Souris
Nouvelle thérapie pro-résolutive dans le contrôle de l’inflammation responsable du développement tumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
7 104 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles reçoivent une inoculation de tumeur par injection sous-cutanée ou par chirurgie, puis des traitements intrapéritonéaux répétés pendant deux à quatre semaines, pour tester une thérapie contre l'inflammation liée au développement tumoral. Le porteur indique que les modèles orthotopiques du poumon et du mésothéliome altèrent la respiration, atteinte servant de point limite, et que ces modèles peuvent provoquer douleur, perte de poids et baisse de mobilité. Il affirme qu'aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et rend donc l'utilisation d'animaux "indispensable".
Objectifs
Ces dernières années, la compréhension des différents acteurs d'une réponse inflammatoire que ce soit dans le cas d'auto-immunité, de rejet d’organes, ou de réponse antitumorale a mis en lumière l’équilibre entre l’activation et l’inhibition de cette réponse. Les traitements de plus en plus ciblés visent des gènes spécifiques de l’immunité sur l’une ou l’autre catégorie des populations immunitaires avec pour effet de moduler la réponse immune. Les essais d'immunothérapie dans le cancer ont été rendus possibles grâce à la preuve de concept sur des modèles précliniques murins. Malgré ces avancées, les rechutes sont encore trop nombreuses et il est essentiel de chercher d’autres molécules et d’autres combinaisons. Les nouvelles stratégies d’immunothérapie cherchent à améliorer l’effet anti-inflammatoire des traitements en limitant les effets secondaires et pour cela les approches sont plus spécifiques de populations cellulaires ou des mécanismes immunitaires spécifiques de l’organe pathologique. Une nouvelle approche consiste à cibler une étape de l’inflammation récemment décrite et nommée la résolution de l’inflammation. En effet, cette étape fait suite à la réponse inflammatoire et permet d’éteindre de manière active la réponse immunitaire tout en permettant la mémoire de celle-ci. Il a été identifié des récepteurs spécifiques de cette étape qui jouent un rôle prépondérant dans le maintien de l’homéostasie mais aussi dans le contrôle de l’inflammation qui pourrait alors devenir chronique. Celle-ci étant responsable des maladies inflammatoires, d’une mauvaise réponse immunitaire contre les pathogènes, voire du développement tumoral. Nous aimerions donc tester différentes molécules capables d’activer un ou plusieurs de ces récepteurs et analyser les effets engendrés par cette activation dans des modèles de cancer induit par l’inflammation et/ou ayant des microenvironnements inflammatoires différents. En effet, nous aimerions évaluer le potentiel thérapeutique d’une telle stratégie encore inexplorée avec des traitements de type anticorps monoclonaux, traitement de référence aujourd’hui en immunothérapie.
Bénéfices attendus
A terme, ce projet pourrait permettre d’identifier un traitement très novateur dans la recherche de nouvelle stratégie thérapeutique contre le cancer humain afin de répondre à des besoins cliniques importants. Durant toutes ces évaluations précliniques, de nouvelles découvertes pourront être faites, notamment durant l’étude de la mécanistique du produit sur le système immunitaire en mettant en lumière des populations cellulaires antitumorales et des mécanismes d’action particuliers et inhérents aux molécules étudiées.
Procédures
Les animaux seront soumis à une inoculation de tumeur murine via injection en sous-cutanée, ou via intervention chirurgicale sous anesthésie et analgésie. Les injections cutanées se font sous anesthésie générale sur un temps maximum de 10min d'anesthésie. Les injections nécessitant une intervention chirurgicale se font quant à elles sous anesthésie générale et sous analgésie sur une durée maximale de 15min par animal. Pour le suivi de chaque modèle, les animaux seront également soumis à des injections en intrapéritonéal (environ 1min par animal) pour les traitements (environ 3 fois par semaine pendant 2 à 4 semaines selon le type de traitement) sur animaux vigiles et, si besoin, pour l’injection de luciférine lors du suivi de la croissance tumorale en bioluminescence (1 à 2 fois par semaine). Dans le cadre de l’étape d’identification des mécanismes mis en jeu dans la réponse antitumorale, un prélèvement de sang en intracardiaque des animaux pourra être effectuée sous anesthésie (intervention sans réveil).
Impact sur les animaux
L'induction des modèles tumoraux décrits dans cette saisine ont plusieurs effets indésirables en fonction du modèle. Pour les modèles orthotopiques du cancer du poumon et du mésothéliome : altération de la respiration (point-limite) Tous ces modèles (or les modèles sous-cutanées) peuvent induire de la douleur, une perte de poids chez la souris, une diminution de la mobilité, un stress notamment dû à la chirurgie associée et un comportement altéré provoqué par ses différents effets indésirables. Tous ces modèles sont considérés comme sévères et une attention particulière sera apportée régulièrement aux souris (quotidiennement aux points les plus critiques). Les modèles tumoraux sous-cutanés peuvent provoquer de la douleur en fonction de la taille, donc la tumeur ne devra pas provoquer de gêne pour la mobilité de l’animal, ni excéder une taille point limite.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et des organes d’intérêts pourront être récupérés pour compléter les analyses.
Remplacement
A ce jour, aucune méthode ne peut remplacer un système immunitaire complet et donc rend indispensable l’utilisation d’animaux. Des études préliminaires sur des cellules ex vivo ont permis d’identifier une activité biologique de ce genre nouveau de médicaments et donc ont orienté les paramètres à évaluer lors de l’étude in vivo de la molécule.
Réduction
L’ensemble des animaux prévus ne sera pas utilisé selon les résultats observés sur les trois traitements évalués et sur les modèles précliniques évalués. Seulement le ou les traitements efficaces en étape 1 et 5 se verront évalués lors des étapes suivantes limitant ainsi le nombre d’animaux à utiliser. Par conséquent, dans le cas de l’observation d’un effet, nous réaliserons ensuite des études d’une part pour faire des études de combinaison de traitements avec des traitements standard en oncologie et d’autre part, pour déterminer les mécanismes mis en œuvre, notamment en euthanasiant des souris avant d’atteindre le point limite à différents temps après l’initiation de la pathologie. Dans le but d'utiliser un nombre d'animaux cohérent avec une pertinence statistique, nous avons défini le nombre d'animaux par groupe de 7 à 10 animaux selon les étapes pour l’ensemble des groupes. Les tests statistiques utilisés reposent sur une analyse de données dites non paramétriques, calculée quand le nombre de sujet est inférieur à 30. Ce test nous permet d’analyser nos données en combinant un test statistique fiable et un nombre d’animaux réduit.
Raffinement
Une étape d’acclimatation de 4 jours minimum sera systématiquement réalisée à l’arrivée des animaux pour éliminer le stress dû au transport et permettre l’habituation aux nouveaux locaux et personnels animaliers avant tout acte sur l’animal. Nous chercherons à obtenir dans un premier temps des différences significatives et reproductibles sur l’efficacité thérapeutique des traitements entre les groupes de souris, puis un effet combinatoire de traitement avec des traitements anti-cancéreux conventionnels, et enfin décortiquer les mécanismes évoluant dans cette réponse antitumorale. La douleur sera dans la mesure du possible évitée en euthanasiant les animaux si leur score clinique global atteint 8 sur deux jours consécutifs tel que décrit dans le tableau de score clinique général ou par injection d’analgésique dans le cas de morsure par exemple. En outre, les animaux sont maintenus dans un cycle jour-nuit de 12h-12h avec un accès à l’eau et à la nourriture à volonté. Le nombre d’animaux par cage est de 5 pour limiter le stress de la surpopulation. Des brindilles de papier sont placées dans la cage pour permettre aux souris de s’enfouir et se cacher. Si un mâle se retrouve dominant et attaque ses congénères malgré la présence d'enrichissements, il sera isolé dans une cage individuelle. L’analgésie quant à elle dépendra de la cause. Pour les animaux en souffrance tels que les animaux ayant un score clinique supérieur à 7 sur deux jours consécutifs ou un score de colite supérieur à 4 sur deux mesures consécutives, l’animal se verra administrer en sous-cutané une injection de buprénorphine à 0.1mg-kg deux fois par jour jusqu’à diminution du score ou exclusion de l’étude. Pour les plaies de surface comme les morsures, après désinfection, les animaux pourront recevoir directement sur la plaie de la tétracaïne. Enfin, nous utiliserons préférentiellement des mâles car les hormones du sexe féminin peuvent apporter une protection générant de l’hétérogénéité sur le développement tumoral. Toutefois, nous n’excluons pas la possibilité de tester les thérapies sur les deux sexes car cette protection hormonale n’est pas valable pour tous les modèles précliniques de tumeur.
Choix des espèces
Nous travaillerons avec la souris qui est un modèle de référence pour la recherche fondamentale ainsi que pour les examens précliniques. Il s’agit en effet d’un modèle animal pour lequel de nombreux outils génétiques et biologiques sont disponibles. Les modèles d’inflammation dans ces souris autorisent une relevance pathologique satisfaisante en comparaison avec la réalité clinique. Des adultes de 7 à 10 semaines seront utilisés, car la prise tumorale est homogène dans cette tranche d’âge contrairement à des âges précoces ou avancés où les défenses immunitaires sont différentes et peuvent induire une hétérogénéité de réponse antitumorale, et donc un stade tumoral différent.
Mise au point d’un modèle de neuropathie périphérique chimioinduite par administration répétée de paclitaxel chez la souris
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
1 862 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées de paclitaxel, un agent de chimiothérapie, puis subissent des tests comportementaux de douleur mécanique ou thermique sur trente-cinq jours, pour mettre au point un modèle de neuropathie chimio-induite. Le porteur indique s'attendre à une perte de poids, de la constipation, de l'alopécie et une piloérection, et rester vigilant aux signes d'anémie et de déshydratation. Il présente ce modèle comme une offre commerciale destinée à ses clients pour développer des candidats médicaments, et affirme qu'aucun modèle in silico ou in vitro ne reproduit la douleur.
Objectifs
Ce projet porte sur le développement d’un modèle de neuropathie chimioinduite, causé par des administrations répétées de paclitaxel chez la souris. Cet agent chimio-thérapeutiques est utilisé dans le traitement des cancers colo-rectaux, pulmonaires, ovarien, ainsi que dans le traitement du cancer du sein. Toutefois, il induit des douleurs neuropathiques chez 40 à 92% des patients conduisant à la limitation ou l’arrêt du traitement. Le nombre de procédures, ainsi que le nombre d’études au sein de ces procédures et le nombre d’animaux sont basés sur l’expérience du laboratoire dans le développement de modèles de douleur chez le rongeur et sur l’expérience acquise dans le même modèle chez le rat . Le laboratoire souhaite mettre en place des modèles au plus proche de la clinique afin de permettre le screening de candidats médicaments.
Bénéfices attendus
Le projet va permettre au laboratoire de mettre au point un nouveau modèle au plus près des conditions cliniques. Le laboratoire peut ainsi offrir à ses clients la possibilité de développer de nouveaux candidats médicaments. Le but est de permettre le développement d’analgésiques ciblés sur les mécanismes de ces douleurs neuropathiques causées par l’administration de paclitaxel, actuellement seul des antidépresseurs et des opiacés sont prescrits pour soulager les patients. Ceci va ainsi permettre une meilleure prise en charge de neuropathie due à l’administration de paclitaxel chez les patients atteints de cancer.
Procédures
Les animaux auront 4 ou 5 injections intrapéritonéale de paclitaxel (tous les jours pendant cinq jours ou tous les deux jours pendant 7jours) et auront un test comportementale de douleur (mécanique ou thermique) Les procédures feront des cinétiques de test sur du long terme pour voir l'induction (tous les 3 à 4 jours pendant 35jours un seul point de mesure) ou un seul jour de test (selon résultats des premières procédures) sera testé mais avec une cinétique de cinq points de mesures le même jour.
Impact sur les animaux
Suite à nos recherches bibliographiques, peu d’informations sont données sur des effets secondaires de ce modèle. Malgré tout, un article nous permet de nous attendre à une non prise de poids, de la constipation, de l’alopécie et de la piloérection. Ces observations seront incluses dans nos points limites. Nous serons aussi vigilants aux signes d’anémies et de déshydratation, signes que nous avons pu observer dans ce modèle chez le rat. Le cadre de ce projet est de travailler sur un modèle de neuropathie, les animaux subissent donc des tests de douleur aiguë (thermique ou mécanique). Les animaux peuvent être isolés pendant la durée des tests. Les traitements pharmacologiques peuvent avoir des effets secondaires tel que la constipation, la baisse de tonus… Ces effets secondaires disparaissent quelques heures après administrations. Les injections répétées de paclitaxel peuvent créer un hématome dans la zone d’injection. Les animaux sont injectés en alternance de chaque côté de l’abdomen.
Devenir
Le modèle de neuropathie chimioinduite par administration de paclitaxel semble être un modèle stable dans le temps. Il n’est donc pas cohérant de réutiliser ces animaux pour d’autres modèles. De plus, les processus biologiques causés par l’administration de paclitaxel pourraient interférer avec d’autres modèles. L’âge de ces animaux à la fin des procédures sera bien plus important que pour l’ensemble de nos modèles. De ce fait, dès la fin de la phase expérimentale, les animaux sont mis à mort par le personnel habilité.
Remplacement
L’objectif de ce projet est le développement d’un modèle permettant de tester l’efficacité de candidats médicaments analgésiques. Les modèles in silico et in vitro permettent seulement d’étudier les effets de ces molécules sur la nociception, c’est-à-dire les mécanismes biologiques encodant les stimuli endommageant, ou susceptibles d’endommager les tissus. Selon sa définition par IASP, la douleur est une « expérience sensorielle et émotionnelle » (https://www.iasp-pain.org/terminology). L’étude de potentiels traitements analgésiques doit donc être conduite dans des modèles restituant à la fois la composante sensorielle et émotionnelle et permettant l’analyse du comportement en plus de la physiologie ; faute de quoi c’est la nociception et non la douleur qui est étudiée. L’étude des candidats médicaments analgésiques chez l’animal vigile reste la seule option pour démontrer l’efficacité sur la douleur avant le passage chez l’homme.
Réduction
Pour chaque étude, le nombre d'animaux utilisé est réduit à un minimum acceptable pour l’obtention d’informations robustes et statistiquement pertinentes. Le nombre d’animaux par groupe de traitement a été fixé à n=12 en se basant sur les données bibliographiques disponibles. En fonction du design de chaque étude (groupes appariés ou indépendants, mesures répétées ou non) et de la distribution des valeurs (conformité à la loi normale), un test paramétrique ou non paramétrique sera réalisé (test-t, analyse de variance à une ou deux voie(s)) suivi si nécessaire d’un test post-hoc approprié via SigmaStat
Raffinement
Notre activité permet de raffiner les modèles in vivo en se rapprochant au mieux situations cliniques (induction de pathologies, mesures des composantes multiples de la douleur). Nous limitons les doses et les injections au minimum afin de ne pas induire de douleurs supplémentaires. Les tests comportent pour la majorité des valeurs maximales (cut-off, ou temps d’application maximale, intensité lumineuse maximale, température la plus basse possible) à ne pas dépasser pour ne pas induire de souffrance supplémentaire. Ces mises au point ont pour objectif de raffiner au maximum les conditions expérimentales.permettant de montrer une allodynie/hyperalgésie. Un soin particulier est apporté à la réduction de la souffrance et du stress des animaux au strict nécessaire et à l’amélioration de leur bien-être (enrichissement (tunnel et matériel pour nidifier) et paramètres environnementaux contrôlés tout au long de l’étude). Des points limites, précoces et spécifiques pour chaque protocole d’étude sont définis et résumé en un arbre décisionnel qui conduit si nécessaire l’interruption des expérimentations si les critères d’arrêts sont atteints. Au vu du domaine d’expertise du laboratoire (spécialisation dans l’étude de la douleur), les expérimentateurs sont strictement formés au respect de l’animal et sensibilisés à la surveillance de signes de douleur ou de souffrance. La maitrise des gestes techniques est contrôlée régulièrement. Les animaux sont surveillés chaque jour, et un suivi spécifique (suivi pondéral, suivi de la consistance des fèces, suivi si présence d’alopécie). Le suivi est réalisé par le technicien en charge de l’étude.
Choix des espèces
La question du remplacement des rongeurs par des espèces « moins évoluées » est critique et suivie avec attention au sein ddu laboratoire. Chez ces espèces la démonstration de leur capacité à ressentir la douleur telle que définie par l’IASP est récente et les modèles d’étude de la pharmacologie de la douleur à visée clinique ne sont pas encore dévelopés. La souris a été sélectionnée pour ce projet en se basant sur plusieurs critères : a) sensibilité aux stimuli nociceptifs utilisés dans ce projet ; b) large caractérisation du comportement et des modèles dans la littérature ; c) les médicaments utilisés chez l’homme sont efficaces pour soulager une douleur équivalente chez la souris (ex. : duloxetine) ce qui permet la validation des modèles et suggère l’existence de mécanismes biologiques communs. Les sujets jeunes sont à favoriser pour le développement d’une neuropathie périphérique après administration répétée de paclitaxel. Cet article met en évidence des marqueurs physiologiques et des tests comportementaux (similaire à ce que nous réaliserons ici)
Mécanismes de différenciation et du recrutement des cellules myéloïdes dans des conditions de développement tumoral
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 090 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des implantations de tumeurs, des injections d'induction de délétion génétique, des immunothérapies intrapéritonéales répétées et parfois une omentectomie ou une splénectomie, pour étudier le recrutement des cellules myéloïdes dans le développement tumoral. Le porteur indique que chaque modèle de cancer fait l'objet d'une grille d'évaluation de la douleur et d'un point limite, la mise à mort intervenant dans le respect de ces seuils. Il affirme que les cultures d'organoïdes 3D ne permettent pas d'analyser l'ensemble des populations cellulaires du microenvironnement tumoral.
Objectifs
Les macrophages ont une grande plasticité et leur état d’activation est régulé par l’intégration de signaux de l’environnement tissulaire dont ceux induits dans des situations d’infection, d’inflammation chronique ou de progression tumorale. Les cytokines sont des médiateurs clés de l’activation des macrophages : les interférons induisant des macrophages de type M1 pro-inflammatoires cytotoxiques; les cytokines IL-4 / IL-13 induisant des macrophages de type M2 immunorégulateurs. Récemment, de nombreux états intermédiaires à ces stades M1 et M2 ont été phénotypiquement caractérisés mais leur fonction dans des situations pathologiques reste à déterminer. De plus, les macrophages peuvent être d'origine embryonnaires et résidents dans les tissus, ou se différencier à partir des monocytes circulants et être recrutés sur un site inflamatoire. Nous réaliserons des analyses du recrutement et de l’orientation de la différenciation des macrophages au cours de la réponse immune contre des mélanomes ou des tumeurs du sein ou ovariennes ou pancréatiques. Ces analyses visent à comprendre comment les réponses immunitaires sont détournées par les cellules tumorales afin d'identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la progression tumorale et de mettre au point de nouvelles immunothérapies
Bénéfices attendus
Ces analyses visent à (i) comprendre comment les réponses immunitaires sont détournées par les cellules tumorales; (ii) identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de la progression tumorale; (iii) mettre au point de nouvelles immunothérapies pour le traitement de cancer résistants aux traitement actuellement proposés.
Procédures
Certaines souris seront directement enrôlées dans des protocoles d'implantation de tumeurs. Le suivi de la pousse tumorale est régulier: une grille d'évaluation de la douleur et un point limite sont établis pour chaque modèle de cancer étudié. Certaines lots d'animauxt recevront un traitement (1 injection intra-péritonéale) d'induction de délétion génétique qui n'induit pas de phénotype dommageable, puis seront enrolés dans des protocoles d'implantation de tumeurs (1 injection sous-cutanée ou intra-péritonéale ou orthtopique, selon le type de cancer). Certaines lots d'animaux pourront recevoir des immunothérapies (1 injection intra-péritonéale tous les 3 jours pendant 2 semaines) visant à réduire la charge tumorale. Enfin, d'autres souris pourront subir un acte de petite chirurgie (omentectomie ou splénectomie) avant implantation ou induction de tumeurs. Dans tous les cas, le schéma expérimental s'étend au maximum sur 4 mois dont 1 mois pour induire la délétion génétique d'intérêt et 1 à 3 mois pour le développement tumoral (4 à 6 semaines pour le mélanome, le cancer du sein ou du pancréas; 10 semaines pour le cancer de l'ovaire). Les animaux subissent au maximum 6 interventions (1 implantation de tumeur - 10 minutes sous anesthésie pour transplantation orthotopique- et 5 injections intrapéritonéales-30 secondes chacune).
Impact sur les animaux
De manière générale, nous utiliserons le minimum de souris nécessaire pour nos expérimentations. Typiquement, 3 expériences indépendantes conduites selon le planning joint en annexe 3 (7 animaux non traités/ 7 animaux traités). Nous conduirons des analyses longitudinales afin de réduire le nombre d’animaux enrôlés. Les procédures de transplantation orthotopique des tumeurs permettent de limiter le développement tumoral au tissu cible (pancréas ou glande mammaire). Elles impliquent des actes de petite chirurgie pratiqués par une scientifique ayant suivi la formation appropriée. Les protocoles d’immunothérapie testés visent à réduire la pousse tumorale.
Devenir
Mise à mort dans le respect des points limites définis pour analyse du microenvironnement tumoral et des organes lymphoides drainant le site tumoral.
Remplacement
Les interactions macrophages/tumeurs seront également analysées dans des cultures d’organoïdes 3D in vitro. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas d’analyser les interactions impliquant l’ensemble des sous-populations de cellules immunes et non immunes retrouvées dans le micrenvironnement tumoral. Les données bibliographiques montrent que les dialogues entre cellules cancéreuses, cellules immunitaires et cellules du stroma tumoral jouent un rôle important dans l'éradication ou l'échappement des cancers et la résistance aux thérapies. Il est donc capiltal d'analyser des modèles murins pré-cliniques in vivo qui récapitulent tant sur le plan génétique que cellulaire la physiologie des pathologies cancéreuses humaines.
Réduction
Typiquement, 3 expériences indépendantes ; analyses longitudinales afin de réduire le nombre d’animaux enrôlés. Les protocoles d’immunothérapie testés visent à réduire la pousse tumorale. Nous appliquerons des tests statistiques permettant de comparer les groupes traités (n=7) /non traités (n=7) par immunothérapie. En effet, nos expériences antérieures (Etzerodt, J Exp Med 2019 ; doi.org/10.1084/jem.20182124) incluaient 6 animaux par groupe. Cependant, la pousse tumorale étant parfois hétérogène, nous préférons dans ce projet inclure 7 animaux par groupe afin d’augmenter la puissance du test statistique.
Raffinement
Notre projet propose (i) des injections orthotopiques afin de réduire l’invasion tumorale, suivant des protocoles d’implantation en accord avec les recommandations en terme d’anesthésie et d’antalgie ; (ii) un suivi longitudinal de la pousse tumorale par imagerie in vivo. Dans chaque modèle tumoral, des points limites spécifiques seront appliqués. Les conditions d'hébergement des souris au CIML respectent la DIRECTIVE 2010/63/UE : surface des cages; matériel pour confectionner des nids; Température/Hygrométrie/Photopériode contrôlées.
Choix des espèces
La souris est l'espèce la plus adaptée pour étudier les réponses immunitaires et l’immunopathologie car les systèmes immunitaires murins et humains sont très proches. Par ailleurs, l'espèce murine a permis de développer de nombreux modèles génétiquement modifiés [souris transgéniques; souris "knock-in"; souris "knock-out" dans la lignée germinale ou conditionnel] que nous utiliserons dans ce projet.
Effet d’un blocage pharmacologique des voies d’inflammation sur un modèle murin d’hyperstimulation ovarienne
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections hormonales de superovulation puis des cotraitements anti-inflammatoires, et subissent un prélèvement sanguin sous-mandibulaire terminal avant leur mise à mort, pour étudier l'étiologie du syndrome d'hyperstimulation ovarienne sur des souris invalidées pour les récepteurs LXR. Le porteur affirme anticiper l'"absence d'effets indésirables" liés au protocole, qu'il dit pratiquer en routine. Il indique avoir d'abord mené des tests in vitro sur cellules de granulosa, censés limiter le nombre d'individus utilisés in vivo.
Objectifs
Le projet s’inscrit dans l’étude l’étiologie moléculaire de l’OHSS. Nous utiliserons des échantillons ovariens issues de souris sauvages, invalidées pour les récepteurs LXRs et ces mêmes souris avec un transgène permettant le sauvetage spécifique des cellules de Granulosa. En effet, le modèle invalidées pour les récepteurs LXRs a été identifié et publié comme un modèle de référence pour ce syndrome. Les études seront conduites sur des animaux de 7 mois environ puisque la mise en place du phénotype est associé à l'age des souris. Les souris seront soumises à un protocole de stimulation hormonale comme suit en vue d’une superovulation. - Jour 1 : Injection IP de l'hormone 1 (PMSG, 7,5UI/souris) - Jour 3 : Injection IP de l'hormone 2 (hCG, 5UI/souris). Nous envisageons donc de réaliser des cotraitements avec des corticoïdes (methylprednisolone), avec des AINS (Ketophen) et enfin avec des inhibiteurs de l'inflammasome (MCC950). Les tissus prélevés seront prélevés à 2 temps spécifiques : 40 heures apres la première stimulation par la PMSG (lot H40) et en fin de protocole après l'ovulation (lot J4). Les échantillons tissulaires seront analysés par des techniques d’histologie et d’immunohistochimie par l’étude de marqueurs d’acteurs de la stéroïdogenèse ovarienne et de l'inflammation. En parallèle des tests de fécondation in vitro (FIV) seront conduit pour déterminer la qualité des ovocytes produits et leurs capacités à reprendre la méiose après fécondation.
Bénéfices attendus
Nous avons précédemment montré le rôle qu'occupe les récepteurs LXR dans l'étiologie moléculaire de l'hyperstimulation ovarienne. Il est maintenant très clair que le phénotype est associé chez la souris à une réponse inflammatoire anormale et à la constitution d'un infiltrat de cellules immunitaires au nievau ovarien qui et totalement anormal et incontrolé. L'etude de l'effet de traitements anti-inflammatoires dans un contexte d'hyperstimulation pathologique de l'ovaire, nous permettra ainsi de connaître le potentiel thérapeutique d'un telle traitement dans le cadre de la clinique humaine.
Procédures
Les animaux subiront un prélèvement unique sous-mandibulaire sanguin de 150microlitres environ en point final juste avant leur mise à mort. Cette procédure aura lieu une fois avec une durée moyenne d'une minute.
Impact sur les animaux
Les procédures décrites dans la présente demande sont largement utilisée dans de nombreux laboratoire, et notre groupe de recherche les utilisent en routine sur ces même modèles génétiques. Ainsi, nous pouvons aidsement anticiper l'absence d'effets indésirables liés au protocole présenté dans la demande. En parallèle, nous pouvons anticiper aue les traitements anti-inflammatoires vont diminués au moins partiellement les manifestations phénotypiques d'hyperstimulation, donc plutôt des effets bénéfiques. Néanmoins, une surveillance renforcée (2 fois par jourà) sera conduite sur les animaux en protocole.
Devenir
L'ensemble des animaux est mis à mort en fin de protocole pour le prélèvement pour l'analyse des ovaires par des techniques d'histologie et d'immunodétection in situ.
Remplacement
Cette étude fait suite à des tests réalisés in vitro en culture de cellules ayant permis de caractériser le comportement des cellules de granulosa en modulant le contexte inflammatoire. Ceci permet donc de limiter notre étude fonctionnelle sur un nombre limiter d’individus pour valider le phénotype in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés a été restreint au maximum et définit pour obtenir une puissance statistique satisfaisante (test ANOVA) à l’issue du protocole, celui-ci a été fixé à 15 individus par lot.
Raffinement
Les animaux en particulier les lignées transgéniques peuvent répondre de manière « exagérée » au traitement hormonale qui induit l’hyperstimulation. De fait, ces lots de souris seront suivis avec une fréquence observationnelle plus élevée (deux fois par jour) pour détecter toute manifestation occasionnelle de mal-être ou de souffrance. Cependant, le protocole post induction est relativement court puisque les souris seront mis à mort 96 heures après l’injection de PMSG - Pregnant Mare Serum Gonadotropin, les études antérieures n'ont pas montrées de manifestation délétère pour l'animal. En parallèle, un erichissement renforcé des cages d'hébergement sera conduit (cabane et/ou tube carton, pads cellulose pour formation de nids). Si des signes de souffrance ou de mal-être se manisfeste, l'application des points limites décrit dans la DAP seront mis en oeuvre.
Choix des espèces
Le cycle oestrien et la physiologie de l’ovaire chez la souris sont très proche de l’espèce humaine. En parallèle, l’existence de lignées transgéniques d’intérêt pour l’étude de l’OHSS justifie le choix du modèle murin. Nous utiliserons des individus de 7 mois, ce stade de développemente est justifié par le lien qu’il existe entre la survenue d’OHSS chez la femme et la réponse inflammatoire que nous avons observé dans nos études précédentes dans lesquelles cette fenêtre temporelle présente une réponse significativement pathologique dans le modèle Lxr ab-/-.
Etude de l’efficacité de la N-acétylcystéine à augmenter l’effet antalgique du paracétamol tout en inhibant son hépatotoxicité
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des tests de seuil de douleur par stimulation plantaire toutes les six heures, des administrations par gavage, la pose d'un cathéter intraveineux, des prélèvements sanguins et des IRM, avant d'être mises à mort par perfusion intracardiaque, pour tester l'ajout de N-acétylcystéine au paracétamol. Le porteur indique que la stimulation plantaire induit une douleur, dont l'animal peut se soustraire en retirant sa patte. Il affirme que les cultures cellulaires et les modélisations informatiques ne peuvent mimer la douleur, appréhendable selon lui uniquement dans l'"organisme entier".
Objectifs
Le paracétamol est un médicament de référence pour le traitement de la fièvre et de la douleur, à tous les âges de la vie et dans de très nombreuses circonstances. La dose actuellement recommandée chez l’adulte est de 3 à 4 grammes par jour, répartis en prises de 1 gramme maximum. Cette dose maximale est limitée par la toxicité, principalement hépatique, qui peut survenir à des doses plus élevées. Cependant, l’élimination par le corps du paracétamol lors d’une prescription classique expose à des périodes d’inefficacité. Pendant ces périodes, il n’est pas possible de soulager la fièvre ou la douleur sans avoir recours à d’autres médicaments, tels que les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou les opiacés. Malheureusement, ces autres médicaments ont un profil d’effet indésirable bien moins bon que le paracétamol et les AINS sont même contre-indiqués lors d’infections bactériennes car ils sont susceptibles d’entraîner des complications pouvant conduire jusqu’au décès. Dans plusieurs études, augmenter la dose de paracétamol de façon très ponctuelle permet effectivement d’augmenter son efficacité. L’enjeu de pouvoir prescrire le paracétamol à forte dose, sur quelques jours ou plus, tout en se préservant de sa toxicité est donc important et n’a pas de solution à l’heure actuelle. La N-acétylcystéine (NAC) est l’antidote de référence lors des intoxications au paracétamol. Elle permet de s’opposer à l’action toxique du paracétamol sans en entraver son efficacité. Ce projet scientifique consiste à utiliser un modèle murin (souris) pour montrer que la combinaison de paracétamol et NAC dans un schéma à 6 administrations par 24h procure une meilleure antalgie dans le temps qu’un schéma classique à 4 administrations par 24h, tout en empêchant la survenue d’une toxicité hépatique.
Bénéfices attendus
L’amélioration de la prise en charge de la douleur est une problématique d’actualité. Permettre une meilleure prise en charge de la douleur grâce à un nouveau schéma thérapeutique du paracétamol permettrait également une réduction de l’utilisation des AINS (non indiqués en cas d’infection et souvent mal tolérés) et des opiacés, souvent mal tolérés et vecteurs de dépendance.
Procédures
1- Test de seuil de la douleur par stimulation plantaire (15 secondes ; toutes les 6h jusqu’à 23h post-traitement). 2- Administration médicamenteuse par gavage (30 secondes ; 4 à 6 administrations selon les groupes). 3- Pose d’un cathéter intraveineux et prélèvement sanguin (15 minutes ; 2 prélèvements). 4- Imagerie par résonance magnétique (IRM) (15 minutes ; 2 examens IRM). 5- Mise à mort par perfusion intracardiaque (15 minutes).
Impact sur les animaux
Test de seuil de la douleur : La stimulation plantaire induit une douleur chez l’animal. Néanmoins, l’animal pourra s’y soustraire en retirant sa patte du dispositif d’expérimentation. Par ailleurs, la procédure expérimentale sera réalisée durant une courte durée de manière à éviter toute lésion tissulaire. Administration médicamenteuse par gavage oral : Tous les moyens seront mis en œuvre pour éviter le stress et les blessures chez l’animal. Avant la procédure, la souris sera habituée à la contention. Une aiguille d’alimentation à bout rond, d’une longueur appropriée à la taille du sujet et flexible sera utilisée. Pour la tolérance de l’administration, l’aiguille sera trempée dans une solution appétente pour la souris (liquide sucré), ce qui stimulera également le réflexe de déglutition. Pose d’un cathéter intraveineux et prélèvement sanguin : L’incision de la queue de la souris est susceptible d’induire une douleur, laquelle sera prévenue par une analgésie locale réalisée avant le réveil de l’animal. Une attention particulière sera apportée afin de permettre aux tissus du site de la ponction de guérir avant le second prélèvement sanguin. Par ailleurs, après chaque prélèvement, l’expérimentateur s’assurera que l’animal ne saigne plus avant de le remettre dans sa cage. Imagerie par résonance magnétique (IRM) : Cette méthode impose des manipulations qui sont autant de stresseurs pour l’animal. De ce fait, l’anesthésie générale sera utilisée durant cette procédure et pratiquée par du personnel expérimenté.
Devenir
Aucun animal ne sera maintenu en vie à la fin du protocole. La mise à mort des animaux est nécessaire pour le prélèvement des tissus en fin de protocole.
Remplacement
Les expériences in vitro de cultures cellulaires ou les modélisations informatiques ne permettent pas de mimer la douleur, et excluent les multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux et de l’organisme entier. Ainsi, les procédures expérimentales de ce projet ont un caractère de stricte nécessité visant à étudier la douleur, une pathologie morphologique dépendante de données architecturales et systémiques uniquement appréhendables in vivo. De fait, les expériences ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
La réduction du nombre d’animaux utilisés est prévue par une limitation aux seules expériences considérées comme absolument indispensables, et déterminée selon la sensibilité des méthodes utilisées et l’expertise nécessaire à la bonne réalisation des techniques. Les analyses statistiques seront réalisées avec le logiciel GraphPad Prism (version 9). Nous vérifierons en premier lieu si les échantillons suivent la loi normale (hypothèse gaussienne) à l’aide de tests de Shapiro-Wilk. Le cas échéant, des tests paramétriques seront utilisés (ANOVA suivi de tests post-hoc en cas de différence significative) ; dans le cas contraire, des tests non paramétriques seront réalisés (comparaisons intergroupes : test de Kruskal-Wallis suivi de tests U de Mann-Whitney en cas de différence significative ; comparaisons intragroupes : test de Friedman suivi de tests de Wilcoxon en cas de différence significative).
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés (anesthésiant : isoflurane ; analgésiques : lidocaïne, buprénorphine) durant chaque procédure (pose d’un cathéter intraveineux, IRM, perfusion intracardiaque). Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en œuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine de la douleur. L’anatomie et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier la douleur. Le stade de développement des animaux est de 8 à 12 semaines correspondant à un stade jeune adulte. Ce stade est classiquement utilisé dans la littérature pour l'étude de la douleur.
Etude de la fibrose interstitielle cardiaque par imagerie chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur implante sous anesthésie une pompe sous-cutanée diffusant en continu de la phényléphrine ou de l'angiotensine II, ce qui provoque une hypertension artérielle, puis elles subissent jusqu'à cinq séances d'imagerie sous anesthésie et un prélèvement sanguin à la queue, pour caractériser un modèle de fibrose cardiaque et tester de nouveaux traceurs d'imagerie. Le porteur indique que la chirurgie mène à un stress et une douleur au réveil qu'il évalue comme modérés. Il affirme que l'étude de la fibrose cardiaque ne peut se passer de l'animal, les modèles cellulaires ne reflétant pas l'environnement neuro-hormonal.
Objectifs
Il existe à l’heure actuelle peu de méthodes permettant un diagnostic précoce de la fibrose interstitielle cardiaque et par conséquent peu de traitements disponibles. L’objectif de ce projet est donc de mettre en place et caractériser un modèle de fibrose cardiaque interstitielle chez la souris, puis d’évaluer de nouveaux traceurs d’imagerie diagnostique précoce de cette pathologie.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra dans un premier temps de caractériser un modèle de fibrose interstitielle cardiaque avant d’explorer de nouvelles stratégies de diagnostic précoce. Par la suite, des études visant à évaluer de nouveaux traitements seront possibles avec à terme une possible translation à la clinique grâce à l’utilisation ici des mêmes imageries que celles réalisées chez l’homme.
Procédures
les animaux subiront les actes suivant : * implantation d’une pompe sous-cutanée sous anesthésie générale Durée : 15 à 20 minutes * prélèvement sanguin (procédure 1 seulement) sur souris vigiles : Durée : 30 secondes * Imagerie in vivo avec injection intraveineuse sous anesthésie isoflurane. L’imagerie se déroulera au maximum sur 1h. La procédure d’imagerie n’est pas répétée dans la procédure 1 et sera répétée 5 fois à une semaine d’intervalle dans la procédure 2.
Impact sur les animaux
la chirurgie d’implantation d’une pompe sous la peau fermée par une suture mènera à un niveau de stress et douleur évalué comme modéré au réveil de l’animal. L’infusion continue de 2 composés par cette pompe (phenylephrine / angiotensine II) provoquera une hypertension artérielle également évaluée à un niveau modéré. Le prélèvement sanguin (procédure 1 uniquement) nécessitera une contention de quelques secondes et la réalisation d’une piqure à la queue et est évalué comme léger. Enfin la procédure d’imagerie pourra engendrer un stress léger au moment de la mise sous anesthésie et du réveil de l’animal.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin de pouvoir réaliser différentes analyses complémentaires sur le tissu cardiaque.
Remplacement
L’étude de la fonction et de la fibrose cardiaque ne peut se passer d’une étude chez l’animal. En effet, les modèles cellulaires ne reflètent pas l’environnement neuro-hormonal présent physiologiquement, ni la fonction cardiaque dans son ensemble (contraintes de pression par exemple).
Réduction
Pour réduire le nombre d’animaux, nous avons choisi de construire notre projet en 2 étapes et d’y associer des analyses in vitro. De plus, en comparaison avec une étude classique qui nécessite la mise à mort des animaux à chaque point de temps examiné, l’imagerie peut être répétée à différents temps et permet de réduire le nombre d’animaux d’autant.
Raffinement
L’imagerie est une méthode non invasive permettant de réduire la douleur à son minimum. De plus, la majorité des procédures (injection intraveineuse, prélèvements et imagerie) est réalisée sous anesthésie sur lit/plaque chauffant(e) réduisant l’inconfort potentiel à son minimum et permettant ainsi le raffinement de l’étude. Enfin le geste chirurgical appliqué dans ce projet est assez peu invasif (pose d’une pompe sous cutanée) et sera associé à une couverture analgésique.
Choix des espèces
Le rongeur est le modèle de référence en cardiologie car l’environnement neuro-hormonal et la physiologie cardiaque sont proches de l’humain. Les animaux seront commandés à l’âge de 8-9 semaines et seront traités de 10 à 14 semaines comme décrit précédemment dans la littérature
Étude de la fonction des DNASEs extracellulaires dans l’immunosurveillance des cancers.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
3 680 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intra-mammaire de cellules tumorales, des chimiothérapies et immunothérapies répétées par voie intrapéritonéale sur deux semaines, des mesures de tumeur au pied à coulisse tous les deux jours et des prélèvements sanguins, pour étudier le rôle d'enzymes dégradant l'ADN tumoral dans l'immunité anti-tumorale. Le porteur indique que les animaux sont mis à mort après avoir atteint les points limites ou pour prélever leurs tissus. Il décrit cette question comme "fondamentale" et affirme qu'une étude sur échantillons humains ne peut remplacer des souris génétiquement modifiées développant des tumeurs mammaires.
Objectifs
Le cancer est la principale cause de mortalité en Europe et 14.1 millions d’individus dans le monde sont affectés par cette maladie. Malgré les avancées technologiques dans le diagnostic et le traitement des cancers, de nombreux patients succombent à la maladie. Il est donc urgent de développer de nouvelles études afin d’améliorer la prise en charge des patients, ainsi que d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques permettant de développer des traitements efficaces. Le système immunitaire est au centre de nouvelles approches thérapeutiques et permet d’induire une immunité anti-tumorale et donc la destruction des tumeurs. L’efficacité de ces immunothérapies requiert au préalable une inflammation dans le site tumoral. Celle-ci n’est présente que dans un nombre limité de tumeurs et peut être induite par l’ADN tumoral. De plus, de nombreuses thérapies, incluant la chimiothérapie et la radiothérapie ont été montrées comme induisant une mort des cellules tumorales conduisant à la libération de l’ADN tumoral qui stimule les réponses inflammatoires et « booste » l’immunité anti-tumorale. Ces observations posent la question fondamentale de savoir comment et par quels mécanismes est régulée la capacité de l’ADN dérivé des tumeurs à stimuler l’immunité anti-tumorale. Nous avons caractérisé récemment des enzymes dont la fonction principale est de couper/digérer l’ADN libéré par les cellules mourantes contrôlant ainsi sa capacité à induire une réponse inflammatoire par le système immunitaire. Nos résultats préliminaires suggèrent que la déficience d’une de ces enzymes limite l’impact thérapeutique des chimiothérapies et leur capacité à induire une réponse immunitaire anti-tumorale. Nous proposons donc dans le cadre de cette demande d’autorisation de projet d’étudier les mécanismes d’action de ces enzymes, ciblant l’ADN tumoral, dans la régulation de l’immunité anti-tumorale en réponse aux thérapies conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies). Cela nous permettra de caractériser la fonction de ces enzymes dans la régulation de l’immunité anti-tumorale et d’identifier de potentielles pistes thérapeutiques afin de renforcer l’efficacité thérapeutiques des traitements communément utilisés chez les patients.
Bénéfices attendus
Notre projet permettra de caractériser le rôle d'enzymes ciblant l’ADN tumoral dans la régulation de l’immunité anti-tumorale induite par différents traitements couramment utilisés en thérapie des cancers. C’est une question fondamentale car l’ADN libéré par les cellules tumorales joue un rôle clef dans l’activation de l’immunité tumorale en réponse à diverses thérapies. Il semble que ces enzymes soient requises pour l’induction de l’immunité anti-tumorale induite par certaines chimiothérapies selon nos résultats préliminaires. Ainsi, une meilleure compréhension du rôle de ces enzymes pourrait déboucher sur de nouvelles pistes thérapeutiques pour les patients atteints de cancer.
Procédures
1. L’injection intra-mammaire des cellules tumorales est effectuée sur des animaux anesthésiées en moins d’une minute. 2. Injection intrapéritonéale avec des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie (5 injections tous les 2 jours) et immunothérapies (3 injections tous les 4 jours) est effectué durant 2 semaines sur des animaux vigiles. Cette injection est très rapide et dure moins de 30 secondes par souris. 3. La mesure de la taille tumorale est effectuée tous les deux jours avec un pied à coulisse sur des animaux anesthésiées. Cette procédure dure moins d’une minute par souris. 4. Les prélèvements sanguins sont effectués sur des animaux anesthésiés à deux reprises espacées de deux semaines. Cette procédure est très rapide et dure moins d’une minute par souris. 5. La vaccination par les cellules tumorales morte en sous-cutanée sur des souris anesthésiées s’effectue à 3 reprises espacées d’une semaine. L’injection dure environ une minute par souris.
Impact sur les animaux
1. La présence de tumeur du sein chez la souris peut impacter le bien-être des animaux. 2. Le traitement des souris par des thérapies anti-cancéreuses conventionnelles (chimiothérapie et immunothérapies) peut induire des effets secondaires (dans notre cas mineurs) qui peuvent impacter le bien-être des animaux. 3. Les prises de sang chez les animaux peuvent conduire à un affaiblissement transitoire. 4. Les injection sous-cutanées et intrapéritonéales peuvent induire un inconfort transitoire des animaux
Devenir
Tous les animaux inclus dans l’expérimentation seront mis à mort à la fin de ce projet, soit après avoir atteint les points limites soit afin de procéder à des prélèvements tissulaires pour des analyses supplémentaires.
Remplacement
Afin d’étudier la fonction des enzymes coupant/digérant l'ADN des cellules tumorales dans l’immunité anti-tumorale et dans la régulation de l’efficacité thérapeutique de traitement anti-cancéreux, nous utilisons des animaux génétiquement modifiés qui à la fois ont des déficiences en ces enzymes digérant l’ADN et développent spontanément des tumeurs mammaires. Ainsi, cette étude ne peut pas être réalisée avec des échantillons humains. De plus nous étudions l’interaction entre le système immunitaire et les cellules tumorales dont la modélisation dans un système d’organoïdes n’est pas à ce jour optimale et ne peut remplacer les modèles in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales ont été déterminés pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Nous utilisons les souris femelles pour notre projet car nous travaillons sur le cancer du sein. Cependant, les souris mâles issues de nos croisements ne seront pas mises à morts mais utilisées dans le cadre d’un projet sur l’obésité et pour le maintien de nos colonies.
Raffinement
1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bien-être (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maîtrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang sous mandibulaires, les injections s.c, ainsi que la mesure des volume tumoraux sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort et la douleur incombé par ces procédures.
Choix des espèces
Nous utiliserons des souris pour répondre à nos objectifs de recherche. Les souris sont les animaux de choix pour notre projet car des souches génétiquement modifiées déficientes pour les enzymes qui digèrent l’ADN que nous étudions sont disponibles et permettent de répondre au mieux à nos objectifs. Des souris génétiquement modifiées qui développent des tumeurs mammaires seront aussi utilisées dans notre projet. Celles-ci sont idéales pour notre étude car elles récapitulent très bien le processus de développement des tumeurs mammaires humaines, ce qui en fait un excellent modèle d’étude et facilite l’applicabilité des résultats à l’Homme. Nous utiliserons les souris adultes entre 8 et 14 semaines. En effet, nous nous intéressons au rôle de nos enzymes digérant l’ADN dans l’induction de l’immunité anti-tumorale en réponses aux thérapies conventionnelles dans le cancer du sein, une pathologie qui affecte presque exclusivement l’adulte.
Édition génomique par CRISPR Cas9 pour traiter les cardiomyopathies liées aux mutations du gène LMNA, dans un modele murin Lmna p.H222P homozygote.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectées dans une veine à deux jours de vie, éveillées, puis soumises chaque mois pendant six mois à une échocardiographie sous anesthésie, 40 souris porteuses d'une mutation du gène Lmna qui atteint le muscle cardiaque vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. L'injection apporte des outils d'édition génomique CRISPR Cas9 destinés à corriger la mutation, une correction déjà obtenue sur des cellules souches pluripotentes induites différenciées en cellules cardiaques. Pour justifier l'arrêt à six mois, le porteur écrit que les souris "ont peu de risques de développer des symptômes de la maladie". Il indique ailleurs que "Les premiers symptômes sont détectés entre 3 et 6 mois chez les mâles homozygotes" et que "Le phenotype devient dommageable à 6 mois".
Objectifs
Ce projet a pour but l’évaluation de l’effet bénéfique de la correction d'une mutation Lmna chez des souris atteintes d’une maladie génétique touchant le muscle cardiaque. Il a été démontré que cette approche était un moyen de corriger le défaut génétique sur des cellules iPSC différenciées en cardiomyocytes, porteurs de mutations LMNA. Nous souhaitons à présent tester cette preuve de concept in vivo, sur un modèle murin avec la même mutation.
Bénéfices attendus
Correction génique et phénotypique pour les souris traitées. Ce projet peut aboutir à la première démonstration du bénéfice de la correction du génome sur l'atteinte cardiaque dans la cardiomyopathie due à des mutations du gène LMNA. Les repercussions peuvent etre majeures en santé humaine, en tant que medecine personnalisee pour cette pathologie, pour laquelle aucun traitement n'est actuellement disponible.
Procédures
1) Injection intraveineuse à l'âge de 2 jours dans un etat vigile de l'animal. Dans son intégralité (contention+injection), le geste s'effectue rapidement en une dizaine de secondes; 2) Echocardiographie tous les mois, pendant 6 mois, sous anestesie. La durée d’une échocardiographie est de 5 à 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
L'injection intraveineuse est une modalité d’administration peu invasive, peu douloureuse et facile à mettre en œuvre chez le nouveau-né. La fonction cardiaque sera évaluée par échocardiographie, sous anesthésie. Cette technique d'imagerie cardiaque n'est pas invasive. Les effets indésirables attendus sur les animaux sont surtout dû à un éventuel développement précoce du phénotype dommageable de la lignée. Notre connaissance approfondie de l’histoire naturelle du développement de ce phénotype permet de déterminer précisément la progression de l’atteinte cardiaque et en particulier l’âge (10 mois pour les males et 12 mois pour les femelles) auquel 80% des souris entrent en insuffisance cardiaque. Afin d’éviter toutes douleurs liées à l’insuffisance cardiaque, dans ce projet, les souris sont euthanasiees à 6 mois d'âge et ont peu de risques de développer des symptômes de la maladie. Il se peiut q'une inflammation apparaise au lieu d'injection.
Devenir
Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de la procédure (thérapie génique et suivi par échocardiographie). Les organes des animaux seront prélévés pour une étude moléculaire de la correction génique et du recouvrement des mécanismes cellulaires.
Remplacement
Le but de notre projet est l’identification d’une possible stratégie thérapeutique pour optimiser le traitement pour la cardiomyopathie causée par des mutations du gène LMNA. Pour cela il est nécessaire d’étudier le rôle de notre approche corrective, et les effets du traitement dans un modèle animal tel que la souris pour avoir accès à la fonction cardiaque. Pour réaliser cette étude, l’utilisation du modèle murin est donc indispensable. La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote toutes les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie humaine liée aux mutations du gène LMNA.
Réduction
Les processus expérimentaux seront conçus de façon à utiliser un nombre de souris limité permettant une analyse statistique. Néanmoins, 8 animaux par groupe (pour un total de 40 souris) seront malgré tout nécessaires pour permettre une analyse statistique. Les protocoles seront rigoureusement élaborés et réfléchis en avance pour que l’expérience soit interprétable et que l’on n’ait pas à la refaire.
Raffinement
Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérés par l’animalerie. Les souris sont stabulées sur des portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique et nourriture à volonté. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (les lumières s'allument automatiquement à 6h du matin et s’éteignent le soir à 18h). Les zootechniciens assurent un contrôle quotidien des animaux afin de relever le moindre signe de souffrance, un changement régulier ds cages, un nombre réduit d’animaux par cage (5 maximum hors cages d’accouplement) et pas d’animaux isolés. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. L’enrichissement du milieu consiste en l’ajout de lanières de papier Kraft afin que les souris puissent faire un nid ainsi que des tunnels en carton. Enfin, si nécessaire, la nourriture pourra être mise à disposition sur le plancher de la cage et de la bouillie pourra être introduite dans les cages si nécessaire. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne jusqu’à leur euthanasie (suivi de poids hebdomadaire, évaluation du bien-être général, vérification de l’absence de lésions). Nous avons des mesures mises en place pour réduire la douleur pendant la procédure expérimentale (avec des points limites adaptés)
Choix des espèces
La pathologie d'intérêt est modélisée uniquement dans l'espèce mus musculus. Nous utilisons une souche sur laquelle la mutation Lmna a été dérivée. Les souris mutantes récapitulent à l’état homozygote les caractéristiques phénotypiques de la cardiomyopathie liée aux mutations du gène LMNA. Les premiers symptômes sont détectés entre 3 et 6 mois chez les mâles homozygotes et évoluent rapidement jusqu’au décès des animaux provoqué principalement par l’aggravation du phénotype cardiaque. Les souris seront utilisées en J2 en pré-symptomatique, pour une injection en IV de nos outils de correction génique. Les souris seront ensuite maintenues pour 6 mois car cela permet d'observer l'apparition et l'évolution de phénotype avant l'apparition des premiers symptomes. Le phenotype devient dommageable à 6 mois.
Criblage pan-génomique in vivo par CRISPRi pour identifier de nouveaux gènes régulant la progression métastatique dans un modèle de cancer du sein
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules cancéreuses du sein sous la peau, puis une résection chirurgicale de la tumeur sous anesthésie et un suivi de l'évolution métastatique. Le porteur mène un criblage pan-génomique par CRISPRi pour identifier des gènes régulant la progression métastatique du cancer du sein. La mise à mort sert à prélever les organes et à rechercher les métastases par imagerie et analyse moléculaire.
Objectifs
Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent dans le monde (2,26 millions) et malgré les progrès des thérapies, un grand nombre de patientes décède chaque année des suites métastatiques (685,000). La majorité des cancers du sein sont d’origine canalaire, et 15% sont diagnostiquées in situ, c’est-à-dire qu’ils n’ont pas franchi la barrière physique qui les entoure constituée par la lame basale. Au moins un tiers des tumeurs resteraient in situ et bénignes, et près de deux tiers de ces tumeurs évoluant vers un stade invasif. A ce jour, en absence de marqueurs prédictifs de l’évolution vers le stade invasif, les médecins traitent les patientes porteuses de tumeurs in situ comme si elles avaient des tumeurs malignes. Ceci a un coût humain et économique important qui va en augmentant avec les progrès des techniques d’imagerie. En outre, il n’existe pas de traitement spécifique contre la transition in situ-invasif ou la progression métastatique. Il est urgent d’identifier des biomarqueurs prédictifs pour évaluer le risque de transition vers le stade invasif - première étape du processus métastatique - pour éviter un traitement lourd et inutile aux patientes porteuses de tumeurs bénignes. Il est tout aussi nécessaire de trouver des cibles thérapeutiques pour combattre la dissémination des cellules tumorales. Nous souhaitons identifier de nouvelles protéines inhibitrices de l’invasion, dont la réduction de l’expression a une action pro-métastatique. Jusqu’alors, les divers criblages génomiques de nombreux cancers n'ont pas permis d'identifier de mutations somatiques responsables spécifiquement de la progression métastatique. Une raison possible est que l'acquisition des capacités métastatiques, contrairement à la transformation et à la prolifération, serait principalement causée par des mécanismes de régulation épigénétique, post-transcriptionnelle ou post-traductionnelle. Nous proposons de réaliser un criblage in vivo afin d'identifier les gènes dont la répression de l’expression confèrerait aux cellules tumorales des propriétés agressives et métastatiques. Nous utiliserons les métastases générées après xénogreffe de cellules mammaires humaines comme sources pour identifier les ARN enrichis dans les métastases comparées aux tumeurs primaires. Notre modèle d'étude est le cancer du sein mais les gènes identifiés dans notre étude pourraient permettre de dessiner un paradigme pour d'autres cancers invasifs.
Bénéfices attendus
Au travers de ce projet, nous identifierons de nouveaux gènes régulateurs du processus métastatique dont l’étude permettra une meilleure compréhension de la progression de la maladie cancéreuse et de la transition d’une tumeur in situ à une tumeur invasive. Les gènes identifiés serviront à établir une signature du risque de développer des tumeurs invasives pour aider au pronostic et diagnostic. Enfin, les voies de signalisation associées à ces gènes ouvriront de nouvelles perspectives dans la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques des cancers métastatiques.
Procédures
Sur le plan des gestes chirurgicaux prévus dans ce projet, les animaux receveurs de greffe par voie sous cutanée seront soumis à une résection de la tumeur au site initial d’injection. Les procédures expérimentales de transplantation et de résection seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. La durée estimée pour la transplantation (de l’induction de l’anesthésie à la greffe) est de 5 minutes par animal. La procédure de résection (de l’induction de l’anesthésie à la phase de réveil sur tapis chauffant) représente 15 minutes par animal. Le retrait des agrafes qui interviendra 10 à 15 jours après l’exérèse des greffons nécessite 5 minutes par animal. En complément de ces approches, dans le contexte du suivi hebdomadaire, les souris feront l’objet d’une mesure du greffon induit. Ce geste basé sur la de préhension nécessite 1 minute par animal. La surveillance de la survenue métastatique par imagerie optique -de l’induction de l’anesthésie à l’acquisition des signaux bioluminescents - est estimée à 10 minutes pour chaque animal
Impact sur les animaux
Les principaux effets délétères attendus portent sur l’induction d’une pathologie cancéreuse chez le modèle murin. Par ailleurs, l’injection sous-cutanée d’une grande quantité de cellules est connue pour engendrer une réaction inflammatoire mais qui est contenue en raison du statut immunodéprimé de la souche murine utilisée. Outre l’application du principe des 3Rs, afin que ces dommages soient réduits à un minimum, nous procéderons par étape tout au long de ce projet et nous nous appuierons sur la mise en place d’une grille de score pour définir une fréquence d’interventions la plus adaptée afin de garantir le bien-être des animaux. L’expérience préliminaire servira de base pour déterminer l’impact de l’injection de 30x10E6 de cellules, évaluer les caractéristiques cinétiques de croissance tumorale et ajuster au mieux le suivi des animaux. Par ailleurs, les souris feront l’objet d’une phase d’acclimatation en vue de leur inclusion dans les procédures expérimentales et seules les manipulations nécessaires seront effectuées. Nous veillerons à conserver les caractéristiques de l’espèce par le maintien des animaux en groupe tout au long de leur stabulation et l’apport d’enrichissement dans les cages pour améliorer leur bien-être.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure en vue de l'investigation tissulaire ex-vivo. L’analyse des tissus (organes) par imagerie optique nous permet d’explorer la présence de métastases. Les foyers tumoraux distants ainsi mis en évidence seront préparés pour l’extraction de matériel biologique en vue de l’identification des gènes associés à l’évolution métastatique de la pathologie par analyse moléculaire.
Remplacement
Le processus métastatique très complexe impliquant l’organe d’origine de la tumeur, les organes receveurs des métastases et les systèmes de circulation des cellules invasives par voie sanguine ou lymphatique ne peut pas encore être reconstitué in vitro. Si la recherche de nouveaux gènes impliqués dans ce processus par un criblage pan-génomique ne peut pas être effectué in vitro, des méthodes complémentaires pourront tout de même être utilisées pour certaines étapes du projet. Sur la base des gènes identifiés in vivo, on utilisera donc des approches in vitro dès que possible et dès qu’elle sera pertinente en vue de disposer de modèles d’études complémentaires notamment en matière de caractérisation moléculaire. In fine ces modèles d’étude complémentaires nous permettront d’utiliser moins de souris.
Réduction
Dans un souci de réduction du nombre d’animaux, le suivi du développement de la pathologie maligne chez les animaux transplantés se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés non invasifs, tels que la mesure des greffons à l’aide d’un pied à coulisse et le recours à l'imagerie optique in vivo par bioluminescence. Tout au long de ce projet, nous procéderons par étape et nous mettrons en place des groupes contrôles pour nous assurer de la pertinence de notre modèle et passer à l’étape suivante.
Raffinement
Afin d’améliorer le cadre de vie des animaux, les besoins physiologiques seront respectés (nourriture et eau ad libitum). Nous optimiserons les conditions d’hébergement des animaux par la présence d’enrichissement dans les cages (copeaux de bois compactés, lanières de papier et/ou coton) et par leur maintien en groupes de 3 à 5 afin d’éviter le stress de l’isolement. Les procédures expérimentales de transplantation seront réalisées sous anesthésie, et la mise en place d’une analgésie pré, per et post opératoire sera assurée pour une bonne prise en charge de la douleur chez les animaux. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal. L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée à mener en fonction d’une grille de score du bien-être.
Choix des espèces
Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’Homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). C’est de plus, le modèle le plus fourni en études pour ce qui concerne le domaine de la cancérologie. Les animaux utilisés dans ce projet seront des animaux à l’âge adulte (8-10 semaines) De par notre expérience et selon les données de la littérature, cette fenêtre d’âge est optimale pour la prise de greffe de cellules tumorales chez le modèle murin dans un contexte de xénogreffe.
TP chez le rat et la souris mâle ou femelle : Formation spéciale à l’expérimentation animale niveau praticien
- Formation professionnelle
Rats : 567
1 125 souris et rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, une partie des rats réutilisés pour d'autres sessions, les autres animaux tués. Ils subissent différentes voies d'injection de produits neutres et des prélèvements sanguins, réalisés par des personnes en cours de formation à l'expérimentation animale. Ces séances servent à valider une formation réglementaire de niveau praticien, non à produire des connaissances. Le porteur affirme que la pratique directe sur l'animal est "incontournable" et "indispensable" malgré la place faite aux méthodes alternatives.
Objectifs
Le projet ci-après a déjà été autorisé au sein de notre animalerie pédagogique, mais cette dernière est en travaux actuellement. Ainsi le temps des travaux, les formations pratiques se dérouleront dans un autre établissement d'enseignements de la région. C'est pourquoi, nous représentons la demande d'autorisation de projet au sein de cet établissement. Pour rappel, ce projet s'inscrit dans la formation réglementaire à l'expérimentation animale décrite dans l’arrêté du 1er février 2013 n° AGRG 1238729, proposée à des personnes appliquant des procédures expérimentales aux animaux. Cette formation est proposée à 20 stagiaires au maximum. Ce projet consiste à former des personnes travaillant au sein d’établissements utilisateurs d’animaux à des fins scientifiques d'un point de vue pratique sur les procédures faiblement invasives chez les rongeurs (rat et souris) (procédures régulièrement utilisées en expérimentation animale), de s’assurer que le bien-être des animaux soit respecté en les accompagnant dans leurs apprentissages pratiques afin de valider la formation réglementaire. Ce TP permettra à certaines personnes d’appliquer ces procédures pour la première fois de façon individuelle et sera l’occasion de manipuler des animaux vigiles et d'acquérir de l’autonomie.
Bénéfices attendus
Ce TP permettra une acceptation au niveau pratique de la formation à l’expérimentation animale niveau praticien dispensée par notre établissement. En effet, la réalisation de ce TP (partie apprentissage) est incluse dans le dossier de validation de notre formation praticien. Etant donné que cette formation à l'expérimentation animale niveau praticien donne aux personnes, l'ayant validée, la possibilité de travailler avec des animaux de laboratoire, il nous semble nécessaire de leur donner des bases pratiques pour s'assurer qu'ils sont bien capables de travailler avec des animaux dans les meilleures conditions pour le bien-être de ces derniers. En outre, le retour des employeurs et personnes sur notre formation praticien est très positif, car ils attestent être rapidement autonomes après une prise de poste et que leur maîtrise des gestes techniques leur permetttent d'assurer un travail respectueux de l'animal.
Procédures
Les animaux seront répartis en 3 lots qui seront soumis à des protocoles différents faisant appel à la réalisation de procédures faiblement invasives (différentes voies d'injections de produits neutres et de prélèvements sanguins). Ces procédures expérimentales seront réalisés sur animal vigile ou anesthésié, quand la procédure le nécessite. Un laps de temps pouvant aller de 30 minutes à 180 minutes, entre chaque procédure est observé afin de respecter le bien-être animal .
Impact sur les animaux
Les procédures réalisées dans ces TP sont faiblement invasives. Les produits adminisitrés de volumes réduits sont neutres (sérum physiologiques, eau). Les administrations de produits et prélèvements se feront sous le strict contrôle de l’équipe formatrice/enseignante. Ainsi les deux nuisances attendues pour les animaux seront liées au stress de la manipulation et aux douleurs éventuelles associées aux injections effectuées par des étudiants en aprrentissage. Afin de diminuer ce stress, les animaux seront préalablement habitués à la manipulation par le personnel technique ainsi que celles liées aux douleurs d'injections éventuelles effectuées par les apprenants. Pour réduire le stress des animaux, les souris commandées en provenance d'éleveurs agrées seront réceptionnées 10 jours avant le début de la session de formation pour leur permettre une bonne acclimatation. Dans le cas où l'animalerie de l'IUT disposerait de rats de poids initial (200gr pour les femelles et 225 gr pour les mâles) ils seront intégrés dans les TP réduisant ainsi fortement la nuisance de transport. Dans le cas contraire (pas le poids demandé) les rats seront commandés auprès d'éleveurs agréés également et seront aussi réceptionnés 10 jours avant le début de la session. Pour les douleurs éventuelles liées aux piqures, l'équipe enseignante/formatrice insistera sur la précision du geste technique avant de procéder à l'injection, qui ne sera réalisée qu'une seule fois par les étudiants.
Devenir
En fin de session (si le temps entre 2 sessions est inférieur à 1 mois, afin de garder des animaux avec un poids adéquat), les rats seront gardés en vie et réutilisés pour une autre session. Au delà d'un mois, les animaux seront réutilisés dans des protocoles hors champs dans notre établissement ou au sein des autres établissements de notre université. Si les animaux ne sont pas réutilisés, ils seront mis à mort et pourront servir pour les TP de dissection.
Remplacement
Afin de valider la formation réglementaire à l'expérimentation animale (niveau praticien), il est nécessaire que les personnes pratiquent les techniques les plus usuelles et les moins invasives (différentes voies d'injections de produits et de prélèvements sanguins) sur animal vigile ou anesthésié pour les maîtriser et ceci en complément des autres supports utilisés (démonstrations...). Même si une large part est faite aux méthodes alternatives à l’expérimentation animale, la réalisation d’interventions directes sur l’animal, avec encadrement professionnel, est incontournable et reste l’objectif principal de ces formations professionnelles.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés a été calculé de manière à prendre en compte le degré de stress et/ou de douleur potentiellement occasionné chez l'animal, tout en permettant une bonne formation pratique des personnes. L'administration par voie orale sera réalisée une fois par rat/souris et par personne, l'injection par voie SC et IP et le prélèvement de sang par voie IV seront réalisés une seule fois par rat/souris et par personne et enfin l'injection IM sera réalisée par une personne sur une cuisse par rat/souris. Un formateur réalisera une démonstration de chaque procédure en utilisant 2 rats et 1 souris. Afin de réduire le nombre d’animaux utilisés, l'ensemble des rats et souris sera réutilisé pour les prélèvements sanguins. Ainsi, 3 rats et 3 souris seront nécessaires pour 1 personne, soit 60 rats et 60 souris pour 20 personnes, effectif maximum de notre formation. A cela nous souhaitons ajouter 1 animal rat et souris supplémentaire par session, en cas de problème de manipulation ou d’animaux dont l'état de santé initial ne permettrait pas d'entrer dans ce projet, ainsi que 2 rats et 1 souris pour la démonstration du formateur. Cela représente 63 rats et 62 souris par session. Il est envisagé 3 sessions par an sur 3 ans, soit un total de 567 rats et 558 souris pour les 3 ans. Ce chiffre sera bien entendu revu à la baisse si le nombre d'inscrits à la formation est inférieur à 20 et si le nombre de session est atteint ou le temps entre 2 sessions est inféreur à un mois. Enfin, certains animaux pourront provenir d'un précédent protocole classé hors champ, dans lequel les rats femelles auront eu 2 frottis vaginaux.
Raffinement
Les animaux utilisés dans ce projet seront hébergés évidemment, par groupe socialement harmonieux, en présence de deux éléments d'enrichissement (tunnel en plastique et bâton de bois à ronger ou noix). Les animaux auront été habitués à la préhension / contention avec le personnel de l’animalerie, afin qu'ils soient moins stressés lors des procédures réalisées par les personnes. Avant toute intervention sur l'animal, les personnes auront observé la démonstration par les formateurs. La pratique des personnes sur l'animal ne sera réalisée que sous contrôle rigoureux des formateurs. Une attention particulière sera portée sur la nécessité de travailler dans le calme afin d'éviter tout stress inutile chez l'animal. Enfin une même intervention ne sera réalisée qu'une seule fois sur un même animal. A noter qu'avant les séances de TP, les personnes auront suivi plusieurs enseignements théoriques de la formation à l'expérimentation animale et seront donc particulièrement sensibilisés au respect des procédures. De plus, les rats et souris seront récompensés à la fin de chaque manipulation à l'aide d'un aliment appétent sucré (type pop corn, biscuit sec...), ce qui permettra de diminuer leur stress tout en sensibilisant les stagiaires à l'importance du renforcement positif. La réalisation de certains procédures expérimentales (prélèvements sanguins) nécessitent l'emploi du poste à anesthésie volatile afin de limiter la douleur pour l'animal. Pour cela, lors des apports théoriques la notion et l'explication de points limites pour limiter la douleur est abordée. Les points limites requis pour ces procédures seront mis en place pendant toute la période de manipulation de ces animaux.
Choix des espèces
Cette formation à l'expérimentation animale (niveau praticien) aura pour spécialisation d'espèces animales : les rongeurs rats et souris. Ces deux espèces sont couramment utilisées en expérimentation animale. Il est indispensable de réaliser une séance de TP chez la souris et le rat, pendant laquelle les personnes réaliseront certaines procédures faiblement invasives (différentes voies d'injections de produits neutres et de prélèvements sanguins) pour consolider et s’assurer que les procédures les plus utilisées soient connues et maîtrisées. Les rats seront âgés de 8-12 semaines et pèseront entre 200 et 350 g en fonction du sexe, poids qui permettront une contention aisée pour des stagiaires qui se forment à l'expérimentation animale. Pour les souris, elles seront agées de 6 à 8 semaines et pèseront entre 25 et 35 g pour permettre une contention aisée.
Analyse des mécanismes d’élimination des composés alkyls perfluorés pour une démarche préventive de leur bioaccumulation
- Recherche appliquée
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
213 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des composés perfluorés par voie intraveineuse ou orale, séjournent 24 heures en cage à métabolisme, puis sont tuées après un prélèvement de sang important, l'appareil chauffant utilisé pour l'injection dans la queue pouvant provoquer des brûlures. Le porteur cherche des stratégies pour accélérer l'élimination des PFAS accumulés dans l'organisme. Il affirme qu'il n'est "pas possible de s'affranchir" de l'animal, le devenir d'une molécule n'étant pas prévisible par des études in vitro.
Objectifs
L’objectif du projet est d’élaborer et évaluer une ou des stratégies de remédiation pour augmenter l’élimination corporelle des composés alkyl perfluorés (PFAS) accumulés dans l’organisme et réduire ainsi les niveaux d'exposition systémique des PFAS et leurs impacts sur la santé Pour atteindre cet objectif, il est nécessaire de caractériser les processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et conduisent à leur accumulation. La clairance rénale jouant a priori un rôle majeur par rapport à la clairance biliaire, nous analyserons ensuite les mécanismes qui contrôlent l’élimination rénale des PFAS dont les propriétés de la liaison des PFAS aux protéines plasmatiques et les processus de filtration glomérulaire, de sécrétion et de réabsorption tubulaires des PFAS. Les résultats orienteront les approches exploratoires de remédiation vers l’utilisation d’inhibiteurs de la réabsorption rénale des PFAS. L’étude de la relation entre l’exposition systémique aux PFAS et un ou des biomarqueurs prédictifs de leurs effets perturbateurs métaboliques pourra être utilisée comme critère de jugement de la capcité des approches exploratoires à réduire les concentrations au-dessous des seuils d’expression des effets délétères des PFAS.
Bénéfices attendus
La prévention des effets délétères des contaminants environnementaux repose essentiellement sur la réduction des expositions externes via l’établissement de doses sans danger. Cette approche ne permet cependant pas de protéger l’homme des substances chimiques dont la principale source d’exposition est interne, comme certains des composés alkyls perfluorés (PFAS). La très faible capacité d’élimination corporelle de ces composés serait à l’origine de la demi-vie plasmatique élevée, de certains d’entre eux qui s’élève à plusieurs années chez l’homme, et est à l’origine de leur bioaccumulation. L’augmentation de l’élimination de ces composés représente le moyen de diminuer l’exposition des tissus aux effets toxiques de ces substances. Pour cela, notre approche basée sur la caractérisation des processus physiologiques qui limitent l’excrétion des PFAS et leurs effets toxiques permettra d’identifier des méthodes de remédiation.
Procédures
Dans le cadre de la procédure 1, 84 souris recevront une administration intraveineuse unique (N=42) ou une administration orale unique (N=42). Les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme. Un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Six autre souris (contrôles) seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme et à l'issue des 24h, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Au cours de la première étude de la procédure n°2, un prélèvement unique de sang sera réalisé chez l’animal anesthésié (n=15) et immédiatement suivi de la mise à mort. Au cours de la deuxième étude de la procédure n°2, toutes les souris (n=36) recevront une administration orale quotidienne d’un mélange de composés alkyl perfluorés pendant 4 jours et, 3 jours après le début des administrations orales, une administration unique intraveineuse d’iohexol seul (n=12), avec du mannitol (n=12) ou avec un inhibiteur des transporteurs rénaux (n=12). Suite à l'administration intraveineuse, les souris seront hébergées pendant 24h dans une cage à métabolisme afin de recueillir les urines et les fèces. Trois prélèvements sanguins de sang seront réalisés au cours des 24h chez l’animal anesthésié. Le dernier prélèvement sera immédiatement suivi de la mise à mort. Les 60 souris de la procédure 3 recevront une administration orale quotidienne pendant 28 jours. Au bout des 28 jours, un prélèvement de sang unique sera réalisé chez l’animal anesthésié et immédiatement suivi de la mise à mort et des prélèvements de tissus. Les administrations orales seront réalisées par gavage. La durée du gavage varie de 10 à 30 secondes. Les administrations intraveineuses seront réalisées dans une veine latérale de la queue à l’aide d’une seringue à insuline de 0.5ml avec aiguille sertie (0.30mm x 12mm, Aniject 0.5ml INS 100U Pentafine, 30Gx1.2). Les souris seront placées dans le tube de contention de l’appareil illuminateur de queue pour permettre une bonne contention de la queue qui sera placée dans la gouttière prévue à cet effet de façon à ce qu’elle soit éclairée, et forme un angle de 45° entre l’aiguille et la queue. La durée des administrations intraveineuses varie de 30 secondes à 2 minutes. La durée des prélèvements sanguins varie de 10 à 30 secondes.
Impact sur les animaux
Une brûlure de la queue pourrait être induite par l’appareil illuminateur de queue utilisé pour les administrations dans la veine caudale. Cet appareil illumine efficacement la queue mais du fait de la température élevée, la queue ne doit pas être maintenue en continu plus de 2-3 minutes dans la gouttière d’éclairage pour éviter les brûlures
Devenir
Les souris seront mises à mort après le prélèvement d’un volume de sang important qui est requis pour l’ensemble des dosages réalisés pour chacune des procédures du projet (dosage des PFAS, dosage de l’iohexol, évaluation des marqueurs métaboliques).
Remplacement
Pour l’ensemble du projet, il n’est pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants car le devenir d’une molécule dans un organisme (pharmacocinétique) n’est pas prévisible par des études in vitro compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu (absorption, destruction par la flore intestinale, métabolisme hépatique, diffusion tissulaire, élimination rénale, …).
Réduction
Une réduction très importante du nombre d’animaux sera permise par l’administration des PFAS en mélange. En effet, l’administration simultanée des 10 PFAS permettra d’évaluer sur les mêmes animaux le devenir des 10 PFAS et de réduire d’un facteur 10 le nombre d’animaux. La méthode d'analyse des données qui sera mise en œuvre permettra de réduire à un seul, le nombre de prélèvement par animal. En effet, contrairement aux méthodes classiques d'analyse qui nécessitent d'obtenir un grand nombre de données sur le même animal, cette approche permettra d’analyser simultanément toutes les données obtenues avec des animaux différents. Aucune approche statistique ne sera réalisée.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des milieux enrichis : tunnels et papier pour faire des nids. Excepté lors de l'hébergement en cage à métabolisme, les animaux seront hébergés en groupe. Les animaux seront habitués au contact avec les expérimentateurs et une surveillance accrue des souris par ces mêmes expérimentateurs sera réalisée lors de l’hébergement des souris dans les cages à métabolisme. Les animaux seront également habitués à entrer dans le tube de contention et à séjourner dans une cage à métabolisme afin de les entrainer à coopérer lors des manipulations. Les prélèvements sanguins seront réalisés sous anesthésie gazeuse. Durant toute l'étude, les animaux seront surveillés deux fois par jour afin de s’assurer de leur prise alimentaire et de leur accès au système de distribution d’eau. Une pesée réalisée toutes les deux semaines permettra de s’assurer de leur prise normale de poids au cours de l’étude. Les procédures n’induisant que peu de souffrance, un animal dont l’état est préoccupant (présentant au moins un des facteurs répertoriés ci-après) serait éliminé et mis à mort car considéré comme anormal par rapport aux autres : mauvais état du pelage, pâleur des yeux ou des extrémités, perte de poids, anorexie prolongée, difficultés respiratoires sévères ou prolongées (particulièrement si accompagnés de cyanose), difficultés digestives (diarrhée prolongées, …), diminution marquée de l’activité ou décubitus latéral, léthargie, hémorragie sévère incontrôlée, déshydratation sévère ou prolongée, signes neurologiques sévères (ex : tête penchée, tremblements, grincement de dents, convulsions, paralysie, incoordination motrice, etc.).
Choix des espèces
La souris est choisie au titre de modèle de référence en toxoicologie. Le choix du modèle des souris femelles C57BL6 s’appuie sur des résultats préliminaires qui montrent la pertinence de ce modèle pour évaluer les effets des PFAS sur le métabolisme énergétique hépatique. Ainsi, une étude récemment réalisée au laboratoire a montré qu’une stéatose hépatique était induite par un traitement par voie orale des souris C57BL6 avec du PFOA à une dose très faible (5 ng/kg.j). De plus, la comparaison des résultats avec ceux précédemment obtenus chez des souris femelles C57BL6 invalidées pour les récepteurs CAR (Constitutive Androstane Receptor) et PXR (Pregnane X Receptor) apportera des informations très importantes sur le rôle de ces récepteurs nucléaires dans les mécanismes de contrôle de la réabsorption rénale des PFAS. Le projet sera réalisée chez des souris adultes âgées de 10 semaines. L’étude toxicocinétique se déroulant sur une période de 120 jours, il est important que les animaux soient au même stade physiologique (adulte) tout au long de l’étude.
Effet de l’exposition prénatale de nicotine et de cocaïne sur le développement spinal embryonnaire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
384 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Des femelles gestantes sont exposées à la nicotine dans l'eau de boisson ou à la cocaïne par injection pendant la gestation, ce qui peut entraîner un défaut d'alimentation ou une anorexie, avant d'être tuées pour prélever les embryons. Le porteur étudie l'effet de ces expositions prénatales sur le développement de la moelle épinière et les troubles moteurs observés chez l'enfant. Il affirme que les modèles in vitro ne permettent pas d'étudier cette exposition prénatale et qu'un modèle mammifère est "nécessaire".
Objectifs
La consommation de nicotine ou de cocaïne chez la femme enceinte conduit à des troubles moteurs chez l'enfant. La nicotine et la cocaïne traversent la barrière placentaire et engendrent des anomalies du développement du système nerveux, à l’origine des troubles moteurs observés chez l’enfant, mais qui restent encore aujourd'hui très mal connus. De nombreuses études effectuées chez la souris montrent que l'activation des récepteurs nicotiniques (AChR) par l’acétylcholine (ACh) de l’embryon est nécessaire au développement correct des réseaux moteurs de la moelle épinière et plus particulièrement au développement des neurones spinaux (migration, synaptogenèse, développement des propriétés électrophysiologiques). Il a été montré par ailleurs que la cocaïne pouvait agir directement sur les AChR en les inhibant. Nous faisons ici l’hypothèse que la nicotine en activant de façon anormale les AChR et la cocaïne en les inhibant, engendre des erreurs de développement dans les réseaux spinaux qui seraient à l’origine des troubles moteurs observés après la naissance. Pour tester ces hypothèses, nous utiliserons un protocole d'exposition prénatale à la nicotine et à la cocaïne de souris transgéniques gestantes permettant de localiser et étudier le développement de certains neurones spinaux impliqués dans la locomotion. Nous analyserons les effets de l'exposition prénatale de nicotine et de cocaïne à deux stades du développement au 12ème et au 14éme jour embryonnaire. Ces deux périodes de traitement doivent nous permettre d'analyser les effets de l'exposition prénatale aux toxines sur la migration et la synaptogenèse des neurones spinaux. Des enregistrements électrophysiologiques et des techniques d'immunohistochimie seront utilisés pour analyser l'activité et le développement des neurones spinaux chez les embryons exposés, comparés à des groupes contrôles. Notre projet doit permettre de mettre en lumière les mécanismes cellulaires du développement spinal à l'origine des altérations motrices dues à l'exposition à la nicotine et à la cocaïne pendant la grossesse.
Bénéfices attendus
Nos travaux doivent permettre de mieux connaitre et mieux comprendre les effets délétères de la nicotine et de la cocaïne sur le développement du foetus et à terme permettre d'adapter et d'améliorer la prise en charge des enfants exposés à ces drogues.
Procédures
Des groupes de souris gestantes seront exposés à la nicotine. Des groupes seront traités avec la nicotine pendant la gestation jusqu'au 12ème ou jusqu'au 14ème jour embryonnaire. La nicotine sera administrèe par l'eau de boisson (200microgramme/L + 1 pour cent saccharine). La quantité de boisson qui sera bue par chacun des animaux sera monitorée. En parallèle un groupe de souris gestantes "contrôle" n'aura pas de nicotine dans l'eau de boisson (1 pour cent saccharine). Des groupes de souris gestantes seront exposés à la cocaïne. Des groupes seront traités avec de la cocaïne pendant 4 ou 6 jours pendant la gestation entre le 9ème et le 12ème jour ou entre 9ème et le 14ème jour de gestation. La cocaïne sera administrèe par injection sous-cutanée (40 mg/Kg/jour dans un liquide physiologique 0.9 pour cent NaCl). En parallèle un groupe de souris gestantes "contrôle" recevra des injections quotidiennes sans cocaïne (liquide physiologique 0.9 pour cent NaCl). 384 animaux au total suivront l'ensemble de ces procédures.
Impact sur les animaux
L'administration chronique de nicotine dans l'eau de boisson peut entrainer un défaut d'alimentation et de prise d'eau. L'administration chronique de cocaïne peut entrainer des anorexies. Le niveau d'eau dans les biberons sera surveillé afin de détecter un éventuel défaut de prise d'eau. Dans le cas d'un risque de déshydratation, le traitement sera interrompu. La prise de poids des femelles gestantes sera surveillée. En cas de perte de poids anormale, un régime spécifique, déjà utilisé pour d'autres études de ce type, sera donné aux animaux (BioServ #F1258SP).
Devenir
Les femelles gestantes sont euthanasiées avant le prélèvement des embryons.
Remplacement
Des simulations informatiques seront réalisées afin de remplacer/compléter certaines expériences. Cela permet de réduire le nombre d'animaux utilisés pour certaines étapes du projet. Des modèles de culture de neurones spinaux existent et permettent de tester les effets de la nicotine ou de la cocaïne sur les récepteurs nicotiniques. Cependant ces modèles in vitro restent complémentaires aux approchent in vivo car ils ne permettent pas d'étudier l'exposition prénatale de ces molécules sur le développement de l'embryon.
Réduction
Plusieurs expériences seront menées sur une même portée. Notre projet est basé sur des méthodes variées qui permettent d'utiliser au maximum tous les embryons d'une même portée. Cela permettra de réduire le nombre de femelles gestantes utilisées. Des tests statistiques seront réalisés afin de vérifier les effets de la nicotine et de la cocaïne sur l'activité et le développement des neurones des moelles épinières embryonnaires. Nous prévoyons des portées de 8 à 12 embryons en moyenne provenant de 6 portées différentes par condition expérimentale afin que des tests non-paramétriques fiables puissent être effectués (Test Mann et Whitney ou Wilcoxon). Les mâles utilisés comme reproducteurs pourront être proposés pour d’autres études lorsque ceci est possible.
Raffinement
Les souris seront élevées avec un enrichissement et en cages collectives. Les mâles ne seront isolés que pendant la période de reproduction et les femelles isolées uniquement pendant la période de gestation. Seuls des personnels qualifiés contrôleront les points limites généraux et pourront euthanasier les animaux en cas de nécessité. Toute anomalie ou souffrance évidente sera signalée à l'expérimentateur et au responsable de projet qui décident de la conduite à tenir en fonction des points limites ci-dessous : - perte de poids supérieure à 20 pour cent sur 3 jours - automutilation - développement de plaies ou d'infections - poil mal entretenu ou aspect général anormal - changement de comportement (particulièrement la prostration) - activité cardio-respiratoire ralentie ou accélérée - En cas de blessure, les plaies seront nettoyées et désinfectées au diaseptyl. - En cas de perte de poids, l'animal peut être réhydraté si besoin par injection IP ou sous-cutané de saline (10ml/kg) ou saline-glucose (v/v, 10ml/kg). On peut également déposer des miettes humides issues de la nourriture habituelle directement dans la cage. - En cas de douleur évidente une injection sous-cutanée de Métacam est réalisée (5 à 10 mg/kg), renouvelée 1 fois par jour pendant 3 jours maximum. - En cas de non amélioration, le responsable du projet sera averti et prendra la décision si nécessaire de mise à mort de l'animal par dislocation cervicale.
Choix des espèces
Ce projet a pour but d'analyser les effets de certaines drogues sur le développement in utéro de la moelle épinière. L'utilisation d'un modèle de mammifère est ainsi nécessaire dans ce projet. Le choix d'un modèle murin a été motivé par la possibilité d'utiliser des lignées transgéniques comme les lignées transgéniques GAD67-eGFP et Hb9-eGFP qui permet de localiser les neurones GABAergiques et les Motoneurones respectivement dans le tissu nerveux.