Souris

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie de la patte leur inflige une douleur neuropathique maintenue pendant sept semaines, avec des tests de douleur répétés et, pour certaines, une injection de naloxone déclenchant un syndrome de sevrage. Le porteur précise que l'allodynie mécanique ne peut être soulagée "car c'est l'objet de l'étude", et attend une perte de poids transitoire, pour évaluer une association méthadone-gabapentine. Il affirme le remplacement "impossible", la douleur ne pouvant être observée que chez l'animal vivant et vigile.

Objectifs

La douleur neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux somatosensoriel, généralement chronique elle affecterait 5 à 7% de la population française. Les traitements actuels ne sont pas efficaces chez tous les patients et leurs effets secondaires conduisent de nombreux patients à arrêter le traitement. Antidépresseurs, anticonvulsivants (Gabapentine) et tramadol/tapentadol sont parmi ces traitements. En clinique, les opiacés classiques (morphine, fentanyl) sont de moins en moins prescrits pour soulager ce type de douleur du fait de leurs nombreux effets indésirables et de la crise des opiacés qui existe aux États-Unis en particulier. Les médecins se tournent alors de plus en plus vers la méthadone qui est actuellement utilisée dans de nombreux pays, mais pas encore en France, comme traitement antalgique des douleurs complexes liées au cancer. Ces douleurs complexes et chroniques mêlent des douleurs par excès de nociception ainsi que des douleurs neuropathiques, ce qui rend difficile leur évaluation et leur traitement. L’objectif de ce projet est de tester l’efficacité de la méthadone seule mais également en association avec un traitement plus courant la Gabapentine dans le soulagement des douleurs neuropathiques périphériques dans un modèle murin. L’association de ces 2 molécules permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Plusieurs doses seront testées afin de trouver une association de doses idéale, c’est-à-dire provoquant un soulagement idéal de la douleur neuropathique avec les plus petites doses possibles (ce qui provoquera donc le moins d’effet indésirable possible). Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Bénéfices attendus

Le projet s'inscrit dans une démarche de raffinement des traitements existants chez l’Homme pour soulager les douleurs neuropathiques. L’association de méthadone et de gabapentine (anticonvulsivants déjà utilisé à plus fortes doses en clinique dans le traitement des douleurs neuropathiques) permettra de cibler des cibles moléculaires différentes, de réduire les doses efficaces et donc les effets secondaires avec une même activité antalgique. Le but final de ce projet sera de proposer une association présentant la meilleure efficacité avec le moins d’effet indésirable pour des essais cliniques.

Procédures

Les animaux seront soumis à une douleur chronique pendant 7 semaines. Les animaux subiront donc une chirurgie au niveau de la patte droite de l'animal d’une durée de 5 min environ sous anesthésie générale. Ces animaux subiront également 6 fois le test de douleur durant une vingtaine de minutes environ avant la chirurgie neuropathique puis trois fois par semaine (délai de 5 jours minimum après la chirurgie avant la reprise des tests) pendant 5 semaines. Les animaux auront un traitement par un analgésique potentiel (méthadone, gabapentine, morphine ou 2 de ces molécules associées) dans leur eau de boisson 15 jours après l’induction de la douleur neuropathique Certains animaux seront soumis à un syndrome de sevrage modéré par une injection de naloxone.

Impact sur les animaux

Il y a présence de douleur, plus particulièrement une allodynie mécanique qui ne peut être soulagée car c'est l'objet de l'étude. Suite à la chirurgie neuropathique (présente dans toutes les procédures de ce projet), une difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais disparaît dans les 48-72h après la chirurgie, une perte de poids transitoire peut se produire. Le traitement par la méthadone peut produire un syndrome de tolérance, d’hyperalgésie ou de sevrage, normalement peu présents voir pas présents aux doses utilisées dans ce projet. Un effet positif, antidouleur, induit par les traitements est également attendu.

Devenir

Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.

Remplacement

Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, la caractérisation de la douleur nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez l’animal vivant et vigile.

Réduction

Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que faire se peut le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre de souris nécessaire a été calculé mathématiquement et les effets de la combinaison des deux traitements sera évalué par les tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux sont hébergés en animalerie dont la température, l’humidité et le cycle jour/nuit sont contrôlés, nourriture et boisson sont disponibles ad libitum. Ils seront hébergés en cohorte de 4 ou 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton et de la frisure seront placés dans la cage pour favoriser la nidation pour limiter les comportements d’agressivité, et des barreaux de bois à ronger pour favoriser le comportement naturel du rongeur de ronger. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant la chirurgie d’induction de douleur neuropathique des méthodes d’anesthésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites pour limiter la souffrance de l’animal sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, ces nouvelles pratiques pourraient être intégrées au projet.

Choix des espèces

Les modèles d’animaux neuropathiques utilisés dans cette étude ont été caractérisés et validés pharmacologiquement chez la souris (travaux antérieurs de notre équipe) et non dans une autre espèce comme le rat par exemple. Etant donné que l’étude de comportements nécessite des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).

200 souris et 200 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une injection de manganèse à travers le tympan puis une IRM d'une heure et demie, pour mettre au point une imagerie des acouphènes servant à tester des candidats médicaments. Le porteur signale un inconfort de l'oreille après l'injection et indique que les animaux sont tués juste après l'IRM parce que le manganèse, toxique à forte dose, est incompatible avec leur maintien en vie. Il affirme qu'aucune méthode alternative validée ne permet de mesurer les acouphènes chez l'animal.

Objectifs

Développer des techniques IRM comme marqueur des acouphènes chez le rongeur en vue de développer et tester des médicaments traitant ce trouble.

Bénéfices attendus

Consolidation scientifique de cette technique d’imagerie pour évaluer l’efficacité de candidat médicament sur les acouphènes.

Procédures

Tous les animaux vont subir une imagerie IRM pendant 1h30 maximum.

Impact sur les animaux

Inconfort au niveau de l'oreille après l'injection trans-tympanique du manganese.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés en fin de procédure afin d'éviter les effets du marqueur nécessaire pour détecter les acouphènes (MnCl2). Une forte dose de MN2+ peut produire de signes cliniques qui représentent des points limites, donc l'incompatibilité avec le maintien des animaux au-delà de l'acquisition IRM.

Remplacement

Dans le cadre de ce projet, le recours à l’animal de laboratoire est nécessaire car il n’existe pas de méthodes alternatives validées pour mesurer la présence d'acouphènes chez l'animal et l'activité cérébrale in-vitro. Il reste nécessaire de vérifier l’efficacité des principes actifs avant de poursuivre le développement chez l'Homme.

Réduction

Le développement d’une technique IRM du sodium permettra à l’avenir de garder les animaux dans le temps. Cette technique sera complètement non invasive et permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés en les gardant pour qu’ils puissent être leurs propres contrôles dans le temps.

Raffinement

Nous avons choisi d'utiliser l'IRM comme methode quantitative de mesure des acouphènes afin d'éviter une approche par électrophysiologie neurochirurgicale avec l'implantation d'électrodes dans le cortex auditif. Cette méthode, moins invasive, ne nécessite pas un point limite associé à la technique de'IRM en elle même. Les animaux sont euthanasiés directement après la mesure IRM sans réveil après l'IRM. L'approche de l'anesthésie sous isoflurane, nous permet de conserver une anesthésie constante et régulière pour éviter le stress d'un réveil de l'animal. Nous conservons les animaux sur un plateau chauffant à température nécessaire pour éviter l'hypothermie de l'animal.

Choix des espèces

Le modéle des acouphénes chez le rat et la souris est validé dans la litérature. Selon les données préliminaires de pharmacologie obtenues sur le traitement des acouphénes, le choix de l'espace s'orientera vers la souris ou le rat. Les animaux utilisés sont des adultes avec une oreille interne complètement formée et fonctionnelle. Cela implique l’utilisation d’animaux âgés au minimum de 4 semaines.

346 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, un suivi de la tumeur trois fois par semaine sous anesthésie et, pour une partie, des injections d'anticorps, afin de tester le blocage d'une réponse immunitaire régulatrice sur la croissance de la tumeur. Le porteur présente cette approche comme une possible alternative ou un complément au traitement anti-PD1. Il conclut que la complexité des réactions immunitaires rend "nécessaire" l'expérimentation in vivo.

Objectifs

Notre système immunitaire est divisé en deux: une réponse inflammatoire qui protège l'organisme contre les infections et les cancers, et une réponse immunitaire régulatrice (anti-inflammatoire) qui contre-balance la réponse inflammatoire pour éviter des réponses trop fortes ou non nécessaires, et donc l'apparition de maladies autoimmunes ou d'allergies. Cependant, il est suggéré que la réponse immunitaire régulatrice peut également avoir un rôle néfaste, comme dans le cancer où elle pourrait empêcher l'élimination de la tumeur par notre corps. D’un point de vue thérapeutique, il serait donc intéressant de bloquer la réponse immunitaire régulatrice dans le but de stopper la croissance tumorale. Pour imaginer bloquer la réponse régulatrice, il est nécessaire d'en comprendre les mécanismes sous-jacents, en particulier la façon dont elle est régulée. Dans ce projet, nous souhaitons donc déterminer les molécules impliquées dans la mise en place de la réponse régulatrice dans un contexte tumoral. Nous testerons dans une seconde partie le potentiel thérapeutique des molécules identifiées en les bloquant à l'aide d'anticorps pour voir si cela arrête la croissance tumorale. Ceci nous permettra de déterminer si bloquer ces molécules pourraient être utilisé comme traitement en complément des thérapies actuelles.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux comprendre les phénomènes contrôlant la réponse anti-inflammatoire, ainsi que le rôle des cellules régulatrices impliquées dans le cancer. L'étude des mécanismes induisant la réponse T régulatrice dans la tumeur, ainsi que le blocage de cette réponse pourraient permettre d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pouvant servir dans le traitement du cancer. De plus, ce projet nous permettra de déterminer si le blocage de ces cibles pourrait se réveler comme une meilleure alternative au traitement actuel anti-PD1 ou alors en améliorer son efficacité.

Procédures

Lors de la première partie du projet, 94 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces 94 animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 50 minutes. Lors de la deuxième partie du projet, 252 animaux seront anesthésiés au jour 0 puis injectés en sous-cutané avec des cellules tumorales (durée : 5 minutes). Par la suite, ces animaux seront anesthésiés trois fois par semaine pendant 3 semaines maximum pour le suivi de la croissance tumorale (prise de photos + mesure de la tumeur) (durée : 5 minutes x 9 traitements =45 minutes). Ces animaux seront également injectés par voie intrapéritonéale 3 fois par semaine pendant 3 semaines (durée : 10 secondes x 9 injections = 1 minute 30 secondes). Au total, la durée de cette procédure expérimentale par souris est de 51 minutes 30 secondes.

Impact sur les animaux

Les animaux développeront une tumeur localisée sur le flanc, au niveau du point d’injection des cellules. Des résultats préliminaires de notre équipe démontrent que ce type de greffe n’engendre pas de métastases au niveau d’autres sites. Nous avons déjà fait des injections intrapéritonéales d’anticorps sur d'autres modèles par le passé, et n'avons observé aucun changement de comportement de la part des animaux traités, cependant une rougeur pourrait survenir au point d'injection. Le traitement avec des anticorps devrait faire régresser la tumeur. Tous les animaux seront surveillés se traités selon les points limites énoncés.

Devenir

A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort pour analyser la croissance tumorale et la réponse immunitaire au niveau des ganglions lymphatiques et de la tumeur.

Remplacement

Les cibles (molécules et cellules) étudiées dans ce projet ont été identifiées grâce à des travaux menés in vitro et in silico par notre équipe et par d'autres laboratoires. Les phénomènes mis en œuvre dans ces réactions immunitaires mettent en jeu plusieurs organes (tumeur et ganglions lymphatiques) et réseaux impliquant plusieurs types cellulaires. Cette complexité rend nécéssaire l'utilisation d'expériences in vivo pour comprendre la réponse immunitaire et et son implication dans la croissance tumorale.

Réduction

Ce protocole sera appliqué à un maximum de 346 souris, permettant de caractériser la réponse T régulatrice dans la croissance tumorale, et son potentiel en tant que cible thérapeutique. Les groupes comporteront 8 souris, ce qui est l'effectif minimal pour avoir des résultats statistiquement interprétables pour les paramètres étudiés (fréquence de Tregs et taille de la tumeur) à l'aide d'un t-test. Deux expériences pilotes seront effectuées avec un nombre limité de souris par groupe, ce qui permettra de déterminer 1) la lignée cellulaire la plus appropriée, 2) les doses d'anticorps à injecter. De plus, nous allons tout d'abord étudier une lignée de souris dans laquelle le gène d'intérêt est absent dans tout l'organisme, puis, si des résultats intéressants sont produits, d'étudier ensuite la lignée de souris dans laquelle le gène est absent dans un type cellulaire donné. De la même manière, nous essayerons de bloquer la signalisation de OX40L avec des anticorps, seulement si nous obtenons des résultats prometteurs au cours de la partie 1 concernant le rôle de cette molécule.

Raffinement

Les animaux seront gardés en groupe dans leur cage pour préserver les interactions sociales, avec un enrichissement. L'injection de cellules tumorales, les prises de photos et les mesures de la taille de la tumeur seront faites sous anesthésie gazeuse légère. Après ces traitements, les animaux seront placés sous une lampe chauffante et surveillés jusqu'à leur réveil. Les sites d'injections d'anticorps seront alternés. Tout au long du protocole, les animaux seront surveillés de manière visuelle et selon la grille d'évaluation de la douleur établie. Si un animal dépasse le point limite établi, il sera retiré de l'étude et pourra bénéficier de soins après l'avis du vétérinaire. Si le cas est plus grave, l'animal sera euthanasié.

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans les réponses immunitaires mettent en jeu différents organes, ce qui rend nécessaire l’utilisation d’expériences in vivo pour étudier ces mécanismes. Le modèle choisi est la souris car elle présente un système immunitaire similaire à celui de l’Homme avec une immunité innée et une immunité adaptative. Les animaux seront utilisés à partir de 10 semaines après la naissance afin d’étudier le système immunitaire à l’âge adulte.

120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis réutilisées comme animaux de réforme ou pour d'autres travaux pratiques. Hébergées seules pendant cinq jours en cage à métabolisme, sur une grille métallique de surface réduite, elles reçoivent un diurétique dans leur nourriture pour que des étudiants de Master mesurent la fonction rénale. Le porteur reconnaît que cet hébergement individuel génère des nuisances, tout en jugeant le traitement sans gravité. Il indique que l'usage de rongeurs reste "nécessaire" à la formation, l'étude des effets du diurétique ne pouvant selon lui se faire que sur un animal.

Objectifs

Ce projet est dispensé sous la forme de séances de travaux pratiques pour des étudiants de première année de Master. Il a pour objectif de les initier à l'expérimentation en cage à métabolisme pour évaluer les fonctions rénales à l'aide d'analyses statistiques à partir de données biologiques qu'ils auront collectées. Plus particulièrement, les étudiants seront amenés à tester les effets d'un diurétique (le furosémide) utilisé couramment en médecine humaine pour diminuer le volume sanguin, chose souhaitable dans le cadre de certaines maladies à oedèmes, l'hypertension artérielle ou les insuffisances cardiaques. D'un point de vue pratique, le furosémide est adapté à une expérimentation courte car ses effets sont rapides. Celui-ci provoque une augmentation du volume des urines, et donc une diminution du volume sanguin.

Bénéfices attendus

Ces séances de travaux pratiques visent à familiariser les étudiants de première année de Master à l'analyse in vivo de la fonction rénale de souris placées en cage à métabolisme, ce qui permet également de les sensibiliser aux problèmes méthodologiques de ce type d'expérimentation qui a pris une place centrale dans les stratégies d'élucidation de mécanismes physiopathologiques à la suite du développement de modèles animaux transgéniques. Plus globalement, ces séances de travaux pratiques permettent de familiariser les étudiants à l'utilisation des animaux à des fins scientifiques et à leur manipulation dans des conditions réglementaires.

Procédures

Tous les animaux seront hébergés en cages à métabolisme individuelle durant une période de 5 jours. Durant cet hébergement, une diète alimentaire standard sera présentée aux animaux sous forme de nourriture en poudre, avec eau déminéralisée ad libidum. Le furosémide sera additionné à la nourriture en poudre en fin de matinée du 4ème jour jusqu'au 5ème jour. Durant les 5 jours, les urines seront collectées, et la prise d'eau et de nourriture seront mesurés. Ces analyses ne nécessitent pas la manipulation des animaux. En revanche, le poids des animaux sera déterminé quotidiennement et nécessitera la sortie des animaux de leur cage à métabolisme le temps de leur pesée (30 secondes à 1 minute). Pour cette mesure, les animaux seront manipulés à l'aide d'un tube en polycarbonate.

Impact sur les animaux

Les animaux seront placés en cages à métabolisme. Celles-ci sont transparentes et disposées les unes à côté des autres. Cela permet le maintien du contact visuel, olfactif et acoustique entre les congénères. Les cages seront placées dans une pièce dédiée, calme, avec une température contrôlée à 22°C +/-2°C et bénéficiant d’une périodicité jour/nuit de 12h/12h. Cependant, ce type d’hébergement génère des nuisances sur les animaux car ceux-ci sont hébergés individuellement, et se déplacent sur une grille métallique de surface réduite. Hormis l'hébergement en cage à métabolisme, le traitement au furosémide durant une journée ne relève d'aucune gravité. Celui-ci provoque transitoirement l'augmentation de la diurèse des animaux, mais celle-ci ne s'accompagne pas d'une déshydratation car les animaux ont libre accès l'eau de boisson durant toute la procédure expérimentale.

Devenir

Le traitement au furosémide des animaux durant une journée n'entraîne aucun phénotype dommageable. En conséquence, tous les animaux pourront être réutilisés par l'EU comme animaux de réforme, ou pour d'autres types de séances de travaux pratiques (démonstration de la préhension/contention d'animaux, ...).

Remplacement

Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux par des méthodes alternatives (études de films, analyses d'articles scientifiques, méthodes in vitro, ...) est préféré. Toutefois, l'un des objectifs de la formation en Master à laquelle les étudiants sont inscrits est notamment de les former à la compréhension des mécanismes qui sous-tendent les différentes fonctions physiologiques et pathologiques chez les animaux ou l’humain. De ce fait, l'utilisation de rongeurs reste nécessaire : l'étude des effets d'un diurétique (furosémide) sur la fonction rénale ne peut se faire que sur un animal. Durant les expérimentations, une attention particulière sera portée aux points limites nécessitant une euthanasie de l'animal.

Réduction

Ce projet a une durée de 5 ans, et est dispensé une fois par an. Chaque année, l'effectif est volontairement limité à 24 étudiants répartis en 4 groupes afin de tenir compte des exigences liées à la surface d'expérimentation de la pièce dédiée à l'hébergement en cage à métabolisme. Les résultats de chaque groupe seront analysés séparément. Ce projet nécessite 6 souris par groupe d'étudiants, soit un total de 120 souris (4 groupes d'étudiants x 6 souris par groupe x 5 ans). Par ailleurs, nous limiterons le nombre d'animaux en réalisant les expériences sur un même animal, car les mêmes animaux fourniront les données contrôles (jours 10 et 11) et les données provenant du test au furosémide (jour 12). Par ailleurs, le traitement au furosémide des animaux durant une journée n'entraîne aucun phénotype dommageable. En conséquence, tous les animaux pourront être réutilisés comme animaux de réforme, ou pour d'autres types de séances de travaux pratiques (démonstration de la préhension/contention d'animaux, ...).

Raffinement

Préalablement à leur hébergement en cages à métabolisme, les animaux en provenance du fournisseur agréé subiront une période d'acclimatation de 7 jours en stabulation (accès libre à la nourriture et à de l'eau filtrée) dans des cages ventilées (maximum 5 animaux par cage) dans les locaux de l'établissement utilisateur, et selon les normes en vigueur dans cet établissement utilisateur (température de 22-24 °C, éclairage de 7h à 19h, régime standard, litière : rafle de maïs, change une fois par semaine). Par ailleurs, l'environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal et des cylindres en carton. L'hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l'établissement utilisateur, et selon les mêmes normes que celles liées à l'hébergement en cages ventilées (température de 22-24°C, et éclairage de 7h à 19h). Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur. Le taux d’encadrement des étudiants sera d’un enseignant par groupe d’étudiants (soit 6 étudiants), ce qui est élevé dans les conditions standards de travaux pratiques (1 enseignant pour 20 étudiants). Cela permettra d’assurer une vigilance constante sur la mise en œuvre des bonnes pratiques d’expérimentation par les étudiants.

Choix des espèces

Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris en raison de l'existance de nombreuses données publiées dans la littérature concernant les effets du furosémide sur la fonction rénale de ces animaux. Nous utiliserons des souris adultes jeunes âgées de 8-10 semaines dans le but d'évaluer les effets du furosémide sur le phénotype rénal à un stade pour lequel la fonction rénale n'est pas physiologiquement altérée par l'âge.

120 souris mâles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection virale dans la veine de la queue, un gavage de glucose et des injections d'insuline et de tyloxapol, entrecoupés de nombreux prélèvements de sang, pour étudier le rôle d'un récepteur du foie dans les maladies liées au gras. Le porteur décrit des douleurs après les injections et les prélèvements, prises en charge par un analgésique. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ou informatique ne peut remplacer l'animal pour mimer la complexité d'un organisme, et rappelle qu'aucun traitement efficace n'existe à ce jour.

Objectifs

Les pathologies métaboliques touchant le foie se développent de plus en plus dans les pays industrialisés et peuvent évoluer vers des formes plus graves de la maladie pouvant se révéler mortelles. A ce jour, aucun traitement n’est disponible, mais certains acteurs du métabolisme du cholestérol peuvent constituer de nouvelles cibles d’intérêt. L’activité du récepteur P2Y13 est particulièrement étudiée par notre équipe. Dans ce projet, nous souhaitons étudier son rôle, en procédant à son invalidation au niveau hépatique, chez des souris soumises à un régime riche en graisses. Nous y étudierons le développement de l'insulino-résistance, de la stéatose et de la fibrose hépatique afin d'évaluer l'implication de ce récepteur dans le développement ou la protection contre ces pathologies. Les résultats obtenus constitueront un appui de recherche fondamentale et pré-clinique permettant d’évaluer l’importance physiologique et physiopathologique du récepteur P2Y13 dans le développement des pathologies métaboliques touchant le foie. Ils définiront une potentielle cible thérapeutique pour la prévention ou le traitement de ces maladies, pour lesquelles, pour rappel, il n'existe pour l'heure pas de composés suffisamment efficaces.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d'identifier l'implication du récepteur P2Y13 au niveau hépâtique dans l'établissement de la steatose hépatique.

Procédures

La solution de particules adenovirales (AAV) sera injectée dans la veine caudale (1 injection par souris sur toute la durée de l’expérimentation). Au cours de l'expérimentation, chaque souris recevra un gavage oral de glucose accompagné de 2 prélèvements sanguin à la veine caudale (30 min avant et 15 min après l’administration du glucose), 1 injection intra-péritonéale d'insuline suivi de 5 prélèvements à la veine caudale (0, 30, 60, 90, et 120 min après l’injection d’insuline) et 1 injection de tyloxapol suivi de 5 prélèvements à la veine caudale (0, 1, 2 et 4h après l’injection de tyloxapol) Pour chaque animal, les interventions de gavage au glucose et d’injection intra-péritonéale d’insuline et de Tyloxapol seront espacées de 8 jours .

Impact sur les animaux

Douleurs post-injection et post-prélèvement sanguin : un analgésique (Carprofen 5mg/kg, dilué dans PBS stérile) sera administré par voie sous-cutanée à la fin de la manipulation et le lendemain.

Devenir

A l'issue de l'étude, les animaux seront euthanasiés et les tissus prélévés seront utilisé au maximum dans une démarche de recherche scientifique saine et préaleblement inteligement réfléchie.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le rôle hépatique du récepteur P2Y13 dans le développement de la stéatose hépatique (NAFLD) et de la stéatohépatite non alcoolique (NASH). Afin de mimer au mieux la complexité d’un organisme, aucun modèle actuel (études in vitro ou études informatiques) ne permet de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour ce genre d’étude.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé pour pouvoir réaliser des analyses statistique au terme de chaque procédures suivant les recommandation mathématiques de chaque situation (ANOVA ou Student t-test) Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons validé et adapté l’ensemble des analyses biologiques à de petites quantité de matériel (sang, tissus) et nous avons optimiser l’obtention de plusieurs paramètres sur un même animal quand cela est possible, telle que la réalisation de procédures différentes à 8 jours d’intervalle. Les procédures se feront uniquement sur des souris mâles car l’étude de la contribution des œstrogènes n’est pas pertinente dans notre projet.

Raffinement

Plusieurs mesures seront mises en œuvre pour respecter /optimiser le bien-être des animaux utilisés et la fiabilité́ des résultats qui seront obtenus. Ces solutions sont détaillées ci-dessous: Bien-être : -L'hébergement des animaux dans des locaux totalement adaptés (zootechnie de Rangueil) -Le respect de la période d'acclimatation de l'animal (4 jours) -Une surveillance quotidienne de l'animal par du personnel qualifié -Euthanasie de l'animal s’il est détecté́ comme étant en souffrance (prostration, perte de poids supérieure à 20%) -La présence d'un enrichissement (papier ou igloo) dans chaque cage -Plusieurs animaux par cage en conservant les groupes sociaux constitués au départ (4 au minimum à 6 au maximum) -Utilisation de l'anesthésie générale lors des procédures expérimentales qui le nécessite (Procédure n°1). Faire les injections et les prélèvement sanguins au niveau de la veine caudale par un expérimentateur formé à la manipulation et l'utilisation des animaux, et, ayant de l'expérience sur les méthodes. Utiliser un analgésique en péri- et post-injection (Carprofen). Surveillance des animaux par la responsable SBEA de la zootechnie afin d'optimiser les soins aux animaux après les procédures expérimentales Optimisation des expériences: -Notre recul sur la qualité́ des mesures enregistrées aux cours des procédures telles que les test de tolérance au glucose et a l’insuline (procédure n°3 et 4) ou la mesure de la sécrétion hépatique des VLDL (procédure 5). -La réduction du nombre d'animaux: optimiser l'obtention de plusieurs paramètres sur un même animal quand cela est possible ; des aliquots dédiés de différents organes seront réalisés afin d'optimiser leur utilisation pour diverses analyses biologiques (western blot, séquençage, analyses biochimiques,...). -Optimisation de la qualité́ des données par la mise en place de conditions optimales pour leur obtention (pièce calme, réduction du nombre d'expérimentateur dans la pièce à 1 ou 2) et à l’utilisation de test statistiques appropriés (ANOVA ou Student t-test selon les recommandations mathématiques de chaque situation)

Choix des espèces

L'espèce souris est choisie pour ce projet car il générera des données qui compléteront des résultats déja obtenus sur ce modèle. D'une manière générale, nous disposons d’une grande expertise de l’utilisation de cet animal et des procédures nécessaires à la réalisation de nos travaux. Ce modèle permet en outre d’étudier l’implication de différentes voies de signalisation et la communication entre les différents tissus de l'organisme. De plus, les données scientifiques de référence sont très nombreuses permettant d’avoir un recul sur la qualité de nos résultats. Enfin, la souris est un animal qui possède un taux élevé de reproduction ce qui permet d’avoir à disponibilité un nombre suffisant d’animaux pour la réalisation de nos travaux. Les souris seront utilisées à l’âge de 8 semaines, ce qui correspond à des animaux matures, ne manifestant pas d'altérations du métabolisme énergétique ou d'atteintes hépatiques qui peuvent être observées chez des souris plus agées.

245 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une chirurgie abdominale sous anesthésie avec injection de cellules souches dans les testicules, pour y induire des tumeurs et vérifier que ces cellules reprogrammées gardent leur capacité à se différencier. Le porteur indique que les sutures peuvent provoquer des blessures que l'animal s'inflige lui-même, ainsi qu'une perte de poids, et que les souris sont mises à mort au plus tard huit semaines après l'injection. Il présente les retombées pour la médecine régénérative comme "cruciales" tout en les renvoyant au conditionnel, et conclut que la démonstration ne peut être réalisée sans recours au modèle animal.

Objectifs

Au début du développement, les cellules de l’embryon ne sont pas spécialisées dans une fonction. Ces cellules dites « souches » vont ensuite acquérir des identités spécialisées et devenir par exemple des cellules du muscle ou des neurones. La possibilité de changer l’identité établie de cellules, par des procédés expérimentaux appelés reprogrammation, génère des espoirs en médecine régénérative. Il est possible de former des cellules souches induites à partir d’une autre cellule, un fibroblaste. Au cours de ce processus les cellules perdent leur identité et passent dans un état particulier qui leur permettra de devenir souches. Deux gènes ont été identifiés et semblent être impliqués dans la régulation de l’identité cellulaire au cours de la reprogrammation. Leur présence ou absence affecte l’efficacité de la reprogrammation. Nous souhaitons alors étudier comment la présence ou l’absence de ces deux facteurs dans la cellule de départ affecte l’acquisition des propriétés souches dans les cellules reprogrammées. Dans le cadre du projet différents types de cellules avec des identités spécialisées sont reprogrammées en cellules souches induites. Le potentiel souche des lignées de cellules souches induites obtenues doit être ensuite confirmé par des tests chez l’animal, qui consistent en l’injection de cellules souches induites chez la souris adulte afin d’induire des tumeurs bénignes. Ces tumeurs ne disséminent pas et sont constituées, non pas de cellules cancéreuses, mais de cellules souches induites qui auront changé d’identité. L’enjeu principal de ces tests est donc d’identifier les types cellulaires spécialisés une fois la tumeur bénigne formée, grâce à des analyses au microscope des tumeurs collectées.

Bénéfices attendus

L’identification des régulateurs de l’identité cellulaire et la compréhension de leur mode de fonctionnement au cours de la reprogrammation serait de grande importance pour la médecine régénérative. Ces connaissances seront cruciales afin de générer des cellules de haute qualité avec une bonne efficacité. De plus, les cellules souches induites contribuent largement dans le domaine de modélisation des maladies et le développement des stratégies thérapeutiques. Par ailleurs des mécanismes peuvent être conservés dans des modèles de cellules souches à l’origine de pathologies humaines telles que le cancer. En conséquence, approfondir la connaissance des mécanismes moléculaires qui régissent l’identité des cellules souches induites présente aussi un enjeu pour la cancérologie. Les travaux in vitro nous ont permis d’identifier deux nouveaux régulateurs limitant ou favorisant la génération des cellules souches induites en partant de différents types de cellules spécialisés. Nous sommes en train d’identifier le réseau de gènes régulé par chacun de ces deux facteurs. Pour approfondir ces résultats nous souhaiterons donc étudier in vivo comment ces gènes pourront affecter les propriétés des cellules souches induites et donc mieux comprendre leur mode de fonctionnement.

Procédures

Les souris seront soumises à une unique procédure chirurgicale d'une durée de 20 min sous anesthésie générale et traitement antalgique pour éviter toute douleur. La procédure consistera en une incision au niveau de l’abdomen et une injection des cellules en suspension dans les testicules des animaux en conditions stériles. L’abdomen sera ensuite refermé et l’animal sera suivi post-réveil de l’opération ainsi que tout au long de la formation des tumeurs.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables qui sont attendus pour les animaux sont ceux qui peuvent découler : i) de la procédure chirurgicale (inflammation, infection et douleurs localisées), ii) de la présence de sutures cutanées qui peuvent entrainer des blessures cutanées à posteriori causes par l’animal lui-même par démangeaisons iii) de douleurs et de modifications du comportement de la souris (perte de poids) liées à la procédure.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort après une anesthésie générale dès l'atteinte des points limites ou après une période maximale de 8 semaines après l'injection des cellules souches dans les testicules. Les testicules seront ensuite prelevées et une analyse histologique sera faite au sein de nos laboratoires.

Remplacement

Jusqu’à présent, le projet a complètement été mené grâce à des expériences sur cellules murines en culture, donc sans faire appel à aucun modèle animal. Néanmoins, afin de pouvoir conclure sur ces résultats et pouvoir les publier, il est nécessaire de démontrer par d’autres approches, que les cellules souches induites maintiennent leur capacité de générer toutes les cellules de l’embryon. Cela ne peut être réalisé sans le recours à des modèles animaux.

Réduction

Le nombre de souris injectées sera réduit à 245 (49 groupes de 5 souris) pour les raisons suivantes : - Le choix des testicules comme site d’injection permet de doubler le potentiel de développement de tumeurs bénignes sans augmenter le nombre d’animaux. - Le résultat attendu de ce projet est l’observation qualitative de cellules/tissus spécialisés au sein des tumeurs mais nous ne recherchons pas d’effet statistique, permettant ainsi de réduire la taille des groupes d’animaux. Notre expérience antérieure nous permet de prédire que 2 souris sur 3 injectées avec des cellules souches développent des tumeurs. Ceci, combiné aux données de la littérature, nous permet de réduire le nombre de souris receveuses à 5 par condition pour obtenir un nombre suffisant de tumeurs analysables et ne pas reproduire l'expérience inutilement.

Raffinement

Durant toute la procédure, et en particulier dès le réveil post-chirurgie, les souris seront observées régulièrement (3 fois par semaine) afin d’identifier tout signe potentiel de mal-être ou de souffrance. Nous avons défini une série de points limites conduisant à l’arrêt de nos protocoles et à la mise à mort immédiate des souris concernées. De plus, anesthésiques et analgésiques seront utilisés avant, pendant et après la procédure opératoire.

Choix des espèces

L’ensemble du projet est focalisé sur l’étude de la biologie des cellules souches de souris. Il nous apparaît donc opportun de réaliser les expériences de formation de tumeurs bénignes chez la même espèce afin de récapituler au mieux les voies de signalisations qui vont induire la différenciation des cellules souches induites dans les tumeurs. Toutes les expériences seront réalisées avec des souris adultes de 6 à 8 semaines, qui est l'âge habituellement utilisé pour l’induction de ces tumeurs bénignes.

40 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau du flanc, des prélèvements de sang à l'oeil et huit injections intrapéritonéales d'immunothérapie, pour tester si la déplétion des macrophages améliore un traitement anticancéreux. Le porteur renvoie les retombées pour les patients au conditionnel et reconnaît que l'objectif immédiat reste de comprendre le comportement des cellules. Sur le remplacement, il affirme que l'étude des interactions entre tumeur et microenvironnement immunitaire ne peut pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Objectifs

Le cancer colorectal, est le 3ème cancer le plus fréquent chez l’homme et le 2ème plus mortel, faisant de cette pathologie un enjeu majeur de santé publique. Bien que l’utilisation des immunothérapies, ont montré une efficacité remarquable dans le traitement de plusieurs types de cancers, leur effet reste cependant limité dans le traitement du cancer du côlon. Ceci peut notamment s’expliquer par la mise en place de voies d’immunosuppression alternatives. Il a notamment été montré que les macrophages infiltrant la tumeur peuvent jouer un rôle immunosuppressif (pro-tumorale) dans plusieurs types de cancer, dont le cancer colorectal. Par conséquent, nous émettons l’hypothèse que la déplétion des macrophages intra tumoraux pourrait améliorer l’efficacité des immunothérapie dans le traitement du cancer du côlon. Pour cela, des souris porteuses de tumeurs de côlon seront déplété ou non en macrophages, et traité ou non par immunothérapie . La croissance tumorale ainsi que le phénotype immunitaire seront évalués.

Bénéfices attendus

Ces travaux ont avant tout une portée translationnelle, puisqu’ils pourraient permettre d’établir à la fois le combo immunothérapie et les macrophages comme des cibles potentielles chez les patients atteints de cancer colorectal.

Procédures

-Rasage des souris sur le flanc après désinfection à l’alcool sous anesthésie gazeuse à l'isoflurane (1x2min/souris) - Injection de cellules tumorales en position sous cutané sur le flanc des souris sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane (1x30sec/souris) - Prélèvement de 100µl de sang au niveau de l'oeil (2x 1min / souris) - Injection intrapéritonéale de d'immunothérapie (8x20sec / souris).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent pas de phénotype dommageable. Les tumeurs injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs. Les traitement utilisés dans ce projet ne provoquent pas d’effets secondaires délétères détectables. Les souris reçoivent au total 8 injections par voie intra-péritonéale. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée, susceptible d’entraîner une angoisse modérée et de courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure par dislocation cervicale sous anesthésie gazeuse à l’isoflurane ; les rates, ganglions lymphatiques et les tumeurs seront prélevées pour peser et analyse du phénotype immunitaire .

Remplacement

Nous avons tout d’abord effectué un certain nombre d'expériences in vitro. Cependant, la validation de nos résultats nécessitera une série d'expériences in vivo pour mesurer l’impact de la déplétion en macrophage sur l’efficacité antitumoral dd'une immunothérapie . À notre connaissance, et malgré les progrès récents dans les domaines de la culture cellulaire et de la biologie computationnelle, l'étude de la pathologie, en particulier les interactions entre les cellules tumorales et leur microenvironnement immunitaire, ne peut actuellement pas être remplacée par des systèmes in vitro fiables.

Réduction

Le nombre de souris par groupe a été défini à minima afin de permettre une analyse statistique des résultats. Notre analyse statistique a priori se base sur des données bien établies de la littérature. Nous avons ainsi calculé unetaille d'échantillon de 10 souris par groupe. Cettt procédure sera réalisé en 2 temps, avec 5 souris par groupe. La deuxième expérience sera réalisée si la première expérience est concluante afin de renforcer la signification statistique des données et de pallier à un problème technique éventuel.

Raffinement

Les tumeurs injectées par voie sous-cutanée ne développent pas de métastases et ne provoquent pas/peu de douleurs ou d'inconfort autre que le stress et la douleur liés à l'injection. De plusLes traitement utilisés dans ce projet ne provoquent pas d’effets secondaires délétères détectables. Les animaux subissent donc un ensemble d’étapes de classe de gravité modérée. Les protocoles que nous suivrons sont bien établis pour réduire au maximum la douleur et l’angoisse. De plus un suivi adapté des points limites précoces et prédictifs (2 fois par semaine), et la manipulation des animaux par des personnes compétentes, permettent de limiter la douleur ou souffrance des souris. Pour garantir le bien-être animal, un enrichissement (morceaux de coton, tunnel en carton, morceaux de bois) est ajouté à chaque cage et du DietGel et/ou de l’HydroGel sera utilisé en cas de douleur et angoisse de l'animal.

Choix des espèces

Le choix de l’expérimentation in vivo est justifié par l’existence de la lignée tumorale et des réactifs thérapeutiques, qui à notre connaissance n’ont pas été développés dans d’autres modèles pré-cliniques. De plus notre laboratoire a développé une expertise unique dans l'analyse du système immunitaire et du cancer chez la souris, et a tous les réactifs nécessaires à disposition. Pour atteindre la maturité du système immunitaire, les souris seront âgées de 7 à 12 semaines en fonction des disponibilité des animeaux chez le fournisseur. En revanche l'age des souris sera homogène entre les différents groupes expérimentaux.

462 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur transfère des lymphocytes T qui déclenchent un diabète auto-immun, avec injections répétées et jusqu'à dix prélèvements de sang à la queue, l'hyperglycémie entraînant soif, perte de poids et baisse d'activité avant l'euthanasie. Le projet vise de nouvelles immunothérapies ciblant les lymphocytes responsables de la destruction des cellules du pancréas. Le porteur affirme que la validation de ces stratégies passe forcément par des "organismes entiers", les composés étant d'abord testés in vitro.

Objectifs

Le diabète de type 1 (DT1) est une maladie auto-immune caractérisée par une perte totale ou quasi-totale de la capacité du pancréas à produire de l’insuline, hormone essentielle pour réguler le taux de glucose dans le sang. La perte de la fonction insulinique est due à la destruction des cellules béta du pancréas par son propre système immunitaire. Parmi l’ensemble des cellules immunitaires se sont les lymphocytes T qui sont majoritairement retrouvés au niveau des lésions pancréatiques et qui sont responsables de la destruction des cellules bêta. Les modèles murins ont permis de mettre en évidence que l’apparition de la maladie se fait en deux étapes consécutives dans des tissus anatomiquement distincts. Premièrement, les lymphocytes T sont activés dans les ganglions lymphatiques drainant le pancréas. Puis ils infiltrent le pancréas où ils vont pouvoir aller détruire spécifiquement les cellules bêta. L’Europe et l’Amérique du Nord ont les taux d’incidence les plus élevés, supérieurs à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en des injections régulières d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Notre objectif est de développer de nouvelles stratégies d’immunothérapie ciblant les lymphocytes T impliqués dans la maladie.

Bénéfices attendus

Le diàbète de type 1 est une maladie auto-immune dont l’incidence en Europe et Amérique du Nord est supérieure à 10 personnes pour 100 000 habitants par an avec des taux d’augmentation annuelle de 2 à 3 %. Le seul traitement disponible consiste en un apport quotidien d’insuline. Il n’existe actuellement sur le marché aucune thérapie ciblant la cause de cette maladie. Nous espérons que nos études contribueront à jeter les bases de nouvelles stratégies thérapeutiques efficaces sur le diabète de type I. De manière plus globale, les connaissances et résultats obtenus pour ce projet devraient contribuer au développement de nouvelles stratégies immmunothérapeutiques pour d’autres pathologies auto-immunes.

Procédures

1. Injection dans la cavité abdominale : Pour reduire le nombre de cellules dans le sang, qui est nécessaire pour déclencher la maladie. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 2. Injection intra-veineuse : Pour injecter les lymphocytes tueurs autoréactifs. 1 seule fois pour chaque animal. L'injection prend moins de 10 secondes. 3. Injection intra-veineuse : 1 seule fois pour chaque animal. Pour injecter un traitement à base de cellules. L'injection prend moins de 10 secondes. 4. Injection dans la cavité abdominale : Pour injecter un traitement à base d'anticorps. 6 injections maximum par souris. L'injection prend moins de 10 secondes. 5. Prélèvements sanguins : Les souris seront suivies pour l’apparition du diabète en mesurant le taux de glucose dans le sang. Une goutte de sang obtenue par ponction dans la veine de la queue est suffisante pour relever une mesure. Un maximum de 10 prélèvements par souris. Cela prend moins de 10 secondes.

Impact sur les animaux

Les souris seront surveillées pour détecter l'apparition de la maladie en mesurant les niveaux de glucose dans le sang tous les 3 jours. Une goutte de sang sera prélevée dans la veine de la queue à cette fin. Les prélèvements répétés peuvent causer du stress aux animaux. Au cours de nos expériences, certaines souris vont développer un diabète auto-immun constaté par une hyperglycémie, ce qui marquera la fin de nos expériences. Cette condition peut entraîner une douleur légère ou modérée pendant les 1 ou 2 derniers jours de l'expérience avant l’euthanasie des animaux. L'hyperglycémie apparaît vers le 10ème jour après le transfert de cellules T. Après ce point, les souris commencent à uriner plus fréquemment. 3-4 jours après l'apparition de l'hyperglycémie, les souris présenteront des poils dressés, une perte de poids et une mobilité réduite. Les animaux seront euthanasiés après deux mesures consécutives supérieures à 300 mg/dL. Les injections provoquent une gêne de très courte durée chez les souris. Les cellules ou les anticorps injectées ne doivent avoir aucun effet indésirable notable sur les souris.

Devenir

Une partie des animaux sera euthanasiée à J11 pour prélèvement des organes. L’autre partie sera suivie notamment pour l’apparition du diabète. Les animaux seront euthanasiés au fur et à mesure de l’expérience quand ils présentent des signes de souffrance ou deux valeurs consécutives de glycémie supérieure à 300 mg/dL. Les expériences seront arrêtées au bout de 30 jours et toutes les souris encore en vie à ce moment là seront euthanasiées pour pélèvement d’organes.

Remplacement

Le diabète est une maladie auto-immune qui implique différents acteurs du sytème immunitaire ainsi que différents organes (ganglions lymphatiques, pancréas...). La validation de nouvelles stratégies d’immunothérapie implique donc forcément l’utilisation d’organismes entiers. Cependant, les composés nouvellement développés seront systématiquement testés et validés in vitro et seules les approches ayant données des résultats probants in vitro seront évaluées in vivo chez la souris.

Réduction

La réalisation des expériences in vivo est conditionnée par l’obtention au préalable de résultats probants in vitro. Nous utiliserons à la fois des mâles et des femelles, ce qui évite de réaliser un tri lors des naissances des souris. Pour les expériences d'apparition du diabète, 12 souris par groupe seront nécessaires pour avoir des résultats significatifs. D’après notre expérience avec ce modèle, pour des expériences de caractérisation des cellules T ex vivo, 9 souris par groupe devraient être suffisantes pour obtenir des résultats significatifs. Le nombre d'animaux représente le minimum requis.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des portoirs ventilés dans un milieu enrichi. Nous nous basons sur une grille de score pour évaluer le comportement et l’état des animaux tous les 2 à 3 jours. Si nous constatons un problème (perte de poids excessive, poil hérissé…) les souris seront euthanasiées. L’apparition d’un diabète se traduit par le fait que les souris commencent à uriner plus fréquemment, une perte de poids et une baisse de l’activité. Afin d’améliorer la condition des souris, dès le début de l'hyperglycémie, une observation quotidienne des cages et du niveau des biberons sera effectuée. De plus, afin de faciliter l’accès à la nourriture, elle sera directement deposée dans la cage.

Choix des espèces

Le projet proposé ici est basé sur nos résultats précédents obtenus en utilisant notre modèle de souris transgénique de diabète auto-immun. Outre les modèles de diabète auto-immun spontané, plusieurs modèles de maladie induite chez des souris transgéniques ont été générés, qui permettent de suivre facilement et rapidement le devenir des cellules T responsables de la destruction des cellules bêta du pancréas. Les animaux utilisés seront des animaux âgés de 8 à 16 semaines. A cet âge les souris ont un système immunitaire suffisamment développé pour les besoins du projet. Par ailleurs, ceci nous permettra d’être dans la continuité des précédents travaux menés par l’équipe.