Souris

168 souris âgées de 20 à 24 mois vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Pendant dix-huit semaines, chaque souris reçoit deux injections sous-cutanées par semaine, des prélèvements sanguins et des mesures répétées d'électroneuromyogramme et d'impédancemétrie, pour tester une molécule contre la fonte musculaire liée à l'âge. Le porteur indique des indurations possibles aux points d'injection et une perte de poids liée à l'âge ou à des tumeurs. Il affirme que le test de force ne peut se reproduire sur modèle cellulaire et que le recours à l'animal est un "prérequis réglementaire", les retombées visant les personnes âgées.

Objectifs

Au cours du vieillissement, la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement de façon involontaire. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : la sarcopénie (forme d' atrophie musculaire liée au vieillissement). La sarcopénie est à l'origine d'une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, des problèmes moteurs et une perte d'autonomie progressive. Elle conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique de cette pathologie. Les évènements biologiques contrôlés par le GDF5 (Growth Differentiation Factor 5) sont connus pour être activés dans certaines conditions conduisant à une atrophie musculaire (écrasement du nerf par exemple): leur activation permet de contrer les effets de la fonte musculaire. Dans le cas du vieillissement, il a été montré que l'expression de GDF5 diminue dans les muscles, et que la sur-expression locale de la protéine recombinante rGDF5 dans un muscle de souris âgée augmente la masse musculaire. Des études de preuve de concept réalisées à une concentration unique de rGDF5 ont permis de mettre en évidence une amélioration du poids et de la force musculaire chez des souris âgées, ce qui permet d'envisager une transposition clinique de cette molécule chez des patients atteints de sarcopénie. Dans cette optique, ce projet aura pour but de définir la dose minimale efficace de rGDF5 nécessaire pour améliorer le poids et la force musculaire dans un modèle murin de souris âgées.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris devraient consister en une stabilisation ou une augmentation du poids des muscles, une amélioration de la composition corporelle (ratio masse grasse/masse maigre), de la communication nerf-muscle (mesurée par un test de l'activité électrique transmise du nerf au muscle) et de la force globale et spécifique des muscles, ainsi qu'une amélioration de la survie à 24 mois. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace de la molécule thérapeutique rGDF5 afin d'envisager dans un second temps une transposition en clinique chez le sujet âgé. Plus de 25% des personnes âgées de plus de 70 ans étant affectées par la sarcopénie, le bénéfice en termes de santé, et par voie de conséquence en termes de financement des soins liés à cette pathologie, est potentiellement très important.

Procédures

Les souris subiront deux injections sous-cutanées par semaine pendant une durée de 18 semaines. Chaque injection dure environ 1 minute. Des prélèvements de sang seront réalisés à 4 points de temps: au moment de l’inclusion des souris, puis 15 jours et un mois après l’administration, et en fin de protocole. Chaque acte ne durera pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures d'électroneuromyogramme espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 5 mesures d'impédencemétrie, espacées chacune de 1 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées en fin de mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris âgées de 20 à 24 mois qui peuvent présenter une perte de poids possible due à l'âge ou développer des tumeurs. L'injection de protéine rGDF5 par voie sous-cutanée deux fois par semaine pourrait entrainer la formation d'indurations aux points d'injection.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements des organes et évaluation de l'efficacité du traitement.

Remplacement

Le projet a pour but de mesurer l'effet thérapeutique de la molécule rGDF5 au niveau de la musculature dans un modèle de vieillissement, notamment par des mesures de force musculaire: le test de force ne peut pas être reproduit dans des modèles cellulaires car il n'existe pas de modèle cellulaire ou d'organoides pouvant reproduire le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle dans toute leur complexité. De plus, le recours à l'animal est un prérequis réglementaire pour les études d'efficacité non-cliniques. L'utilisation d'animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre d'animaux, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une augmentation de la force musculaire de 14% minimum. Le calcul permet de conclure que 8 animaux sont nécessaires par groupe. Considérant l'expérience de nos collaborateurs, une mortalité élevée de 35% en moyenne a été observée chez les souris entre l'âge de 20 et de 24 mois: pour cette raison, l'effectif a été majoré, soit 8 animaux + 4 animaux supplémentaires = 12 animaux par groupe de souris par condition afin de permettre une analyse statistique fiable et d'éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo n'empêche la bonne exploitation des résultats.

Raffinement

Les souris étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux étant âgés, ils seront observés attentivement 2 fois par semaine. Tous les tests fonctionnels seront réalisés dans une pièce dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les grip tests ne sont pas source de stress pour l'animal, qui s'agrippe naturellement à la grille. Pour l'ENMG ou la mesure de la force sur le TA, afin d'éviter les douleurs éventuellement créées par la stimulation électrique, une prémédication par un antalgique fort sera administrée par voie sous-cutanée. La procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse pour l'ENMG et sous anesthésie générale pour la mesure de force sur le TA. La mesure d'impédencemétrie n'est pas douloureuse (courant de très faible intensité), mais les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse pour permettre le placement des électrodes et les mesures. Au cours des différentes procédures, les souris seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir la température de leurs corps A l'exception du test de mesure de force sur le TA qui est terminal, en fin de procédure, les animaux seront remis dans une cage et surveillés jusqu'à leur réveil. Après l'ENMG, ils recevront par voie sous-cutanée un antalgique fort toutes les 12h pendant 48h. Ils seront ensuite surveillés très attentivement et pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de relever le moindre signe de souffrance. Les prélèvements de sang se feront par voie sous-mandibulaire durant le protocole et par voie rétro-orbitale au moment de l’euthanasie. Dans le cas du prélèvement sous-mandibulaire, l’animal sera maintenu par contention, des lancettes à usage unique seront utilisées puis une compresse sera appliquée quelques secondes au point de prélèvement pour stopper le saignement. Les souris seront surveillées individuellement après les prélèvements pour s’assurer que le saignement ne reprend pas, et un nouveau point de compression sera réalisé le cas échéant. Dans le cas du prélèvement rétro-orbital, le sang sera prélevé à l’aide d’un capillaire sur animal anesthésié par la voie générale, puis la souris sera euthanasiée. Les actes seront rapides (moins d’une minute).

Choix des espèces

Les souris reproduisent bien les caractéristiques des maladies neuromusculaires, notamment la sarcopénie liée au vieillissement, et sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur ces pathologies. De plus, ce modèle permet une évaluation fonctionnelle très complète à de multiples niveaux, comme mis en évidence lors de sa caractérisation (Grip test, mesure de force sur TA in situ, impédencemétrie, ENMG). Les souris C57BL/6 seront des adultes âgées de 20 mois en début de protocole et de 24 mois en fin de protocole afin que la sarcopénie soit à un stade avancé. Ces âges ont préalablement été définis par nos collaborateurs lors de la preuve de concept de l'efficacité de rGDF5. La caractérisation du modèle à donc également été réalisée à ces âges.

4 932 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes et de fluides, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent par injection ou inhalation des molécules pharmacologiques pendant quelques jours, avec deux prélèvements sanguins, pour étudier la régulation de l'interleukine-33 dans l'inflammation allergique. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer une inflammation des bronches et une gêne respiratoire, outre un stress modéré et une irritation. Il affirme devoir travailler sur un organisme intégré tout en revendiquant un criblage in vitro pour limiter le nombre d'animaux, les bénéfices restant des avancées de connaissance sur l'asthme.

Objectifs

L'inflammation allergique joue un rôle crucial dans les maladies allergiques telles que l'asthme qui touche 30 millions d'Européens. Ce nombre a doublé au cours des dix dernières années et continue d'augmenter. De nombreuses études sur des modèles animaux et des données cliniques ont démontré de manière concluante le rôle critique de l’interleukine-33 (IL-33) dans l'inflammation allergique. L’IL-33 est une protéine présente au niveau des cellules des vaisseaux sanguins et des tissus en contact avec l’extérieur, comme l’appareil respiratoire. L’IL-33 ne joue pas véritablement de rôle à l’intérieur des cellules ; sa quantité est variable et dépend de nombreux facteurs. Elle est libérée en dehors des cellules suite à divers stimuli, notamment après exposition à des allergènes comme Alternaria alternata, un allergène clinique majeur chez les patients asthmatiques. Une fois libérée dans l'espace extracellulaire, l'IL-33 va jouer le rôle de messager et alerter le système immunitaire d’un danger, comme la présence d’un champignon, en activant rapidement les cellules immunitaires qui sont impliquées dans l'inflammation allergique. Bien que l'IL-33 constitue une cible thérapeutique prometteuse pour l'asthme et d'autres maladies humaines importantes, il existe encore plusieurs questions non résolues concernant la biologie et la biochimie de la protéine. Par exemple, on ne sait pas quels sont les facteurs importants qui régulent la présence de l’IL-33 dans les cellules et sa quantité. Ou bien, comment l’IL-33 est libérée dans le milieu extracellulaire, après exposition à des allergènes comme Alternaria alternata ? L'objectif principal du projet est de fournir une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression de la protéine IL-33 et sa libération à l’extérieur de la cellule, conduisant à l'inflammation allergique.

Bénéfices attendus

Une meilleure connaissance des mécanismes impliqués dans la régulation de l'expression et de la libération de la protéine IL-33 est essentielle étant donné ses rôles critiques dans l'immunité, l'allergie, l'inflammation et d'importantes maladies humaines, comme l'asthme. Nous pensons que ce projet permettra de mieux comprendre ces questions non résolues dans la biologie de l'IL-33, et conduira à des avancées scientifiques importantes. Nos résultats préliminaires effectués in vitro, dans des cellules en culture, indiquent qu’il est possible de moduler les niveaux d’expression de la protéine IL-33 dans les cellules productrices. Les expériences proposées ont pour but de démontrer que si l’on arrivait à diminuer l’expression de l’IL-33 in vivo, on pourrait limiter l'inflammation allergique. En outre, nous pensons que le projet permettra de mieux comprendre les mécanismes biochimiques et moléculaires impliqués dans l’expression et/ou la libération rapide de l'IL-33 lors d’un stress, comme l'exposition à des allergènes environnementaux. Enfin, de nouveaux inhibiteurs pharmacologiques de l’expression/libération de l'IL-33 devraient être identifiés et pourraient également contribuer au développement d'applications industrielles et thérapeutiques.

Procédures

Injection ou inhalation de molécules pharmacologiques 1 fois par jour sur un maximum de 4 jours. 2 prélèvements sanguins à 6 semaines d'intervalle. Prélèvement post-mortem d'organes et de fluides biologiques.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont un stress modéré lors de la manipulation des animaux, une légère douleur lors de l’inhalation et de l'injection des produits. Ainsi qu'une légère irritation cutanée ou de la mucqueuse nasale suite aux injections ou aux inhalations. De plus, les produits injectés ont pour but d’augmenter (ou diminuer) l’expression et/ou la libération de l’IL-33. Ainsi, les nuisances attendues sur les animaux sont liées à la quantité d’IL-33 libérée par ces traitements qui peuvent induire une inflammation des bronches et une gêne respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Différents organes et fluides biologiques (lavages broncho-alvéolaires) seront prélevés post-mortem afin de pouvoir réaliser les analyses nécessaires à la compréhension de l'expression et de la libération d'IL-33 sous l'effets des différents inhibiteurs utilisés.

Remplacement

Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, ce projet nécessite de mener des expériences chez l’animal, car nous devons travailler dans des conditions intégrées permettant l’interaction de plusieurs systèmes cellulaires complexes dont le système immunitaire et le microenvironnement inflammatoire. Cependant afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous avons développé des expériences de screening in vitro qui nous permettent de remplacer le screening in vivo afin de sélectionner les meilleures molécules candidates capables de moduler l’expression et /ou la libération de l’IL-33, mais ces expériences in vitro ne peuvent pas à l'heure actuelle intégralement remplacer les expériences in vivo pour les raisons évoquées ci-dessus. De plus, l’IL-33 est présente uniquement chez les mammifères et ces études ne peuvent donc pas être conduites dans un organisme modèle autre qu’un mammifère. L’espèce animale choisie est la souris car notre étude nécessite l’utilisation d’animaux modifiés génétiquement et qui sont déficient pour l'IL-33.

Réduction

Le nombre d'animaux, qui sont utilisés pour répondre aux différentes questions du projet, est réduit au strict minimum afin d’obtenir des résultats statistiquement significatifs. Il s’agit d’un nombre maximum d’animaux qui pourra être significativement réduit; Par exemple, nous avons prévu des expériences avec plusieurs sites d'injection mais si le premier site d'injection donne des résultats satisfaisant, nous ne réaliserons pas les expériences pour les autres sites d'injection ce qui réduira automatiquement le nombre d’animaux. De même, nous avons prévu dans certaines expériences plusieurs injections si une seule injection n’était pas suffisante mais si une seule injection suffit, alors les expériences avec plusieurs injections ne seront pas réalisées. De plus, certaines procédures ne seront pas réalisées si les procédures précédentes ne sont pas concluantes. Les expériences menées in vitro avant la réalisation des expériences in vivo nous permettront de sélectionner les meilleures molécules candidates capables de moduler l’expression et /ou la libération de l’IL-33, et ainsi d’éviter de tester directement toute une panoplie de molécules chez l’animal, ce qui permet une réduction certaine du nombre d’animaux.

Raffinement

Les conditions d'hébergement et les méthodes utilisées seront les plus appropriées pour réduire le plus possible toute angoisse ou dommage durable que pourraient subir les animaux. L’ensemble de nos procédures fera l’objet d’expériences pilotes avec un nombre très réduit d’animaux (2 maximum) par groupe de traitement. Ces expériences nous permettront de vérifier que les traitements n’entrainent pas de détresse et de douleur majeure chez les animaux pendant tout le temps de la procédure. Les expériences sur des groupes plus importants d’animaux ne seront réalisées que si les expériences pilotes montrent que les points limites adaptés au modèle sont corrects. Les inhalations auront lieu sous anesthésie gazeuse pour réduire le stress chez l’animal. Les procédures seront courtes puisqu’elles dureront de 1 à 4 jours maximum. De plus, nous procèderons à un nombre d’injections minimum (le plus souvent, une seule injection) qui ne sera augmenté (jusqu’à trois maximum) que si les résultats obtenus avec une seule injection sont insuffisants. Pour chaque procédure, le suivi des animaux sera journalier avec un suivi établi selon une grille de score. Enfin, tous les prélèvements seront effectués post-mortem.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle le plus couramment utilisé dans la littérature scientifique pour étudier la biologie de l’IL-33 et son implication dans le développement de l’inflammation allergique. De plus, il existe des souris déficientes pour l'IL-33 ce qui est capital pour étudier les mécanismes d’expression et de libération de cette cytokine. Nous utiliserons des souris femelles adultes âgées de 6 à 8 semaines car c'est un modéle validé pour l'inflammation allergique et qui est en relation avec le développement d'asthme allergique dont l'incidence est plus importante chez les femmes que chez les hommes.

15 910 souris et 972 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue pour analyse des organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit un modèle de souris à phénotype dommageable dont environ 30 % meurent dans les premières 48 heures et 10 % développent des complications sévères comme une hydrocéphalie ou des troubles respiratoires. Les souris subissent des prélèvements sanguins jusqu'à sept fois par semaine, une biopsie d'oreille et des injections, les mini-porcs des prélèvements de sperme, de sang et des injections. Il affirme que le projet ne peut se faire sans modèle animal, le bénéfice pour les patients d'une maladie osseuse rare étant présenté comme "éventuel" et à long terme.

Objectifs

Le but de ce projet est de développer un traitement pour une pathologie osseuse rare. Il s'agit d'une maladie osseuse génétique qui cause une forme rare de nanisme chez l'être humain (1 naissance sur 100 000). Elle est caractérisée par une petite taille avec un raccourcissement du tronc et du cou, induisant un risque important d'instabilité au niveau des vertèbres cervicales pouvant provoquer une paralysie. Les patients souffrent également d'anomalies au niveau de l'oeil et d’une perte d'audition. Ce projet a pour but de continuer le développement d’un potentiel traitement pour cette pathologie. Ce projet nécessite l'utilisation de souris atteintes de la maladie mimant la pathologie humaine ce qui permettra de tester l’approche thérapeutique validée et l’améliorer.

Bénéfices attendus

Ce projet va nous permettre de faire la preuve de concept chez l’animal d’une approche thérapeutique pour cette maladie rare. Il s’agit d’une maladie rare sévère pour laquelle à l’heure actuelle il n’existe aucune approche thérapeutique. Dans le cas où cette approche fonctionnerait cela nous permettrait de continuer le développement dans le but d’apporter un jour un traitement efficace pour les patients. Il s’agit donc d’un bénéfice éventuel à long terme pour ces patients.

Procédures

Souris: prélèvements de sangs (30s), maximum 7 fois par semaine pour les microprélèvements et 1 fois par semaine pour les prélèvements de 7,5% du volume sanguin circulant. biopsie d'oreille (quelques secondes), une fois dans la vie de l'animal. Injection 1 à 3 fois dans la vie de l'animal (30sec à 10min) Miniporc: prélèvements de sperme (10-20min), maximum 1 fois par semaine. injections (1-60min), maximum 1 fois par semaine dans la vie de l'animal sauf pour les injections terminales 2 dans la même journée. prélèvements de sang (3-10min), maximum 2 fois par semaine.

Impact sur les animaux

Le modèles de souris utilisé dans ce projet est à phénotype dommageable. En effet, les animaux malades présentent des complications qui surviennent de façon chronologique et si les souris survivent les premières semaines, elles restent modérément atteintes. Environ 30% des animaux malades meurent dans les 48 premières heures et environ 10% développent des complications sévères (hydrocéphalie, pectus excavatum, troubles respiratoires) dans les 3 premières semaines de vie. Une attention toute particulière est apportée à ces animaux qui sont surveillés quotidiennement dès leur naissance. En ce qui concerne les souris et miniporc non malades, il n'y a pas d'effets indésirables prévues suite aux procédures. Il s’agit d’injection et de prélèvements réalisés par des personnes compétentes et formées. Les tampons qui sont prévus d’être utilisés sont à pH physiologique et peu visqueux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans les procédures seront euthanasiès à la fin des procédures afin de pouvoir analyser les organes.

Remplacement

Ce projet ne peut pas se faire sans modèle animal car avant de pouvoir envisager un traitement, et de commencer une étude clinique sur les patients souffrant de cette pathologie osseuse, il est nécessaire de démontrer que les molécules choisies ont l'effet attendu au niveau du modèle animal de la maladie et qu'elles ne présentent pas d'effets toxiques majeurs.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé de manière à produire les animaux nécessaires pour la partie expérimentation. Nous avons inclus dans les procédures des contrôles communs dès que possible.

Raffinement

Le suivi quotidien (weekends et jours fériés inclus) des animaux par le personnel de l’établissement utilisateur et les visites régulières des expérimentateurs (à minima trois fois par semaine) nous permettront de déceler précocement tout signe de souffrance ou d’angoisse et nous appliquerons strictement les points limites définis. En cas d'altération de l'état de l'animal, la surveillance sera rapprochée et les animaux seront soignés en fonction de la sévérité de la douleur observée. En cas d'apparition d'une souffrance ou toxicité inattendue, les animaux seront exclus de l'étude et mis à mort dans les 24 heures avec l’accord du directeur d’étude.

Choix des espèces

Ce projet développe un traitement pour une pathologie rare de la croissance. Nous allons avoir besoin de souris pour faire du criblage de thérapie. Cela permet de cribler un grand nombre de molécules rapidement (gestation courte de 3 semaines et 5 à 8 petits en moyenne par portée). Le mini porc est utilisé pour démontrer la pénétration de l'approche thérapeutique dans la plaque de croissance d’une espèce non-rongeur. La plaque de croissance du mini porc est proche de celle de l’homme, donc cette espèce est un bon modèle dans le cadre de cette étude. Nous travaillons sur les porcelets, ce modèle permet d’avoir entre 6 et 10 petits par mise-bas et donc raffiner le nombre de femelles nécessaires. Nous allons utiliser des souris qui sont un mutant spontané caractérisé à l'état homozygote. Ces animaux ont un phénotype de nanisme similaire à la pathologie humaine. Chez la souris, les études de bio distribution seront réalisées sur des animaux âgés de 5 à 8 semaines et pour les études d’efficacité nous utiliserons les animaux de la naissance jusqu’à 18 mois d’âge. Dans le cas des mini porcs, les porcelets seront utilisés de la naissance jusqu’à l’âge de 12 mois maximum et les génitrices jusqu’à ce que les porcelets soient euthanasiés. Il n’est pas possible de remettre les génitrices en croisement après la mise bas. Cela nous permet de couvrir tous les âges potentiels d’utilisation du traitement chez l’homme.

7 200 souris, 1 200 rats et 1 600 hamsters vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever le sang et les organes lymphoïdes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cette société de prestation les expose à des composés vaccinaux ou pharmacologiques par une à cinq injections sous anesthésie, afin de mesurer la réponse immunitaire induite. Le porteur indique attendre des pertes de poids et des douleurs transitoires au point d'injection. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit la complexité observée in vivo, l'évaluation chez l'animal étant présentée comme "nécessaire" pour sélectionner les candidats médicaments.

Objectifs

Notre société développe et propose des modèles de recherche, adaptés aux études visant à mesurer l’efficacité et l’innocuité de candidats thérapeutiques et vaccinaux. La réponse du système immunitaire est une composante importante de notre organisme à considérer dans le développement de nouveaux vaccins ou de nouveaux composés pharmacologiques, en particulier d’origine biotechnologique. En pratique, ces études consistent à injecter, dans la plupart des cas à plusieurs reprises à une ou plusieurs semaines d’intervalle, un produit à potentiel immunogène, dans le but d’évaluer la réponse immunitaire induite (dans le sang et les tissus lymphoïdes). Ce programme de recherche s’intéresse à mieux caractériser cette composante chez le rongeur, et plus particulièrement l’immunogénicité de nouvelles formulations ou composés (adjuvants, vaccins, protéines thérapeutiques, etc.). Pour cela, un composé induisant potentiellement une réponse immune sera injecté aux animaux. Afin d’évaluer et de caractériser cette réponse immune, des prélèvements, sanguins notamment, seront ensuite réalisés tout au long de l’étude afin de suivre, par exemple, l’émergence d’anticorps dirigés contre l’antigène injecté dans le sérum, ou l’activation cellulaire associée spécifiquement au composé d’intérêt. Dans cette procédure, aucun challenge infectieux ne sera réalisé sur les animaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de tester de nouvelles molécules candidates pour une utilisation en préventif de pathologies existantes ou dont l’immunogénicité doit être testée. A terme, cela permettra l’introduction en clinique de nouvelles stratégies thérapeutiques pour cette maladie pour laquelle les options sont pour le moment limitées.

Procédures

Les animaux (rats, souris ou hamsters) immunocompétents ou partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal) transgéniques ou non, humanisés ou non, seront exposés à des composés de différente nature (entité chimique de type vecteur ou adjjuvant vaccinal, biologique, et/oubiotechnologique (nucléique et protéique), etc.) Les animaux recevront en général 1 à 5 injections administrations du produit potentiellement immunogène avec au minimum une semaine d’intervalle entre les injections mais potentiellement plusieurs mois. Cette procédure aura lieu sous anesthésie générale qui durera environ une heure. Afin d’évaluer de potentiels traitements, des composés chimiques ou biologiques seront administrés aux animaux par toutes les voies possibles : intranasale et intratrachéale,soit sous anesthésie générale d’environ une heure, intramusculaire et intradermique sous anesthésie générale d’environ une heure avec analgésie, oralesoit sur animaux vigiles (acte bref d’une minute environ), sous cutanée et intrapéritonéale sur animal anesthésié ou vigile (acte bref d’une minute sur animal vigile, anesthésie d’environ une heure sinon). Les volumes administrés respecteront les recommandations. Les animaux seront observés tous les jours, et pesés au minimum 2 fois par semaine. Le site d’injection sera observé sur les quelques jours suivant l’administration pour surveiller l’absence de réactions dans la zone, et l’état général des animaux sera vérifié. Des prélèvements de sang ou d’urine pourront être réalisés au cours de la vie de l’animal pour le suivi des réponses immunitaires ou d’autres paramètres biologiques. Les prélèvements de sang sur animal vigile prendront environ deux minutes. En cas d’anesthésie, celle-ci durera environ une heure. La fréquence et le volume de ces prélèvements sera conforme aux recommandations vétérinaires pour la voie utilisée. Ces recommandations incluent une potentielle réhydratation sous cutanée des animaux en cas de prélèvements répétés / à volume important. En fin de projet, les animaux seront euthanasiés. Un prélèvement de sang terminal en intracardiaque pourra être réalisé sous anesthésie générale profonde puis des prélèvements d’organes pourront etre effectués après euthanasie.

Impact sur les animaux

Dans ce projet, nous pouvons nous attendre à des pertes de poids et des douleurs transitoires au site d’injection et dans la zone (ganglion drainant).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour récupération de grandes quantités de sang et d’organes lymphoïdes afin de vérifier la réponse immunitaire induit par les vaccinations.

Remplacement

Des modèles in vitro permettent d’étudier certains processus de l’immunité et sont utilisés pour présélectionner les composés les plus intéressants mais aucun ne reproduit la complexité observée in vivo. C’est pourquoi l’évaluation chez l’animal des propriétés immunogènes des candidats médicaments chimiques ou biologiques est nécessaire, pour sélectionner le meilleur composé pouvant être amené dans les études cliniques chez l’homme.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est le plus faible possible en fonction des objectifs de l’étude et de la puissance statistique nécessaire. Entre 3 et 50 animaux seront inclus par groupe. Seuls des rats, souris et hamsters seront utilisés dans le cadre de ce projet. Ces espèces sont utilisées pour tester les effets de composés sur le système immunitaire.

Raffinement

Les prélèvements sanguins sont de faibles volumes et seront réalisés à l’aide de la méthode la moins invasive possible. Les volumes et fréquences d’administration et de prélèvement sont conformes aux bonnes pratiques et toutes les techniques sont réalisées par du personnel formé et compétent. Enfin, les prélèvements d’organes/tissus sont réalisés après euthanasie. Dans tous les cas, les animaux sont observés régulièrement et des mesures sont mises en œuvre pour arrêter, minimiser ou diminuer la souffrance et/ ou détresse de l’animal en cas d’apparition de signe clinique indésirable.

Choix des espèces

Les études à l’aide des petits rongeurs, notamment les souris, sont depuis longtemps la première étape de l’exploration du rôle physiopathologique du système immunitaire ou de l’efficacité de tout nouvel immunomodulateur, qu’il soit d’origine chimique ou biotechnologie. Selon le type de profil immunologique ou le type de prélèvement nécessaire, le rat et le hamster pourront également être utilisés. L’excellente connaissance du système immunitaire des rongeurs, conduisant souvent à une meilleure connaissance du même système chez l’Homme, permet d’explorer de nouvelles pistes immuno-pharmacologiques. Les animaux pourront être partiellement immunodéficients (à un niveau de déficit n’induisant pas de risque infectieux significativement supérieur pour l’animal), puisque cela s’avère d’un fort intérêt pour certaines approches expérimentales pathologiques e.g. maladies infectieuses. Par ailleurs, les rats, les souris et les hamsters autorisent une variété de techniques d’administration et de prélèvement. Seuls les animaux sevrés seront utilisés. Les animaux seront utilisés à partir de 5 semaines pour la mise en œuvre de modèles expérimentaux stables et reproductibles, c’est-à-dire un système immunitaire établi, d’après la littérature sur le sujet.

1 130 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue car porteuses d'une pathologie qualifiée de létale, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie, des injections répétées par plusieurs voies et une nébulisation pour tester des nanoparticules chargées de chimiothérapie contre la carcinose péritonéale. Le porteur indique des douleurs post-opératoires, un gonflement de l'abdomen et une possible perte de poids, l'imagerie servant à repérer les points limites. Il affirme que les interactions entre système immunitaire et tumeur ne peuvent être reproduites in vitro, les bénéfices étant présentés comme une amélioration attendue du traitement.

Objectifs

Ce projet vise à étudier de nouveaux traitements à base de nanoparticules pour la carcinose du péritoine. La carcinose péritonéale est une évolution fréquente de plusieurs cancers intestinaux et gynécologiques et constitue la principale cause de décès chez ces patients. Les thérapies actuelles ne permettent pas aux agents de chimiothérapie d’atteindre efficacement le péritoine. Cela entraîne une mauvaise distribution et pénétration des principes actifs dans la tumeur, générant une mauvaise réponse au traitement pouvant évoluer vers une résistance aux thérapies.

Bénéfices attendus

L'intérêt de cette approche réside dans l'amélioration du traitement et du pronostic des patients souffrant de carcinose péritonéale. Plus largement, l'utilisation de la nébulisation combinée à l'utilisation de nanoparticules pour délivrer des chimiothérapies améliorera la diffusion des médicaments dans la cavité péritonéale et augmentera la pénétration des médicaments dans les nodules tumoraux. Le bénéfice immédiat pour les patients sera la réduction de la fréquence des traitements, la réduction des effets secondaires dus à l'administration systémique des principes actifs et la détermination d’un nouveau mécanisme d’action des nanoparticules basé sur la modulation de la réponse immunitaire.

Procédures

- procédure chirurgicale - 15 min ; imagerie par bioluminescence - 2 min ; injections - >1 min (voie intraveineuse, voie intrapéritonéale, voie sous-cutanée); nebulisation 5 sec; anesthesie - max 20 min. Nombre d'injections: Si bioluminescence: 15 maximum (1 chaque dueux jours) (voie intrapéritonéale) Si tumeur: 1 (voie intrapéritonéale) Si traitment:1 (voie intrapéritonéale ou voie intraveineuse) Si analgesie: maximum 3 ( voie sous-cutanée)

Impact sur les animaux

Effets dus à la chirurgie: - doleur post-operatoire - diminution des mouvements dans la cage. Effets dus au modele tumoral: - un gonflement de l'abdomen - une éventuelle perte de poids. Effet dus à l'administration des produits: - aucun

Devenir

Tous les animaux sont mis a mort a la fin des procedures car, ils sont tous atteint d'une pathologie lethale

Remplacement

L’utilité prédictive des modèles tumoraux chez la souris ne peut pas être remplacée par des études in vitro. L'activité des cellules immunitaires liée à des tumeurs est régulée par de nombreux facteurs dont la plupart sont encore inconnus et donc impossible à reproduire in vitro. Il est très compliqué de recréer in vitro toutes les interactions entre le système immunitaire, les cellules accessoires secondaires et la tumeur car, à l'heure actuelle, toutes ces interactions ne sont pas encore totalement maitrisées. De plus, l'évaluation d'une nouvelle approche thérapeutique, comme celle décrite dans ce projet, doit tenir compte de l'effet du principe actif et de la procédure sur la santé globale de l'animal, ce qui ne peut être réalisé in vitro. Des tests in vitro ont déjà été réalisés pour évaluer la cytotoxicité des nanoparticules sur les lignées tumorales et la capacité des nanoparticules à libérer correctement le médicament et le moment de la libération.

Réduction

Le nombre d'animaux a été estimé par les biostatisticiens comme étant le minimum nécessaire pour obtenir des résultats exploitables. Cette estimation permettra d'analyser avec précision un nombre suffisant d'animaux et d'obtenir des résultats avec une marge d'erreur très faible, évitant ainsi des résultats non concluants et la nécessité de répéter l'étude pour valider les données. Le projet étant conçu par étapes successives, le nombre d'animaux calculé à chaque étape peut être réduit en fonction des résultats obtenus aux étapes précédentes : en fonction de la précision et de la reproductibilité interindividuelle de la croissance tumorale dans le temps, il sera possible de réduire le nombre d'animaux requis pour les expériences suivantes. Par ailleurs, en cas de croissance tumorale lente, il sera possible d'échelonner les séances de bioluminescence afin de réduire le nombre d'anesthésies et d'injections intrapéritonéales que les animaux devront subir.

Raffinement

Les protocoles les moins invasif et le moins douloureux possibles sont privilégies. Des mesures sont prises pour améliorer les conditions d’élevage et de bien-être afin d’enrichir l’environnement des souris. Les animaux porteurs de tumeur sont suivis quotidiennement pour éviter tout souffrances inutiles, et prendre les mesures adéquate dans le cas éventuelle d’apparition de nuisances. Les animaux ayant subit une chirurgie seront monitorés plus suivant et un protocole antalgique est mis en place. L’imagerie par bioluminescence nous permet de déterminer de manière précoce l’apparition des signes de catégorie point limite et ainsi, d’intensifié le suivi des animaux lors de cette étape intermédiaire et d’agir en conséquence (Analgésique ou mise a mort). L’apparition de signe point limite conduit automatiquement a une mise à mort de l’animale concerné pour lui éviter toute souffrance inutile

Choix des espèces

Les souris utilisées sont le modèle primaire et le plus utilisé pour les études oncologiques impliquant le système immunitaire. Le mécanisme immunitaire des souris est largement décrit dans la littérature et de nombreux outils de diagnostic sont disponibles pour effectuer des analyses immunologiques par rapport à d'autres modèles comme les rats. De plus, la disponibilité de différentes lignées cellulaires tumorales murines qui imitent les tumeurs humaines permet d'utiliser des animaux immunocompétents. Les souris seront adultes, âgées de 8 à 10 semaines, car il est nécessaire que le système immunitaire soit développé et mature.

2 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever notamment le cœur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections de cellules sanguines anormales, subissent une ablation des ovaires, un régime gras et l'administration de L-NAME dans l'eau de boisson pour induire une insuffisance cardiaque, avec plusieurs prélèvements sanguins. Le porteur indique que ces procédures peuvent générer des douleurs modérées et transitoires, prévenues par analgésiques. Il affirme que la complexité de la maladie rend le recours à un organisme vivant "nécessaire", les bénéfices pour les patients restant hypothétiques.

Objectifs

Notre objectif est d’étudier le rôle des cellules sanguines anormales dans le développement de maladies du cœur appelées insuffisances cardiaques, caractérisées par l’incapacité du cœur à envoyer suffisamment de sang dans les vaisseaux. Nous rechercherons si ces cellules sanguines anormales accélèrent l’apparition ou aggravent ces insuffisances cardiaques. Nous étudierons également si ces cellules anormales peuvent remplacer certains facteurs participant à l’apparition ces insuffisances cardiaques. Nous déterminerons les propriétés des cellules sanguines qui participent au développement de ces insuffisances cardiaques et chercherons à empêcher leur action en testant des médicaments ciblant les phénomènes identifiés.

Bénéfices attendus

Les insuffisances cardiaques sont responsables de l’hospitalisation de nombreux patients chaque année en France et conduisent au décès de 70 000 personnes. Identifier les cellules sanguines anormales comme responsables de ces maladies permettrait d’identifier les patients les plus à risque et donc d’adapter leur suivi médical. Cela pourrait aussi conduire à la découverte de nouveaux mécanismes contre lesquels des médicaments plus efficaces pourraient être proposés afin d’éviter les décès et les hospitalisations dont les insuffisances cardiaques sont responsables.

Procédures

Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : - pour créer les cellules sanguines anormales : injections de cellules anormales (3 injections sont prévues sur 3 jours consécutifs,

Impact sur les animaux

Certaines des procédures employées peuvent générer des douleurs qui ne persisteront pas dans le temps et resteront modérées. Ceci sera prévenu par l’emploi de produit anesthésiants et antalgiques administré avant la procédure mise en cause et éventuellement après la procédure.

Devenir

A la fin des procédures, l’ensemble des animaux seront sacrifiés. Ceci est indispensable pour prélever les organes que nous étudierons, notamment le coeur.

Remplacement

L‘insuffisance cardiaque est une pathologie complexe mettant en jeu des interactions de divers mécanismes, dont beaucoup restent inconnus, entre de nombreux types de cellules. Etudier l’ensemble de ces acteurs et plus encore leurs interactions ne peut pas à l'heure actuelle être réalisé uniquement par des tests in vitro. Le recours à un organisme vivant proche de l’Homme, et dans lequel nous pouvons à la fois crée des cellules anormales et induire une insuffisance cardiaque (maladie du coeur) est donc nécessaire pour réaliser ce projet.

Réduction

Différentes lignées et modèles sont nécessaires à la réalisation de ce projet pour recréer les différents types de cellules anormales. D’après la littérature scientifique, le nombre d’animaux nécessaires par lot est de 40. Nous utiliserons donc 10 animaux par lot en reproduisant au maximum 5 fois les expériences (marge d’un lot dans le cas de mort prématurée d’animaux ne permettant pas l’aboutissement d’une ou plusieurs expériences). Des analyses de résultats à la fin de chaque expérience nous permettront éventuellement de réduire ce nombre.

Raffinement

L’hébergement des animaux permet de réduire le stress et l’inconfort (animalerie agrée, personnels formés, cage de 3 à 6 animaux maximum en portoir ventilé avec libre accès à l’eau et à la nourriture ainsi qu’un environnement adapté avec igloo cartonné et serpentins de papier à dérouler). Les animaux seront systématiquement anesthésiés lors des administrations intraveineuses et des prélèvements sanguins et nous utiliserons des analgésiques afin de limiter la douleur. Deux fois par semaine, nous évaluerons le bien-être des animaux afin d'identifier les points limites et d'apporter dans les plus brefs délais la mesure adaptée à l'animal.

Choix des espèces

L'utilisation de souris comme modèle d'étude dest pertinente car : - Différentes lignées de souris sont disponibles pour reproduire les cellules anormales étudiées. - Les modèles utilisés nos permettront d'identifier ces cellules anormales. - Le modèle d'induction de l’insuffisance cardiaque chez la souris est couramment utilisé. - Nous disposons du matériel et des compétences nécessaires. Des souris adultes âgées d’au moins 6 semaines au début du protocole seront utilisées. Notre objectif n'est pas d'étudier des processus développementaux mais des processus physiopathologiques. Pour être sûr de ne pas induire de phénotype confondant, les expériences de transfert adoptif de moelle ou l’induction des KO/KI de nos gènes d'intérêt seront réalisés chez des animaux d'au moins 6 semaines.

3 860 souris et 120 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélever la rate et la tumeur, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les animaux reçoivent une immunisation sous la peau et, pour une partie, une implantation de cellules tumorales, le porteur les mettant à mort dès que la tumeur s'ulcère, se nécrose ou dépasse un volume fixé. Il indique tester un adjuvant à base de mélanine pour un futur vaccin contre le glioblastome, tout en affirmant que la souris est l'espèce "la plus adaptée" et que le modèle de gliome implantable n'existe que chez le rat. Les retombées cliniques sont renvoyées après sélection d'un candidat et poursuite du développement pharmaceutique.

Objectifs

Le cancer reste une maladie souvent mortelle, pour laquelle la recherche de traitements innovants est requise. L’induction d’une immunité contre un antigène cible par vaccination à l’aide d’adjuvants classiques (tels que ceux utilisés dans les vaccins anti-infectieux) permet d’obtenir facilement des anticorps circulants. Ces anticorps sont cependant peu efficaces pour lutter contre les tumeurs. L’obtention de lymphocytes T capables de tuer les cellules cancéreuses est plus difficile car les adjuvants disponibles actuellement donnent généralement des réponses faibles ne permettant pas d’induire une réponse antitumorale satisfaisante. Nous avons récemment découvert que la mélanine synthétique utilisée en tant qu’adjuvant vaccinal permettait de stimuler de façon exceptionnelle la réponse immunitaire lymphocytaire contre un antigène peptidique donné (i.e. un fragment de protéine surexprimée ou bien anormalement exprimée par les cellules cancéreuses et présenté à leur surface). Notre but est de poursuivre le développement de notre adjuvant afin d’obtenir à terme un vaccin thérapeutique pour le traitement des cancers humains, en nous concentrant plus particulièrement sur le glioblastome, la plus fréquente des tumeurs cérébrales, pour lequel il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement satisfaisant. Des peptides cibles issus de protéines exprimées dans les glioblastomes humains seront sélectionnés, puis validés par des tests in vitro. La capacité de ces peptides associés à notre adjuvant à base de mélanine à induire une réponse immunitaire et à contrôler la croissance tumorale, sera évaluée in vivo chez la Souris ou le Rat. L’étude chez l’animal est indispensable pour mesurer une réponse immunitaire par lymphocyte et la Souris constitue l’espèce la plus adaptée pour les études immunologiques. Comme il n'existe pas de modèle de gliome implantable en sous-cutané chez la Souris, les effets anti-tumoraux de nos formulations seront évalués chez le Rat, pour lesquels un tel modèle existe.

Bénéfices attendus

La réalisation de ce projet permettra la sélection d’un candidat vaccin pour le traitement du glioblastome, dont nous poursuivrons le développement pharmaceutique avant d’initier les essais cliniques chez l’Homme. A l'issue de ce projet nous aurons : 1- Sélectionné deux peptides-candidats issus de protéines surexprimées ou anormalement exprimées par les gliomes humains 2- Déterminé la formulation (ratio peptide/mélanine, temps de contact) permettant d'obtenir une réponse imunitaire optimale pour chacun des deux peptides 3- Réalisé les études de stabilité de notre adjuvant à base de mélanine synthétique sur 3 ans

Procédures

Les immunisations seront réalisées par injection sous la peau sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une ou deux injections (à deux semaines d'intervalle) seront réalisées par animal. Les implantations de cellules tumorales sous la peau seront réalisées sur animaux anesthésiés. L’ensemble de la procédure dure environ 5 minutes. Une seule implantation sera effectuée par animal.

Impact sur les animaux

L’injection du vaccin est susceptible de provoquer une rougeur, un gonflement, une démangeaison ou une douleur au point d'injection, ce qui fera l'objet d'une surveillance quotidienne. Il est cependant à noter qu'aucune des expériences menées à ce jour n'a mis en évidence de tels effets indésirables. Dans les expériences impliquant l’implantation d’une tumeur sous la peau, un effet indésirable potentiel est l'apparition d'une ulcération ou d'une nécrose de la tumeur. Une surveillance quotidienne des animaux sera mise en place et il sera procédé à leur mise à mort en cas d'ulcération ou de nécrose de la tumeur ou bien dès que celle-ci atteindra un volume déterminé à l’avance et adapté à l’espèce.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chacune des procédures afin de pouvoir obtenir le matériel biologique (rate, tumeur) nécessaire à l'évaluation de la réponse immunitaire.

Remplacement

Il s’agit d’une étude qui nécessite d’être réalisée in vivo pour évaluer la réponse immunitaire et antitumorale après immunisation par voie sous-cutanée. Aucun modèle in vitro n’est en effet prédictif d’une réponse immune chez l’animal ou chez l’Homme, en raison de la complexité des mécanismes biologiques impliqués (interactions cellules présentatrices des antigènes-lymphocytes, interactions cellules immunitaires-tumeur (y compris microenvironnement tumoral)). Cependant, les corrélations entre les résultats obtenus chez l’animal et les résultats des études in vitro menées en parallèle seront évaluées en permanence dans l’objectif de remplacer le modèle in vivo par la prédiction in vitro lorsque cela sera possible.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisé sera réduit au nombre minimum nécessaire et suffisant pour permettre l’analyse statistique des données. Les protocoles de ce projet utiliseront des modèles validés par la littérature, permettant d’obtenir des résultats reproductibles et ainsi de limiter la multiplication des expériences. De plus, les expériences sont conçues de façon à utiliser les mêmes groupes contrôles pour plusieurs préparations vaccinales ce qui permettra de limiter encore davantage le nombre d’animaux. Au total, 3980 animaux seront utilisés dans ce projet, 3860 souris et 120 rats.

Raffinement

Les expériences nécessiteront des procédures peu traumatisantes. Toutes les injections sont effectuées sous anesthésie générale. Les vaccins sont formulés de façon à être bien tolérés et à ne pas induire de douleur ou de réaction indésirable au point d’injection. Chez les animaux porteurs de tumeurs, la croissance tumorale est mesurée tous les 2 à 3 jours à l’aide d’un pied à coulisse, ce qui constitue une procédure non invasive, non douloureuse et peu perturbante pour l’animal. Les animaux font l’objet d’une surveillance quotidienne afin de déceler précocement des signes de souffrance et d’y mettre un terme par une mise à mort anticipée si nécessaire.

Choix des espèces

Souris : La souris est le modèle de choix pour l'étude de la réponse immunitaire. Le système immunitaire des souches utilisées dans ce projet est bien caractérisé et de nombreux outils immunologiques sont disponibles (bases de données et outils de prédiction in silico, réactifs et méthodes permettant d’étudier et de mesurer l’intensité la réponse immunitaire). Il existe un modèle de souris transgéniques dont le système immunitaire est capable de reconnaitre les antigènes tumoraux humains, que nous pourrons utiliser pour valider notre candidat vaccin avant passage aux essais cliniques chez l’Homme. Rat : Il n’existe pas de modèle de glioblastome implantable en sous-cutané chez la Souris. En revanche, il existe un modèle reconnu chez le Rat, que nous allons utiliser dans ce projet. Les animaux seront agés de 5 à 7 semaines en début d’expérimentation, ce qui permet d’utiliser des animaux jeunes adultes dotés d’un système immunitaire mature.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, non pour produire des connaissances mais pour former des étudiants de BUT aux techniques d'expérimentation. Chaque souris reçoit quatre injections d'une neurotoxine provoquant une neurodégénérescence dopaminergique, avant une perfusion transcardiaque réalisée par l'enseignant puis le prélèvement du cerveau. Le porteur indique que le modèle s'accompagne de troubles moteurs, réduction et lenteur des déplacements, qu'il juge modérés au vu de la dose et de la durée. Il affirme qu'il n'existe pas de modèle non animal capable de mimer cette neurodégénérescence et justifie le projet par la "nécessité" pédagogique de la formation.

Objectifs

Les objectifs du projet sont de permettre à nos étudiants, futurs techniciens de laboratoire de recherche, de faire l’apprentissage de la mise en place d’une procédure expérimentale dans un contexte physiopathologique sur animaux de laboratoire, et ce dans le respect de la réglementation et des lois d’éthique sur l’utilisation d’animaux vivants. Ce projet comprendra la caractérisation d'un dysfonctionnement moléculaire et cellulaire dans ce contexte physiopathologique qui est celui de la neurodégénerescence dopaminergique induite par l'administration systémique d’une neurotoxine chez la souris. Il permettra aux étudiants de maitriser certaines techniques d'études de ces dysfonctionnements cellulaires. Les méthodes choisies pour évaluer la perte neuronale seront des techniques immunologiques avec un immunomarquage sur coupes de cerveaux et un immunoblot sur extraits cérébraux.

Bénéfices attendus

Le projet proposé étant à visée pédagogique, les bénéfices attendus sont ceux de permettre l'acquisition de compétences telles que définies dans le programme du BUT-BMB. Ainsi, dans le cadre général de la réalisation d’une procédure expérimentale chez l'animal, tous les aspects allant de sa mise en place à sa validation auront été abordés lors d'enseignements dirigés avant d'être pratiquement effectués avec les étudiants (mise en pratique des techniques de contention et d'administration chez la souris - respect du bien-être animal - analyse comportementale des animaux - prélèvement de tissu). Ce projet permet aussi de sensibiliser les étudiants à la nécessité d'une recherche bibliographique pour faire un choix pertinent de modèle expérimental mimant une pathologie humaine (en mettant l'accent sur la connaissance des limites des modèles expérimentaux). Il permet aussi d'aborder les diverses techniques utilisées pour étudier un processus physiopathologique et/ou pour valider un modèle expérimental et éventuellement l'efficacité d'un traitement.

Procédures

Les substances testées seront administrées par voie intrapéritonéale de manière répétée (4 fois) à intervalle d'une heure. Cinq jours après ces administrations, les souris recevront une injection sous cutanée d'analgésique suivie 20 min plus tard d'une injection intrapéritonéale d'une solution anesthésiante afin de procéder à la perfusion transcardiaque d'une durée d'environ 10 min (réalisée par l'enseignant) de sérum physiologique puis de solution fixatrice avant le prélèvement du cerveau. Chacune des administrations intrapéritonéales et sous cutanées est d'une durée maximale de 30 secondes.

Impact sur les animaux

Ce modèle expérimental de neurodégénérescence dopaminergique s'accompagne d'une réduction progressive de la motricité qui dépend de la dose de neurotoxine administrée. Les troubles moteurs sont donc les effets indésirables attendus (réduction et lenteur des déplacements). Cependant, l'importance de ces troubles devraient être modérée au regard de la dose de neurotoxine choisie et de la durée de la procédure expérimentale (5 jours). Afin de palier l'éventuel impact de ces troubles moteurs sur la prise alimentaire de la souris, des croquettes seront directement mises à disposition de l'animal dans sa cage. Une surveillance biquotidienne des animaux sera effectuée par l’enseignant pendant les 5 jours précédents la mise à mort : surveillance de l'aspect général de la souris, de sa prise alimentaire et hydrique.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure expérimentale lors de la perfusion transcardiaque réalisée par l'enseignant avant le prélèvement du cerveau. Le cerveau est l'organe cible de la neurotoxine sur lequel sera réalisé l'évaluation de la neurodégénérescence dopaminergique.

Remplacement

Le projet s’inscrivant dans le cadre d’une SAÉ (Situation d'Apprentissage et d'Évaluation) consacrée à la réalisation d’une étude moléculaire et cellulaire dans un contexte physiopathologique (SAÉ 3.BMB.02), il permet de répondre aux objectifs et problématique professionnelle de la SAÉ : « inscrire les expérimentations dans un contexte physiopathologique pour caractériser et ou proposer un modèle d’étude ». De plus, il est nécessaire d'avoir recours à des animaux car il n’existe pas de modèle expérimental non animal capable de mimer la neurodégénerescence dopaminergique.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit à son minimum tout en considérant un nombre suffisant pour permettre aux étudiants de tester chaque condition expérimentale. Ainsi, la promotion de 2° année de BUT étant divisée en 4 groupes de TP, les étudiants de chaque groupe travailleront en trinôme avec un total de 4 trinômes par groupe de TP. Chaque trinôme testera chaque condition expérimentale (au nombre de 2) sur une seule souris (condition contrôle, injections de sérum physiologique versus condition perte neuronale dopaminergique, injections de MPTP).

Raffinement

Ce protocole a été adapté pour limiter l'inconfort et le stress des animaux. Une phase d'acclimatation des animaux à leur nouvel environnement (animalerie du département Génie biologique de l'IUT) est instaurée une semaine avant la mise en oeuvre de l'expérimentation au cours de laquelle les animaux sont manipulés par le personnel technique et l'enseignant (préhension et déplacement des cages). Toutes les administrations de substances effectuées par l’étudiant sont pratiquées sous le contrôle de l’enseignant encadrant la SAÉ dans une salle de travaux pratiques du département dédiée à la réalisation de ce projet. Une formation pratique à l’administration de substances aura déjà été faite en 1° année et consolidée au début du semestre au cours duquel sera réalisée cette étude afin de rappeler les consignes de contention de la souris et d’administration par voie i.p. La perfusion transcardiaque étant techniquement plus délicate sera quant à elle réalisée par l'enseignant sous analgésie et anesthésie profonde induites par les étudiants. Une surveillance des animaux sera instaurée après administration des substances jusqu’à la mise à mort (2x par jour pendant 5 jours post-injection (troubles moteurs – troubles du comportement – contrôle de la prise alimentaire et hydrique – contrôle de l’aspect général). Cette surveillance sera effectuée par l’enseignant responsable du projet. Les souris sont placées dans des cages enrichies avec divers objets (copeaux et tunnel en carton). Enfin, les étudiants sont sensibilisés au bien être animal et à la règle des 3R depuis la 1° année de leur formation. L'ensemble du personnel (enseignants - technicien animalier) dispose d'une formation et qualification adéquate à l'expérimentation animale.

Choix des espèces

Outre le primate non-humain, la Souris est l’espèce animale la plus utilisée pour réaliser ce modèle expérimental. De plus, il s'agit plus particulièrement de la souche C57Bl/6J qui est utilisée pour induire la perte neuronale dopaminergique à l’aide de la neurotoxine MPTP. En effet, cette souche est sensible à cette neurotoxine de manière dose-dépendante, ce qui permet de contrôler l'intensité des troubles moteurs et de mimer divers stades de la pathologie humaine. De plus, une administration systémique peut être réalisée chez la Souris car la neurotoxine passe la barrière hématoencéphalique chez cette espèce alors qu'une administration intracérébrale est requise chez le Rat en raison de sa très faible biodisponibilité cérébrale (dégradation enzymatique de la substance par l'endothélium avant son passage de la barrière hématoencéphalique). Les souris utilisées sont des individus adultes qui doivent avoir atteints leur maturité cérébrale (environ 6 semaines)