Souris

45 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit chirurgicalement une plaie cutanée sur toute l'épaisseur de la peau puis on y greffe ou non un substitut dermique, chaque animal étant maintenu isolé en cage pour éviter l'arrachage des pansements. Le porteur compare la fonctionnalité d'un nouveau substitut dermique à base de collagène à un produit commercial. La mise à mort échelonnée sert à analyser la vascularisation et la régénération du tissu cutané.

Objectifs

L’objectif de ce projet est d’évaluer in vivo chez la souris la fonctionnalité d’un nouveau substitut dermique acellulaire à base de collagène développé selon une nouvelle technique de fabrication brevetée, en comparaison avec un substitut dermique acellulaire commercial également à base de collagène. Les substituts dermiques seront greffés sur des souris possédant un système immunitaire fonctionnel après induction d’une plaie cutanée sur toute l’épaisseur de la peau. Des prélèvements seront effectués à différents temps après réalisation de la greffe de substitut dermique afin d’étudier les interactions se mettant progressivement en place entre les substituts dermiques et l’environnement de l’hôte, plus spécifiquement sa colonisation par les cellules de la souris pour le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir donc du tissu environnant de la souris lors des phases précoces de la cicatrisation. Le substitut dermique nouvellement développé devrait en effet permettre d’accélérer la mise en place de ces interactions via une colonisation plus rapide et progressive du substitut dermique et donc d’accélérer le processus de cicatrisation. Un ensemble d'analyses effectuées sur les prélèvements cutanés collectés permettront de caractériser au cours du temps la fonctionnalité du substitut dermique nouvellement développé par rapport à un substitut dermique commercial, et d’appréhender les interactions se mettant progressivement en place au cours du temps entre les substituts dermiques et l’hôte.

Bénéfices attendus

Les substituts dermiques sont des biomatériaux capables de remplacer une partie de la peau et constituent une alternative précieuse pour la gestion des plaies lorsque les thérapies standards sont un échec. Cependant, sélectionner le bon substitut n’est pas une décision thérapeutique aisée. Aujourd'hui, si les greffes autologues (donneur et receveur sont la même personne) sont les greffes de première intention pour la couverture des plaies, elles se heurtent à l’écueil d’une disponibilité limitée de peau, en particulier dans la prise en charge des grandes brûlures et les procédures restent invasives et douloureuses. Des allogreffes (donneur et receveur de même espèce) et des xénogreffes (donneur et receveur d'espèces différentes) peuvent pourvoir au remplacement temporaire de la peau, avant de laisser la place à une autogreffe. Subsiste évidemment les risques de rejet, douleurs et infection, et la formation de cicatrices. Le développement de nouveaux substituts dermiques acellulaires biosynthétiques, ne nécessitant donc pas l’utilisation de cellules humaines ou de prélèvement de peau sur une autre partie du corps, mais permettant d’accélérer le développement d’un réseau vasculaire et la régénération du tissu cutané à partir du tissu périlésionnel de l’hôte constitue une des nouvelles voies envisagée pour traiter les plaies chroniques qui ne cicatrisent pas, les greffes de tissus mous chez les patients présentant des brûlures à épaisseur partielle, des plaies chirurgicales, ulcères du pied diabétique, ulcères veineux… La caractérisation des interactions cellulaires se mettant en place entre le substitut dermique et l’hôte sur l’acceptation du substitut dermique, la colonisation du substitut dermique par les cellules de la souris, la rapidité de revascularisation et de régénération du tissu cutané au cours du temps après réalisation d’une greffe cutanée sont des paramètres importants qui vont permettre de mieux appréhender ces phénomènes précoces lors de greffes de substituts dermiques et de valider ou d’améliorer le process de fabrication du substitut dermique acellulaire nouvellement développé.

Procédures

Les souris seront soumises à une procédure chirurgicale pour l’induction de la plaie cutanée et la réalisation ou non des greffes de substitut dermique, effectuée sous anesthésie générale et sous couverture antalgique. La chirurgie sera réalisée en 20 minutes environ et ne sera effectuée qu’une seule fois. Le maintien des souris greffées ou non en cage individuelle sera nécessaire pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles les pansements, la compresse et surtout le substitut dermique.

Impact sur les animaux

L’induction de la plaie cutanée suivie ou non de la réalisation de la greffe de substitut dermique peur engendrer une souffrance des animaux. L’hébergement en cage individuelle des souris greffées ou non, nécessaire tout au long de l’étude pour éviter qu’elles ne s’arrachent entre elles le substitut dermique, l’anneau en silicone, les pansements, la compresse et la bande de sparadrap, peut conduire à un stress par la limitation des interactions sociales directes.

Devenir

Procédure expérimentale 1 (seule procédure expérimentale) : les 45 souris seront mises à mort à différents temps après réalisation de la greffe ou non de substitut dermique pour la réalisation d'un ensemble d’analyses permettant de caractériser les interactions cellulaires se mettant progressivement en place entre le substitut dermique et l’environnement de l’hôte (réseau vasculaire et régénération du tissu cutané notamment).

Remplacement

Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n’est pas envisageable dans le contexte de ce projet. Il n’est en effet pas possible d’utiliser des modèles in vitro ou ex vivo permettant de caractériser sur un temps prolongé la fonctionnalité de substituts dermiques greffés, processus dépendant de mécanismes complexes (influence du microenvironnement cutané, processus inflammatoire et immunitaire, revascularisation, réépithélialisation…). L’ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu’in vivo sur un modèle animal.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d’animaux nécessaire à la réalisation de ce projet mais permettant d’obtenir des résultats prédictifs et représentatifs. Ce nombre a été déterminé sur la base de résultats d’études précédentes obtenus sur ce modèle de greffe cutané. D’autre part, la réalisation de l’ensemble des analyses envisagées sur un même prélèvement cutané permet de limiter le nombre d’échantillons et donc d’animaux nécessaires.

Raffinement

Une attention toute particulière sera portée aux animaux lors de l’induction de la plaie cutanée puis de la réalisation ou non de la greffe cutanée (analgésie pré-opératoire, maintien des conditions d’asepsie, maintien de la température corporelle) ainsi qu’après réalisation ou non de celle-ci (analgésie post-opératoire). Les animaux seront observés quotidiennement tout au long de l’expérimentation et leur poids sera mesuré deux fois par semaine à chaque renouvellement de pansement. Une grille de score et des points limites adaptés à ce modèle d'étude seront suivis avec un arbre décisionnel permettant de mettre fin si nécessaire à toute souffrance des animaux. Des bâtonnets d’ouate seront placés dans chaque cage comme dispositif d’enrichissement pour assurer leur bien-être, et seront remplacés lors de chaque change de litière.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus adaptée pour réaliser ce projet en raison de sa taille et de sa facilité de manipulation permettant d’induire une plaie cutanée représentative des plaies à traiter chez l’Homme. Son utilisation est largement décrite dans la littérature scientifique pour les études sur les greffes cutanées et pour le développement de substituts cutanés. Les animaux seront des souris âgées de 6 semaines à l’arrivée au laboratoire et de 7 semaines pour le démarrage des expérimentations. Cela correspond à l’âge de souris décrit dans la littérature scientifique pour la réalisation d’études sur des greffes cutanées (généralement 6 à 8 semaines).

57 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur étudie le rôle de la protéine PTK7 dans le potentiel métastatique du cancer colorectal pour identifier des marqueurs et des cibles thérapeutiques. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie.

Objectifs

Le cancer colorectal est l'un des plus fréquents en France. Il touche, chaque année, plus de 43 000 personnes et cause 17 000 décès. A l'heure actuelle, nous cherchons toujours à comprendre les mécanismes de développement tumoral et métastatique afin d'améliorer la prise en charge, le traitement et le suivi des patients atteints de cancers colorectaux. L'identification de nouveaux marqueurs prédictifs de l'évolution de la maladie, ainsi que de cibles thérapeutiques qui seraient au coeur des processus tumoraux clés (initiation tumorale, dissémination dans la voie sanguine, colonisation métastatique des organes) constitue un enjeu majeur en terme de lutte contre cette maladie. Chez les patients atteints de cancers colorectaux, la protéine PTK7 a été décrite comme un facteur de mauvais pronostic. On retrouve cette protéine dans les tumeurs primaires (étape initiale) ainsi que les métastases (étape finale) chez les patients atteints de forme aggressive. Nous avons découvert que, chez ces mêmes patients, cette protéine est absente des cellules tumorales qui sont dans le sang (étape intermédiaire de dissémination). De cette observation est né le présent projet qui vise à déterminer le mécanisme de régulation transitoire de PTK7 dans les cellules tumorales. En effet, la perte de PTK7 sur les cellules cancéreuses en circulation sanguine semble primordiale dans le développement métastatique et nous voulons valider cette hypothèse afin de pouvoir déterminer comment mieux cibler cette protéine en terme de stratégie thérapeutique. Pour ce projet, nous voudrions mettre en place un modèle murin de cancer colorectal métastatique qui récapitule les observations que nous avons faites chez les patients concernant la protéine PTK7. Dans cette optique, nous utiliserons une lignée cellulaire humaine de cancer colorectal exprimant un fort taux de PTK7 que nous injecterons à des souris immuno-déficientes. Sur la base de la validation de la régulation de PTK7 dans notre modèle, nous proposons dans un second temps, de déterminer si l'absence de PTK7 est requise au niveau des celulles pour leur survie dans la circulation et la formation de métastases. Récemment nous avons mis en évidence que l'induction de la perte de PTK7 in vitro avait pour effet d'augmenter l'expression de FAK, protéine impliquée dans la survie des cellules cancéreuses. Nous prosposons, dans un troisème temps, de tester l'effet d'inhibiteurs de FAK et sa voie de signalisation sur la dissémination métastatique.

Bénéfices attendus

Au travers de cette étude chez la souris, nous pourrons valider et mieux comprendre un mécanisme nouvellement identifié chez l’homme. Sur la base des données obtenues, nous aurons déterminé l’implication de PTK7 dans la pathologie cancéreuse. Nous espérons, in fine, proposer de nouvelles pistes thérapeutiques dans le but final d’améliorer la prise en charge des patients atteints de cancers colorectaux agressifs.

Procédures

Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. Dans le contexte du suivi des cellules tumorales circulantes, les animaux feront l’objet de prélèvements sanguins, réalisés sous anesthésie. La fréquence des prélèvements respectera un délai de 15 jour minimum entre deux prélèvements (3 prélèvements maximum par animal). Le geste technique ne prend pas plus de 5 minutes par animal (induction de l’anesthésie comprise). Les animaux recevant les cellules tumorales par voie intraveineuse, en vue de mimer la dissémination des cellules à des foyers distants seront injectés (dose unique) dans la veine caudale (durée 2 minutes par animal). L’administration de traitement avec des inhibiteurs se fera par voie orale(gavage) à raison de deux administrations pour chaque animal concerné (durée 1 minute).

Impact sur les animaux

Dans ce projet, les animaux recevront les cellules par injection en voie sous-cutanée, manipulation pouvant entrainer de la douleur, du stress pour les individus concernés. La greffe de cellules ainsi que le suivi par prélèvement sanguin seront effectués sous anesthésie, procédure technique qui pourra induire une angoisse chez l’animal lors de la phase l’endormissement. De plus, le suivi de l’évolution de la pathologie cancéreuse nécessitera une préhension fréquente des animaux qui pourra également être source de stress. Lors du développement tumoral, la survenue de lésions cutanées est possible au niveau des greffons de croissance avancée. Dans le contexte du suivi de l’évolution métastatique de la pathologie, les animaux développeront des foyers tumoraux distants qui pourront induire des inconforts (tels que perte de poids, difficultés respiratoires) en fonction des sites touchés. L’administration par voie orale de composés pourra entrainer un stress / un inconfort pour les animaux. La prise en compte et l’anticipation de ces nuisances (phases d’acclimatation, d’habituation à la manipulation, enrichissement dans les cages, grille de score de bien-être et soins adaptés) nous permettront d’agir au mieux afin de réduire ces effets indésirables à leur maximum et le plus précocement possible dans le contexte du suivi des animaux, sans mettre en péril les conclusions expérimentales.

Devenir

Tous les animaux inclus dans ce projet seront euthanasiés à la fin de chaque procédure concernée en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. Les organes ainsi prélevés seront analysés par imagerie optique afin d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de la caractérisation du profil d’expression de notre protéine d’intérêt dans le contexte de la pathologie cancéreuse et de son évolution métastatique.

Remplacement

Dans cet objectif, chaque fois que cela a été possible, nous avons utilisé des approches substitutives in vitro et mis en place des techniques de culture cellulaire. Ces méthodes ont toutefois des portées limitées dans leur capacité à récapituler l’ensemble du processus physiopathologique de la croissance (pousse de la tumeur initiale) à la dissémination métastatique de la maladie. Le recours au modèle in vivo se fera dans la continuité de ces approches in vitro et ne sera utilisé qu’après validation de nos hypothèses au travers de ces méthodes complémentaires.

Réduction

Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Le recours à l’outil statistique nous a permis en outre de déterminer le nombre d’animaux suffisants mais nécessaires pour permettre de fournir des résultats significatifs.

Raffinement

Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.

Choix des espèces

Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines). De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.

1 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur applique un produit allergisant et irritant sur le ventre rasé puis sur les oreilles pour déclencher un eczéma, et jusqu'à huit injections d'anticorps sur trois semaines. Le porteur analyse les mécanismes immunitaires de l'eczéma et sa récidive, maladie qu'il dit toucher plus de 15% de la population. Il affirme qu'aucun test in vitro ne récapitule la complexité de la réaction immunitaire de la peau et que les cellules primaires doivent être prélevées post-mortem sur des souris.

Objectifs

Les eczémas allergiques tels que l’eczéma de contact (colorants, produits chimiques, nickel…) ou l’eczéma atopique (acariens, moisissures, poils de chien/chat…) se caractérisent par des lésions cutanées et sont dues à une réaction allergique. Ces eczémas touchent plus de 15% de la population. La cause des eczémas est complexe et reste mal comprise à ce jour. Ces dernières années, une population de cellules immunitaires, ayant une fonction de mémoire à long terme et résidant dans les tissus, a été mise en évidence. Ces cellules particulières ne re-circulent pas dans l’organisme et patrouillent dans la peau à l’interface entre l’organisme et l’environnement. Il a été montré que ces cellules sont impliquées dans la récidive et la sévérité de l’eczéma. En effet, une des caractéristiques cliniques de l’eczéma est qu’il se développe sous forme de poussées, entrecoupées de périodes de rémission. Lors des poussées, dont la sévérité augmente généralement au cours du temps, les lésions reviennent préférentiellement sur les sites antérieurement atteints. Les traitements actuels préconisés pour ces eczémas consistent notamment en l'application cutanée d'anti-inflammatoires (corticoïdes). Toutefois, ce type de traitement, bien que permettant de soulager les symptômes de l’eczéma, ne permet pas d’empêcher les récidives. Ce projet a donc pour but de tester une nouvelle stratégie thérapeutique pour lutter contre les eczémas et d'évaluer son effet sur la formation, la survie, la prolifération et la réactivation des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Ainsi, 6 anticorps, dont l'efficacité et la sureté ont déjà été démontrées dans d'autres modèles, seront testés dans ce projet. Grâce à cette stratégie, une nouvelle solution thérapeutique permettant d’éliminer les cellules responsables de l'eczéma et donc de traiter cette pathologie à sa source, pourrait voir le jour.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une meilleure compréhension de la physiopathologie de l’eczéma et une meilleure compréhension de la biologie des cellules immunitaires mémoires résidant dans la peau. Il pourra servir en outre de preuve de concept de l’intérêt de cibler les cellules immunitaires mémoires résidants dans la peau pour traiter l'eczéma ou d'autres maladies inflammatoires chroniques. Enfin, l'objectif final de ce projet serait de pouvoir proposer une stratégie thérapeutique innovante, permettant de stopper la récurrence des poussées d’eczémas, grâce aux résultats de ce travail.

Procédures

Les animaux recevront une application cutanée de produit allergisant et irritant sur leur ventre rasé au début des procédures. Cette procédure (rasage + application du produit) sera réalisée sur animal vigile et durera au maximum 1 minute. 5 jours après, les animaux recevront une application du même produit sur leurs oreilles, afin d'induire une réaction allergique (inflammation). Cette intervention sera réalisée sous anesthésie générale afin d'éviter que les souris ne lèchent le produit avant qu'il n'ait pénétré dans la peau. L'anesthésie durera environ 40 minutes. Les animaux seront également être traités (8 injections de traitement au maximum) avec un anticorps (ou anticorps contôle) sur une durée maximale de 3 semaines. En effet, dans certaines procédures, 7 injections de traitement sont nécessaires pour observer un effet de l'anticorps, comme démontré dans la littérature. Ce traitement sera réalisé sur animal vigile par injection du produit (durée de la procédure d'injection : 10 secondes). Enfin, les oreilles des souris seront mesurées 5 fois par semaine, pendant 2 semaines, afin de suivre de manière quantitative l'inflammation (l'augmentation de l'épaisseur des oreilles étant un des signes de l'inflammation). Ces mesures seront effectuées sur animaux anesthésiés (durée de l'anesthésie : 2-3 minutes) afin d'éviter de générer un stress trop important chez les souris et pour réaliser les mesures les plus fiables et reproductibles possible.

Impact sur les animaux

Les procédures mises en place ne devraient pas donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l'état général des animaux. Ce modèle d'eczéma induit chez la souris est parfaitemenent maitrisé dans l'équipe ; nous savons donc que l'induction d'un eczéma chez la souris ne génère pas de signe de douleur apparente. L'eczéma peut conduire les souris à se gratter, mais dans notre expérience, nous n'avons jamais observé de signe excessif de grattage.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir prélever leurs oreilles, leurs ganglions (et éventuellement leur rate et leur sang). Ces différents organes sont ensuite utilisés pour analyser la réponse immunitaire.

Remplacement

Aucun test in vitro ne permet de récapituler de manière satisfaisante la complexité de la réaction immunitaire de la peau et des organes immunitaires associés, dans le cadre de l’allergie. D'une part, les cellules que nous étudions dans ce projet sont des cellules initialement circulantes, qui pénètrent dans le tissu suite à la ré-application de l'allergène sur la peau de l'animal. Malheureusement, les techniques actuelles d'étude in vitro ne permettent pas de mimer cette étape de pénétration dans le tissu. D'autre part, l'utilisation de modèles de peau reconstruite à partir de cellules murines n'est pas envisageable. En effet, ces modèles sont loin d'être fonctionnels puisqu'il n'existe à ce jour aucune lignée de cellules de peau immortalisées. Cela nécessite donc l'utilisation de cellules primaires (récupérées post-mortem sur des souris) qui ne peuvent pas être congelées et qui résistent mal ex vivo. Enfin, les modèles de peau reconstruites à partir de tissu humain en sont à un stade de développement plus avancé que chez la souris mais ils restent malgré tout inutilisables après 2 semaines de culture. Etant donnée que nos expériences durent toutes 3 semaines ou plus, l'utilisation de ces modèles de peau reconstruites ne peut être envisagée dans ce projet. Dès lors, l’utilisation d’un modèle animal est indispensable à la réalisation de notre étude.

Réduction

L’estimation du nombre d’animaux par groupe est réalisée sur la base de notre expérience ainsi que sur la littérature scientifique et a été réduit au maximum sans mettre en péril une interprétation statistique de nos résultats. Aussi, un minimum de 10 animaux par groupe est nécessaire afin de réaliser des analyses statistiques pertinentes et robustes. A noter que les expérimentations décrites ici indiquent le nombre maximum d’animaux susceptibles d’être utilisés dans ce projet. Toutefois, le nombre d’animaux nécessaire pourra diminuer en fonction des résultats obtenus. En effet, des statistiques intermédiaires pourront être réalisées afin de déterminer la puissance de nos tests et de revoir à la baisse nos effectifs d’animaux si possible.

Raffinement

Afin d'optimiser le bien-être des souris, nous réaliserons une observation clinique des animaux 5 fois par semaine (durant les 2 premières semaines de chacune des procédures) puis de manière hebdomadaire jusqu'à la mise à mort des animaux. Nous attacherons ainsi une grande importance à l'apparence physique externe et aux changements comportementaux de ceux-ci. Dans le cadre de ce projet, les animaux seront anesthésiés pour chaque geste entraînant ou pouvant entraîner un stress ou une douleur pour l’animal, geste invasif ou non. Lors des injections par voie intrapéritonéale, nous veillerons consciencieusement à ne pas toucher les mammelles des souris afin de ne pas blesser les animaux. L'application d'un produit anti-inflammatoire ou cicatrisant n'est pas envisageable pour les souris présentant des lésions d'eczéma car cela risquerait de perturber le déroulé de la réponse inflammatoire et donc d'impacter les cellules étudiées dans cette étude. Dès lors, les animaux présentant des signes de grattage excessif seront immédiatement mis à mort.

Choix des espèces

La souris est un modèle très utilisé pour étudier les pathologies inflammatoires telle que l’allergie en raison des nombreux outils mis à disposition pour l’analyse des réponses immunes. De plus, de nombreux produits, spécifiques à l'immunologie (ex: anticorps, kits de dosage de cytokines), ne sont disponibles que chez la souris. Cette espèce est également proche de l’homme en ce qui concerne certains marqueurs de la réponse immunologique comme la production de molécules inflammatoires ou l’induction de différentes populations de cellules mémoires. De plus, les travaux de recherche sur les cellules étudiées dans ce projet sont également réalisés chez la souris. Dès lors, dans l’optique de pouvoir confronter nos résultats à ceux obtenus par d’autres, l’utilisation du modèle murin est indispensable à notre étude. Les souris provenant de fournisseurs arrivent à l’âge de 6 semaines et sont acclimatées au sein de notre animalerie avant d'entrer dans nos protocoles. Les souris entrent dans les procédures à 8-10 semaines, âge auquel les souris présentent un système immunitaire suffisamment mature pour effectuer une sensibilisation efficace.

279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur lèse un muscle de la patte arrière par injection d'une toxine, puis on leur injecte des cellules immunitaires génétiquement modifiées par voie intramusculaire ou dans la veine de la queue. Le porteur cherche à mettre au point une stratégie pour délivrer des molécules thérapeutiques aux muscles dans les maladies musculaires. La mise à mort sert des analyses des tissus, et le porteur précise que tout animal tué peut fournir des prélèvements à d'autres projets de l'équipe.

Objectifs

Un obstacle majeur au développement de thérapies musculaires est de parvenir à délivrer les molécules thérapeutiques aux muscles, qui sont répartis dans tout l'organisme et représentent plus de 40% de la masse totale chez l’adulte. Ce projet vise à développer une nouvelle stratégie de délivrance aux muscles, basée sur l'utilisation de cellules sanguines génétiquement modifiées. La plupart des maladies musculaires provoquent une dégénérescence des fibres, entraînent un recrutement naturel de cellules immunitaires du sang aux sites de régénération, le muscle étant très irrigué. En modifiant ces cellules immunitaires pour les rendre capable de reconnaître les sites de régénération et de fusionner avec les cellules musculaires, nous cherchons à générer un outil qui puisse cibler le muscle blessé, fusionner avec les fibres nouvellement formées et délivrer des molécules d'intérêt thérapeutique. Les cellules immunitaires utilisées dans ce projet sont des cellules T (lymphocytes) génétiquement modifiées par des virus, afin d'exprimer des molécules de reconnaissance musculaire et des protéines de fusion à leur surface. Des essais de fusion de ces cellules sanguines à des cellules musculaires ont déjà été réalisés dans l’équipe apportant une preuve de principe pour cette stratégie in vitro. Nous sommes prêts à étendre notre étude in vivo, par l'utilisation d’un modèle animal capable de reproduire cet obstacle de délivrance présent chez l'homme. La souris représente un modèle optimal pour ces approches, avec la possibilité d’utiliser des protocoles établis pour la délivrance de cellules par voie intraveineuse, et la possibilité de mimer les phénomènes de réparation des muscles. Les lymphocytes T génétiquement modifiés seront administrés à des souris immunodéficientes, dont le muscle a été lésé par une injection de toxine, induisant un contexte de régénération et d’inflammation aigu. L’objectif du projet est donc d’utiliser les cellules T comme cargo pour véhiculer des molécules thérapeutiques aux muscles en régénération via la circulation sanguine. Les objectifs sont donc multiples : s’assurer qu’après manipulation génétique, les cellules T thérapeutiques fusionnent aux muscles dans un contexte systémique d’organisme vivant, qu’elles peuvent être recrutées aux sites de régénération et qu’une combinaison de ces deux propriétés permette d’avoir un système de transport de molécules thérapeutiques efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet totalement novateur permettrait de prouver la fusion de cellules immunitaires sanguines aux cellules musculaires in vivo et ainsi de mettre en avant l’utilisation de ces cellules sanguines comme outils thérapeutiques dans le combat contre les myopathies ; notamment la myopathie de Duchenne, très étudiée aujourd’hui, pour laquelle pourtant les alternatives thérapeutiques font défaut. Si cette stratégie fonctionne, des systèmes de réparation des mutations génétiques causant la maladie sont en train de faire leurs preuves sur le marché, leur expression par nos cellules immunitaires thérapeutiques pourrait être une avancée majeure dans le domaine. De plus, l’étude de la régénération des muscles dans ce modèle spécifique de souris immunodéficientes n’a jamais été réalisée et elle permettra d’enrichir la littérature.

Procédures

La première intervention commune à tous les animaux sera la lésion musculaire (d’un muscle de la patte arrière), par injection intramusculaire d'une toxine, qui peut occasionnellement entrainer une diminution de la mobilité des souris pendant les heures qui suivent. Cette injection sera unique pour chaque patte de l’animal, le temps d’injection par patte est de 30 secondes, l’anesthésie pour cette procédure est au maximum de 10 minutes par animal et se fait par isoflurane (transitoire par les voies respiratoires). Les animaux subiront également des injections de cellules immunitaires. Certains en intramusculaire, la procédure est la même que pour la lésion. D’autres en intraveineux, qui correspond à une injection unique de cellule dans la veine de la queue, sous anesthésie toujours par les voies respiratoires. L’injection dans la veine dure 1 minute par injection et les animaux seront anesthésié au maximum 10 minutes. Les souris recevront aussi une injection d’analgésique pour éviter les douleurs liées aux injections intra-musculaires et intra-veineuses, en sous-cutanée, au maximum 2 fois (une fois lors de la lésion et une fois lors de l’injection de cellules, si les deux injections sont à des temps différents). Les souris soumises à de l’imagerie in vivo pourront y être soumises tous les 3 jours (injection de réactif, en sous-cutanée, puis anesthésie, par les voies respiratoires pendant maximum 10 minutes le temps de la prise d’image) pendant au maximum 14 jours. Les animaux vont être transportés dans leurs cages d'habitat avant chaque lecture de bioluminescence (dans le même bâtiment), le transport (aller ou retour) dure au maximum 5 minutes.

Impact sur les animaux

Les animaux de ce projet vont subir des interventions non chirurgicales et les seuls actes effectués seront des injections sous-cutanées et intra-musculaires. L’injection intra-musculaire de cardiotoxine pour léser le muscle porte un risque spécifique et une attention particulière sera portée sur la capacité motrice des souris (même si les animaux présentent une régénération spontanée et totale des muscles après cette technique et qu’elle ne doit en théorie pas les empêcher de marcher, même directement après lésion). L’inconfort lié à la piqûre sera évitée car sous anesthésie et la douleur au réveil sera prise en charge par des analgésiques préventifs. Les injections de cellules intra-musculaire ou intraveineuses (prolifération non contrôlées in vivo) seront à surveiller pour toute apparition de masse dans la patte, l’inconfort et la douleur seront pris en charge de la même manière que lors de la lésion musculaire. Les effets indésirables attendus pour les injections sous-cutanées sont l’inconfort lié à la sensation de piqûre. Les animaux vont aussi être soumis à des inhalations d’isoflurane (anesthésique) plusieurs fois au cours des expériences, une bonne et rapide récupération de l’anesthésie (réveil) est à surveiller. Les animaux vont aussi devoir être transportés (dans le même bâtiment) avant toute imagerie de bioluminescence. L’accès à l’eau et la nourriture ainsi que leurs habitats ou le groupe dans la cage resteront inchangés.

Devenir

A l’issue de chaque procédure les animaux seront mis à mort pour analyse des tissus. En effet, même dans le cas où les images de bioluminescence donnent des résultats positifs, des analyses histologiques des tissus (coupes musculaires) seront effectuées afin de comprendre plus en détail (de façon microscopique) le fonctionnement des phénomènes que l’on voit apparaître tels que la localisation des cellules injectées ou leur fusion aux muscles, ou tout simplement attesté d'une bonne régénération du muscle.

Remplacement

Ce projet vise à tester la capacité de fusion de cellules T modifiées avec les fibres musculaires, suite à leur administration systémique dans la circulation sanguine. Après une preuve de concept de la fusion des deux types cellulaires (sanguine et musculaire) in vitro, il n’existe actuellement aucun moyen de continuer ce projet pour une étude dans un contexte systémique autrement que dans un système animal complet. L’organisme de la souris pourra permettre de comprendre l’influence du micro-environnement de la lésion musculaire et l’implication des cellules en périphérie des muscles sur notre modèle thérapeutique.

Réduction

Ce projet a été pensé avec un nombre d’animaux minimum pour avoir un effet statistiquement significatif. Un effort de réduction des animaux est amené par l'utilisation de l'imagerie de bioluminescence in vivo : cela permet de suivre la progression de l'expérience à différents points de temps sans mettre à mort l’animal. De plus tout animal mis à mort peut être utilisé pour obtenir des prélèvements nécessaires à d’autres projets de l’équipe (notamment extraction de cellules T pour test in vitro sur ce projet). Lorsque cela est possible, les muscles des deux pattes seront injectés afin réduire le nombre d’animaux en conservant une puissance statistique qui nous permettra de conclure sur l’expérience. Finalement, le projet est découpé en multiples procédures qui vont nous permettre de comprendre le comportement des cellules injectées dans l’animal et d’ajuster certains paramètres avant l’expérience d’intérêt thérapeutique, ce projet ne représente alors pas seulement la recherche d'un résultat mais la compréhension de processus encore non décrits dans la littératures.

Raffinement

Dans un esprit de raffinement du projet, les protocoles choisis en priorité sont ceux qui limitent la douleur et l’inconfort de l’animal. Des analgésiques et des anesthésiques sont combinés pour réduire au maximum la douleur et le stress de l’animal lors des procédures de type lésion musculaire et injection de cellules. Les animaux sont surveillés quotidiennement dans les trois jours qui suivent l’injection de cardiotoxine ou de cellules notamment afin de s’assurer de la mobilité des animaux dans les cages. Une grille d’évaluation clinique est mise en place, basée sur le comportement (prostration, aggressivité), l’aspect physique (aspect du poil, prise ou perte de poids) et la physiologie de l’animal (de plis cutanés, signes de déshydrations, de diarrhées). Le niveau d'analgésique (de pallier 1, 2 ou 3) est adapté selon le score total. Un score supérieur à 8 sans effet des analgésiques de pallier 3 constitue un point limite de mise à mort de l’animal. Le raffinement des animaux passe aussi par l’enrichissement de leur habitat spécifique à leur génotype dommageable immuno-déficient comme des aliments et des éléments de jeu irradiés et des manipulations en milieu stérile.

Choix des espèces

La souris est couramment utilisée dans le domaine de l’immuno-oncologie (cellules CAR T) et les protocoles associés à cette technique sont hautement normalisés. De plus, le modèle de lésion aiguë à la cardiotoxine est vastement utilisé et la régénération spontanée et rapide des muscles de souris ce qui en fait un candidat très intéressant pour notre étude. Le modèle murin sert aussi couramment de modèle de dystrophie musculaire dans des études précliniques ce qui valide notre approche pour une potentielle étude dans un contexte de lésion chronique des muscles, voire, dans le cadre d’une application thérapeutique chez les patients. Le projet concerne des animaux adultes étant donné que le muscle termine sa croissance aux alentours de 5 semaines. Les animaux sont utilisés préférentiellement entre 7 et 12 semaines. Cependant, afin de réduire le nombre d'animaux pour former des cohortes, les souris peuvent être utilisées jusqu'à l'âge de 5 mois.

1 888 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur induit une fibrose du foie par des injections deux fois par semaine pendant quatre à douze semaines ou par un régime gras, puis certaines subissent sous anesthésie une coupure de la queue ou une lésion du foie au laser après ouverture du ventre pour provoquer un saignement observé au microscope. Le porteur étudie le rôle de la coagulation dans la cirrhose et les saignements associés, sur des mécanismes qu'il décrit comme mal connus. La mise à mort est justifiée par le prélèvement d'organes et de grands volumes de sang.

Objectifs

La fibrose hépatique est une cicatrisation anormale du foie en réponse à des agressions répétées (infection par un virus, consommation excessive d'alcool, consommation excessive d'aliments gras ou sucrés (maladie du foie gras). La maladie du foie gras est la première cause de maladie du foie dans le monde, affectant 25% de la population mondiale, et est caractérisée par une accumulation de graisses dans le foie puis l'apparition d'une inflammation et à terme d'une fibrose. La fibrose du foie peut progresser vers la cirrhose qui est une maladie grave responsable de 150000 décès par an en Europe. Les mécanismes de la fibrose du foie sont incomplètement compris et il n'existe à ce jour aucun traitement approuvé. La coagulation est une cascade de réaction aboutissant à la formation d'un caillot qui va permettre d’arrêter un saignement. Le foie joue un rôle central dans la coagulation car il synthétise les facteurs qui servent à coaguler. En cas de cirrhose, la production de ces facteurs est perturbée ce qui peut favoriser les saignements, notamment après une biopsie. Mieux comprendre les mécanismes qui perturbent la coagulation au cours de la cirrhose permettrait de mieux prévenir les saignements. De plus, la coagulation favorise également le développement de la fibrose du foie, ce qui en fait une cible thérapeutique potentielle. Nous étudions une protéine enzymatique qui inhibe la coagulation et favorise donc les saignements. Elle est produite par les plaquettes, les cellules immunitaires et les cellules endothéliales, et sa concentration est augmentée dans le sang des patients qui ont une cirrhose. Cette protéine enzymatique protége du développement de la fibrose pulmonaire mais son rôle dans le développement de la fibrose du foie est inconnu. Les deux objectifs du projet sont de comprendre le rôle de cette protéine enzymatique dans le développement de la fibrose du foie (en général et dans la maladie du foie gras) et son rôle dans la coagulation et les saignements survenant au cours de la cirrhose.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont nombreux 1) En déterminant les mécanismes de développement de la cirrhose et fibrose du foie, nous allons potentiellement trouver de nouvelles pistes pour développer des traitements de ces maladies chez les personnes avec un foie gras mais aussi chez les personnes qui ont de la fibrose liée à un virus ou à une consommation excessive d'alcool. 2) En étudiant la coagulation de la cirrhose, nous comprendrons mieux les mécanismes complexes qui entrainent une coagulation anormale chez les patients atteints de cirrhose. Nous allons voir si bloquer une protéine de la coagulation permet de diminuer les saignements sur des modèles de souris. Si c'est efficace, cela pourrait devenir un traitement préventif des saignements qui surviennent chez les patients qui ont une cirrhose après une biopsie et cela éviterait d'avoir à transfuser les patients dans un contexte actuel où on manque de poches de sang.

Procédures

La demande d’autorisation de projet concerne les procédures suivantes Sur animal vigile : - Injections dans le ventre d'un produit deux fois par semaines pendant 4 à 12 semaines pour développer de la fibrose au niveau du foie - Mise sous régime riche en matières grasses pour créer une maladie du foie gras pendant 4 à 12 semaines. Sur animal anesthésié: - Injection dans une veine de la queue d’un anticorps (molécule qui bloque la coagulation) pour stopper les saignements sous anesthésie - Coupure de la queue pour induire un saignement sous anesthésie - Lésion avec un laser du foie après ouverture du ventre pour induire un saignement et observation des cellules qui aident à arrêter le saignement à l'aide d'un microscope sur la souris encore vivante sous anesthésie - Prélèvement de sang dans une veine du ventre puis euthanasie sous anesthésie et prélèvements des organes.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont - Une perte de poids initiale puis une stabilisation du poids chez les souris traitées pour induire une cirrhose - Pour les souris qui ont un régime riche en graisses, une prise de poids modérée est attendue - Des douleurs temporaires au moment de l'injection de produit dans le ventre - Possible stress les premiers jours des injections dans le ventre lié à la nouveauté de la procédure qui devrait s’estomper avec le temps - Les procédures pouvant induire des douleurs ou un stress telles que le prélèvement dans la veine du ventre, l’injection de produit dans la queue, la coupure de la queue pour induire un saignement ou les lésions du foie induites par un laser - La fibrose du foie et la cirrhose sont des maladies indolores qui n'entraînent pas d'altération du bien être animal.

Devenir

Les souris seront toutes euthanasiées à l'issue des procédures sous anesthésie car elles ne pourront pas être maintenues en vie (car on aura prélevé plusieurs organes vitaux ou prélevé une trop grande quantité de sang).

Remplacement

La coagulation et le développement de la fibrose du foie étant des processus complexes, il n’est actuellement pas possible de remplacer totalement le modèle animal par des modèles informatiques ou des modèles de cellules en laboratoire. Néanmoins, pour limiter l'utilisation de trop de souris, nous réaliserons certains tests pour étudier la coagulation sur du sang prélevé sur des malades quand cela est possible.

Réduction

Nous avons réduit le nombre d'animaux au strict minimum afin d'être en mesure d'obtenir des résultats interprétables. Nous avons utilisé des tests statistiques pour déterminer le nombre de souris minimum que nous incluerons dans le projet pour mettre en évidence une différence entre les deux groupes. Nous utiliserons les mêmes souris contrôles (souris qui n'ont pas de traitement toxique pour le foie) pour plusieurs procédures. De plus, nos souris contrôles seront issues des accouplements faits pour générer les souris des différentes lignées.

Raffinement

Toutes les mesures seront prises pour assurer le bien être des animaux: surveillance quotidienne par le personnel qualifié de l'animalerie, enrichissement de l'environnement (batonnets en bois et cotons), analgésie et anesthésie lors des procédures douloureuses. Le bien être sera également évalué à l'aide d'une grille d'évaluation (étude du comportement des animaux, de leur poids...) pour prendre en charge la douleur de manière anticipée.

Choix des espèces

Le modèle murin permet d’utiliser des souris génétiquement modifiées. Les techniques pour modifier le génome développées chez les souris et les nombreux outils actuellement adaptés à la souris en font un modèle de choix pour l'étude. Enfin, la fibrose du foie et la cirrhose étant des maladies multifactorielles, la proximité génétique de la souris vis à vis de l’Homme nous permettra de nous affranchir en partie de certaines variables occasionnées par d’autres espèces. Le début des procédures sur les animaux se fera à partir d’un âge de 8 semaines (ce qui correspond à l’âge adulte chez l’homme et qui est l'âge auquel apparaît cette maladie chez l'homme).

911 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses de mutations dans les voies de réparation de l'ADN, elles subissent des prélèvements sanguins tous les quatre mois pendant un an et développent pour certaines des syndromes tumoraux, celles-ci étant tuées dès l'apparition des tumeurs. Le porteur étudie le rôle de la réparation de l'ADN dans le développement des systèmes immunitaire et nerveux et dans la genèse de cancers comme la leucémie lymphoïde chronique. Il affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vitro" pour ces processus de développement.

Objectifs

Les cassures double brin de l’ADN (CDB) sont les lésions génomiques les plus toxiques et font pourtant partie intégrante de processus biologiques au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux. Des mécanismes puissants de réparation de ces lésions ont été conservés au cours de l’évolution afin d’éviter l’instabilité génétique qu’elles peuvent engendrer. La mauvaise réparation des CDB est à la base de nombreuses pathologies chez l’homme allant de certaines maladies neurodégénératives (Ataxie télangiectasie), aux déficits immunitaires sévères en passant par le développement de cancers. Chez l’animal, les formes les plus sévères de déficit de réparation des CDB se traduisent par une létalité embryonnaire tardive consécutive à la mort massive des neurones. Néanmoins, les voies de réparation de l’ADN constituent des cibles thérapeutiques privilégiées pour le développement des traitements anticancer. Notre laboratoire a identifié plusieurs gènes impliqués dans diverses voies de réparation des CDB à partir de l’analyse de situations pathologiques chez l’homme. Depuis de nombreuses années nous associons ces études issues du patient au développement de modèles animaux d’invalidation génique afin de mieux comprendre la physiopathologie des facteurs identifiés.

Bénéfices attendus

Nous attendons de ce projet une meilleur compréhension du rôle des mécanismes de réparation de l'ADN au cours du développement du système immunitaire et du système nerveux central. Ce projet nous aidera également à mieux comprendre comment les défauts de ces mécanismes de réparation participent à la genèse de syndromes tumoraux que l'on rencontre en pathologie humaine, notamment la leucémie lymphoïde chronique.

Procédures

sacrPour évaluer la survenue de leucémie chez les animaux porteurs de mutation dans les voies de réparation de l'ADN, des prélèvements sanguins (une minute sous anesthesie) seront réalisés tous les 4 mois sur une période de 1 an (soit 3 prélèvement par animal) pour l'analyse de l'apparition de cellules pré-leucémiques.

Impact sur les animaux

Les seuls effets indésirables que nous anticipons sont le développement de syndromes tumoraux dans certaines situations. Les animaux seront particulièrement suivis pour l'existence de ces tumeurs et euthanasiés dès leur apparition.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue des procédures pour prélèvements d'organe et analyse phénotypique

Remplacement

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont des processus très complexes pour lesquels il n’existe malheureusement pas d’alternative in vitro aux analyses sur animaux entiers pour avoir une vision d’ensemble. Pour certaines études mécanistiques il existe néanmoins la possibilité d’utiliser des lignées cellulaires après immortalisation in vitro des lymphocytes. Nous utiliserons cette approche afin de diminuer le nombre d’animaux dans la mesure du possible.

Réduction

Notre expérience préalable sur ce type de modèles animaux nous montre que les phénotypes, lorsqu’ils sont dommageables (létalité embryonnaire, baisse de viabilité avant sevrage ou déficit immunitaire), sont en général suffisamment importants et homogènes pour être statistiquement significatifs sur de faibles cohortes. Nous calculons le nombre minimal d'animaux nécessaire à l'aide d'outils statistiques.

Raffinement

Un des phénotypes dommageables possible des animaux par ailleurs viables étant un déficit immunitaire plus ou moins sévère, ils seront obtenus et maintenus en portoirs ventilés, en zone protégée afin de minimiser leur exposition à des agents pathogènes. Un suivi quotidien permettra de s’assurer que les animaux ne développent pas de signes cliniques d’infection. Devant un état moribond du pelage, une voussure ou prostration sévère ou un amaigrissement important laissant supposer une telle infection ou un mal-être général, les animaux seront systématiquement sacrifiés. Les animaux sont par ailleurs maintenus dans un environnement enrichi (coton, bâton, tunnel) avec eau et nourriture ad libitum et en groupe social.

Choix des espèces

Le développement du système nerveux central et du système immunitaire sont particulièrement bien étudiés depuis de nombreuses années chez la souris. De nombreuses lignées mutantes existent déjà et peuvent être croisées sur de nouveaux modèles. Le développement de nouvelles technologies permet l’ingénierie de mutations « fines » calquées sur les mutations observées en pathologie humaine. De nombreux réactifs existent pour l’analyse phénotypique des modèles murins. - Pour évaluer le phénotype dommageable affectant la survie (embryonnaire et postnatale) le génotypage des animaux sera réalisé au moment du sevrage (3 semaines) - Pour confirmer un éventuel phénotype dommageable embryonnaire, les embryons seront récupérés à E18, date à partir de laquelle il est possible de réaliser un immunophénotypage - Pour évaluer le phénotype dommageable sur le système immunitaire, les animaux seront sacrifiés à 6-8 semaines, période classique d’analyse pour laquelle le système immunitaire est pleinement fonctionnel