Souris

224 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 188 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 36 modéré. Elles reçoivent une implantation de cellules cancéreuses, soit sous la peau soit directement dans le pancréas au cours d'une chirurgie de 45 minutes, des prélèvements sanguins, puis des modèles de thrombose déclenchée au laser ou une thrombose veineuse maintenue 48 heures. Le porteur étudie le rôle d'un globule blanc, le neutrophile, dans la thrombose associée au cancer du pancréas, en situant au long terme et au conditionnel un meilleur traitement chez l'humain. Il affirme qu'aucune lignée cellulaire ne produit ces cellules en quantité suffisante et que l'intégrité du vaisseau ne se reproduit pas in vitro.

Objectifs

La principale comorbidité du cancer pancréatique est la thrombose. La probabilité de décés de patients developpant un cancer du pancréas et une thrombose est augmentée de 50%. Un type de globule blanc (le neutrophile) est impliqué dans la thrombose. Ce neutrophile est l'élement initiateur de la thrombose. Il existe plusieurs sous population de neutrophiles présents dans le compartiment sanguin. Le but de cette étude est de déterminer la sous population de neutrophiles impliquée dans la thrombose associée au cancer du pancréas. Pour cela nous utiliserons un modèle de cancer du pancréas murin dans le lequel nous testerons leur impact sur le développement de thrombose. Nous évaluerons également le rôle d'un récepteur porté par les cellules cancéreuses dans la progression tumorale et le développement de la thrombose.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de mieux appréhender le rôle des neutrophiles et du récepteur à l’adenosine diphosphate dans la thrombose associée au cancer et dans l’évolution du cancer du pancréas. A long terme cela pourrait permettre de mieux traiter les thromboses associées au cancer chez l’homme.

Procédures

Les animaux seront soumis à des implantations de cellules cancéreuses. Ces implantations sont realisées soit en sous cutanée et d'une durée de maximum deux minutes d'intervention soit directement dans la tête du pancreas, intervention de 45 minutes. Ces procédures sont realisées sous anesthsesie, les animaux sont surveiller gràce à des grilles specifiques d'evalaution de la douleur et seront traités par des analgesiques si necessaire. Des prélèvements sanguins sont realisés sous anesthesie volatile (durée 5 minutes maximum) et sont espacés d'au moins une semaine. Les modèles de thromboses spontanée et induite par laser sont des expériences sans reveils. Le modéle induit de thrombose veineuse necessite 48 heures de developpement les animaux sont sous analgèsique durant ces 48 heures.

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues pour les animaux sont de la douleur pouvant être induite par la croissance du cancer et leurs métastases. Dans le cas des deux types d’implantation les animaux sont étroitement surveillés et la douleur est évaluée grâce à des grilles de scores adaptées à chaque type d’implantation, en fonction du score les animaux sont traités par analgésique à dose croissante. Nous veillions également à ce que les animaux soient bien hydratés, ils reçoivent tous une injection de solution saline en sous cutané après les opérations chirurgicales . Nos points limites qui sont précoces, l’utilisation des grilles d’évaluation de la douleur et notre connaissance de ces modèles nous permettrons de limiter le plus possible la douleur des animaux.

Devenir

Les animaux sont tous euthanasiés à la fin des procédures, différents organes seront prelevées en post mortem.

Remplacement

Les neutrophiles, les plaquettes et les cellules endothéliales sont des cellules clefs dans l’immunothrombose et de l’immonothrombose associée au cancer. A ce jour, Aucune lignée cellulaire immortalisée ne permet de produire dans des proportions satisfaisantes des neutrophiles et de plaquettes. D’autre part, Il n’est pas possible de reproduire à l’heure actuelle l’intégrité du vaisseau, ni l’activation des cellules endothéliales in vitro.

Réduction

Dans une première phase nous testerons plusieurs modèles pour caractériser et produire une sous population de neutrophiles particuliers. en parallèle nous testerons des strategie in vivo. Ces stratégies seront nous l’espérons plus efficace que la production in vitro déjà testée qui ne permet de produire suffisamment de neutrophiles de la sous population recherchée viables à ce jour dans notre laboratoire. Nous ne reproduirons les résultats que pour le groupe présentant les meilleurs taux de neutrophiles recherchés pour les tester sur les modèles de thrombose. D’autre part à résultats identiques entre les deux groupes in vivo nous choisirons le modèle préclinique présentant le moins de sévérité pour réaliser les deux modèles induits de thrombose .

Raffinement

Les animaux sont hébergés en groupes de 5, en présence de coton de nidification ; avec boisson et nourriture adlibitum. Une période de 7 jours d’acclimatation sera réalisé pour tous les animaux avant expérimentation. Les animaux sont suivis et pesés quotidiennement après implantations. Les implantations sont réalisées sous anesthésie accompagnées d’analgésique. Les animaux sont observés toutes les 12 heures durant les 48 premières heures suivant les implantations, en cas de signe de souffrance les animaux seront administrés avec un analgesique. La visualisation de la thrombose spontanée est sans reveil et realisée sous anesthesie. Les animaux seront euthanasiés par un excès d’anesthésiques. Le modèle au laser est une expérience sans réveil réalisés sous anesthésie, les animaux seront euthanasiés par un excès d’anesthésique. Dans le cas du modèle de thrombose veineuse, les animaux sont pendant toute la durée de l’expérience jusqu’48 heures sous anagesique et sont euthanasiés par dislocation des cervicales sous anesthésie volatile.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix pour l’étude préclinique de la thrombose. En effet la formation d’un thrombus dans le modèle murin est excessivement proche de celle de l’Homme, aussi bien au niveau des molécules que des cellules impliquées. Le modèle murin offre également la possibilité de travailler sur des animaux transgéniques, pour ce projet nous avons choisi d’utiliser en plus des animaux sauvages des souris transgenique sur le recpteur de l'adénosine diphosphate. Les animaux seront utilisés entre la 5eme semaine et la 12 eme semaine. Les expériences seront effectuées sur des animaux adultes (pancréas mature) puisque les cancers du pancreas se developpent chez l'Homme Adulte.

354 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 288 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 66 modéré. Elles subissent une chirurgie du cerveau avec mise en barre d'oreille et craniotomie, l'injection d'un virus AAV dans le striatum, puis des tests moteurs répétés (openfield, rotarod, analyse de la marche) de 4 à 12 mois et un prélèvement de sang et de liquide céphalorachidien avant la mise à mort. Le porteur teste une thérapie génique contre la maladie de Huntington, les retombées pour les patients restant renvoyées à un futur essai clinique. Il affirme que seuls les modèles murins miment fidèlement la pathologie et que la preuve de concept chez les rongeurs est exigée par l'ANSM.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives comme la maladie de Huntington (MH) sont une préoccupation croissante en santé publique. Malgré d’importants efforts de recherche, il n’existe encore aujourd’hui aucun traitement capable de combattre de façon efficace la progression de ce type de maladies. De nouvelles approches thérapeutiques sont essentielles pour améliorer la qualité de vie des patients. Parmi ces nouvelles approches prometteuses se trouve la thérapie génique. Elle utilise l’ADN pour soigner ou prévenir de la maladie. Selon la pathologie, cet objectif peut être atteint en délivrant aux cellules un gène sain qui prendra le relai du gène déficient et un inhibiteur du gène qui permettra de réduire l’expression délétère de ce gène déficitaire. Un virus modifié (AAV) non pathogène nous permettra de délivrer cet ADN avec cette inhibiteur au cœur même des cellules. Nous avons déjà la preuve de concept de notre stratégie dans des modèles murins pour la maladie de Huntington : l’enzyme déficiente à l’origine de la pathologie est remplacée par cet ADN permettant la synthèse d’une enzyme assurant la fonction normale permettant de corriger les anomalies neuropathologiques et comportementales chez la souris malade. Le but est de tester l’efficacité des AAV exprimant un gène témoin ou des gènes thérapeutiques (pour éteindre l’expression de la protéine huntingtine mutée) sous contrôle des promoteurs qui ciblent de façon spécifique les neurones dans différentes régions du cerveau des modèles murins pour la MH

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de tester l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale d’un AAV exprimant le gène thérapeutique dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui va être utilisé chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique.

Procédures

Les animaux commerciaux seront soumis à 8 semaine d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. A 11 semaines d’âge, les animaux seront euthanasies pour l’analyse post mortem des tissus. A partir de 6 mois d’âge, les animaux modèles de la maladie d’Huntington développeront un phénotype dommageable. Ces animaux seront soumis à 2 mois d’âge à une injection stéréotaxique sous anesthésie générale (durée de 70 min), animal endormi avec une prise en charge analgésique afin d'éviter la douleur, par l'administration d'analgésiques avant et après la chirurgie. Les animaux modèles pour la maladie d’Huntington seront soumis à tests comportementaux des 4 mois d’âge. L’openfield sera réalisé a 4, 6 , 8 et 11 mois avec une session de 10 minutes a chaque fois. Le rotarod est réalisée en 3 session pendant 3 jours et est réalisés a 4, 5, 6, 7 , 8 , 9, 10, 11 et 12 mois d’âge. Enfin le gait analysis est réalisé a 12 mois + 1 semaine et consiste en 3 sessions de 10-30 secondes. A 12 mois d’âge, un prélèvement unique de sang et de LCR seront effectués avant euthanasie pour l’analyse post mortem des tissus.

Impact sur les animaux

Une douleur peut survenir lors la mise en barre d’oreille des animaux, Un risque de saignement peut avoir lieu au moment de la craniotomie. Un risque traumatique mécanique local relativement faible peut être également être observe suite l’injection de l’aiguille dans le striatum des souris. Une perte de poids dû a l’injection de AAV pourrait être observé, 5 à 7% du poids total de l’animal, (selon nos précédentes études), bien que les concentrations des AAVs utilisées ont déjà été évaluées in vitro et dans nos précédentes études afin d’éviter toute toxicité chez la souris. L’injection de AAV avec le gène thérapeutique améliore l’état général de l’animal ; améliore les performances motrices, présente un effet trophique au niveau des neurones.

Devenir

Les animaux d’intérêt produits/commerciaux seront maintenus en vie pour la chirurgie stéréotaxique et/ou les tests comportementaux. Les souris seront euthanasiées de 3 semaines a 10 mois après les injections décrites , pour continuer les différentes études moléculaires et cellulaires.

Remplacement

A ce jour, seuls les modèles murins de la MH permettent de mimer suffisamment fidèlement la pathologie et donc d'être utilisés dans des études d'efficacité de nouveaux traitements. Toutes les études in vitro possibles ont été effectuées en amont de ce projet, en particulier la démonstration de la fonctionnalité des AAVs. L’objectif de ce projet ne permet pas d’envisager de méthode évitant ou remplaçant l'utilisation des animaux. En effet, le développement de l’approche thérapeutique chez l’Homme, nécessite une preuve de concept chez les rongeurs (souris modèle). Ces étapes sont requises par l’ANSM pour toute demande d’autorisation d’étude clinique.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés est optimisé pour obtenir des résultats statistiques. Leur nombre (354) a été restreint au minimum indispensable de façon à obtenir des données nécessaires pour valider l’efficacité d’une stratégie thérapeutique innovante qui peut être considérée comme cible dans plusieurs maladies neurodégénératives. En effet, des travaux précédents ont permis d’établir les doses de vecteur à injecter et les temps d'analyses.

Raffinement

Afin de réduire la douleur lors de la mise en barre d’oreille nous enduisons préalablement les barres d’oreilles de crème analgésique. Le geste réalisé pour la craniotomie est maitrisé au sein de l’équipe et les risques de saignement n’apparaissent que rarement. Pour limiter le risque de traumatisme mécanique local, relativement faible lié à l’injection, nous utilisons des aiguilles fines 32G de type 3 non biseautés acquise avec l’expérience de nos études précédentes).. Les protocoles d’anesthésie et d’analgésie ont été définis et validés par une équipe vétérinaire. De plus, en cas d’observation de la moindre douleur, les souris recevront un traitement analgésique et si cette douleur devait persister, les animaux seraient euthanasiés pour éviter toute souffrance.; 6h après l’acte chirurgical, une première injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. 24h après une fiche de scoring est remplie pour tout animal et une deuxième est réalisée. 4h/5h après cette injection les animaux seront observés par l’expérimentateur pour examiner les animaux et vérifier qu’aucun signe de douleur est détecté. Si besoin, une injection d’analgésique est réalisée pour éviter tout inconfort de l’animal. La prophylaxie de la douleur sera donc adaptée à l’examen clinique de l’animal. Le protocole d’analgésie post opératoire a été décidé avec l’accord du vétérinaire. L’expérimentateur surveille la respiration de la souris et adapte si besoin l’analgésie et le dosage de l’anesthésique. Les animaux reçoivent un traitement analgésique approprié selon le geste chirurgical. L’application de critères d’arrêts en élevage/utilisation, et le suivi quotidien des animaux hébergés en groupe certifient le bien-être des animaux. Le suivi est renforcé au cours des 48h suivant la chirurgie puis celle-ci est ensuite allégé a 1 fois par semaine sauf a l’approche de points limites. De plus, le suivi du poids et les tests comportementaux étant réalisé de façon mensuelle (période de repose d’une semaine entre chaque test, il favorise un suivi renforcé). Les animaux seront hébergés en groupe et un igloo sera ajouté dans chaque cage stabulée en portoir ventilé.

Choix des espèces

L’objectif de cette étude est d'évaluer l’efficacité et de trouver la dose efficace minimale de notre produit dans la région cible du cerveau (striatum) du modèle murin pour la MH, en injectant le même lot qui sera utilisé par la suite chez les patients atteints de la MH dans le cadre du futur essai clinique. Nous commencerons donc par valider l'expression de notre produit , dans des souris saines avant son utilisation future chez un modèle de souris de la MH. Les souris qui seront utilisées sont des souris âgée de 2 mois, dans lesquelles nous avons déjà optimisé les coordonnées d'injection dans le cerveau.

3 500 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 800 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 2 700 un niveau modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules leucémiques humaines, des traitements à évaluer et jusqu'à huit prélèvements de sang, avec un suivi de la maladie par imagerie sous anesthésie. Le porteur agit comme prestataire de services pour des laboratoires publics ou privés qui testent leurs candidats-médicaments. Il affirme que le passage au modèle in vivo est "indispensable" et que la souris est le rongeur le plus utilisé pour modéliser cette maladie.

Objectifs

Les leucémies et maladies apparentées, en forte augmentation et affectant aujourd’hui 2,3 millions de patients dans le monde, sont le plus mortel des cancers du sang et touchent environ 9 000 personnes chaque année en France. Ce sont aussi le premier cancer de l’enfant. Le besoin médical insatisfait est donc considérable. Dans ce contexte, notre plateforme propose à ses partenaires de réaliser des tests précliniques chez la souris afin d'évaluer l'efficacité de leurs différentes stratégies thérapeutiques innovantes les plus prometteuses in vitro. L’objectif de cette demande est donc de développer des modèles précliniques robustes, pour évaluer l’effet anti leucémique in vivo de thérapies innovantes en utilisant des modèles de lignées cellulaires et des échantillons de patients leucémiques déjà bien caractérisés.

Bénéfices attendus

En tant que prestataire de services, nous réalisons ces études pour des laboratoires partenaires publics ou privés. Dans ce projet, nous offrons la possibilité à la communauté scientifique de pouvoir évaluer l’efficacité de nouveaux candidats thérapeutiques à l’aide de modèles précliniques dont nous assurons la reproductibilité et la robustesse nécessaires au développement des projets en immuno-oncologie. Bien que ces modèles demandent à être améliorés, ils ont permis de reproduire chez la souris certains aspects des pathologies humaines et, en complément des autres modèles expérimentaux, ils laissent ainsi espérer le développement dans un futur proche de thérapies innovantes.

Procédures

L’ensemble des animaux recevra des administrations de candidats thérapeutiques dont la fréquence et la route seront dépendantes de la pharmacocinétique du composé à évaluer. Unje partie des animaux subiront une transplantation de cellules leucémiques humaines (1 injection durant 1 min / animal) ainsi que des prélèvements sanguins (au maximum 8 sur 6 mois) réalisés sous anesthésie volatile ( 5 min/souris), en alternant les sites de prélèvement et espacés d’au minimum 15 jours afin de favoriser la cicatrisation. Enfin, lorsque possible, le développement de la leucémie sera effectué hebdomadairement par imagerie optique par bioluminescence, un procédé non invasif mais nécessitant l’anesthésie des souris (durée= 6 à 10 minutes/souris).

Impact sur les animaux

Les animaux seront transplantés avec des cellules leucémiques et développeront donc une pathologie humaine potentiellement grave. L'administration des traitements à évaluer constituera une nuisance sur les animaux. L'anesthésie ainsi que les pesées peuvent être source d'angoisse.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédures afin de caractériser ex-vivo le développement leucémique en fonction des conditions expérimentales.

Remplacement

Notre projet se fera dans la continuité d'études in vitro. Le passage au modèle in vivo est une étape indispensable avant d’envisager un essai thérapeutique chez les patients. Nous avons besoin d’un modèle permettant de reproduire d’un point de vue phénoménologique toute la complexité de la croissance leucémique. Un organe isolé ou une espèce, autre que les mammifères, ne permettra pas d’évaluer la biodistribution du candidat thérapeutique évalué ni les éventuels phénomènes de résistance. La souris est alors le modèle rongeur le plus utilisé permettant de modéliser cette pathologie humaine et de faire un suivi de croissance leucémique.

Réduction

Ce projet sur 5 ans présente un nombre maximum de 3500 souris, cependant ces études seront menées avec un système de GO/No GO. Une première étape permettra de vérifier l’absence de toxicité des composés à évaluer. Si des problèmes de tolérance sont identifiés, l’étude de cette molécule sera interrompue. Dans le cas contraire, l’étude sur lignées cellulaires leucémiques transplantées sera initiée =étape 2. Pour l’étape 3, s’agissant de l’étude à partir de greffes de prélèvements de patients, seuls les composés ayant des résultats positifs à l’étape 2 seront lancés. Afin de réduire au strict nécessaire le nombre d’animaux, un calcul d’effectif pour chaque groupe sera réalisé sur la base de notre expérience et de la littérature scientifique du domaine. D’autre part, dès que possible, nous procèderons à la mutualisation de groupes contrôles.

Raffinement

Dans un souci de raffinement, le suivi du développement leucémique se fera par des mesures cinétiques utilisant des procédés peu ou pas invasifs (dosages sur prélèvements sanguins ou d'imagerie optique). De même, l’ensemble de ces procédures de prélèvements et d'imagerie sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Afin d’améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, enrichissement, stabulation en groupe). L’apparition de signes d’inconfort ou d’éventuelle souffrance nous conduira à choisir l’action appropriée (comme par exemple l'apport d'un analgésique) à mener en fonction d’une grille de score du bien-être. Les animaux seront hébergés dans des salles dont les paramètres d’ambiance sont contrôlés (température ; renouvèlement d’air ; éclairage artificiel avec alternance jour/nuit). Afin de respecter leur instinct grégaire, les souris seront stabulées par petits groupes de 3 à 5 dans des cages dont l’environnement est enrichi à l’aide de copeaux de bois compactés et/ou de coton. Les animaux feront l’objet d’une surveillance quotidienne par du personnel compétent afin de détecter précocement toute altération du bien-être animal.

Choix des espèces

Le recours à l’expérimentation animale se justifie par l’impossibilité réglementaire de conduire ce type de développement chez l’homme en l’absence de données précliniques. Le projet nécessite l’utilisation d’une espèce de la classe des mammifères proche de l’homme pour sa physiologie. L’accessibilité à des lignées murines immunodéficientes constitue un avantage déterminant pour le développement de notre approche, permettant la transplantation de cellules d’un individu d’une espèce donnée (humaine) chez un individu hôte d’une espèce différente (souris). Nous utiliserons les paramètres décrits dans la littérature pour ce type de modèle d’injection de cellules leucémiques humaines, c’est à dire des souris « jeunes adultes » âgées de 6 à 12 semaines au moment de la greffe.