ajout de la molécule pourrait être bénéfique pour le muscle. Le projet vise à valider cette hypothèse in vivo, après que des expériences in vitro ont montré son bénéfice.

Procédures

Les souris subiront des injections de faible volume en sous cutanée (1 maximum) ; en intraperitoneal (5 au maximum), puis 3 semaines plus tard, des injections intramusculaires (4 au maximum). La durée de ces injections est d'environ 10 secondes (contention totale 30 secondes).

Impact sur les animaux

Des nuisances et effets indésirables "modérés" sont attendus du fait d’un cumul d’actes (injections ip, injections im, anesthésies, blessure musculaire), qui induisent du stress et une douleur transitoire. Les données de la littérature ne rapportent pas d’effets indésirables des différentes substances injectées.

Devenir

Les animaux sont mis à mort en vue de de récupérer le tissu musculaire pour des analyses histologiques et cellulaires.

Remplacement

Cette étude arrive à la fin d'une série d'analyses qui a montré in vitro les effets bénéfiques de la molécule anti-inflammatoire sur les cellules de l'inflammation et des vaisseaux. L'analyse finale nécessite de valider le rôle bénéfique de cette molécule au sein de l'organe, et de l'organisme entier, donc in vivo, de façon intégrée.

Réduction

L'expérience du laboratoire permet de réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés pour les analyses. Le nombre de souris est diminué par deux car les deux pattes des animaux sont utilisées. Les analyses sont réalisées de manière séquentielle, sur des petits groupes d'animaux, ce qui permet d'ajuster les points d’étude et de réduire potentiellement le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Après chaque injection intramusculaire, les animaux font l'objet d'une surveillance accrue le jour même et le lendemain, afin de vérifier l'absence d'évènement indésirable au site d'injection, et plus généralement sur le comportement de l'animal. Un traitement antalgique est administré après induction de la lésion musculaire. Des points limites définis permettent d’éviter toute souffrance chez les animaux

Choix des espèces

Des travaux précédents ont montré que les processus mis en œuvre au cours de la régénération musculaire chez la souris sont proches de ceux observés chez l'homme . Les animaux sont utilisés entre 10 et 12 semaines, à l'âge adulte.

432 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent une greffe de tumeur de lymphome humain sous la peau, puis jusqu'à trois injections de composés sur animal vigile, la pousse tumorale étant surveillée jusqu'à un point limite. Le porteur teste une molécule immunostimulante déjà évaluée dans ce modèle et vise un futur essai clinique. Il affirme que la sensibilité des cellules tumorales dépend du microenvironnement et qu'il faut donc travailler sur un organisme entier.

Objectifs

Ce projet vise à étudier et quantifier l’efficacité antitumorale d'une molécule seule ou formulée avec des molécules encapsulées (qui rends la molécule moins toxique) sur un modèle humain de tumeur. Que ce soit la molécule ou la molécule encapsulée, les deux sont conçues stérilement et développées spécifiquement pour être compatible avec une injection intraveineuse. Cette molécule "prototype" seule ou encapsulée a déjà été évalué dans ce même modèle humain de tumeur. Dans les deux cas il a été observé une très bonne tolérance et des très bonnes réponses anti-tumorales. Afin d'évaluer la molécule dans des essais cliniques et pour répondre aux contraintes de la production à grande échelle, la molécule seule et la molécule encapsulée ont été optimisées. C'est pourquoi la Dose Maximale Tolérée (DMT) de la molécule industrielle doit être déterminée et son efficacité antitumorale doit être confirmée.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus concernent la santé humaine, à moyen terme. Ce projet permettra de tester l’efficacité antitumorale d’une molécule immunostimulante. Le projet va permettre de développer en phase préclinique des molécules et des combinaisons qui permettront au mieux de guérir les patients atteints de ces cancers, au pire de ralentir la progression tumorale.

Procédures

- Implantation de tumeur en sous-cutané sur animal vigile (une fois au début de l'expérimentation, degré de gravité léger, quelques minutes) - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite (lorsqu'il n'y a pas de réponse au traitement, la pousse tumorale prend une vingtaine de jours) - injection intraveineuse ou intrapéritonéale de composés thérapeutiques non toxiques (degré de gravité léger, quelques minutes), pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Impact sur les animaux

- Perte de poids >10% non améliorée par ajout de nourriture humidifiée dans le fond de la cage en maximum 24h (peu probable) - Perte de poids >20% (très peu probable qui conduirait à la mise à mort de l’animal) - Injection de cellules tumorales en sous cutané : quelques minutes - Pousse tumorale : gêne si le volume tumoral au site d’injection atteint le point limite. Il n’y a pas de métastase attendue avec ce modèle tumoral. - Injection dans la veine caudale sur animal vigile sous contention de composés thérapeutiques: douleur caudale si inflammation du point d’injection (très peu probable), 2 heures maximum, pour un maximum de 3 injections espacées de 7 jours.

Devenir

Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai.

Remplacement

Avant le passage chez l’animal, l’efficacité de notre molécule et de notre formulation a déjà été validée sur un modèle in vitro utilisé au laboratoire. En effet, nous avons déjà pré-validé notre molécule et notre formulation liposomale en in vitro par toutes les techniques pertinentes pour l'étude de nos produits. Nous devons passer maintenant à l'in vivo pour évaluer son effet sur un organisme entier. En effet, la sensibilité des cellules tumorales aux traitements anticancéreux dépend fortement du microenvironnement. Par ailleurs plusieurs paramètres impactant sur l’élimination, le métabolisme et la diffusion du médicament dans la tumeur nécessite de travailler sur un organisme entier. Pour toutes ces raisons nous devons effectuer les études d’efficacité sur la souris.

Réduction

Les procédures seront réalisées sur le nombre minimal d’animaux nécessaires pour permettre de conclure de façon statistiquement fiable. Les résultats seront évalués pour déterminer la nécessité de poursuivre les expériences et la stratégie à adopter, afin de réduire au autant que possible le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

vant toute manipulation les animaux bénéficieront d’une période d’acclimatation et d’habituation au(x) manipulateur(s) pendant 7 jours. Après la période d’acclimatation et avant le début des procédures nous habituerons les animaux à la manipulation en les pesant et en prenant la température corporelle par voie rectale (avec une sonde enveloppée avec un gel anesthésiant) une fois par jour pendant 5 jours. les souris seront observées quotidiennement 5 jours sur 7 . les expérimentateurs ont une très bonne expérience et détectent très rapidement le moindre signe de douleur afin d'appliquer les meilleurs mesures. Leur état général sera aussi suivi et annoter dans le cadre de l’expérimentation. Pour les deux procédures, tous les animaux seront mis à mort 100 jours après le début de la procédure si aucun point limite n’a été atteint avant ce délai. Les animaux feront l’objet d’un suivi très soutenu le jour J de l’injection, puis toutes les 24h jusqu’à 72h par les expérimentateurs. Par ailleurs, le personnel animalier inspecte quotidiennement les animaux et renseigne une grille de suivi basée sur des critères comportementaux (activité, isolement ...), physiques (poils hérissés, dos vouté …) qui permettent de détecter rapidement une souffrance ou l’atteinte d’un point limite.

Choix des espèces

Nous souhaitons évaluer nos traitements anticancéreux in vivo, grâce à l’utilisation d’une lignée cellulaire tumorales d'origine humaine (implantées chez la souris), avec des traitements utilisés en clinique humaine. L'utilisation d'une souche murine fortement immunodéprimée est donc nécessaire pour éviter les phénomènes de rejet des cellules ou des tissus implantés et favoriser la prise des greffes. En effet la souris immunodéprimée est un modèle reconnu pour l’implantation de xénogreffes. Notre équipe a une forte expérience de l’utilisation de souris immunodéprimées pour l’étude d'implantation de cellules humaines. Les autres modèles de mammifères immunodéprimés sont peu nombreux (rats) et il est préférable d’avoir recours aux modèles murins. Les animaux seront utilisés à l’âge de 5 à 6 semaines afin de favoriser a prise tumorale.

2 240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris immunodéprimées, elles reçoivent des greffes de tumeurs d'ostéosarcome puis des traitements par voie orale deux à quatre fois par semaine pendant trois à dix semaines, en portant sous la peau des tumeurs pouvant donner des métastases. Le porteur décrit une molécule première de sa classe censée vaincre la résistance aux chimiothérapies, les bénéfices pour les patients étant renvoyés aux essais cliniques à venir. Il affirme que les modèles cellulaires ne rendent pas la complexité de l'organisme et conclut au caractère indispensable du recours à l'animal.

Objectifs

L’objectif principal de ce projet est d’évaluer l’activité d'une molécule et d'évaluer spn efficacité anti- tumorale et de mieux comprendre les mécanismes ciblés par cette molécule, en vue de vaincre la résistance aux traitements et d’améliorer la réponse des patients à mauvais pronostics (ostéosarcome pédiatrique). Après nos résultats prometteurs obtenus avec la molécule seule et en association avec des chimiothérapies in vitro, nous évaluerons la sensibilité de cette molécule in vivo sur des modèles d’ostéosarcome (lignées cellulaires et des modèles dérivés de patients), administré seul et en combinaison avec les traitements standards qui devraient avoir une synergie avec la nouvelle molécule. Nous étudierons les mécanismes d’action de cette molécule et évaluerons leur application thérapeutique pour des ostéosarcomes de mauvais pronostic.

Bénéfices attendus

Ce projet apportera les éléments précliniques permettant d’évaluer l’effet thérapeutique d'une nouvelle molécule et de mieux comprendre les mécanismes liés à cette molécule. Cette molécule a le potentiel de vaincre la résistance des cancers à certaines chimiothérapies et est la première de sa classe à entrer en clinique prochainement. Le traitement pourra être utilisé dans des essais cliniques sur l’ostéosarcome pour améliorer la survie des patients de mauvais pronostic.

Procédures

Une procedure chirurgicale unique sera réalisée pour le développement des greffes de tissus de patients, avec une durée maximale de 5-10min par souris. Les souris seront soumises à des traitements par voie orale de 2 à 4 fois par semaine pendant 3 à 10 semaines (durée 1 minute). Un prélèvement de sang unique sera réalisé, sous anesthésie générale, pour les études fonctionnelles (durée: 5-10 minutes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables seront liés aux interventions (greffes, gavages) et à la présence de tumeurs sous la peau. Dans le cas des modèles d’ostéosarcome sous-cutané les animaux peuvent aussi potentiellement développer des métastases.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés afin d'étudier au mieux la réponse antitumorale mise en place après traitement par notre molécule.

Remplacement

Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d’appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents systèmes au sein de l’organisme (système vasculaire, osseux…), l’utilisation des modèles appliqués in vivo reste indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l’efficacité de la molécule XCE853 et son lien avec les mécanismes oncogéniques et métastatiques des cancers à mauvais pronostics mais également explorer et valider l'efficacité de thérapies susceptibles d’être utilisées chez les patients.

Réduction

Peu de modèles d’ostéosarcome sont décrits, ce qui montre la difficulté d'obtenir un modèle stable et représentatif de cette maladie. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, les doses seront calibrées par rapport à la littérature et sur nos résultats obtenus in vitro. Pour les modèles issus des patients, la quantité de tissu disponible est limitée donc, selon les évaluations sur les lignées cellulaires in vivo, les modèles PDX seront choisis afin de compléter les observations sur les lignées cellulaires in vivo. Considérant un taux d'échec de greffe de 50%, nous considérons donc un effectif de 30 animaux par groupe pour obtenir 15 animaux traités par groupe pour l’efficacité et un effectif de 20 animaux par groupe pour obtenir 10 animaux traités pour la pharmacodynamique.. Trois modèles cellulaires (2 lignées résistants au traitement actuel et la lignée parental) et 5 modèles PDX d'ostéosarcome, représentant l'hétérogénéité de la maladie seront utilisés et chaque modèle sera traité avec la molécule d'intérêt administrée seule et en combinaison avec des chimiothérapies utilisées dans le traitement de la maladie et supposées avoir une synergie avec la nouvelle molécule d’après nos études préliminaires. Afin de réduire le nombre d'animaux implantés, nous avons choisi de réaliser un suivi du développement tumoral longitudinal par imagerie. Dans notre étude, l’imagerie sera utilisée pour une analyse, de façon à confirmer la présence/croissance tumorale et le développement des métastases.

Raffinement

Les souris sont greffées et imagées sous anesthésie générale . Les animaux sont surveillés chaque jour après la chirurgie afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de détecter précocement un développement de la tumeur. Des points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués. De plus, si nous détections des signes de douleur, nous donnerions un antalgique ou morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d’une anesthésie locale . Les animaux sont stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement adapté à l'espèce sera systématiquement ajouté dans les cages. Un enrichissement supplémentaire pourra être ajouté si nécessaire.

Choix des espèces

La souris est le modèle le plus utilisé en oncologie notamment du fait de l'existence de souches immunodéprimées qui permettent le développement de tumeur d'origine humaine. D'après notre expérience, nous avons pu observer que l’ostéosarcome se développe mieux chez la souris immunodéficiente, aussi les métastases semblent se développer davantage chez ces souris, ce qui en fait un modèle de choix pour notre projet. Nous travaillons sur des cancers qui atteignent des individus entre l'enfance et l'adolescence. De ce fait, nous serons amenés à utiliser des jeunes animaux âgés de 4 semaines à 6 semaines afin de pouvoir mimer le stade de développement.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiées pour ne pas exprimer le récepteur CD36 sur la langue, elles subissent un régime obésogène, des mises à jeun répétées, des tests de préférence au gras, un gavage au glucose et des prélèvements de sang, avant le prélèvement des organes. Le porteur reconnaît que l'obésité induite entraîne un inconfort et de possibles complications. Le bénéfice annoncé se limite à décrire une nouvelle souche génétiquement modifiée servant de modèle pour de futures questions sur le goût du gras.

Objectifs

Des études récentes chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. Chaque bourgeon est constitué par un amas cellulaire constitué de 4 types cellulaires. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Il existe des récepteurs aux acides gras dont l’un est appelé CD36. Il est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Cette étude a pour but d’étudier le rôle spécifique de CD36 au niveau de la langue. Pour mener à bien les objectifs, nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant pas le récepteur CD36 au niveau de la langue.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle souche génétiquement modifiée, qui pourra donc servir de modèle animal pour de nouvelles questions sur CD36 et le « gout du gras ».

Procédures

L’ensemble des souris subira une mise sous régime (obésogène ou standard), une pesée hebdomadaire, une glycémie toutes les deux semaines (prélèvement d’une goutte de sang) (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute), et une individualisation ainsi qu’une mise à jeun hydrique 6h avant chaque test double choix (2 tests par semaines). Les souris seront individualisées pendant 5J pour réaliser des doubles choix. Les tests de préférence rapide au gras (mesure des lapements pendant 5 minutes) nécessiteront également une mise à jeun de 12h avant chaque test avec une pesée avant mise à jeun et après test permettant l’évaluation du poids des souris. Les souris seront soumises à un test nécessitant un gavage au glucose (contention de quelques secondes et gavage de 100 µL pour 10g de masse corporelle) et 5 prélèvements sanguins de faible volume (5 µL à chaque temps soit 25 µL au total) seront réalisés sous anesthésie locale. A la fin du régime, les organes seront prélevés, après mise à mort.

Impact sur les animaux

Cette étude à un impact sur les souris puisqu’on induit une obésité, ce qui implique un certain inconfort et de potentielles complications liées à l’obésité. De même, les animaux peuvent être sous stress, des suites de prélèvements répétés lors de la glycémie ou encore des suites d’individualisation pour les tests double-choix.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour réaliser des prélèvements d’organes.

Remplacement

L’obésité est une pathologie faisant intervenir une communication inter-organes in vivo qui se caractérise par des altérations du métabolisme des lipides, des glucides et du comportement alimentaire. Ces paramètres métaboliques et comportementaux ne peuvent s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de toute la partie expérimentation in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie et le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement. Pour le bien être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront isolées, un enrichissement supplémentaire sera apporté. De plus, les souris sont habituées à la contention pour les pesées hebdomadaires, et après la mise à mort des souris la collecte des tissus permet de construire une banque d’organes. Enfin, chaque geste technique est réalisé par les personnels qualifiés et entrainés ce qui diminue le stress.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix dans l’étude de l’obésité car c’est un modèle qui est assez documenté conduisant à l’apparition de syndrome métabolique comme chez l’homme. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 6 semaines chez la souris est relativement courte (entre 3 et 4 semaines), ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (Anticorps, kits de dosage etc …) contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et l’induction du KO étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Des souris mâles de 8 semaines seront mises sous régime obésogène.

292 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont hébergées seules et soumises à un régime gras et sucré pauvre en fibres pendant dix semaines, avec des gavages, des prises de sang et des collectes de fèces sur près de deux ans, pour étudier l'effet d'une rupture de la symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement et la descendance. Le porteur surveille la perte de poids pour qu'elle ne dépasse pas 20 %, seuil au-delà duquel les souris seraient mises à mort. Les retombées annoncées pour l'humain restent renvoyées à une compréhension future, et il affirme que le recours à l'animal s'impose faute de pouvoir modéliser cette dynamique.

Objectifs

Chaque année, 41 millions de personnes décèdent des conséquences de maladies chroniques, également appelées maladies non transmissibles (obésité, diabète, asthme, cancer, …), ce qui représente 71% des décès dans le monde. L’augmentation de l’incidence de ce type de maladie est entre autres associée à une mauvaise alimentation. Il apparait aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies chroniques. Ces dernières tendent à être de longue durée et résultent de l’association combinée de facteurs génétiques, physiologiques, comportementaux et environnementaux (Source : Organisation Mondiale de la Santé) dont l’environnement microbien. Le microbiote intestinal est l’ensemble des micro-organismes vivant au sein des intestins. Ces micro-organismes forment une association intime, durable et à bénéfice mutuel avec l’hôte que l’on qualifie de symbiose. Depuis plusieurs années, de nombreux travaux scientifiques ont décrit des déséquilibres dans la composition du microbiote intestinal de patients atteints de maladies chroniques. Cette altération de la symbiose microbiote-hôte est caractérisée par une modification de la composition du microbiote couplée à la perturbation du statut immuno-physiologique de l’hôte qui conduit à la mise en place d’états « pré-pathologiques » et/ou pathologiques. Cette symbiose altérée est associée à différentes maladies chroniques et a été décrite chez l’animal et l’humain. Elle se caractérise souvent par une diminution de la richesse du microbiote et de ses fonctionnalités. L’objectif de notre projet est d’évaluer la possibilité d’une rupture de la symbiose microbiote-hôte par l’utilisation d’un régime dit « occidental », riche en gras, en sucre et appauvri en fibre, qui chez l’animal induit une perméabilité intestinale et une inflammation intestinale et globale. Au travers de ce projet, nous souhaitons évaluer l’impact de la rupture de symbiose microbiote-hôte sur le vieillissement des animaux et sa transmission à la descendance. Les résultats obtenus au cours de ce projet serviront de base pour la compréhension du mécanisme chez l’homme et permettront d’indentifier des leviers permettant de retarder, prévenir et/ou traiter la rupture de la symbiose dans le cadre des maladies chroniques.

Bénéfices attendus

Les maladies chroniques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Diagnostiquées précocement au cours de la vie de l’individu, elles sont souvent de longue durée et en partie associées à une mauvaise alimentation. De nombreux travaux en lien avec un régime alimentaire déséquilibré témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal associée à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients la persistance d’un déséquilibre dans la symbiose microbiote-hôte conduit souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier de nouvelles solutions permettant leur dépistage et leur traitement. Notre projet amènera à une meilleure compréhension mécanistique de la rupture de symbiose microbiote-hôte en lien avec un régime alimentaire déséquilibré et permettra d’anticiper les effets de cette rupture sur le vieillissement et la descendance.

Procédures

Les animaux recevront un régime appauvri en fibre et riche en gras et en sucre d'une durée de 10 semaines susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids de manière modérée. Les animaux seront hébergés en cage individuelle tout au long de l'expérimentation excepté lors des périodes de reproduction et de sevrage. Les cages seront transparentes et sans couvercle filtrant afin de maintenir des contacts visuels, olfactifs et sonores entre congénères. Des prélèvements de sang (n=24) pendant 96 semaines seront effectués sur toute la durée de la procédure. Nous effecturons aussi des gavages (n=30) et prélèvements de fécès (n=150) tout au long de l’étude. La durée d'un prélèvement de sang est d'une trentaine de secondes de même que celle d'un gavage . Les fèces seront collectées lors de l’émission naturelle de manière quotidienne, hebdomadaire ou mensuelle en fonction des différentes périodes établies dans la procédure.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Il est attendu que les animaux réduisent de 5 à 10% leur ingéré alimentaire durant les 5-7 jours qui suivent l'exposition au régime. Le poids et l'ingéré de ces animaux sera surveillé hebdomadairement pour s'assurer que la perte de poids n'excède pas les 20% du poids initial. Les contentions, les prises de sang et le gavage des animaux avec des solutions neutres pour leur santé pratiqués par un expérimentateur confirmé constitueront un stress modéré et limités dans le temps (quelques secondes).

Devenir

L'ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de la procédure afin de récolter le sang et les tissus pour analyses.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale est justifié par l'impossibilité de modéliser la dynamique de la rupture de la symbiose microbiote-hôte.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux nous proposons d’étudier l’impact d’un régime nutritionnel de type occidental à la fois sur la longévité de l’animal et sa descendance. D’après les études antérieures menées au laboratoire, nous estimons que 168 animaux, pour le groupe expérimental et 124 animaux pour le groupe controle, sont nécessaires afin de mettre en évidence des différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un enrichissement avec du papier absorbant à déchiqueter et d'un abri en propylène rouge et auront accès à la nourriture et à l’eau ad libitum. Les animaux hébergés individuellement auront des contacts visuels, olfactifs et sonores. Pour détecter l’apparition de signes de souffrance et/ou blessures, les animaux seront surveillés quotidiennement. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et mis à mort. Le poids et la consommation alimentaire seront renseignés dans un tableau hebdomadairement. Nous définissons un point limite sur l’apparence des animaux et leur comportement.

Choix des espèces

Les animaux utilisés dans notre étude seront des souris C57Bl6. Ce modèle est largement utilisé pour les recherches sur les maladies métaboliques induites par des régimes riches en énergie en raison de ses réponses reproductibles. Les animaux seront âgés de 6 semaines, ce qui nous permettra de débuter le traitement nutritionnel inducteur à 8 semaines. Ceci correspond à l’âge moyen auquel les modèles sont utilisés dans la grande majorité des laboratoires. Cet âge constitue donc un point d’ancrage pour les comparaisons avec les données disponibles dans la littérature et nos expériences précédentes. Il est également admis qu’à cet âge le microbiote de ces animaux est mature et stable d’un point de vue fonctionnel et compositionnel.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris est anesthésiée et intubée pour recevoir dans les poumons une injection unique d'un composé induisant une inflammation de type BPCO. Le porteur indique une possible blessure de la trachée et des difficultés respiratoires liées au développement de l'emphysème. Il affirme qu'aucun modèle non animal ne reproduit la complexité de la maladie et de la circulation des cellules immunitaires, les applications thérapeutiques étant renvoyées au long terme.

Objectifs

La bronchopneumopathie chronique obstructive (BPCO) est une maladie chronique respiratoire. Chez les personnes atteintes, une inflammation des voies aériennes entraîne des perturbations dans le fonctionnement normal des poumons. Les alvéoles pulmonaires qui permettent les échanges gazeux lors de la respiration sont progressivement détruites, conduisant à un emphysème. On estime que la BPCO atteint 3,5 millions de personnes en France, soit 7,5% de la population. La maladie est plus fréquente chez les fumeurs, le tabac étant le principal facteur de risque. Les cellules du système immunitaire participent à la maladie et pourraient constituter une cible thérapeutiques intéressante. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle des cellules immunitaires dans la BPCO.

Bénéfices attendus

A court terme sur un plan fondamental, ce projet permettra de faire avancer les connaissances scientifiques concernant la circulation et la prolifération des cellules immunitaires. Sur un plan pathologique, ce projet pourra déterminer la contribution des cellules immunitaires dans la BPCO. A plus long terme, cela permettra de proposer des applications thérapeutiques ciblant les cellules immunitaires dans cette pathologie.

Procédures

La BPCO est induite chez les souris par une injection unique, directement dans les poumons, d'un composé provoquant une inflammation. Pour cela les souris sont anesthésiés (environ 20 minutes) et intubées le temps de l'injection (environ 5 minutes).

Impact sur les animaux

En de rares occasions, une blessure de la trachée pourra être observée . Le développement de l’emphysème pourrait s’accompagner de difficultés respiratoires.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issue de la procédure. En effet, l'analyse du système immunitaire nécessite la mise à mort pour le prélèvement et l'analyse des organes.

Remplacement

Une évaluation exhaustive de la bibliographie nous a confirmé qu'il n’existe pas de modèle non animal permettant de reproduire les mécanismes biologiques complexes à l’œuvre au cours de la BPCO et de la circulation des cellules immunitaires entre les organes. Notre projet nécessite donc l’utilisation d’un modèle animal.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons utilisé une analyse statistique a priori afin de limiter le nombre d’animaux au strict minimum.

Raffinement

La méthodologie utilisée a été optimisée dans le laboratoire afin de limiter l'utilisation des animaux. Les souris feront l’objet d’une surveillance rapprochée afin de détecter tout stress et souffrance et d'y pallier. Avant la procédure expérimentale, les souris seront anesthésiées afin d’éliminer la souffrance potentielle due à la procédure. De la naissance à la mort, les animaux seront hébergés dans des conditions optimales incluant un enrichissement.

Choix des espèces

Il n’existe aucun modèle n'utilisant pas les animaux capable de reproduire la complexité de la réponse immunitaire, le recours à l’animal est donc nécessaire. La souris est couramment considérée comme le modèle le plus proche de l'Homme pour l’étude du système immunitaire. L'utilisation de souris jeunes est indispensable puisque l’altération des poumons est un processus normal du vieillissement qui pourrait impacter sur les résultats.