Souris

288 souris immunodéficientes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des poumons, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans la trachée de la bléomycine puis des cellules bronchiques issues de patients, suivies de quatre à cinq injections et, pour certaines, de deux gavages par jour pendant treize à dix-sept jours. Le porteur indique que les instillations provoquent une gêne respiratoire, que la maladie induite peut aggraver la difficulté respiratoire en fin de protocole et que le gavage peut entraîner une inflammation de l'œsophage voire des saignements. Il conclut que l'étude ne peut se faire qu'in vivo car les réactions dépendent de l'"organisme entier" intact, l'usage clinique de l'anticorps étant renvoyé à un horizon de trois à cinq ans.

Objectifs

Ce projet est une étude pharmacologique visant à tester un anticorps thérapeutique dirigé contre une protéine humaine exprimée dans les poumons et pour le traitement de la fibrose pulmonaire dans un modèle de souris humanisées. La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) chez l'homme est caractérisée par une perte irréversible et progressive de la capacité pulmonaire due à un remodelage de l'arbre pulmonaire avec développement de tissus cicatriciels. Le pronostic de cette maladie est extrêmement limité avec une survie médiane de 2-3 ans. En dehors de la transplantation pulmonaire, aucune option thérapeutique convaincante n'est actuellement disponible. Seules certaines molécules permettent de ralentir la progression de la maladie. Le développement de médicaments pour cette maladie mortelle est donc essentiel. Dans cette maladie, la prolifération aberrante des certaines cellules appelées cellules basales bronchiques contribue au mécanisme pathologique central de la FPI. Ces cellules basales bronchiques humaines (cellules basales des voies aériennes ou cellules ABC) sont des cellules de l'arbre bronchique qui peuvent proliférer in vitro après avoir été prélevées par frottis. Des travaux préliminaires ont démontré qu’un modèle de souris humanisées de FPI peut être établi par administration de ces cellules ABC issues de patients atteints de FPI dans les poumons des souris. En revanche, l'administration de cellules ABC provenant de volontaires sains n'entraîne pas de maladie. À l'aide de ce modèle de souris humanisées de FPI, nous souhaitons tester l’efficacité d’un anticorps thérapeutique qui s’est déjà montré efficace pour le traitement d’autres pathologie du foie et des reins.

Bénéfices attendus

Ce projet permettrait développer une stratégie thérapeutique pour les patients qui souffrent de fibrose pulmonaire idiopathique. Cet anticorps est déjà en développement clinique pour le traitement de maladies du foie et des reins. Les résultats positifs de ce projet permettraient utilisation de cet anticorps chez les patients atteints de FPI à moyen terme (3 à 5 ans).

Procédures

Les animaux subiront le premier jour une instillation dans la trachée de bléomycine pour induire la maladie pulmonaire, et le 4ème jour de cellules bronchiques issus de patients. Cet acte est réalisé sous anesthésie générale gazeuse et dure environ 1 minute. Les animaux recevront ensuite 4 ou 5 injections sur une période de 13 à 17 jours. Ces injections sont faites sur animaux vigiles et prennent moins d’une minute à être réalisées. Certains animaux recevront un gavage oral 2 fois par jour pendant 13 à 17 jours. Le gavage oral est également réalisé en moins d’une minute et est réalisé sur animaux vigiles.

Impact sur les animaux

Les instillations dans la trachée vont engendrer une gêne respiratoire qui peut perdurer quelques heures (

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder au prélèvement des poumons.

Remplacement

Les processus réactionnels étudiés dans ce projet dépendent de l'organisme entier intact. Il s'agit d'une analyse structurelle et fonctionnelle de l'architecture pulmonaire, qui ne peut être étudiée dans son intégralité dans des cultures cellulaires. Il n’est donc pas possible de remplacer l’étude sur les animaux pour ce projet.

Réduction

Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux inclus dans cette étude, nous n’utiliserons que des groupes pertinents nous permettant de conclure quant à l’efficacité de notre approche. Le nombre d’animaux inclus par groupe sera suffisant pour arriver à une conclusion claire. La taille des effectifs a été déterminée à priori en se basant sur les résultats d’une expérience menée par des collaborateurs et en utilisant une approche statistique préalable. Les données obtenues grâce aux animaux de ce projet seront analysées avec des tests statistiques classiques paramétriques et/ou non paramétriques.

Raffinement

Afin de raffiner au mieux notre méthodologie, le protocole expérimental est planifié en amont, l’environnement des animaux est enrichi avec des tubes de coton pour la nidification et des briques de tremble à ronger, et des points limites précoces ont été établis afin d’interrompre de manière précoce les procédures permettant de soustraire les animaux à la souffrance si besoin. Une méthode anesthésique (isoflurane) est appliquée lors des procédures le nécessitant. Les animaux sont observés quotidiennement, et une observation scorée est réalisée 2 fois par semaine.

Choix des espèces

Le modèle de fibrose pulmonaire induite chez la souris est un des modèles les plus utilisé pour étudier cette maladie. Les souris utilisées sont immunodéficientes et ne rejettent pas les cellules humaines greffées. Ce modèle nous permet ainsi d’étudier le comportement de cellules pulmonaires (cellules basales des bronches ou cellules ABC) issues de patients atteints de maladie pulmonaire et de tester des approches thérapeutiques dans un contexte humain. Les animaux d’un âge adulte de 10-15 semaines seront utilisé, cette pathologie étant une maladie apparaissant à l’âge adulte, surtout chez les personnes de + de 50 ans.

1 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie du cerveau avec implantation de fibres optiques, puis un protocole de stress, soit un conditionnement de peur par chocs électriques, soit une limitation de litière chez le juvénile, avant des tests comportementaux d'anxiété dont le détail n'est pas précisé. Le porteur affirme que l'augmentation de l'anxiété est inhérente au "besoin" de la recherche et que la culture cellulaire ne permet pas de mesurer l'activité neuronale in vivo. Les retombées annoncées pour les patients anxieux sont renvoyées au long terme, l'objectif immédiat restant de cartographier des circuits neuronaux.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de mettre en évidence les altérations des circuits de neurones contrôlant les émotions dans des modèles de pathologie anxieuses chez la souris. Notre recherche ciblera l'identification d'altérations structurelles (anatomiques) ainsi que fonctionnelles (activité électrique). Ensuite nous utiliserons des techniques de manipulation de l'activité de circuits de neurones pour restaurer les altérations observées, avec l'objectif de restaurer des niveaux d'anxiété normaux.

Bénéfices attendus

A long terme, les connaissances générées par notre recherche permettront de pouvoir envisager des stratégies théropeutiques innovantes chez les patients atteints de troubles anxieux.

Procédures

Chirurgies: grâce à l'utilisation de coordonnées sur la boîte crânienne, des substances permettant de visualiser les cellules sont injectées dans le cerveau et des fibres de verre de moinsn d'un demi milimetre de diamètre sont ensuite implantées afin de visulaiser les cellules. Chaque souris subira une chirurgie, sous anesthésie totale, recevra des traitements analgésiques et son bien être sera surveillé quotidiennement. Les animaux subiront une procédure de stress parmi deux modèles [1] soit un conditionnement de peur chez l'adulte impliquant de légers chocs électriques, [2] soit une limitation de litière chez le juvénile. Enfin, les souris seront ensuite exposées à des tests comportementaux pour mesurer leur niveaux d'anxiété, ce qui n'induit pas de nuisances pour l'animal car ils sont habitués à la présence de l'expérimentateur/trice de façon quotidienne pendant une semaine en amont du test (handling). Les tests durent entre 5 et 20 minutes chacuns, et un seul test par jour est réalisé, sur une durée maximale de 10 jours.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables sont la douleur potentielle induite pas la chirurgie qui est traitée avec des analgésiques, et un niveau d'anxiété augmenté chez certains individus par les procédures de stress. Cette augmentation de l'anxiété est inhérente au besoin de la recherche de substrat biologiques des troubles anxieux dans des modèles pré-cliniques qui est l'objet de cette saisine (la souris dans notre étude).

Devenir

Nous devons réaliser des vérification histologiques sur tissu cérébral, donc euthanasier l'animal.

Remplacement

Le projet porte sur une analyse de la connectivité des neurones et de leurs propriétés de codage d’informations au cours du comportement. Par conséquent, cette procédure doit être effectuée chez des animaux vivants. Des méthodes telles que la culture cellulaire ne permettent pas la quantification des connexions neuronales ou de la mesure de l’activité en réponse à une simulation sensorielle in vivo.

Réduction

Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux afin d’obtenir une analyse fiable et complète de la connectivité et de l’activité de la région cérébrale d’étude et des circuits associés. Afin de limiter le nombre d'animaux, nous réalisons plusieurs test comportementaux pour chaque individus, ce qui réduits considérablement le nombre d'animaux nécessaires. Nous réalisons également toutes nos expérience sur les mâles et les femelles afin d'éviter l'euthanasie de masse inutile des femelles.

Raffinement

Avant la mise en place du modèle d’anxiété, les animaux seront hébergés en cages collectives, afin de limiter le stress dû à l’isolement. Les cages seront également enrichies de nids en coton. Une surveillance particulière sera adressée aux animaux en période péri-opératoire. L’acte chirurgical sera effectué dans des conditions de propreté maximales. Des antibiotiques et analgésiques seront administrés en cas d’infection ou de douleur. Une partie des animaux (100) subira aussi un stress plus léger que le conditionnement de peur, qui n'implique pas de chocs électriques afin d'améliorer le BEA. Ces 100 animaux seront soumis à un protocole de stress plus léger dès leur naissance, par une limitation de litière du jour 2 au jour 12 (souris non sevrées). A l'age adulte (environ 12 semaines) les souris seront alors testées dans des tests permettant d'évaluer leur niveau d'anxiété. Cette modification de procédure nous permet de tester un modèle de modélisation de l’anxiété plus éthologique et éthique car nous n’imposerons plus de de chocs électriques aux animaux.

Choix des espèces

Les souris sont un modèle largement utilisé pour l’étude des circuits impliqués dans la peur et les troubles anxieux. Dans des projets futurs, nous ferons appel à des souris transgéniques. Dans un souci de continuité et de rigueur scientifique dans nos études, nous avons besoin d'utiliser le même modèle. De plus, la majorité des études se font sur la souris. Il est donc là aussi nécessaire de travailler sur la souris, pouvoir comparer nos résultats avec les publications actuelles. Par ailleurs, la souris est génétiquement très bien définie, offrant ainsi un large panel de choix dans les méthodes utilisables, non au niveau du laboratoire, mais au niveau mondial. Les animaux seront utilisés au stade adule, soit à partir de 10 semaines, un âge qui correspond à la maturité des circuits neuronaux des aires cérébrales ciblées. De plus, les souris adultes sont plus résistantes et récupèrent plus rapidement après la chirurgie.

Des souris porteuses d'une mutation du récepteur de l'hormone thyroïdienne dans leurs neurones à parvalbumine, et leurs témoins, reçoivent une puce sous la peau, boivent une eau acidifiée pendant les 21 jours d'un test sur écran tactile, passent dans une arène de suivi automatisé (Live Mouse Tracker) et reçoivent un agent pro-convulsivant qui provoque des myoclonies et quelques crises cloniques et toniques. 36 souris vont être utilisées dans ces procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur présente pourtant l'implantation sous-cutanée de la puce comme "la seule intervention" prévue. Toutes sont tuées à l'issue, et leur cerveau est prélevé après une perfusion intracardiaque de fixateur sous anesthésie.

Objectifs

L’hormone thyroïdienne est essentielle pour le bon développement du cerveau chez les mammifères. Un défaut de celle-ci au cours du développement du cerveau induit des troubles neurologiques tels que retards mentaux, défauts de concentration, épilepsie, défauts de contrôle du mouvement. Les mécanismes par lesquels l’hormone thyroïdienne agit sur le cerveau sont mal compris. Il a été montré récemment qu'un récepteur de l’hormone thyroïdienne joue un rôle majeur, notamment dans les neurones dits inhibiteurs. Parmi ces neurones inhibiteurs, une sous-population particulièrement sensible a été identifiée : des neurones qui expriment une protéine appelée parvalbumine. Chez l’homme, des pathologies telles que l’autisme, l’épilepsie et la schizophrénie sont associés à un déficit de neurones à parvalbumine. De plus, chez la souris, l’invalidation du gène de la parvalbumine induit des altérations du comportement qui évoquent les troubles du spectre autistique. L’objectif de ce projet est d’évaluer si le blocage de l'hormone thyroïdienne uniquement dans les neurones à parvalbumine induit des modifications de comportement chez la souris. Nous faisons l’hypothèse que ces souris pourraient présenter des altérations modérées de leur comportement, potentiellement en lien avec les troubles autistiques.

Bénéfices attendus

L'étude du rôle de l’hormone thyroïdienne dans les neurones à parvalbumine permettra de mieux comprendre le développement du cerveau chez les mammifères. Plus précisément, les résultats de ce travail contribueront à mieux comprendre ce qui se passe chez les patients atteints de pathologies affectant cette hormone thyroïdienne. Plus largement, comme les neurones à parvalbumine jouent un rôle majeur de coordination de l’activité dans le cerveau, les résultats de cette étude devraient améliorer notre connaissance de l’origine de plusieurs maladies neurologiques, dont l’autisme.

Procédures

Une implantation sous-cutanée d'une puce constituera la seule intervention que subiront les animaux. Elle se fera sous anesthésie et avec une couverture antalgique durant une durée de 30 minutes maximum. Les animaux consommeront de l'eau acidifiée pendant le test Touch Screen (21 jours). Une injection d'un produit pro-convulsivant: durée moins d'une minute. Une injection de produits anesthésiques: durée moins d'une minute

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux subiront une implantation d'une puce, permettant l'identification par radiofréquence, en sous-cutanée sous anesthésie gazeuse. Lors des périodes d'analyse du test Live Mouse Tracker, ils seront simplement transférés dans une arène de 50 cm de côté qui disposera de sciure, boisson et aliment qu'ils pourront explorer. Pour le test du Touchscreen, l'eau des biberons des cages d'élevage sera acidifiée pendant les jours de test (21 jours). Suite à l’injection d'un agent pro-convulsivant par voie intrapéritonéale, les animaux présenteront des myoclonies (contractions rapides et brutales des muscles) et peu de crises cloniques (spasmes rythmés) et toniques (augmentation accrue du tonus musculaire ou raideur). Enfin, les animaux seront anesthésiés avec un mélange d'anesthésiques avant d’être perfusés par voie intracardiaque avec une solution tampon et un fixateur de tissus afin de préléver leurs cerveaux pour réaliser des analyses histologiques.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les cerveaux afin de réaliser des analyses histologiques.

Remplacement

L'objectif de ce projet étant d'étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans le dévelopement du cerveau, il est nécessaire de travailler sur un organisme entier, car il est actuellement impossible de reproduire in vitro le développement du cerveau. A cet égard la souris est un modèle pertinent, car elle présente une organisation du système nerveux proche de celle de l'Homme. Des études in vitro sont réalisées en parallèle, notamment pour aborder les aspects moléculaires de l'hormone thyroïdienne.

Réduction

D’après notre expérience, les paramètres comportementaux présentent en général une grande variabilité interindividuelle, il est nécessaire de prévoir 12 souris par groupe pour pouvoir conclure statistiquement. En fonction de la répartition des données nous utiliserons des tests paramétriques ou non paramétriques pour mettre en évidence des différences significatives dans les résultats des tests comportementaux entre les groupes expérimentaux (mutants vs contrôles). A l’issue de l’étude comportementale, nous avons prévu de prélever les cerveaux de 6 souris de chaque groupe, de façon à disposer de matériel biologique qui permettra de prolonger l’étude par une exploration histologique, si les tests comportementaux révèlent des différences entre souris exprimant la mutation et souris témoins. Cela évitera de générer une nouvelle cohorte de souris pour l’histologie, le cas échéant. Le nombre de 6 par groupe est suffisant pour conclure statistiquement sur les paramètres histologiques.

Raffinement

Afin de réduire l'inconfort et le stress des animaux, la durée minimale sera appliquée pour chaque test. Des phases de récupérations entre les différents tests seront prévues. De plus, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement et auront un accès illimité à l'eau et à la nourriture. Ils subiront la pose d'une puce sous-cutanée sous anesthésie et avec une couverture antalgique suite à laquelle une attention particulière sera effectuée afin de vérifier la bonne cicatrisation. Nous utiliserons du gel ophtalmique hydratant durant les implantations pour éviter un dessèchement oculaire. Le réveil de l'animal se fera sur une couverture chauffante (37°C), qui permettra un retour progressif de la température corporelle de l'animal. Un antiseptique local par spray pourra être administré si besoin. Nous avons défini des points limites éthiques dans le cadre de la procédure expérimentale. Chaque animal sera ainsi suivi avant les expériences afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt avant l’expérimentation voire l’euthanasie de l’animal.

Choix des espèces

La souris est un bon modèle pour étudier le rôle de l'hormone thyroïdienne dans l'organisme car elle joue un rôle similaire chez la souris et chez l'homme. De plus, c'est actuellement la seule espèce chez laquelle existent différentes lignées premettant de bloquer cette hormone dans un type cellulaire choisi. Cette étude comportementale sera réalisée sur des souris adultes, âgées de 16 à 20 semaines au début des tests, de façon à ce que le développement du cerveau soit terminé au début de l’étude.

1 942 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de 30 à 60 minutes pour une injection de virus dans le cerveau, certaines dès l'âge de trois semaines, puis la pose d'une fenêtre crânienne d'une à deux heures, pour l'imagerie de l'activité du cortex insulaire postérieur, une région impliquée notamment dans le traitement du goût. Le porteur annonce aussi des "tests comportementaux spécifiques" sans les nommer, et les bénéfices se limitent à des "notions fondamentales" que l'équipe espère acquérir. Les souris qui ne sont pas tuées sur place pour des études d'électrophysiologie partent dans un autre établissement utilisateur, où elles sont utilisées puis tuées elles aussi.

Objectifs

L'objectif principal du projet est de déterminer les propriétés des circuits neuronaux du cortex insulaire postérieur (CIP) et les mécanismes par lesquels ces circuits traitent les informations sensorielles. En effet le cortex insulaire est impliqué dans une grande variété de fonctions, notamment l'interoception, les états émotionnels et, dans sa partie postérieure, le traitement sensoriel du goût, du toucher, du son et de la température. Nos connaissances sur les propriétés des circuits neuronaux du CIP et sur sa connectivité fonctionnelle dans des conditions physiologiques et pathologiques sont très limitées. Il a été postulé que la plasticité à court terme est un facteur clé dans le façonnement du traitement sensoriel, permettant par exemple de distinguer des stimuli de nature similaire. Cependant, cette hypothèse n'a pas encore été testée directement. Nous utiliserons une approche multidisciplinaire allant du traçage anatomique et fonctionnel in vitro à l'imagerie fonctionnelle in vivo et enfin nous évaluerons la pertinence de nos résultats avec des tests comportementaux spécifiques. Nous activerons ou inactiverons des voies spécifiques et testerons les conséquences sur la fonction des circuits et le traitement sensoriel. Nous modifierons, au niveau d'une synapse spécifique, la plasticité à court terme en éliminant ou en surexprimant des protéines clés impliquées dans la transmission synaptique et nous testerons les conséquences sur la fonction du circuit, le traitement sensoriel et le comportement.

Bénéfices attendus

Nous espérons identifier les principales projections sous-corticales vers le CIP et comprendre le circuit synaptique par lequel les informations sensorielles sont intégrées dans le CIP. Grâce à l'approche expérimentale impartiale conçue ici, nous espérons acquérir des notions fondamentales sur l'anatomie et la fonction du circuit sous-cortical-cortical impliqué dans le traitement sensoriel gustatif. Dans une perspective plus large, cela ouvrira la voie à une meilleure compréhension de la physiologie du CI, une région proposée pour orchestrer les entrées sensorielles, cognitives et émotionnelles.

Procédures

- 1 procédure chirurgicale pour injection de virus : entre 30 et 60 min - 1 procédure chirurgicale avec implantation fenêtre cranienne : entre 1 et 2H

Impact sur les animaux

Ces animaux sont soumis à des procédures dont le degré maximal de gravité ne dépasse pas le degré modéré. Des nuisances ou effets indésirables potentiels sont ceux associés à la chirurgie bien que toutes les précautions soient prises pour être dans des conditions d’asepsie et pour réduire au maximum ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse (anesthésie, analgésie, anti-inflammatoire, suivi post-opératoire, raffinement des conditions d’hébergement ...)

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour des études électrophysiologiques ou alors ils seront utlisés dans un autre établissement utilisateur où ils seront euthanasiés également.

Remplacement

La souris est une espèce de choix pour étudier le système nerveux central des vertébrés, qui fournit des informations largement transférables à l'homme. Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent le rôle des propriétés et des plasticités synaptiques dans le traitement sensoriel dans le CIP chez des animaux au comportement éveillé. Par conséquent, aucun des modèles in vitro ou in silico ne peut être utilisé ici.

Réduction

La solidité de nos hypothèses de travail vérifiées par nos études précédentes, le caractère innovant des méthodes utilisées (imagerie chronique), ainsi que la qualité de la mise en œuvre des procédures (basée sur une expertise reconnue de l'expérimentateur) permettront de réduire significativement le nombre d'animaux. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).

Raffinement

Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long du projet : logement sur des racks ventilés, dans des cages adaptées, enrichissement de l'environnement et points limites adaptés pour éliminer ou réduire toute douleur. Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L'expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du néocortex de la souris présentent de nombreuses similitudes avec le néocortex d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les injections de virus seront effectuées sur des animaux âgés de 3 semaines à 6 mois. Comme la taille du cerveau varie entre 3 semaines et 6 mois, les coordonnées stéréotaxiques seront ajustées en conséquence.Le reste des procédures expérimentales sera réalisé sur des animaux âgés de plus de 5 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.au laboratoire. L'expérimentateur a une forte expérience de pour toutes les procédures proposées.

284 souris femelles immunodéprimées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des cellules humaines de cancer de l'os sont injectées sous leur peau sur animal vigile, la tumeur est mesurée trois fois par semaine et des composés sont administrés dans l'eau de boisson et par injection, pour tester si l'inhibition d'une protéine renforce la chimiothérapie. Le porteur décrit une gêne possible à la locomotion et des effets tardifs de la chimiothérapie sur la reproduction. Il justifie le recours à l'animal par les limites des cultures in vitro en deux dimensions et présente les femelles comme moins agressives.

Objectifs

Le cancer reste un enjeu clinique important en France (382 000 nouveaux cas et 158 000 morts par an). Bien que le cancer soit mieux pris en charge aujourd’hui, les options thérapeutiques sont limitées pour certains cancers, comme pour le cancer de l’os. Sa prise en charge repose essentiellement sur les chimiothérapies qui sont associées à des effets indésirables ou à de la résistance. Il est nécessaire de remplacer celles-ci par des alternatives thérapeutiques ou de limiter les doses de chimiothérapies en les combinant à de nouvelles thérapies. Pour cela, il faut (1) identifier de nouvelles protéines qui jouent un rôle dans la réponse aux chimiothérapies et (2) évaluer le bénéfice à cibler ces protéines en combinaison avec les chimiothérapies. A l’aide d’une lignée cellulaire dérivée de l’os, il a été montré que la réduction de la quantité de la protéine P induit un arrêt de la prolifération des cellules cancéreuses en réponse à une chimiothérapie. Aujourd’hui il reste à démontrer que l’inhibition de la protéine P améliore la réponse aux chimiothérapies chez l’animal. L’objectif principal est de déterminer si l’inactivation de la protéine P est suffisante pour augmenter l’effet anti-tumoral des chimiothérapies. L’objectif secondaire est de déterminer si la protéine P joue un rôle dans le développement d’une tumeur, démontrant que l’inhibition de la protéine P peut être une approche anti-cancer à elle seule. Pour cela, une greffe de cellules génétiquement modifiées présentant une diminution de la quantité de la protéine P sera pratiquée chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont de contribuer à valider une nouvelle stratégie thérapeutique anti-cancer en santé humaine. Ce projet permettra d’évaluer le bénéfice thérapeutique de la perte de fonction d’une protéine P dans le traitement de cancers par chimiothérapies. Cette stratégie thérapeutique innovante permettra de réduire la dose des chimiothérapies utilisées tout en augmentant leur efficacité et ainsi diminuer les effets indésirables associés aux chimiothérapies.

Procédures

Des cellules humaines de cancer de l’os sont injectées sous la peau des souris. Pour effectuer ce geste, la souris est maintenue environ 15 sec, une seule injection de 0.1 ml. A la suite de cette injection, la souris développera une tumeur sous-cutanée. La croissance tumorale est suivie par des mesures au pied à coulisse 3 fois par semaine, l’animal est maintenu immobile environ 25 secondes. Les composés sont administrés par voie orale dans l’eau de boisson (à partir de l’entrée des souris en protocole jusqu’à la mise à mort),ou par injection intrapéritonéale (1x/semaine, 10 sec, pendant 5 semaines).

Impact sur les animaux

La greffe de cellules humaines par injection sous-cutanée est réalisée sur animal vigile. La tumeur pourrait entrainer dans de très rare cas une gêne à la locomotion. Le traitement ajouté dans l’eau de boisson donne un goût amer. Les effets non désirables des chimiothérapies sont observés à long terme (au-delà de 10 semaines de traitement), par exemple une atteint de fonction reproductrice chez la femelle.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les tumeurs pour des analyses biochimiques, moléculaires et histologiques. Si des animaux ne développent pas de tumeur, ils seront mis à mort 8 semaines post-greffe. En effet, les animaux ayant subi une injection de cellules tumorales, ne peuvent pas être réutilisés dans un autre projet.

Remplacement

En amont de ces expérimentations in vivo, les chimiothérapies et le médicament-candidat ont été testés sur les cellules in vitro. Les approches in vitro sont nécessaires mais elles restent limitées à un seul type cellulaire ayant une structure en 2D. La deuxième étape de validation du médicament-candidat est in vivo, c’est-à-dire d’étudier son action dans des conditions physiologiques et seul un organisme entier le permet.

Réduction

Une étude préliminaire de validation du modèle est conduite sur un nombre limité de souris (20 souris). Si les résultats de cette étude sont concluants, l’étape 2 sera alors mise en œuvre pour déterminer la concentration de chimiothérapie à utiliser. Cette procédure sera également faite sur un nombre limité d’animaux (50) pour 3 chimiothérapies testées (chimiothérapies classiquement administrées chez l’homme pour le cancer de l’os). Enfin, à l’issu de cette 2ème étape, la procédure 3 sera conduite en séquentielle afin de ne pas avoir à gérer un nombre d'animaux trop important (une chimiothérapie à la fois). Le but de cette procédure est d’étudier s’il est possible de réduire les effets indésirables des chimiothérapies en co-administrant un médicament-candidat.

Raffinement

Le traitement ajouté dans l’eau de boisson ayant un goût amer, 3% de sucrose sont additionnés pour permettre une bonne hydratation. Les analyses de croissance des tumeurs sont non invasives (mesure au pied à coulisse) et ne requiert pas d'injection d'anesthésiant ou d'antalgique. L'effet des composés sur l'état physiologique des souris est suivi par la pesée des animaux, et la mesure du développement tumoral. De l'aliment sera mis en fonds de cage si une souris présentait une gêne à la locomotion. Des points limites adaptés sont définis de manière objective pour chaque procédure, incluant des critères d'arrêt de l'expérience en cas de souffrance.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour l’analyse de greffes de lignées cellulaires en oncologie. Les expérimentations sont réalisées sur des souris immunodéprimées pour qu’il n’y ait pas de rejet de la greffe des cellules humaines. Des femelles sont mises en œuvre car elles présentent un caractère moins agressif que les mâles, ce qui permet un remaniement plus facile de la composition des cages lors de constitution des groupes de traitement des animaux. Les souris femelles sont également choisies car les cellules humaines ont été obtenues à partir d’une tumeur développée chez une femme. La greffe est pratiquée sur les souris de 6–8 semaines, pour des raisons d’efficacité de prise tumorale et de reproductibilité.

1600 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue par les établissements partenaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après tonte et dépilation sous anesthésie, un produit est appliqué sur leur dos jusqu'à vingt-quatre fois pour induire un psoriasis, avec des injections sous-cutanées et des pesées répétées. Le porteur attend une perte de poids pouvant atteindre 20 %, un érythème, une desquamation et un épaississement de la peau, et précise que l'élevage préalable conduit aussi à tuer les animaux non sélectionnés. Il affirme ne pas pouvoir se passer de l'expérimentation animale pour cette maladie multifactorielle.

Objectifs

Le psoriasis est une maladie pro-inflammatoire chronique et multifactorielle de la peau (démangeaisons, plaques inflammatoires, …), touchant 2 à 4% de la population française, principalement bénigne et actuellement sans traitement curatif définitif. Dans 20% des cas, des formes sévères sont relevées montrant l’augmentation des risques cardiovasculaires et métaboliques chez ces patients. Le récepteur TRPV1 (Transient Receptor Potential Vanilloide 1) est un acteur majeur dans la perception et l’intégration des sensations douloureuses (nociception), et est impliqué dans l’inflammation des couches superficielles de la peau (épiderme externe et derme plus profond), dans de nombreuses maladies, mais son rôle précis au niveau vasculaire local et/ou dans les échanges entre les différents types cellulaires, n’est pas clairement démontré à ce jour. Aujourd’hui, parallèlement à des études pharmacologiques en biologie cellulaire (in vitro sur cultures cellulaires) ou par des analyses biochimiques et de biologie moléculaire sur organes isolés (ex vivo, explants de peau ou prélèvements tissulaires de patient), notre objectif est de caractériser in vivo l’implication du récepteur TRPV1 dans un modèle induit de psoriasis chez des souris génétiquement modifiées. Ce projet inclus 2 procédures expérimentales. La procédure 1, de sévérité legère, est une procédure d'élevage permettant de générer 3 nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées « Knock-Out tissu-spécifique », où l’expression du gène TRPV1, soit le complexe protéique constitutif du récepteur TRPV1 exprimé à la membrane cellulaire, est spécifiquement invalidée dans l’un des 3 compartiments cellulaires suivants : vasculaire (microcirculation vasculaire locale), épidermique (relations entre les cellules constitutives de l’épiderme) ou nerveux (relations entre cellules sensitives), et de sélectionner au maximum de 1600 animaux d’intérêt. Ces animaux seront tous inclus dans la procédure 2, de sévérité modérée, permettant d’induire un modèle psoriasique selon 3 modalités : très court terme / précoce – 3 jours, court terme / aigüe – 6 jours et long terme / chronique – 9 semaines. Au terme de l’induction du modèle pathologique, des analyses fonctionnelles et biochimiques permettront de caractériser finement l’implication du récepteur TRPV1 au niveau des 3 compartiments précédents, de proposer une nouvelle approche de développement de traitements du psoriasis et/ou des pathologies dermatologiques similaires.

Bénéfices attendus

Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif définitif, seuls des traitements symptomatiques aux résultats transitoires sont proposés aux patients étant atteint d’un psoriasis. L'idée novatrice de ce projet est d'étudier l'implication fine du récepteur TRPV1 et de le placer au centre de la dérégulation de l'équilibre homéostatique (constantes fonctionnelles régulées et maintenues à des valeurs bénéfiques pour l’organisme), incluant l'ensemble des acteurs, et d'identifier si possible le site d'inflammation privilégié (épithélial, neuronale, vasculaire) permettant d'envisager une possible nouvelle voie de développement d’un traitement diminuant le nombre et l’intensité des poussées.

Procédures

Les souris issues des 3 nouvelles lignées KO tissu-spécifique TRPV1, soit au maximum 1600 animaux, obtenues par la procédure 1 – élevage et obtention des 3 lignées de souris LoxP-Cre Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, seront incluses dans la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris et seront donc soumises à 3 types d’interventions : I – en amont du protocole d’induction (procédure 2), chaque souris sera tondue et dépilée (crème VEET « peaux sensibles »), sous anesthésie gazeuse ; intervention réalisée 1 fois et d’une durée maximale de 5 minutes, II – durant le protocole d’induction (procédure 2), chaque souris vigile recevra une application externe / topique de Vaseline® (condition contrôle) ou d’Aldara™ 5% (condition induite), sur la zone dépilée ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce – 3 jours », 5 fois pour la modalité « aigüe – 6 jours » et 24 fois pour la modalité « chronique – 9 semaines » et d’une durée de moins de 5 minutes, III – Durant la procédure 2, chaque souris vigile recevra une injection sous-cutanée préventive de NaCl 0,9% (300µL), après contention manuelle, pour limiter déshydratation générale liée à la procédure d’induction ; intervention réalisée 2 fois pour la modalité « précoce », 3 fois pour la modalité « aigüe » et 6 fois pour la modalité « chronique », d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les nuisances et effets indésirables attendus sur les animaux sont : I – du stress lors des pesées régulières (entre 2 et 7 fois par semaine, durée inférieure à 30 secondes) diminuant avec l’habituation, II – du stress lors des anesthésies gazeuses générales de préparation (tonte, dépilation) des animaux en amont de l’induction du modèle, de faible intensité (maximum 5 minutes), III – du stress et de l’inconfort lors des manipulations des animaux vigiles pour induire le modèle (application dorsale de crème, injection sous-cutanée préventive, observations comportementales, …), de faible intensité, et se réduisant avec l’habituation à la répétition journalière des opérations (5 minutes par animal et par jour), IV – une perte de poids corporel transitoire, attendue durant les premières 48 heures après début du traitement d’induction et pouvant atteindre 20% maximum, due à une déshydratation générale, soit d’une intensité modérée (maximum durant une semaine), V – L’apparition des « symptômes » induits, caractéristiques du psoriasis (rougeur / érythème, desquamation, épaississement cutané), d’intensité faible à modérée (durée totale de l’expérimentation) et VI - du stress lors de la réalisation des transferts des animaux vers nos partenaires (préparation, conditionnement, nouvel environnement transitoire, vibrations lors du transport, …), de faible intensité, sur 24-48h.

Devenir

Ce projet comporte 2 procédures expérimentales. Lors de la procédure 1 – Elevage et obtention des 3 nouvelles lignées de souris Knock-Out tissu-spécifique TRPV1, l’apparition éventuelle d’un phénotype dommageable mettrait fin au projet et l’ensemble des animaux seraient mis à mort. Les animaux présentant les génotypes d’intérêt, ainsi que les géniteurs d’intérêt pour la cryoconservation de leurs gamètes, seront gardés en vie. Les animaux non-sélectionnés seront mis à mort. Les animaux sélectionnés en procédure 1, intègreront la procédure 2 – Induction du modèle de psoriasis chez la souris, où ils seront transférés immédiatement vers nos partenaires (modalité « précoce – 3 jours » et « aigüe – 6 jours ») ou intègreront la modalité « chronique – 9 semaines », où ils débuteront le protocole d’induction du psoriasis, avant d’être transférés, à leur tour, vers nos partenaires, qui se chargeront de finaliser l’induction et de réaliser les expérimentations finales, puis mettrons à mort l’ensemble des animaux. Ils seront donc tous conservés en vie dans notre établissement.

Remplacement

Le psoriasis est une maladie multifactorielle, dont la physio-pathologie implique différents intervenants et composantes au sein de la peau (vasculaires, nerveux, barrière cellulaire, …), ne pouvant être reproduits et étudiés uniquement par le développement de modèles cellulaires et/ou l’utilisation de méthodes alternatives. Nous ne pouvons donc pas nous passer de l’expérimentation animale et de la mise en place de protocoles in vivo pour prendre en compte l’ensemble de ces aspects.

Réduction

L’ensemble du projet a été conçu afin de réduire au maximum le nombre d’animaux sans compromettre l’interprétation statistique des résultats. De par la variabilité interindividuelle dans les tests fonctionnels finaux, nous devons inclure 20 animaux par double analyse fonctionnelle pour obtenir des résultats robustes. Si les variations des résultats expérimentaux sont « significatives », nous envisagerons de réduire le nombre d’animaux par groupe et ainsi diminuer le nombre global d’animaux nécessaire. De plus, nous limiterons le nombre de groupes « contrôle » dans les 3 modalités d’induction du modèle (précoce - 3 jours, aigüe - 6 jours, chronique - 9 semaines), en utilisant les animaux contrôles de la modalité d’induction « aigüe - 6 jours » pour la réalisation des analyses de la modalité « précoce - 3 jours ».

Raffinement

Les responsables du projet s’assureront du bien-être de l’ensemble des animaux au quotidien, par la réalisation d’observations comportementales et d’évaluations du poids corporel, au minimum 2 par semaine. Si nécessaire et en suivant une échelle de cotation adaptée, les responsables prendront en charge la gestion de la douleur ou du mal-être par une analgésie adaptée, et si un point limite est atteint, pratiqueront la mise à mort immédiate de l’animal concerné.

Choix des espèces

L’utilisation de souris comme modèle d’étude in vivo est courant en immuno-dermatologie. Son système immunitaire, humoral et cellulaire est largement décrit depuis de nombreuses années et font référence, ce qui nous permettra d’expérimenter sans avoir recourt à des espèces de mammifères plus proches de l’homme. Dans notre contexte, il nous semble d’autant plus pertinent d’induire un psoriasis sur cette espèce, car, commercialement, nous pouvons obtenir des animaux génétiquement modifiés d’intérêt (mutant KO total TRPV1, souris LoxP-TRPV1, souris Cre-tissu spécifique), et créer des souris Cre-LoxP KO spécifique TRPV1 par les méthodologies d’inactivation Cre-LoxP développées dans les années 2000. Le modèle inductible d’inflammation cutanée / psoriasis est documenté depuis plus de 10 ans, utilisé par de nombreuses équipes mondialement et nos partenaires sont rompus à son utilisation. Les 3 nouvelles lignées produites permettront de caractériser l’implication du récepteur TRPV1 au sein de 3 compartiments cellulaires impliqués dans le psoriasis induit chez la souris. Le psoriasis touche l’ensemble de la population, du jeune à l’adulte, avec un pic d’apparition de la maladie chez l’homme se situant entre 20 et 30 ans. Notre étude souhaite évaluer les phases précoces d’apparition du psoriasis, puis l’installation de la pathologie à court terme (phase aigüe) et l’évolution à long terme (phase chronique) dans un modèle induit de dermatite psoriasiforme chez la souris. Nous utiliserons donc des animaux adultes, âgés de 8 à 12 semaines et dont le poids variera entre 20 et 30g au moment de débuter le protocole d’induction du modèle.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Sous anesthésie, elles reçoivent une injection de chlorure de baryum dans les muscles de la patte pour provoquer une lésion, après un gavage de dioxine, afin d'étudier l'effet de ce polluant sur la régénération musculaire. Le porteur reconnaît qu'une paralysie ou une nécrose de la patte reste possible, et prévoit la mise à mort au plus tard vingt-huit jours après la lésion. Il indique que l'étude d'interactions cellulaires dans l'organisme entier ne peut être qu'en partie remplacée par la culture in vitro.

Objectifs

Parmi les tissus des organismes vertébrés, le muscle squelettique est l’un des plus remarquables parce qu’il possède de grandes capacités régénératrices, ce qui font de lui un organe très plastique. À l’origine de cette plasticité musculaire se trouve un réservoir de cellules souches, dont les plus étudiées à ce jour sont les cellules satellites qui, comme leur nom l’indique, se localisent en périphérie des fibres musculaires. La dioxine, un polluant organique et hautement toxique, a un impact sur les cellules souches du muscle squelettique et il a été démontré qu’il existe une différence de réponse face à la pollution au sein des sous-populations de cellules souches du muscle. Une partie d’entre elles semblent résistantes à la pollution et présentent un mécanisme de résistance unique, tandis que la majorité des cellules satellites y sont sensibles. Ceci interroge désormais sur le rôle respectif de ces deux sous-populations quant à la réparation du muscle squelettique dans un contexte de pollution. Comme la pollution est un facteur de risque important pour la santé humaine nous proposons avec ce projet et sur la base de nos résultats, de décrypter les réponses cellulaires et moléculaires spécifiques de chacune de ces deux souspopulations au cours de la régénération musculaire après une exposition à la pollution. Alerter sur les effets de la pollution dans un système biologique tel que le système musculaire permettra de comprendre quel stress cellulaire peut engendrer la pollution. Dans notre étude, nous utiliserons des modèles murins qui subiront une exposition à la dioxine ou à une molécule contrôle. Une partie des souris sera, dans un deuxième temps, soumise à une blessure musculaire. Nous pourrons ainsi étudier l’impact de la pollution par dioxine sur les cellules souches musculaires notamment au cours du processus de la régénération musculaire.

Bénéfices attendus

Comme notre projet s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et l’interaction entre de nombreux types cellulaires nous ne pouvons pas mettre en place une méthode alternative au vivant. Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation excessif d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Pour essayer de minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Notre étude fera appel à un total de 480 souris sur une procédure expérimentale.

Procédures

Pour le déroulement de ce projet les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%) et soumises à des injections de BaCl2 dans les muscles TA et BCPS. L’intervention sera faite une seul fois par souris et la durée de l’intervention est de 10 minutes (après endormissement des animaux).

Impact sur les animaux

Il n'est attendu aucun effet indésirable majeur dans le contexte du traitement de TCDD par gavage. Les animaux gavés avec TCDD ou contrôle nonane sont comparables en termes de comportement/activité motrice spontanée et de poids corporel. Les génotypes des animaux utilisés ne sont pas délétères ou indésirables. L’induction de la régénération musculaire peut entrainer des contraintes au niveau du mouvement de la patte pendant quelques heures. Dans notre expérience nous n’avons jamais observé de complications majeures liés à la régénération musculaire mais nous ne pouvons pas négliger la possibilité qu’une éventuelle paralysie ou nécrose de la patte puisse se manifester.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour analyse au plus tard 28 jours post-lésion intramusculaire.

Remplacement

Nos projets s’intéressent à des processus biologiques qui reposent sur l’évolution au cours du temps et/ou l’interaction entre de nombreux types cellulaires/tissus. De fait, l’étude de ces processus au sein d’un organisme dans son ensemble où toutes les cellules impliquées sont en étroite communication est nécessaire et ne peut être substituée qu’en partie par l’in vitro. Pour éviter au maximum l’usage d’animaux dans l’étude et être confiant de la réussite de notre projet in vivo, nous avons fait des études préliminaires sur des lignées cellulaires musculaires avant de passer aux expériences sur les animaux. De plus, la culture cellulaire restera une technique que nous utiliserons au cours de ce projet pour des testes préliminaires et complémentaires à l’utilisation des souris.

Réduction

Dans un but de suivre le principe des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) et de réduire l’utilisation d’animaux, le nombre d’animaux a été calculé sur la base de protocoles déjà publiés avec 15 animaux par lot ce qui est le minimum pour obtenir suffisamment de matériel biologique pour réaliser l’ensemble des analyses nécessaires. Ce nombre de souris n’a pas été calculé avec des méthodes de statistique mais basé sur notre expérience sur l’obtention de matériel biologique pour chaque technique.

Raffinement

Pour minimiser la souffrance et le stress induit aux animaux, des analgésiques seront administrés avant et après d’induction de la régénération musculaire. En préalable à l’injection, les animaux seront anesthésiés sous isoflurane (induction 4%; maintien 2%). L’endormissement complet sera contrôlé par pincement ferme de la queue. L’anesthésie à l’isoflurane est rapide et profonde afin de permettre la réalisation de la procédure dans un temps relativement court et assurer un réveil rapide. De plus, de la nourriture humidifiée sera ajoutée dans les cages les 3 premiers jours pour faciliter l’alimentation des animaux. Pendant toute la procédure, les cages sont visuellement inspectées chaque jour donc tout animal présentant les points limites sera mis à mort (lordose, tremblements, prostration, paralysie, difficulté de locomotion, nécrose de la patte, perte de poids).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris pour des raisons multiples. Les approches de transgénèse et recombinaison homologue nécessaires à l’étude de mécanismes moléculaires de processus biologiques sont facilement réalisables. La recombinaison homologue permet de modifier de manière efficace et contrôlée le locus des gènes murins. Ce modèle étant couramment utilisé, de nombreuses lignées transgéniques, notamment lignages spécifiques, sont aujourd’hui disponibles à toute la communauté. Des lignées pures et génétiquement caractérisées sont disponibles pour ce modèle. La courte durée de gestation chez la souris est compatible avec la durée de nos expériences. Nos expérimentations concernent les jeunes adultes de 6 semaines, date à laquelle le muscle adulte est complètement formé et les cellules satellites sont en quiescence. L’administration de tamoxifène par gavage sera faite à tous les animaux de l’étude. La tamoxifène va permettre l’induction de la recombinase Cre dans des lignées floxées au stade d’expression du promoteur contrôlant l’expression de la recombinase dans chaque lignée. Apres l’administration de tamoxifène par gavage, les animaux seront analysés pour l’étude de l’impact de l’exposition à la TCDD et pour l’étude de la régénération musculaire.