Souris

504 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit sous anesthésie deux injections d'air pour former une poche cutanée, puis une injection infectieuse par la bactérie Cutibacterium acnes, avant un prélèvement sanguin terminal, pour étudier la réponse inflammatoire à ce microbe impliqué dans les infections de prothèses. Le porteur indique que l'infection peut provoquer gonflement, écoulement, perte de poids et repli de l'animal. Il affirme avoir atteint "les limites des modèles in vitro" et juge indispensable l'étude d'un "hôte complet".

Objectifs

Le projet vise à étudier la réponse de souris mise en contact avec une bactérie causant des infections lors de la mise en place de prothèses (Cutibacterium acnes (C. acnes)). En effet, ce microbe est responsable de nombreuses infections qui ont la particularité ne se manifester que très discrètement, voire pas, au niveau clinique aboutissant à une prise en charge trop tardive. Nous cherchons donc à caractériser la réponse de l’organisme à ce microbe afin de savoir si cette faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte ou bien à la mise en place de stratégies de défense par le microbe. Les microbes utilisés seront de deux types : une bactérie de référence commercialement disponible et trois bactéries récupérée sur des infections humaines cliniques réelles. Ces bactérie ont déjà été étudiées en laboratoire dans le cadre d’interactions avec des cellules du système immunitaires de l'homme et ont permis de mettre en évidence une réponse augmentée lors de l’utilisation des souches cliniques. Cependant, ces conditions d’étude étant extrêmement éloignées de la réalité il est nécessaire d’analyser la réponse du système immunitaire dans un organisme complet afin de pouvoir conforter les réponses obtenues in vitro et pouvoir ainsi envisager de découvrir de nouvelles pistes thérapeutiques. Nous proposons donc d’utiliser un modèle d’étude, développé chez la souris, des réponses de l’organisme vis-à-vis d’agents infectieux afin de collecter, quantifier et identifier la réponse de l’organisme. Ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre les cellules de l’hôte et le microbe dans un contexte d’infection sur prothèse et donc à plus long terme mieux lutter contre ce type d’infections. Ce projet nécessitera l’utilisation d’au minimum 126 souris et n’excèdera pas 504 souris. Des procédures de réduction faisant appel à des analyses intermédiaires de la réaction permettront de stopper toute condition d’expérience qui ne fonctionne pas ou génère un mal-être exagéré des animaux et ainsi de réduire au maximum le nombre d’animaux exposés.

Bénéfices attendus

Cutibacterium acnes (C. acnes), microbe naturellement présent sur la peau humaine, est surtout connu pour son rôle dans l’acnée. Cependant ce microbe est également identifié comme responsable d’infections au niveau des os, et plus particulièrement autours des prothèses articulaires (IOA). La prise en charge des infections à C. acnes est complexe et coûteuse avec la nécessité de coupler plusieurs antibiotiques et la nécessité d’un changement de prothèse, et donc de nouvelles interventions chirurgicales pour le patient. C. acnes semble pouvoir échapper au système de défense de l'organisme probablement, en partie, grâce à sa capacité à se dissimuler. Peu de données sont disponibles sur l’existence de marqueurs spécifiques de ces infections. Aussi, le projet ici présenté nous permettra d’étudier la réponse de l'organisme, dans un environnement proche de celui qui est retrouvé autour d’une prothèse, induit par diférentes souches de C. acnes. Rapidement, ce travail permettra de mieux comprendre les interactions entre l'organisme et ce microbe. A plus long terme, les résultats obtenus devraient permettre d’améliorer la prise en charge des patients souffrant d’une infection ostéo-articulaire et donc mieux lutter contre ce type d’infections.

Procédures

Chaque animal sera soumis à deux injections d’air sous la peau pour former une poche ainsi qu’à une injection supplémentaire pour l’infection. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé. Chaque injection sera précédée d’une anesthésie générale.

Impact sur les animaux

Nous proposons d’utiliser le modèle de poche a air car il est souvent utilisé en recherche et n’entraine pas de souffrance particulière chez l’animal. Il permet de délimiter physiquement une cavité qui permettra de contenir les agents pathogènes en évitant leur dissémination dans le corps de l’animal. Compte tenu des éléments disponibles dans la littérature, nous n’attendons pas une très forte réaction qui pourrait changer le comportement des animaux. Néanmoins il est possible d’observer un gonflement, un écoulement et/ou une irritation susceptibles d’amener à une diminution de l’activité de l’animal, pouvant l’empécher de se nourrir correctement et donc mener à une perte de poids et un comportement de repli.

Devenir

A l’issue des procédures tous les animaux seront euthanasiés afin de prélever des tissus pour observer le recrutement des cellules immunitaires ainsi que du sang pour d’autres analyses indispensables à l’évaluation de la réponse inflammatoire.

Remplacement

Une phase initiale de recherche in-vitro a permis d’apporter un grand nombre de données concernant les capacités de réponses du système immunitaire face aux infections par C. acnes. Cet agent microbien est incriminé dans de nombreuses infections sur matériel prothétique qui ont la particularité de ne se manifester que très discrètement, voire de façon paucisymptomatique, au niveau inflammatoire. Cette diversité a été retrouvée in-vitro. Les 4 souches étudiées ont déjà été étudiées in-vitro dans le cadre d’interactions avec des cellules de l’immunité et ont permis de mettre en évidence des réponses inflammatoires différentes. Nous cherchons maintenant à caractériser la réponse d’un hôte complet afin de déterminer si cette très faible réponse est liée à un défaut de reconnaissance par l’hôte voire à une réponse complexe faisant intervenir les différents acteurs du système immunitaire ou bien à la mise en place de stratégies particulières par le microorganisme, les modèles de culture cellulaire étant assez éloignés de la réalité physiologique. Dans ce cadre, nous pensons avoir atteints les limites des modèles in vitro disponibles concernant les informations que nous pouvons obtenir. Aucun test alternatif ne peut remplacer l’étude in vivo de l’intégralité des systèmes physiologiques de l’hôte impliqués dans la réponse inflammatoire aigüe vis-à-vis des infections bactériennes

Réduction

Des méthodes de réduction du nombre d'animaux impliqués dans l'expérimentation (mise en place d'expérimentation sur un nombre réduit d'animaux avec poursuite uniquement si l'expérimentation fonctionne, arrêt précoce des conditions jugées non exploitables, analyse/projection mathématiques à mi-parcours avec arrêt de l’étude si aucun résultat exploitable ne peut être envisagé) seront appliquées. Pour que les valeurs obtenues soient exploitables du point de vue statistique un nombre minimum de 6 animaux par groupe sera utilisé. Les données quantitatives obtenues seront analysées par des tests permettant la comparaison d’échantillons de faible taille. Une logique d’arrêt des procédures est mise en place : en cas de dépassement par 3 animaux pour chaque groupe de points limites, la procédure sera interrompue.

Raffinement

A leur arrivée à l’animalerie, les animaux seront hébergés pendant une semaine pour leur permettre de s’acclimater à leur nouvel environnement. Les cages seront enrichies de divers matériaux permettant aux animaux d’exprimer des comportements variés dans leur lieu d’hébergement. Tout au long de l’étude, un suivi régulier sera effectué de façon à observer l’apparence, le comportement des animaux et à contrôler l’absence de points limites tout au long de l’étude. A chaque manipulation les animaux seront anesthésiés afin de limiter le stress et la douleur. Un suivi rapproché sera effectué dès les premiers signes d’inconfort détectés. Un protocole de suivi définissant des points limites aisément mesurables ainsi que les mesures à prendre en cas d’atteinte est réalisé conformément aux études de prise en charge des éventuelles souffrances exprimées. Ainsi, en fonction du résultat, une prise en charge adaptée sera réalisée. En cas de situation non connue l’appel à un vétérinaire sera réalisé.

Choix des espèces

Dans le but de se placer dans des conditions expérimentales les plus représentatives de la réalité physiologique rencontrée en médecine humaine, les souris C57Bl6 utilisées seront des souris adultes âgées de 8 semaines.

185 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une transplantation de microbiote de patients par gavages répétés ou une induction d'arthrite par injection d'anticorps, l'implantation chirurgicale d'un capteur de télémétrie, puis un test de sensibilité tactile de von Frey, pour étudier le rôle du microbiote intestinal dans la douleur de la polyarthrite rhumatoïde. Le porteur indique que l'induction d'arthrite peut provoquer diarrhée et déshydratation et que les mesures cardiaques imposent un isolement en cage individuelle. Il affirme qu'aucun modèle de substitution ou in silico ne convient, la perception de la douleur étant selon lui propre à "l'organisme conscient".

Objectifs

Il existe actuellement de très nombreux traitements pour les patients atteints de polyarthrite rhumatoïde (PR). Bien que ces traitements soient très efficaces sur l’inflammation, on observe chez 20 à 30 % des patients la persistance de douleurs chroniques diminuant grandement leur qualité de vie au quotidien. Ces patients présentent une sensation douleureuse déclenchée plus facilement que ches des personnes non atteintes. C'est la sensibilisation des voies nerveuses de la douleur. Ce mécanisme pathologique est responsable de la douleur chronique. De plus en plus de travaux montrent que le microbiote intestinal agit sur le contrôle de la douleur. On parle de l’axe intestin-cerveau. Cet axe repose entre autres sur les voies d'entrée de la douleur via le nerf vague parasympathique. Nous émettons l’hypothèse que le microbiote intestinal des patients atteints de PR est à l’origine de la sensibilisation de la douleur en modulant les neurones parasympathiques. Une fois altérés, ces neurones vont entrainer des douleurs pathologiques chroniques, malgré le contrôle l’inflammation articulaire. Notre objectif est d'évaluer in vivo l’impact du microbiote intestinal sur la sensibilisation à la douleur et sur la fonction du système nerveux parasympathique dans un contexte de polyarthrite rhumatoide. Nous voulons identifier quels facteurs issus du microbiote intestinal est/sont impliqué(s).

Bénéfices attendus

Une fois la preuve de concept apportée, l'analyse et la comparaison des souches bactériennes et métabolites du microbiote des différentes conditions (polyarthrite douloureuse, non douloureuse et de différents groupes contrôles), en fonction du stade clinique et de la sensibilisation obtenue in vivo permettront d’identifier quels facteurs du microbiote pourraient être impliqués dans ce mécanisme allodynique. Ceci ouvrira de nouvelles voies de recherche sur ce phénomène pathologique. De plus, une fois le facteur identifié, nous pourrons continuer d'explorer ce mécanisme in cellulo (neurones de ganglions jugulaires et noueux murins contenant les corps neuronaux des afférences du parasympathiques).

Procédures

Selon le groupe de souris, les animaux auront soit un transfert de microbiote intestinal de patients (4 gavages (durée 2 à 4 minutes) sur 4 semaines, précédés d'une semaine d'antibiotique par voie orale), soit une induction de polyarthrite rhumatoïde (injection d'anticorps anti-collagènes). Tous les animaux auront une implantation de capteurs de télémétrie sous-cutanée pour enregistrement de l'électrocardiogramme (2 mesures). L'implantation chirurgicale en sous cutanée dure environ 20 minutes. D'une manière hebdomadaire, des recueils de selles seront effectués et une pesée sera réalisée. Un test de détermination de la sensibilité tactile sera effectué à 2 temps du protocole (avant/après). La durée du test de Von Frey est d'environ 20 minutes par animal. Plusieurs prélèvements seront effectués en post-mortem.

Impact sur les animaux

Les animaux utilisés à des fins d'enregistrement de l'electrocardiogramme devront être mis en cage unique. Concernant l'execution du test de sensibilité tactile (Von Frey), ce dernier sera mené de manière éthique et consiste à ne pas faire durer l'inconfort/la douleur d'un animal au cours du test. L’étude de la douleur se fera donc dans la recherche des seuils de douleur avec un cut off pour ne pas faire souffrir en excès les animaux. Concernant l'induction d'arthrite, l’injection de LPS peut entraîner des diarrhées et une déshydratation.

Devenir

L'ensemble des animaux seront mis à mort pour éffectuer des prélèvements, soit pour récupérer le télétransmettteur de télémétrie.

Remplacement

Ce projet s'interressant aux mécanismes de régulation de la douleur par le microbiote intestinal, il n'existe pas de modèle de substitution ou in silico permettant d'étudier les mécanismes mis en jeu. Par ailleurs, la perception de douleur est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques.

Réduction

Pour réduire la variabilité interindividuelle et donc le nombre de souris nécessaires pour démontrer un effet, nous utiliserons des lots d’animaux du même âge et du même genre au moment de l’initiation du protocole. Nous avons fait le choix de méthodes (télémétrie, von Frey), permettant le suivi des animaux dans le temps pour réduire le nombre de groupes utilisés et obtenir le maximum d'information sur chaque animal. AInsi nous étudierons les paramètres avant/après intervention sur le même animal. De plus, nous effectuerons les mesures d'ECG, de pharmacologie, les tests d'allodynie, les analyses de microbiote chez le même animal afin de réduire le nombre d'animaux utilisés et augmenter la puissance statistiques des tests (tests appariés). Les tissus d'intéret (tissu nerveux, cardiaque, digestif) seront prélevés sur tous les animaux en vue de leur étude ultérieure.

Raffinement

Les souris sont hébergées dans l’EU, régulée à 22-24°C avec un cycle jour/nuit 12h/12h, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson et un bruit de fond d’ambiance. Les conditions de stabulation sont effectuées en ambiance EOPS (pas de pathogène, pas d'opportuniste, pas de parasite) avec maintien en groupe dans des cages de taille appropriée avant inclusion dans le protocole. Les animaux sont stabulés en condition d'enrichissement intermédiaire (copeaux de différentes origine et texture, cotons et substrat de nichage, aliment accessible sur le substrat au besoin). Une visite quotidienne par un zootechnicien ou investigateur principal des animaux pour le suivi journalier est effectuée. L'ensemble des procédures sera réalisé avec l'objectif de réduire /limiter l'angoisse tout au long du projet, de limiter la douleur au seul besoin du projet (test d'allodynie de von Frey) en utilisant les méthodes appropriées d'analgésie et d'anesthésie lors de l'implantation des capteurs de télémétrie., et dans le respect de l'animal. Une grille d'évaluation clinique et des actions à mener en conséquences est mise en annexe. En particulier, le jour de l’implantation ECG, les animaux sont surveillés une fois par heure. Puis, les animaux sont surveillés une fois par jour. En cas de présence de douleur (échelons décrits dans la grille), un renforcement des visites sera conduit : Echelons 1 & 2 : 2 à 3 visites/jour; Echelon 3 : 4 visites/jour et 1 visite/heure en échelon 4. Si l’animal est inactif, incapable de se déplacer, avec les poils très hérissés, le dos courbé (possibilité de décubitus latéral) et des difficultés respiratoires ou bien avec les yeux fermés, et une perte de poids (>15% du poids initial), la mise à mort de l’animal est décidée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour les expériences de transfert de microbiote chez l’animal in vivo, permettent d’évaluer les conséquences fonctionnelles intégrées d’un microbiote précis. La régulation autonomique (afférences/éfférences) est largement similaire entra l'Homme et la souris, tout comme les mécanismes de l'allodynie. L'expérience du laboratoire dans le transfert de microbiote chez la souris, dans les investigations cardiaques et autonomique (HRV) permet d'éviter une mise au point/validation du protocole et la consommation d'animaux pour cela. Par ailleurs, un projet connexe sur le modèle murin est déjà en cours sur cette thématique au laboratoire. L’arthrite sera induite chez des animaux de 10 à 12 semaines d'âge comme cela est conseillé dans la littérature. Le protocole d’humanisation nécessitera 4 semaines et donc l’utilisation de souris âgées de 8 semaines pour qu’elles atteignent les 12 semaines au moment de l’induction de l’arthrite.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections sous-cutanées puis des mesures d'électromyographie et de contractilité musculaire sous anesthésie gazeuse, pour mettre au point une technique de mesure de l'activité électrique du muscle sur un modèle de myopathie de Duchenne et un modèle de vieillissement. Le porteur indique que les souris âgées peuvent présenter une perte de poids massive ou des tumeurs, et les souris Duchenne des atteintes locomotrices. Il affirme que ce test ne peut pas être reproduit sur un modèle cellulaire, aucun organoïde ne reproduisant le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle.

Objectifs

Au cours du vieillissement et dans de nombreuses maladies neuromusculaires (myopathies), la masse et la fonction musculaires diminuent progressivement. Lorsque la perte musculaire est excessive, elle peut conduire à une pathologie : l'atrophie musculaire. L'atrophie est à l'origine d'une détérioration générale de la condition physique qui se traduit par un risque accru de chutes, des problèmes moteurs et une perte d'autonomie progressive. Elle conduit inévitablement à une augmentation du taux de morbidité et de mortalité. Il n'existe actuellement aucun traitement pharmacologique de cette pathologie. La masse musculaire squelettique dépend de l'état d'innervation des muscles. Lorsque le nerf périphérique est endommagé, la jonction neuromusculaire est altérée et le muscle squelettique subit une atrophie. La diminution d'activité électrique peut être mesurée par la technique d'ElectroNeuromyographie (ENMG) après une stimulation du nerf. Cette méthode donne des indications sur la neurotranmsission du signal électrique. Dans ce projet, nous mettrons en place cette technique au laboratoire. Après mise en place des conditions optimales de mesure, cet outil sera utilisé dans deux populations de souris présentant une atrophie importante: un modèle murin de la myopathie de Duchenne et un modèle de vieillissement. Ces deux modèles ont été choisis car ils seront utilisés par la suite dans le cadre d'un projet thérapeutique visant à corriger l'atrophie.

Bénéfices attendus

Ce projet de développement et validation technologique permettra une meilleure caractérisation de 2 modèles d'intérêt pour notre laboratoire, les modèles murins de Dystrophie de Duchenne et de vieillissement. Leur caractérisation est un prérequis à de nombreux projets thérapeutiques.

Procédures

Les souris seront soumises à des injections sous-cutanées (20 secondes) et à des mesures fonctionnelles: mesure du poids ( minutes -indolore); électromyogramme ( 20 minutes) et mesures de la contractilité musculaire (20 minutes).

Impact sur les animaux

Nous utiliserons des souris âgées qui peuvent présenter une perte de poids massive ou développer des tumeurs et des souris modèle de la pathologie de Duchenne, qui peuvent également présenter des atteintes musculaires affectant leur capacité locomotrice.

Devenir

Tous les animaux inclus dans une procédure expérimentale seront euthanasiés pour prélever et analyser les tissus à la fin de la procédure.

Remplacement

Le projet a pour but de mesurer l'activité électrique passant du nerf au muscle squelettique: ce test ne peut pas être reproduit dans des modèles cellulaires car il n'existe pas de modèle cellulaire ou d'organoides pouvant reproduire le nerf, la jonction neuromusculaire et le muscle. Notre projet nécessite donc l'utilisation d'animaux.

Réduction

Ce projet consistant en la mise en place d'une nouvelle technique, nous n'avons pas les données permettant de calculer les effectifs par statistiques prédictives. Cependant, considérant l'expérience de nos collaborateurs de l'AIM, une mortalité élevée de 20-30% chez les souris agées, des groupes de 10 souris par condition seront nécessaires pour permettre une analyse statistique fiable et éviter que la variabilité des paramètres de mesures in vivo puisse empêcher la bonne exploitation des résultats.

Raffinement

Les conditions d'hébergement et d'enrichissement du milieu sont gérés par l'animalerie. Les souris étant sociables, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les électroneuromyogrammes, qui mesurent l'activité électrique du muscle, seront réalisés dans un environnement calme, dans une pièce isolée du lieu d'hébergement. Au cours de la procédure, afin d'éviter les douleurs éventuellement créées par la stimulation électrique, une prémédication par un antalgique fort sera administrée par voie sous-cutanée. La procédure sera réalisée sous anesthésie gazeuse. Les souris seront placées sur une plaque chauffante afin de maintenir la température de leur corps. En fin de procédure, les animaux seront remis dans une cage et surveillés jusqu'à leur réveil. Ils recevront par voie sous-cutané un antalgique fort toutes les 12h pendant 48h.

Choix des espèces

Les souris reproduisent bien les caractéristiques des maladies neuromusculaires, notamment l'atrophie, et sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifiques du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur des myopathies. Ce modèle est également très bien adapté aux études sur l'atrophie au cours du vieillissement. Le développement de l'ENMG sur cet animal permettra donc de mesurer l'efficacité thérapeutique de nombreux produits dans nos projets futurs. L'anatomie des souris permet d'accéder facilement au nerf sciatique et aux muscles qu'il controle, ce qui facilitera la mise en place de la méthode d'ENMG. Les souris C57Bl6 seront des adultes jeunes (12 semaines) afin que le développement du muscle soit terminé mais qu'il n'y ait aucun signe de vieillissement. Ces souris seront comparées à des souris du même fond génétique agées de 18 mois afin que l'atrophie soit à un stade avancé. Les souris C57bl10 et les mdx seront utilisées à l'âge de 3 à 6 mois (selon les disponibilités des mdx), car les différences d'activités au niveau de l'ENMG sont bien présentes à ces âges.

552 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des femelles gestantes subissent sous anesthésie une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes pour injecter un marqueur fluorescent dans les embryons, et d'autres femelles reçoivent des embryons génétiquement modifiés, afin d'étudier la létalité embryonnaire liée à des défauts de réparation de l'ADN. Le porteur indique que ces gestes peuvent provoquer douleur et infection post-chirurgicale, et que certaines lignées mutantes développent un déficit immunitaire menant à l'euthanasie. Il affirme que ces questions ne peuvent être étudiées que chez le mammifère "in toto", aucun modèle in vitro ne reproduisant le développement du cortex cérébral.

Objectifs

Les cassures de l’ADN sont des lésions génomiques très toxiques qui interviennent lors du développement du système nerveux central. La mauvaise réparation de ces lésions est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme comme certaines maladies neurodégénératives, des déficits immunitaires sévères et le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des lésions de l'ADN se traduisent par une létalité embryonnaire. Plusieurs facteurs impliqués dans les voies de réparation des dommages à l'ADN ont été identifiés à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme et analysés dans des modèles animaux d’invalidation génique afin d’en mieux comprendre la fonction. L'objectif du présent projet est d'identifier les raisons de la létalité embryonnaire de certaines lignées de souris déficientes en voie de réparation de l'ADN. Nous projetons de générer une lignée de souris mutantes incapables de générer les lésions de l'ADN dans le cerveau en développement et d'évaluer si ce fonds génétique peut préserver les animaux déficients en réparation de l'ADN de la létalité embryonnaire.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu du projet est la détermination de la fonction des lésions programmées de l’ADN dans les phases précoces du développement du cerveau. Cette fonction est jusqu'à présent inconnue. Cette étude nous permettra alors de mieux comprendre la mort cellulaire neuronale et la létalité embryonnaire qui en découle chez les animaux porteurs d'anomalies de la réparation de l'ADN. In fine, cette étude participera à la compréhension de maladies génétiques de l'enfant caractérisées par des anomalie du développement, l'existence de microcéphalies ainsi que le développement de tumeurs cérébrales et les mécanismes de vieillissement accéléré.

Procédures

Pour générer certaines souris mutantes, 30 femelles pseudogestantes seront réimplantées avec des embryons génétiquement modifiés. Pour l'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN, des embryons à E12.5 ou 14.5 recevront par injection in utero (en une seule intervention et sous anesthésie générale) des souris femelles gestantes un marqueurs fluorescent de ces dommages. La chirurgie dure entre 30 et 45 min selon le nombre d’embryons avec 45 min comme durée maximum.

Impact sur les animaux

Les souris avec un défaut de réparation de l'ADN ont un phénotype dommageable connu ; une létalité embryonnaire. Nous n’envisageons pas de phénotype dommageable des deux lignées mutantes faisant l’objet de ce dossier. L’analyse des lésions de l’ADN dans le cerveau par l'introduction intra-embryonnaire d'un marqueur fluorescent ainsi que la réimplantation d'embryons génétiquement modifiés dans des femelles receveuses peuvent présenter quelques nuisances (douleur, infection post-chirurgicale) liées à l'expérimentation.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques

Remplacement

Les questions scientifiques que nous posons ne peuvent être étudiées qu’in vivo ou ex vivo, sur des cerveaux prélevés sur des embryons. Il s’agit ici d’études sur le développement du cortex cérébral, qui ne peuvent être reproduites dans des systèmes autres que celui du mammifère in toto. En effet, le développement du cortex des mammifères et son fonctionnement ultérieur sont de mieux en mieux caractérisés chez la souris et aucun modèle in vitro ne peut mimer à ce jour toutes les étapes de ces processus dans leur complexité et la richesse des interactions des nombreux types cellulaires qui y prennent part.

Réduction

Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement euthanasiés. Les animaux sont maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social avant et après la procédure. Pour certaines procédures la litière utilisée dans la cage est spécifique pour les animaux opérés et permet de diminuer le risque d'infection de la cicatrice. La nourriture ainsi qu’un gel hydrique sont placés directement dans la litière pour une meilleure accessibilité. Lors des actes chirurgicaux, les souris placées sur une plaque chauffante sont anesthésiées et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré́- et post-opératoire. Un gel ophtalmique est également utilisé pour éviter un dessèchement des yeux. Après l'opération, la surveillance des animaux est quotidienne afin de détecter des signes de souffrance. Une grille d'évaluation des animaux est mise en place. Une injection d'analgésique ou le sacrifice de l'animal sont envisagés en cas d’atteinte d’un ou de plusieurs points limites.

Choix des espèces

La souris représente un organisme modèle pour mener les études sur le développement du cerveau, principalement en raison de la similarité des mécanismes fondamentaux du développement du cortex cérébral entre les rongeurs et l’Homme. De plus, nous disposons d’outils adaptés à cette espèce pour la réalisation du projet. L'analyse des phénotypes dommageables éventuels se fait sur des femelles gestantes pour la létalité embryonnaire et sur des animaux nouveau-nés de la naissance jusqu'au sevrage pour la baisse de viabilité. L'analyse in vivo des lésions programmées de l’ADN est effectuée sur des embryons à E12.5 et E14.5. Les embryons sont ensuite analysés à E16.5 et E18.5 après activation d'un marqueur spécifique fluorescent.

Pour mener en cinq ans 330 études précliniques de candidats médicaments sur des tumeurs greffées, 10 000 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin d'étude. Une partie des souris porte un système immunitaire ou un foie humanisé, et les procédures comprennent l'injection sous la peau de cellules tumorales sous anesthésie, des administrations par injection ou par gavage et des prises de sang dont la fréquence dépend du poids. Ni les composés testés ni les cancers visés ne sont nommés, et le porteur qualifie la souris de "modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable". Une souris est tuée dès que son score clinique atteint 7, qu'elle perd plus de 20 % de son poids ou que sa tumeur dépasse 1 000 millimètres cubes.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de réaliser des études précliniques sur des souris afin d’évaluer l’effet d’un composé au potentiel thérapeutique sur des tumeurs en condition in vivo.

Bénéfices attendus

En utilisant un modèle in vivo, nous pouvons étudier les interactions pouvant exister entre des organes fonctionnels et les pathologies cancéreuses qui les impliquent, tout en évaluant l’efficacité et la toxicité de candidats thérapeutiques dans un contexte préclinique.

Procédures

Prélèvements sanguins : la fréquence et les volumes seront déterminés sur base du poids de la souris. La durée des prélèvements est de 10 à 15 secondes. Administration de composés à visées thérapeutiques, par injection ou administration orale (gavage). La durée est de 10 à 15 secondes par administration. Injection sous-cutanée de cellules tumorales sous anesthésie générale, la durée de la procédure est de 2 à 3 minutes par animal.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par : les injections intraveineuses, les prélèvements sanguins et l'injection et les effets potentiellement toxiques de composes a visées thérapeutiques dans un contexte préclinique.

Devenir

Le modèle impliquant la greffe d'une tumeur, les souris seront mises à mort en fin d'étude.

Remplacement

Les tests in vitro seront envisagés si ceux-ci sont appropriés. Néanmoins, il n'est actuellement pas possible de recréer in vitro un environnement complexe comme le système immunitaire ou le système hépatique, et de mimer leurs interactions avec une tumeur, tout en objectivant les effets potentiellement toxiques d’une molécule en développement. La souris constitue donc un modèle scientifiquement valide, robuste et indispensable pour le développement et la mise au point de traitements innovants pour des pathologies cancéreuses.

Réduction

Un total de 10000 souris adultes seront utilisées, couvrant une période 5 ans, permettant de réaliser 330 études précliniques. Le nombre de souris par étude sera de 5 à 10 individus par groupe, avec un minimum de 4 groupes (1 groupe placebo et 3 groupes traités). Les effectifs seront déterminés et les résultats analysés sur base de tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les souris seront hébergées en cages ventilées, par groupe social stable. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum. La cage contiendra une couche de litière permettant aux souris de creuser, de se cacher et de réaliser un nid, élément essentiel à leur bien-être. Six morceaux de bois permettant aux souris d’exprimer leur comportement de rongeur, ainsi qu’un nid en carton seront également disposes. A leur entrée dans le projet, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation et seront habituées a la présence de l’expérimentateur qui les manipulera régulièrement. Pour gérer la douleur, la souffrance et l’angoisse, nous évaluerons l’état de santé par une échelle cumulative de scores (donnés entre parenthèse) prenant en compte : l’aspect du pelage, les mouvements, l’activité, l’activité, la couleur des muqueuses et le score corporel. Les souris seront évaluées quotidiennement et l’échelle sera appliquée dès que nécessaire. Une souris avec un score clinique ≥ à 7 sera euthanasiée pour raison éthique. Le poids sera monitoré 3 fois par semaine. Le suivi de l’évolution pondérale pourra être adapté au stade de l’étude. Une perte de plus de 20%, calculée à partir du poids mesuré le jour de la première manipulation inhérente à l'étude sera considérée comme une raison de mise à mort. Un volume tumoral supérieur à 1000mm3 sera également considéré comme une raison de mise à mort. Le vétérinaire d'établissement aura pleine autorité pour euthanasier un animal pour raison éthique ou mettre en œuvre un traitement anti-douleur si elle/il le juge nécessaire.

Choix des espèces

Nous maîtrisons l’humanisation du système immunitaire et l'humanisation du foie sur différentes souches de souris en se basant sur cette expertise, il est essentiel de poursuivre sur cette espèce. Les animaux seront intégrés aux études à l’âge de 7-8 semaines pour les animaux non humanisés, afin d'utiliser des animaux adultes, et à partir de 15-18 semaines pour ceux humanisés, afin que le système immunitaire humanisé ou le foie humanisé se soit développé. Les animaux d'une même étude auront un âge homogène.

4 776 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris reçoit une greffe de cellules tumorales sous la peau puis des injections quotidiennes de molécules anticancéreuses pendant trois semaines, avec un suivi de la tumeur trois fois par semaine. Le porteur indique que les traitements peuvent provoquer perte de poids, diarrhée et cachexie, et que la croissance tumorale peut entraîner des métastases. Il affirme que le recours à des animaux vivants est "indispensable" parce que la réponse immunitaire à la chimiothérapie ne serait pas reproductible in vitro.

Objectifs

Les lysosomes sont des compartiments cellulaires impliqués dans la dégradation et le recyclage du matériel de la cellule. Les lysosomes ont un rôle important dans le bon fonctionnement des cellules mais une fois endommagés ils peuvent déclencher la mort des cellules. Depuis quelques années, un intéret important est porte en médecine sur les composés qui ont la capacité d’endommager les lysosomes et provoquer la mort des cellules cancéreuses en induisant la perméabilisation de la membrane lysosomale. Nous avons sélectionné in vitro plusieurs nouveaux composés capables d’induire la mort des cellules cancéreuses via la perturbation des lysosomes. Ce projet vise a tester le potentiel anti-cancéreux de ces molécules dans des modèles murins de croissance et vaccination anti-tumorale. Nos objectifs sont : i) déterminer les molécules les plus efficaces dans les modèles tumoraux; ii) étudier la réponse de l’immunité tumorale; iii) explorer l’effet thérapeutique des molécules en monothérapie ou en combinaison avec d’autres thérapies.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de valider dans un modèle préclinique des nouvelles molécules anti-tumorales efficaces dans plusieurs types de cancer en monothérapie et/ou en association avec d’autres thérapies.

Procédures

Toutes les souris de ce projet seront injectées via sous-cutanée (1 fois) avec des cellules tumorales afin d’induire la croissance d’une tumeur. Les injections s.c. seront effectuées sur l’animal anesthésié (via anesthésie gazeuse) pour une durée maximale de 2 minutes. Les traitements anti-tumoraux seront administrés (maximum 1 fois par jour sur 3 semaines) via des injections intra-péritonéales, qui ne provoquent pas de symptômes majeurs et seront effectuées sur l’animal vigile pour une durée maximale de 30 secondes. La mesure des tumeurs s’effectuera sur souris vigiles au moins 3 fois par semaine avec une durée maximale d’une minute à l’aide d’un pied à coulisse.

Impact sur les animaux

Les traitement anti-tumoraux peuvent induire une perte de poids/d’appetit et de la diarrée. Le site des injections pourrait s’infecter. L’induction de la croissance tumorale peut conduire à des effets indésirables (apparition de métastases, cachexie).

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

L’utilisation d’animaux vivants est indispensable car il est actuellement impossible à reproduire, in vitro ou ex vivo, la réponse du système immunitaire à la chimiothérapie vu sa complexité.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 4776 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si la procédure initiale invalide l’hypothèse de travail. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Plusieurs tests statistiques seront utilisés pour comparer les divers groupes de traitements.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie, tapis chauffants,). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Pour nos études, nous utilisons principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé et dont le système immunitaire est mature (développement thymique achevé́).

720 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont soumises à un régime gras, à des mises à jeun de vingt-quatre heures avec suivi de la température rectale, à des tests de tolérance au glucose et à l'insuline et à des échographies sous anesthésie, avant d'être mises à mort pour prélever leurs tissus, pour étudier le rôle de la protéine PTPIP51 dans l'adipocyte au cours de l'obésité. Le porteur indique que le régime gras entraîne une prise de poids et une insulinorésistance, l'effet de la délétion du gène restant inconnu. Il affirme qu'une validation in vivo est "indispensable" après des tests menés sur lignées cellulaires.

Objectifs

L’obésité est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiométaboliques. De plus en plus d’évidences montrent que la dysfonction adipocytaire joue un rôle central dans le développement des complications métaboliques de l'obésité. Notre équipe s’intéresse à différents facteurs qui contrôlent l’homéostasie de l’adipocyte. Des travaux récents de notre équipe ont démontré que les points de contact entre deux structures cellulaires, le réticulum endoplasmique (RE) et les mitochondries sont des éléments importants de la bonne santé de l'adipocyte. Ces points de contacts sont appelés les MAM. Dans le foie, il a été montré que ces MAM contrôlaient la santé métabolique. Dans le tissu adipeux, le rôle physiologique de ces MAM n’a pas été exploré. Les MAM correspondent à des rapprochements des membranes de du RE et de celles des mitochondries. Ces rapprochements sont notamment permis par la présence de protéines de rapprochement comme la protéine tyrosine phosphatase-interacting protein 51 (PTPIP51). Le but du présent projet est de supprimer la présence de cette protéine (PTPIP51) de rapprochement dans l'adipocyte, chez la souris, pour tester l'effet que celà aura sur la santé du tissu adipeux et sur la santé métabolique globale de l'animal.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de démontrer le rôle des MAMs dans le développement des complications métaboliques associées à l’obésité. Si ce travail s’avère concluant, les MAMs du tissu adipeux pourraient être considérées comme une cible thérapeutique contre les complications cardiométaboliques du surpoids.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les souris sont mises sous régime gras. La mesure de glycémie requiert 3 microlitres de sang par mois. Les tests de tolérance (glucose et insuline) sont effectués une fois par mois et requièrent 5x3 soit 15 microlitres de sang, avec une semaine d'intervalle entre les deux tests. La mise à jeun se traduit par une privation de nourriture pendant 24 heures et un suivi de la température (sonde rectale + vaseline), de la glycémie (5 prélèvements de 3 microlitres) et des corps cétoniques (5 prélèvements de 3 microlitres) Les analyses d’échographie se font sous anesthésie 1 fois par mois pendant 20 minutes

Impact sur les animaux

En ce qui concerne les procédures expérimentales, les nuisances principales sont liées aux injections, aux gavages et aux prélèvements à la queue. La mise sous régimes gras entrainnera une prise de poids et le développement d'une insulinorésistance. L'effet de la délétion de PTPIP51 est inconnue. Nous émettons l'hypothèse qu'elle accélrera le développement d'une insulinorésistance.

Devenir

Les animaux sont mis à mort et les tissus d'intéret sont prélevés.

Remplacement

Le but de notre projet est de valider l’importance des MAMs dans l’homéostasie du tissu adipeux. La solidité de l’hypothèse du rôle des MAMs dans le tissu adipeux est actuellement testée dans des lignées cellulaires et nous avons démontré que la déficience en PTPIP51 réduisait drastiquement les MAMS. Dans la continuité, une validation in vivo est indispensable pour étudier les conséquences de l’altération des MAMs du tissu adipeux sur la santé cardiométabolique. Les expériences proposées ici interviennent à un moment ou le rationnel est solide et/ou nos expériences chez l’animal sont indispensables pour observer l’effet de nos interventions dans les adipocytes matures et les réponses physiologiques intégrées.

Réduction

Le projet préconise l’utilisation d’un nombre total de 720 animaux, ce qui dans un souci de réduction correspond au nombre minimal d’animaux permettant d’obtenir des résultats significatifs, en accord avec nos données précédentes. Nous utiliserons des tests statistiques adaptés

Raffinement

Nous utilisons systématiquement des cages avec litières et frisottis et soit un igloo soit un tube tunnel, les deux fabriqués en polycarbonate. Nous utilisons des aiguilles micro-fines pour l'injection, qui réduise la douleur. Nous utilisons des sondes de gavages en polypropylène qui réduise la nuisance de cette procédure. Nous avons détaillé dans la section concernant la procédure notre stratégie en terme de points limites gradés et adaptés aux nuisances observées. La surveillance quotidienne (week-end) compris permet une application stricte et efficace de la stratégie élaborée.

Choix des espèces

Le modèle adipoPTPIP51 est spécifique de l’adipocyte et nous avons déjà la démonstration que la déficience en PTPIP51 altère les MAMs. La mise sous régime gras permet de reproduire les conditions de surnutrition relative à l’étude du surpoids et de l’obésité. Ce modèle permettra d’étudier si la dérégulation des MAMs entraîne une dysfonction adipocytaire et si la dysfonction adipocytaire altère d’autres paramètres généraux de santé comme la sensibilité à l’insuline et la fonction cardiaque. Un modèle animal intégré est le seul moyen de tester ces éléments. Nous utiliserons des souris de 8 semaines au moment de la mise sous régime gras et donc du démarrage de l’expérience.

80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie stéréotaxique avec injection d'un virus et implantation d'une fibre optique, puis des enregistrements en champ ouvert après administration de cocaïne pendant cinq jours, avant leur mise à mort pour analyses post-mortem, pour étudier le rôle du transporteur PMAT dans les effets de la cocaïne. Le porteur indique que la chirurgie peut causer un œdème et une douleur post-opératoire, prises en charge sous anesthésie et analgésie. Il affirme que les effets des drogues d'abus se produisent à l'échelle de l'"organisme entier" et ne peuvent être évalués que sur l'animal entier.

Objectifs

Les transporteurs de recapture des neurotransmetteurs exercent un contrôle étroit de la transmission synaptique dans le cerveau en assurant l'élimination des transmetteurs libérés dans la fente synaptique et leur recyclage dans les terminaisons des neurones. A ce titre, ils interviennent dans des processus importants pour les comportements liés à l’humeur et certaines maladies psychiatriques, comme la dépression et l’addiction. PMAT (Plasma Membrane monoAmine Transporter) est un transporteur atypique, dont le rôle dans le cerveau est encore mal connu. In vitro, il transporte préférentiellement la dopamine et la sérotonine. Il est exprimé dans le cerveau des humains et des rongeurs dans diverses régions et divers catégories de neurones, tels que des neurones glutamatergiques, GABAergiques et cholinergiques. Il module des comportements reflétant le niveau d'anxiété, l'activité locomotrice et les effets des drogues d'abus. Des anomalies importantes des taux des neurotransmetteurs aminergiques dans le cerveau ont été mises en évidence dans plusieurs régions cérébrales chez les souris mutantes pour le gène correspondant. Le projet présenté ici vise à préciser le rôle de ce transporteur dans l'activité de certains circuits cérébraux à l'aide d'une technique de photométrie par fibre.

Bénéfices attendus

Les addictions sont des désordres psychiatriques caractérisés par la dépendance physique et/ou psychologique à une substance ou une activité, avec des répercussions délétères sur l’individu. Les informations récoltées par ces expériences précliniques devraient clarifier le rôle d’un transporteur peu connu, PMAT (Plasma membrane monoAmine Transporter), dans les effets d’une drogue d'abus, la cocaïne. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de cette drogue sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris invalidées pour certains gènes (tels que PMAT ici) permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Les approches utilisées dans le projet permettent d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés. Ces connaissances pourront permettront d’approfondir les mécanismes qui sous-tendent les processus addictifs, afin d’élaborer à terme des thérapies plus efficaces pour traiter ces troubles psychiatriques. Ces travaux sont originaux et les expériences ne sont pas réalisées par d'autres laboratoires.

Procédures

Toutes les souris subiront 3 étapes séquentielles: 1- Une chirurgie stéréotaxique (classe modérée; durée 30-40 min). 2- Des enregistrements par fibre optique dans un champ ouvert, à l'état basal ou après administration de cocaine (classe légère; durée 1h30 min par session sur 5 jours consécutifs). 3- Une euthanasie, afin de valider les expériences (classe sans réveil; durée 20 min). La chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour injecter le virus dans le cerveau et implanter la fibre optique peut causer un œdème localisé associé à une douleur post-opératoire passagère. Cette chirurgie est effectuée sous anesthésie et analgésie. Il existe un risque faible d'infection suite à la chirurgie et l'implantation de la fibre optique. La manipulation par l'expérimentateur et l'exposition à un environnement nouveau lors du test comportemental peuvent engendrer un léger stress chez les souris. L'administration par injection intra-péritonéale de cocaïne ou de saline n'engendre pas d'effets secondaires et n'altère pas les poids des animaux. Les souris sont surveillées pendant toute la procédure. L’effet hyperlocomoteur de la cocaïne est très rapide et dure 20 min. La cocaïne n’est pas associée à des effets secondaires indésirables notables. Les souris mâles logées dans la même cage peuvent parfois se battre et être blessées. Nous n'envisageons pas d'autres nuisances possibles lors des expériences proposées.

Devenir

A la fin de la procédure tous les 80 animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements et analyses post-mortem nécessaires au projet (immunofluorescence et analyse anatomique).

Remplacement

De manière générale, les effets à court ou long terme des drogues d’abus se produisent à l’échelle de l’organisme entier et donc ne peuvent être évalués de manière définitive qu’in vivo, sur l’animal entier. Les procédures d’expérimentation animale décrites ici sont donc essentielles pour décrypter les conséquences fonctionnelles de ces drogues sur des circuits neuronaux intacts. Les modèles de souris mutées pour des transporteurs de neurotransmetteurs permettent également d’étudier la fonction de ceux-ci in vivo chez l’animal, une approche irremplaçable pour aborder des comportements complexes. Cette approche permet d’étudier les mécanismes et circuits cérébraux dans un contexte intégré, et rester le plus proche possible des conditions d’administration de ces drogues chez l’homme. Ces aspects intégrés ne sont pas reproduits dans des modèles de substitution, comme des cellules en culture, et il n’existe pas encore de modèle computationnel des comportements complexes animaux. Ces résultats obtenus grâce aux animaux sont complémentaires de ceux obtenus chez les humains, auxquels ils sont confrontés et comparés.

Réduction

Afin d’en limiter le nombre, tous les animaux (80 en tout) sont soumis aux enregistrements en photométrie par fibre, puis ces mêmes animaux en bonne santé sont euthanasiés en vue des études anatomiques ou immunohistochimiques. Des groupes de 10 minimum doivent être utilisés afin d’obtenir des résultats statistiquement concluants sur les effets biologiques. La taille de ces effectifs est déterminée sur la base des études antérieures et de calculs de sensibilité.

Raffinement

Dans le cadre du raffinement de l’expérimentation animale, les procédures sont optimisées pour exposer les animaux au minimum de douleur possible. L’injection stéréotaxique et l’implantation de la fibre optique sont réalisées simultanément sous anesthésie totale et locale pendant la chirurgie et un analgésique est administré en péri-opératoire. Les animaux sont observés quotidiennement par une personne compétente. Toute souris qui montre des signes de mauvaise santé engendrant une souffrance selon des points limites préétablis, est exclue du protocole et euthanasiée. Les souris (4 par cage) sont hébergées dans une animalerie de stabulation ventilée (température 19-21 degrés C, cycle jour-nuit 12h-12h) avec accès à l’eau et croquettes ad libitum, et la litière est changée tous les 7 jours pour éviter le stress. Les animaux d’origine extérieure sont acclimatés pendant au moins une semaine avant le début des procédures. Nous travaillons en étroit lien avec l’équipe vétérinaire pour s’assurer que l’animal ne souffre pas face à une gêne, une détresse, une douleur ou une blessure. Si un animal est en souffrance, il est rapidement euthanasié.

Choix des espèces

L’anatomie et la physiologie de la souris sont suffisamment complexes pour modéliser de nombreux aspects de la biologie humaine, et son système nerveux présente de multiples analogies avec celui des humains. Ceci nous permet d’identifier des processus transposables en physiologie humaine et médecine, y compris en ce qui concerne les mécanismes qui sous-tendent l'addiction. De plus, ce rongeur constitue un modèle de choix bien caractérisé, avec une histoire fournie d’études pharmacologiques et comportementales en rapport avec l’addiction, ce qui permet de construire des hypothèses valides et pertinentes. Enfin, l'utilisation de la souris comme modèle autorise l'application de techniques moléculaires sophistiquées très informatives, telles celles mises en oeuvre dans ce projet (recombinaison homologue, transfert de gènes au moyen de virus), permettant d’aborder la fonction des gènes de manière intégrée, dans l’organisme vivant. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (âge entre 10 et 20 semaines). Il s’agit du stade pertinent pour évaluer l'effet des drogues addictives, les études chez les juvéniles sortant du cadre de ce projet de recherche.

5 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de cellules tumorales pour développer des tumeurs pédiatriques, puis des traitements par voie orale et par injection pendant une quinzaine de jours, avant d'être mises à mort pour prélever leurs organes et leurs tumeurs, dans une étude de molécules inhibitrices d'épissage contre les cancers de l'enfant. Le porteur limite la description des effets indésirables aux tumeurs sous-cutanées du flanc et aux traitements. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne rend compte du comportement tumoral dans toute sa complexité.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont d’évaluer l’impact de modificateurs de la traduction des protéines comme immunomodulateurs sur la réponse anticancéreuse dans les cancers pédiatriques. Après plusieurs tests in vitro, nous avons isolé huit molécules candidates et ce, sur plusieurs lignées de cellules murines à l’origine cancers très graves de l'enfant.

Bénéfices attendus

Ces résultats démontreront les composants biologiques importants dans la traduction des protéines ont un potentiel dans les cancers pédiatriques avec comme objectif final l’identification de potentielles combinaisons médicamenteuses capables d’augmenter ultérieurement la survie des patients.

Procédures

Une injection unique de cellules tumorales sera réalisée pour le developpement des tumeurs pédiatriques (durée 5 minutes). Dans le cas de la voie d'administration per os, les souris seront administrées 2 à 4 fois par semaine pendant 2 semaines (durée 30 secondes). Un prélevement de sang unique, sera réalisé sous anesthésie générale. Les traitements par injection seront faits toutes les 24h, 48h ou 72h et ce durant 15 jours (durée 30 secondes).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables potentiels seront ceux liés à la présence de tumeurs uniques sur le flanc, sous la peau, ainsi que ceux liés aux traitements par injection ou administration orale.

Devenir

Tous les animaux de l’étude seront euthanasiés pour prélèvements d'organes et de tumeurs post-mortem.

Remplacement

Il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’évaluer les interactions entre les différents compartiments cellulaires (cellules du système immunitaire, cellules tumorales, etc.). Ainsi, la faisabilité et l’efficacité d’une nouvelle approche à visée thérapeutique a recours à un modèle animal. Les modèles cellulaires alternatifs ne permettent pas d'appréhender le comportement tumoral dans toute sa complexité, en particulier les interactions avec le microenvironnement ou encore la réponse aux traitements impliquant souvent différents système au sein de l'organisme (systeme vasculaire, immunitaire...), l'utilisation des modèles appliqués in vivo reste donc indispensable. Ces modèles vont à la fois nous permettre d'étudier l'efficacité de nos molécules et leurs liens avec les mécanismes oncogéniques et metastiques des cancers mais également explorer et valider l'efficacitté de thérapies susceptibles d'être utilisées chez les patients.

Réduction

Une étude approfondie de la littérature a été menée avant d’initier ce projet pour s’assurer de l’absence de résultats publiés s’approchant des objectifs de notre étude. Le nombre d’animaux utilisé lors des expériences sera établi de façon à obtenir des résultats statistiquement significatifs. Le nombre d'animaux utilisé tient compte de la variabilité naturelle des réponses immunitaires et de la nécessité d'utiliser un nombre suffisant d'animaux pour que les données générées soient exploitables sur le plan statistique. Les analyses statistiques seront effectuées en utilisant des tests non-paramétriques dont l'application ne requiert pas la vérification préalable de la normalité incompatible avec les petits échantillons.

Raffinement

Les animaux sont surveillés chaque jour afin de détecter toute modification dans le comportement/déplacement de l'animal. Les zones implantées sont également observées quotidiennement afin de detecter précocement un developpement de la tumeur. Les procédures expérimentales peuvent engendrer une douleur modérée. Pour la limiter, nous avons établie une grille d’observation visant à définir des points limites précoces à partir desquels l’expérience sera arrêtée et cadrant les mesures prises à l’apparition des premiers signes de contrainte/ douleur. Si nous détectons des signes de stress ou de douleur anormaux, nous donnerions un antalgique morphinique pour soulager les animaux. Toutes les injections seront précédées d'une anesthésie locale. Les animaux seront stabulés en groupe, avec accès illimité à la nourriture et à la boisson. Un enrichissement du milieu est également apporté par des sizzlenests et de maisons en cartons.

Choix des espèces

Les modèles murins sont les modèles les plus utilisés pour étudier l’effet des médicaments sur la croissance tumorale. Dans ce projet, nous utiliserons des souris immunocompétentes ce qui nous permettra d’évaluer au mieux les coopérations entre les cellules immunitaires et les cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes (animaux âgés entre 4 et 6 semaines au début de protocole) au moment de l’injection des cellules tumorales. Nous utiliserons des souris jeunes afin de pouvoir etudier nos molécules sur des cancers pédiatriques.